CN104946772B - 线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及其应用 - Google Patents

线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104946772B
CN104946772B CN201510388654.0A CN201510388654A CN104946772B CN 104946772 B CN104946772 B CN 104946772B CN 201510388654 A CN201510388654 A CN 201510388654A CN 104946772 B CN104946772 B CN 104946772B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
mir
hsa
mirna
mark
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510388654.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104946772A (zh
Inventor
陆春城
季娟
秦玉峰
郭锡熔
季晨博
夏彦恺
王心如
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Medical University
Original Assignee
Nanjing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Medical University filed Critical Nanjing Medical University
Priority to CN201510388654.0A priority Critical patent/CN104946772B/zh
Publication of CN104946772A publication Critical patent/CN104946772A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104946772B publication Critical patent/CN104946772B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及其应用。该标志物为一些miRNA为线粒体相关miRNA，选自hsa‑miR‑141‑3p、hsa‑miR‑196a‑5p、hsa‑miR‑210‑3p、hsa‑miR‑378a‑3p、hsa‑miR‑484和hsa‑miR‑499a‑5p中的多种。该标志物能很好地将将肥胖病例和正常体重对照分开，可用于制备肥胖诊断或监测试剂盒。

Description

线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及 其应用
发明领域
本发明属于基因工程领域，涉及线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及其应用
背景技术
肥胖是一种以能量代谢失衡为特征的慢性代谢性疾病，主要表现为体内脂肪总含量过多和(或)局部含量增多及分布异常，它是心血管疾病、糖尿病和癌症三大疾病的高危因素。流行病学调查表明，不管在经济发达国家或发展中国家生活优裕的群体，肥胖发生率正以惊人速度迅速增长，已构成21世纪全球医学和公共卫生的严重问题。预计到2030年，将有58％成人患有肥胖和超重。肥胖发生率在青少年和儿童中呈增长趋势，其并发症如II型糖尿病、高血压等成人期疾病在儿童的发病年龄已迅速前移，越来越呈现低龄化趋势。
近年来研究发现，肥胖的病因与环境化学污染物、遗传因子改变、表观遗传修饰异常等密切相关，其中遗传因素在肥胖的发生发展中起重要作用。线粒体基因组作为核外唯一的基因组，是能量代谢中心细胞器，负责生物细胞中能量供给、调控细胞存亡等重要生物学过程。病理条件下，线粒体能量代谢障碍、氧化损伤等是代谢性疾病、衰老及神经退行性疾病、心血管疾病及肿瘤等相关疾病的发生的关键因素。
线粒体基因组(mtDNA)能编码13种多肽参与氧化磷酸化，包括7个复合物I(NADH脱氢酶)，1个复合物III(细胞色素c还原酶)，3个复合物IV(细胞色素c氧化酶)和2个复合物V(ATP合成酶)。线粒体参与大量生物活动，包括ATP生成，钙离子稳态，自由基生成和脂肪酸β氧化等。线粒体通过氧化磷酸化，可生成ATP和活性氧(ROS)(即细胞呼吸的毒性副产物)。线粒体的数量，形态，结构及能量供需失衡与脂肪细胞的分化有着密切关系。过多的能量代谢底物会导致线粒体功能紊乱，糖脂代谢异常。线粒体合成异常，线粒体动力学失衡及线粒体功能紊乱可导致肥胖，糖尿病和癌症等代谢疾病。
微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节，并与生物的许多正常生理活动密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。在人类中已发现了2000余种miRNAs，其参与的细胞转录后调控，在个体发育、细胞胞增殖、分化、代谢和凋亡等多种生物学过程中发挥着重要的调节作用。miRNA可调控脂肪细胞分化，如miR-133和miR-155抑制脂肪细胞分化，而miR-196a和miR-26促进脂肪细胞分化。早期研究认为，miRNA仅由核基因组所编码，通过直接或间接途径参与线粒体功能的调节。随着研究的深入，发现线粒体自身基因组也可编码大量miRNA，进而发挥多种生物学功能。这些miRNA均被称为线粒体相关miRNA。线粒体相关miRNA影响线粒体功能，如能量代谢、线粒体动力学、活性氧和电子传递等。其中，一些线粒体相关miRNA在癌症发生发展中的作用已被深入研究；但是，线粒体相关miRNA在肥胖形成中的作用却不清楚。因此，有必要研究线粒体相关miRNA在肥胖形成中的作用。
研究发现血清中存在上百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血清miRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。因此，我们有理由相信，血清miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA，其差异表达谱可以作为疾病早期诊断的生物标志物。
目前还没有将线粒体相关miRNA应用于肥胖辅助诊断的报道，若能筛选出肥胖相关的线粒体相关miRNA作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对肥胖的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了一条新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供与人类肥胖发生相关的血清中线粒体相关miRNA标志物。
本发明的第二个目的是提供上述血清miRNA标志物的引物。
本发明的第三个目的是提供含有上述血清miRNA标志物或其引物的应用。
本发明的第四个目的是提供含有上述血清miRNA标志物或其引物的用于人类肥胖诊断或监测的试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
与人类肥胖相关的血清miRNA标志物，这些miRNA为线粒体相关miRNA，选自hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p中的多种。
所述的血清miRNA标志物由hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p构成。
所述的血清miRNA标志物，其中hsa-miR-141-3p的序列为UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG(SEQ ID No.1)，hsa-miR-196a-5p的序列为UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGGG(SEQ ID No.2)，hsa-miR-210-3p的序列为CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA(SEQ ID No.3)，hsa-miR-378a-3p的序列为ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC(SEQ ID No.4)hsa-miR-484的序列为UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU(SEQ ID No.5)，hsa-miR-499a-5p的序列为UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU(SEQ ID No.6)。
检测所述的血清miRNA标志物的引物，其中序列为SEQ ID No.1的标志物的上游引物为SEQ ID No.7，下游引物为SEQ ID No.8；序列为SEQ ID No.2的标志物的上游引物为SEQ ID No.9，下游引物为SEQ ID No.10；序列为SEQ ID No.3的标志物的上游引物为SEQID No.11，下游引物为SEQ ID No.12；序列为SEQ ID No.4的标志物的上游引物为SEQ IDNo.13，下游引物为SEQ ID No.14；序列为SEQ ID No.5的标志物的上游引物为SEQ IDNo.15，下游引物为SEQ ID No.16；序列为SEQ ID No.6的标志物的上游引物为SEQ IDNo.17，下游引物为SEQ ID No.18。
所述的血清miRNA标志物或其引物在制备肥胖诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些血清miRNA标志物在血清中表达量的试剂。
一种人类肥胖诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述血清miRNA标志物(hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p中的多种)的引物。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有下列6对引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，SEQID No.9和SEQ ID No.10，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12，SEQ ID No.13和SEQ ID No.14，SEQ ID No.15和SEQ ID No.16，SEQ ID No.17和SEQ ID No.18。
试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
本发明详细描述如下：
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血清样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了TaqMan miRNA Array、qRT-PCR(TaqMan探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
一、研究对象选择和分组依据
(1)根据中国参考标准：偏瘦(BMI<18.5)，正常(BMI 18.5-23.9)，超重(BMI≥24)，肥胖(BMI≥28)；重复BMI检测，确诊为肥胖；
(2)排除未满18周岁，运动员，正在做重量训练，怀孕或哺乳中，身体虚弱或久坐不动的老人；
(3)与病例年龄匹配的体重正常(即BMI为18.5-23.9)对照；
(4)研究对象分组
A组：正常体重对照组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)；
B组：肥胖病例组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)。
二、血清分离及前处理
(1)新鲜肝素抗凝血5ml于离心机3000rpm离心5min，取上清每100μl分装至洁净1.5ml EP管中
(2)向EP管中加入900μl TRIzol，充分混匀后，12000rpm离心15min，立即取上清至一洁净1.5ml EP管中。
(3)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，10000rpm离心15秒，弃下层废液。
(4)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。
(5)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。
重复一遍。
(6)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。
(7)将离心柱装在一个新的1.5ml的离心管中，并在柱子上加入50μlDEPC处理的水，离心1分钟。
(8)-70℃保存处理后的样本。
本发明实验中使用的离心柱和配套试剂(RWT缓冲液、RPE缓冲液)均来自QiagenmiRNeasy Mini Kit(货号217004)这个试剂盒，下同。
三、qRT-PCR方法测量血清miRNAs表达量
1.取经前处理的血清，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。
按下表所示配制反转录体系：
2.将PCR管反复颠倒混匀6次后做简短离心，冰上放置5分钟。
3.将PCR管放入PCR仪进行反转录，反应条件如下表所示：
反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。
4.逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：
预扩增的反应条件如下表所示：
降至4℃后，将预扩增产物保存于4℃冰箱。
5.将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH 8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的qRT-PCR。
预扩增产物进行qRT-PCR按下表所示配制反应体系：
考虑到吸液损失而放量12.5％。
6.检测并比较正常体重对照组、肥胖病例组血清样本中miRNAs表达量的差异。
检测到的存在差异表达的正常体重对照和肥胖者血清miRNAs包括hsa-miR-141-3p(SEQ ID No.1)、hsa-miR-196a-5p(SEQ ID No.2)、hsa-miR-210-3p(SEQ ID No.3)、hsa-miR-378a-3p(SEQ ID No.4)、hsa-miR-484(SEQ ID No.5)和hsa-miR-499a-5p(SEQ IDNo.6)。其中hsa-miR-141a-3p在肥胖者血清中的表达量显著高于对照组，而hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-499a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p和hsa-miR-484在肥胖者血清中的表达量显著低于对照组，并且这些miRNAs在血清中表达具有稳定性。
四、qRT-PCR方法验证血清miRNAs表达量
1.设计6条目标miRNAs的引物。
2.加入荧光染料进行qRT-PCR反应。检测并比较正常体重对照、肥胖者病例血清样本中miRNAs表达量的差异(病例和对照各80人)。
3.选择独立人群(对照和病例各30人)进行qRT-PCR检测，结果均与芯片结果一致。
因此，最终确认为存在差异表达的正常体重对照、肥胖者病例血清miRNAs包括hsa-miR-141-3p(SEQ ID No.1)、hsa-miR-196a-5p(SEQ ID No.2)、hsa-miR-210-3p(SEQID No.3)、hsa-miR-378a-3p(SEQ ID No.4)、hsa-miR-484(SEQ ID No.5)和hsa-miR-499a-5p(SEQ ID No.6)，具体引物见表1。其中hsa-miR-141a-3p在肥胖者血清中的表达量显著高于对照组，而hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-499a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p和hsa-miR-484在肥胖者血清中的表达量显著低于对照组，同时这些miRNAs在血清中表达具有稳定性。采用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6这6个构成的组合可以将对照组、病例组区分开。
五、诊断试剂盒制备方法
根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于肥胖的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血清中稳定存在且可检测的成熟hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p的引物和工具。诊断试剂盒包括一批血清miRNAs引物，还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂。
本发明的有益效果：
本发明人通过分离和比较正常体重对照和肥胖病例血清中的miRNAs，发现了血清中存在可用于评估是否患有肥胖的特异性和敏感性(实施例5的ROC曲线提示具有较好的灵敏度，实施例6对其实际效果进行了验证，即肥胖患者均被正确检测识别)的miRNA组合，因而提出了肥胖患者的血清miRNA标志物组合，以及该血清miRNA标志物或其引物在制备肥胖诊断试剂中的应用，研制出可便于临床应用的肥胖诊断试剂盒。
本发明采用血清miRNA作为肥胖评价的标志物的优越性在于：
(1)血清miRNA是传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高肥胖诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为肥胖的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明提供的血清miRNA标志物可用于肥胖诊断标志物，可在早期通过微创方式对肥胖进行辅助诊断，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。
(3)本发明采用符合肥胖病例和正常体重对照人群的样本进行验证，证明这几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为标志物使用。
(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种血清miRNAs，应用qRT-PCR等方法进行二次验证和独立人群验证，采用分层评分系统对诊断结果进行标化，并在另一组独立人群中对血清miRNA标志物和诊断试剂盒进行盲法评价，保证了该血清miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。
附图说明
图1以hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p作为标志物对健康对照和肥胖病例进行区分。
图2个体血清miRNAs表达水平波动性分析。
图3正常对照组和肥胖病例组之间的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1 研究对象选择和分组依据
本发明人于2013年7月到2014年7月从南京医科大学第一附属医院江苏省人民医院收集符合要求的肥胖病例及正常体重对照成年血液样品，通过对样品资料的整理，从中选择了符合要求的80例正常体重对照(平均年龄：22.15±3.45岁)、80例肥胖病例(平均年龄：22.32±3.51岁)作为qRT-PCR检测miRNA表达的实验对象。具体的样品归类标准如下：
(1)根据中国参考标准：偏瘦(BMI<18.5)，正常(BMI 18.5-23.9)，超重(BMI≥24)，肥胖(BMI≥28)；重复BMI检测，确诊为肥胖；
(2)排除未满18周岁，运动员，正在做重量训练，怀孕或哺乳中，身体虚弱或久坐不动的老人；
(3)与病例年龄匹配的体重正常(即BMI为18.5-23.9)对照；
(4)研究对象分组
A组：正常体重对照组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)；
B组：肥胖病例组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)。
注：BMI(即身体质量指数，Body Mass Index，简称BMI)，是用体重公斤数除以身高米数平方得出的数字，是目前国际上常用的衡量人体胖瘦程度以及是否健康的一个标准。
实施例2 线粒体相关miRNA TaqMan array筛选
制备cDNA样品：a)取100μl血清；b)加入900μl TRIzol，振荡混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃下层废液；c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000rpm离心15秒，弃下层废液；d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。f)重复e。g)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。h)在柱子上加入50μlDEPC处理水12000rpm离心收集RNA。i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。(若针对不同miRNA则采用对应的miRNA反向引物按上述步骤进行)
逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：
预扩增的反应条件如下表所示：
将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH 8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的实时荧光定量PCR(qPCR)。
预扩增产物进行qPCR按下表所示配制反应体系：
考虑到吸液损失而放量12.5％。
检测并比较正常体重对照、肥胖患者血清样本中miRNAs表达谱的差异，筛选差异表达的miRNA(4倍以上)，在此基础上，结合生物信息学分析及相关文献报道，筛选与线粒体功能密切相关的miRNAs，最终选定6条作为候选并进行进一步验证，具体为：hsa-miR-141-3p,hsa-miR-196a-5p,hsa-miR-210-3p,hsa-miR-378a-3p,hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p。
实施例3 qRT-PCR方法测量血清中线粒体相关miRNA表达量
设计引物(表1)分别对80例正常体重对照、80例肥胖病例的血清进行各miRNAs的定量Real-time PCR检测。制备cDNA样品：a)取100μl血清；b)加入900μl TRIzol，振荡混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃下层废液；c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000rpm离心15秒，弃下层废液；d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。f)重复e。g)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。h)在柱子上加入50μl DEPC处理水12000rpm离心收集RNA.i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；
(2)qRT-PCR：染料法：取1μl cDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，1μl 20×EVA GREEN，0.25μl 10μM上述单一miRNA对应的正向引物，0.25μl 10μM通用反向引物(URP)，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl 2.5mM dNTP混合液(Takara公司)，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水，20μl体系进行荧光定量PCR。10μl TaqMan universal PCR masterMix，6.6μl H2O，20μl体系进行q-PCR。仪器使用的都是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件都是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。检测并比较正常体重对照、肥胖者血清样本中miRNA表达量的变化，各组样品血清miRNA的表达量比值可用方程2–△G表示，其中△G＝CT group1–CT group2。为保证各次实验间的可比性，我们在每板上都设置了U6，以其表达量作为内参调整计算表达量。
从结果分析得出，hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p这六条miRNA在各组间均有显著差别(图1)。非参数的趋势性检验也显示了相同的差异。
实施例4 个体血清中线粒体相关miRNA表达量的稳定性分析
采用实施例3的方法对6名成人血清miRNA水平的稳定性进行评价。和实施例1同样的采集方法采集研究对象连续三次血清(间隔时间为1周，间隔期内无疾病)。结果显示，血清中hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p这六个线粒体相关miRNA表达水平较稳定(图2)。这些都提示了个体血清miRNA的表达量较为稳定，具备作为诊断标志物的特性。
实施例5 线粒体相关miRNA组合对肥胖的判断
根据上述qRT-PCR方法，本发明人通过对病例和对照组血清样品的线粒体相关miRNAs表达水平的分析，以正常体重对照组miRNAs表达量的五分位数为阈值，对hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p进行评分，进一步求得总得分，以此绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这六个miRNAs低表达或高表达对肥胖的评估能力。ROC分析结果显示，hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p以79.2％的AUC(ROC曲线下面积)将正常体重对照组和肥胖病例组分开(图3)，最佳临界点的敏感度＝0.738，特异度＝0.775。
在上述一系列研究结果的基础上，本发明人证明了采用hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p能够很好地将肥胖病例和正常体重对照分开。
实施例6 线粒体相关miRNA分层评分和独立人群盲法验证
当对hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p这六个标志物的表达水平进行分层评分时(五分位数分层后累加)，能够对是否患有肥胖进行评估，表述为积分越高，确认为肥胖的风险越高。
表3 六个miRNAs五分位数得分并求和
注：每个miRNA按表达量的五分位数分为五个等级0、1、2、3、4，最低的0分，最高的4分，6条miRNA综合可以得分为0～24分，而正常体重组绝大多数得分很低(表达量低，积分按反向计算)，而肥胖病例组绝大多数得分很高。举例来说，如有一个样本评分为24分(最高的分值组)，则其不可能为正常体重对照，而应为肥胖症。
针对得出的评估分值(即根据具体得分判断其分组，得高分的归入肥胖病例组，得低分的归入对照组；比较而言，≥18算高分，≤6算低分)，对另一组独立采集的人群进行盲法首诊，即采用双盲试验，对独立人群(另一医院采集的40例)同时进行常规诊断分析和血清样品的miRNA检测，结果显示通过6个miRNA检测评分，可以将肥胖者及正常体重对照很好的区分开(40例随机选择样本中有10例评分较高(≥18分)，其中达到24分(最高分)的有3例，这3例经诊断均为肥胖者，其余评分较低(≤6分)的均为非肥胖者)，提示这六种线粒体相关miRNA可作为评估肥胖的标志物。
实施例7 用于肥胖监测和风险评估的线粒体相关miRNA诊断试剂盒的制作
该miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于qRT-PCR技术。
首先通过测序的方法和qRT-PCR方法确定正常体重对照和肥胖者血清中有一个以上拷贝的miRNA。然后通过定量PCR等技术筛选与肥胖相关的一类血清miRNA，作为肥胖监测和风险评估的指标。最后筛选出对应的血清miRNA的数量控制在几条，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血清miRNA引物，其中miRNA的引物包括hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484、hsa-miR-499a-5p和U6的正反向引物、U6逆转录引物(见表1)。还包括相关PCR技术常用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂，这些试剂可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要一次提供少量(2ml)血液，即可检测血清miRNA标志物的变化趋势，再通过该变化趋势预测肥胖发生可能性，并易于进行动态监测。
具体试剂盒组成如下：
试剂盒含有以下6对引物：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12，SEQ ID No.13和SEQ ID No.14，SEQ ID No.15和SEQID No.16，SEQ ID No.17和SEQ ID No.18，各10μM 0.25μl。
试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶，1μl 20×EVA GREEN，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl2.5mM dNTP混合液，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。
试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对、U6逆转录引物(表1)。
或者试剂盒中除正向引物外还含有1μl 10μM通用反向引物，10μl TaqMan通用PCR混合液，6.6μl H2O。
试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA含量检测的相应试剂。

Claims (7)

1.与人类肥胖发生相关的血浆miRNA标志物，这些miRNA为线粒体相关miRNA，该标志物由hsa-miR-141-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-484和hsa-miR-499a-5p构成。
2.根据权利要求1所述的血浆microRNA标志物，其特征在于hsa-miR-141-3p的序列为SEQ ID No.1，hsa-miR-196a-5p的序列为SEQ ID No.2，hsa-miR-210-3p的序列为SEQ IDNo.3，hsa-miR-378a-3p的序列为SEQ ID No.4，hsa-miR-484的序列为SEQ ID No.5和hsa-miR-499a-5p的序列为SEQ ID No.6。
3.权利要求2所述的血浆microRNA标志物的引物，其特征在于序列为SEQ ID No.1的标志物的上游引物为SEQ ID No.7，下游引物为SEQ ID No.8；序列为SEQ ID No.2的标志物的上游引物为SEQ ID No.9，下游引物为SEQ ID No.10；序列为SEQ ID No.3的标志物的上游引物为SEQ ID No.11，下游引物为SEQ ID No.12；序列为SEQ ID No.4的标志物的上游引物为SEQ ID No.13，下游引物为SEQ ID No.14；序列为SEQ ID No.5的标志物的上游引物为SEQ ID No.15，下游引物为SEQ ID No.16；序列为SEQ ID No.6的标志物的上游引物为SEQID No.17，下游引物为SEQ ID No.18。
4.权利要求1所述的血浆microRNA标志物在制备人类肥胖诊断或监测试剂中的应用。
5.权利要求3所述的引物在制备人类肥胖诊断或监测试剂中的应用。
6.一种人类肥胖诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1所述的血浆microRNA标志物的引物。
7.根据权利要求6所述的诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有引物SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12，SEQIDNo.13和SEQ ID No.14，SEQ ID No.15和SEQ ID No.16，SEQ ID No.17和SEQ ID No.18。
CN201510388654.0A 2015-07-03 2015-07-03 线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及其应用 Active CN104946772B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510388654.0A CN104946772B (zh) 2015-07-03 2015-07-03 线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510388654.0A CN104946772B (zh) 2015-07-03 2015-07-03 线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104946772A CN104946772A (zh) 2015-09-30
CN104946772B true CN104946772B (zh) 2017-10-10

Family

ID=54161834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510388654.0A Active CN104946772B (zh) 2015-07-03 2015-07-03 线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104946772B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106011303B (zh) * 2016-08-08 2019-05-24 南京市妇幼保健院 一种与儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用
CN111518886B (zh) * 2020-04-23 2021-08-17 浙江大学 一种与肿瘤细胞对索拉非尼耐药性相关的microRNA及其应用
WO2023062046A1 (en) * 2021-10-11 2023-04-20 Actelion Pharmaceuticals Ltd Methods and compositions for predictive outcomes for pulmonary arterial hypertension treatment

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1931780B1 (en) * 2005-08-29 2016-01-06 Regulus Therapeutics Inc. Antisense compounds having enhanced anti-microrna activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1931780B1 (en) * 2005-08-29 2016-01-06 Regulus Therapeutics Inc. Antisense compounds having enhanced anti-microrna activity

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Elevated circulating microRNA-122 is associated with obesity and insulin resistance in young adults;Rui Wang等;《European Journal of Endocrinology》;20141216;第172卷(第3期);第294页左栏第3段到右栏第1段和表1 *
MicroRNA: 线粒体功能调控的新机制;王学翔等;《中国细胞生物学学报》;20131231;第35卷(第1期);正文表1、表2和表3 *
Mitochondria-related miR-141-3p contributes to mitochondrial dysfunction in HFD-induced obesity by inhibiting PTEN;Juan Ji等;《Scientific Reports》;20151109;第1-12页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104946772A (zh) 2015-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105039530B (zh) 线粒体相关精浆微小核糖核酸作为人类严重弱精子症发生的标志物及其应用
KR20170035932A (ko) 위암 진단용 microrna 바이오마커
CN107338324A (zh) 用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
CN102876676B (zh) 一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用
CN102031261B (zh) 一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用
CN103642914B (zh) 与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用
CN107937512A (zh) 用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
CN104946772B (zh) 线粒体相关血清微小核糖核酸作为人类肥胖发生的标志物及其应用
CN104830989A (zh) 一种用于ros1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒
WO2017120285A1 (en) METHODS OF USING miRNA FROM BODILY FLUIDS FOR DIAGNOSIS AND MONITORING OF NEURODEVELOPMENTAL DISORDERS
CN106434982A (zh) 缺血性脑卒中相关的分子标记物及其应用
CN104962654B (zh) lncRNA-MALAT1在制备增生性玻璃体视网膜病变诊断试剂中的应用
WO2015171510A2 (en) Circulatory micrornas (mirnas) as biomarkers for diabetic retinopathy (dr) and age-related macular degeneration (amd)
CN106701962A (zh) 用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒
US11124832B2 (en) Serum miRNA marker for OPLL diagnosis and application thereof
AU2010290828A1 (en) MicroRNA expression signature in peripheral blood of patients affected by hepatocarcinoma or hepatic cirrhosis and uses thereof
CN108300788A (zh) 一种用于检测轻型脑外伤的微小核糖核酸组合及其应用
CN108929910B (zh) 一种与肺腺癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用
CN108410977B (zh) 酒精性股骨头坏死患者血清miRNAs超早期检测试剂盒
CN106244688A (zh) 一种评估结肠腺癌患病风险的标志物
CN109628583A (zh) 血浆/血清外泌体miRNA作为青光眼诊断标志物中的应用
CN110373457A (zh) 一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用
CN109762883A (zh) 血浆/血清外泌体hsa-miRNA-29-3p作为青光眼诊断标志物中的应用
CN107447008A (zh) 用于诊断不明原因复发性流产的增强子rna组合、引物组及应用和试剂盒
CN107326076A (zh) 一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant