CN103642914B - 与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用 - Google Patents

与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用，该恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物是miR-610、miR-1224-5p、miR-125a-3p以及miR-557的组合。本发明提供了一种具备早期诊断和筛查恶性黑素瘤的能力的与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用。

Description

与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用。
背景技术
黑素瘤是具有高度侵袭性的皮肤恶性肿瘤[Clark WH Jr et al，1984]，患病率在全球范围约为0.02-0.5‰，年增长率3-5%，是所有恶性肿瘤中发病率增长最快的恶性肿瘤之一。黑素瘤致死率高，尽管其发病仅占皮肤肿瘤的4%，但在皮肤肿瘤所造成的死亡病例中高达74%，已成为严重危害人类健康的疾病之一。早期诊断并切除的黑素瘤预后良好，5年生存率可达90%以上，然而二期黑素瘤患者5年生存率迅速降至60%，5年生存率在三期黑素瘤患者只有10%左右，四期黑素瘤患者几乎全部死亡[Mueller DW et al，2009]。由此可见，寻找可用于黑素瘤早期诊断和预后判断的临床检测指标，从而采取更有效的治疗措施干预疾病进展，对提高患者生存率具有非常重要的意义。
目前黑色素瘤的早期诊断和预后判断均比较困难。在早期诊断方面，传统的方法主要是根据患者临床表现、肿瘤形态和组织病理学特点作出判断。这些方法虽可为肿瘤生物学行为和发展结局提供一定信息，但存在着一定的缺陷，如手术取材的创伤性、人为经验诊断的主观性、与其他色素性皮肤肿瘤难以鉴别以及无法判断预后等，这些都将增加误诊或漏诊的发生率。研究表明，皮肤黑素瘤（CM）误诊的情况最为常见。国外一项大样本研究显示[Lindelof B et al，1994]，CM常被误诊为色素痣、基底细胞癌、脂溢性角化、雀斑、Bowen’s病、疣、皮肤纤维瘤、化脓性肉芽肿和血管瘤等疾病。虽然目前已发现一些血清标志物如LDH、S100B、MIA蛋白等可应用于黑素瘤的临床诊断，但这些标志物主要还是黑素瘤患者诊断分期的辅助指标，并都存在各自的局限性[Selma U et al，2009]。因此，发现早期诊断黑素瘤的新的分子标志物以及开发灵敏的诊断方法具有重要意义。
microRNA（miRNAs）是一类广泛存在于动植物体内的内源性非编码单链RNA，由19-23个核苷酸组成。miRNAs通过与靶信使核糖核酸（mRNA）特异结合抑制转录后基因表达，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面发挥重要作用，具有极其重要的病理和生理意义[Stefani G et al，2008]。大量研究证实miRNAs表达及变化与黑素瘤的发生发展存在着必然联系。有研究发现与健康人黑素细胞系相比，黑素瘤细胞系中大量miRNA表达失调[Mueller DW etal，2009]。针对黑素瘤细胞系的miRNA研究显示[Lu J et al，2005]低分化的肿瘤可以被其miRNA表达谱有效的区分出来。最近，Cell上发表了克菲勒大学研究人员对miRNA调控黑色素瘤发展的机理进行的一项系统研究，揭示了多种miRNA互作介导促进黑色素瘤转移的重要机制[Pencheva N，2012]。
以上研究多通过检测细胞或病变组织中miRNA表达谱与正常细胞或组织差异探究发病机制，其检测技术复杂、创伤大，难以真正应用于临床诊断。寻找简便、快捷的miRNA研究方法，对于大规模、快速筛查黑素瘤发病相关miRNA显得十分重要。2008年，牛津大学Lawrie等[Lawrie CH et al，2008]首次报道B细胞淋巴瘤血清中miR-155、miR-210及miR-21增高。随后大量实验证明miRNAs可以广泛而稳定地存在于细胞外液，包括血清、血浆、组织间液及各类体液中，统称为循环miRNAs（circulating miRNAs）。循环miRNA的发现是肿瘤分子生物学革命性的突破。目前血液中肿瘤生物标志物主要基于一些特定蛋白质在血液中表达水平的改变，如癌胚抗原与多种肿瘤，前列腺特异抗原与前列腺癌，甲胎蛋白与肝癌，鳞状细胞癌抗原与肺鳞癌等。但是血液蛋白质组成的复杂性、转录后修饰引起的变异、较低的蛋白质标志物水平、标本稳定性及检验手段的敏感性等在一定程度上制约了进一步寻找新型蛋白质标志物。而循环miRNAs由于其自身独特的优势——高度的特异性和稳定性，以及其在不同物种表达间进化保守、具有器官或生物学发育时段的特异性，以及多种高敏感性的miRNAs检测技术等，弥补了血清蛋白质标志物的不足，决定了其作为新一代肿瘤生物标志物的巨大潜力。
然而，目前还没有用于黑素瘤诊断的较为稳定的循环miRNA标志物的报道，若能筛选出黑素瘤异常表达的循环miRNAs作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国黑素瘤的诊断现状必将是一次有力的推动。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种具备早期诊断和筛查恶性黑素瘤的能力的与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用。
本发明的技术解决方案是：本发明提供了一种与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物，其特殊之处在于：所述与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物是miR-610、miR-1224-5p、miR-125a-3p以及miR-557的组合。
如上所述的标志物在制备黑素瘤辅助诊断试剂盒中的应用。
一种用于扩增如上所述的与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物的引物，其特殊之处在于：所述引物是：
miR-610的正向引物是：5’-TGAGCTAAATGTGTGCTGGGA-3’；
miR-1224-5p的正向引物是：5’-GTGAGGACTCGGGAGGTGG-3’；
miR-125a-3p的正向引物是：5’-ACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCC-3’；
miR-557的正向引物是：5’-GTTTGCACGGGTGGGCCTTGTCT-3’。
如上所述的标志物的引物在制备黑素瘤辅助诊断试剂盒中的应用。
一种基于如上所述的与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物所形成的黑素瘤辅助诊断试剂盒，其特殊之处在于：所述试剂盒用于检测血浆/血清中循环miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p以及miR-557。
上述黑素瘤辅助诊断试剂盒含有循环miRNA中miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p以及miR-557的引物。
上述黑素瘤辅助诊断试剂盒含有循环miRNA中miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p以及miR-557的引物分别是：
miR-610的正向引物是：5’-TGAGCTAAATGTGTGCTGGGA-3’；
miR-1224-5p的正向引物是：5’-GTGAGGACTCGGGAGGTGG-3’；
miR-125a-3p的正向引物是：5’-ACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCC-3’；
miR-557的正向引物是：5’-GTTTGCACGGGTGGGCCTTGTCT-3’。
上述诊断试剂盒还包括PCR发应常用的酶和试剂。
本发明解决问题的技术方案包括：
（1）建立统一标准的标本库和数据库，以标准操作程序（SOP）采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。
（2）循环miRNA差异表达谱分析：选择黑素瘤病例、与黑素瘤病例年龄匹配的健康对照，检测其循环miRNA表达谱及含量，筛选差异表达miRNAs，进行进一步大样本多阶段验证。对已筛选的循环miRNAs在大样本人群中进行定量分析，确定黑素瘤发病相关循环miRNAs。循环miRNA筛查和诊断试剂盒的研制：根据黑素瘤病例和健康对照的特异循环miRNA开发miRNAs诊断试剂盒。
本发明以标准操作程序（SOP）采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料，临床资料等（这些资料可用于判断疾病进展，并控制疾病分期，患者年龄等因素对于发病的影响），并采用Agilent microRNA芯片检测、Real-timePCR方法等。
本发明的有益效果是：
本发明提供的循环微小核糖核酸（microRNAs/miRNAs）标志物作为黑素瘤诊断的标志物的优越性在于：
（1）循环miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于黑素瘤的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
（2）循环miRNAs试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于黑素瘤患者的辅助诊断，有助于反映黑素瘤患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
（3）采用严密的设计和评价体系，本发明初期采用Agilent microRNA芯片检测以获取疾病特异和异常表达的循环miRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法在大样本中进行了多阶段验证，采用了染料法进行验证；以上方法和策略的应用加速和保证了循环miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究循环miRNA在黑素瘤辅助诊断的应用前景，阐述异常表达的miRNAs对于黑素瘤进展的影响，揭示其筛查和诊断价值。因此，本发明获得了黑素瘤发病相关循环miRNAs表达数据库和特异性标志物；通过循环miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得黑素瘤的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1显示miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p和miR-557在健康对照组和恶性黑色素瘤中的表达水平。
图2显示30例样本人群病例组和对照组的ROC曲线。
图3显示100例样本人群病例组和对照组的ROC曲线。
具体实施方式
本发明的第一个目的是提出一种与黑素瘤相关的循环miRNA标志物，该与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物是miR-610、miR-1224-5p、miR-125a-3p以及miR-557的组合。
本发明的第二个目的是提供上述循环miRNA标志物的引物，该引物分别是：
miR-610的正向引物是：5’-TGAGCTAAATGTGTGCTGGGA-3’；
miR-1224-5p的正向引物是：5’-GTGAGGACTCGGGAGGTGG-3’；
miR-125a-3p的正向引物是：5’-ACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCC-3’；
miR-557的正向引物是：5’-GTTTGCACGGGTGGGCCTTGTCT-3’。
本发明的第三个目的是提供上述循环miRNA标志物及引物在制备黑素瘤辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供辅助黑素瘤诊断的试剂盒，该试剂盒用于检测血浆/血清中循环miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p以及miR-557，同时还含有循环miRNA中miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p以及miR-557的引物。该引物可以是如上所记载的黑素瘤辅助诊断试剂盒含有循环miRNA中miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p以及miR-557的引物。
同时，该诊断试剂盒还包括反转录系统和扩增系统，如一些PCR发应常用的酶和试剂，还含有标准品和对照品。
发明人通过分离和研究黑素瘤患者及与其年龄匹配的健康对照循环中的miRNAs，寻找一组与黑素瘤高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于临床应用的黑素瘤诊断试剂盒，为黑素瘤的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明具体来说，研究的试验方法包括以下几个部分：
1、研究样本的选择
（1）经病理学明确诊断的黑素瘤病例（2）采血前未经过手术和治疗
（3）与病例年龄匹配的健康对照本研究共采用260例符合标准的样本进行研究
2.Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）和miRNeasy Mini Kit（QIAGEN公司）提取循环总RNA，按常规方法操作。
3.Agilent microRNA（Agilent公司）芯片检测
（1）总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品
（2）cDNA样品进行预扩增反应
（3）预扩增产物进行Agilent microRNA芯片检测，得到miRNA的表达谱
（4）数据分析与处理
4.Real-time RT-PCR方法
（1）取受试者的循环总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品
（2）设计引物
（3）加入染料进行PCR反应
（4）检测并比较黑素瘤病例与健康对照血浆/血清样品中miRNA的量的变化
5.诊断试剂盒制备方法Agilent microRNA芯片检测方法确定黑素瘤病例和健康对照中表达差异的miRNA，通过Real-time RT-PCR筛选在黑素瘤病例和健康对照中表达量和差异程度大的一组循环miRNA，作为辅助黑素瘤诊断的指标。最后筛选出与黑素瘤发病有关的循环miRNA组成诊断试剂盒（miRNA中miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p，miR-557）。诊断试剂盒包括这些循环miRNA组合的引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。
6.统计分析方法运用x2检验（用于分类变量）或者student t检验（用于连续性变量）比较人口学特征、组织类型和miRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。
在30例黑素瘤病例和30例健康对照中运用Agilent microRNA芯片的研究结果发现有61种miRNAs在黑素瘤中表达异常（拷贝数倍数差异大于2）。个体miRNAs检测的不同表达水平以2-△Ct表示，其中△Ct=CT样本-CT内参，在每一个样本提取时加入cel-mir-39的RNA作为参照，计算相对表达量。对有统计学显著差异的miRNAs在另外100例黑素瘤病例和100例对照中进行进一步验证，进而观察本研究结果的稳定程度。
为了进一步研究这四种miRNAs构成的综合指征用于恶性黑色素瘤诊断的效果，构建了一个数学公式，综合考虑每种miRNA与恶性黑色素瘤发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，首先以30例健康人群对照组miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p和miR-557量的单侧95％参考值范围为标准，分别将这4种miRNA的表达水平评为0分和1分，然后再以30例样本对照人群的回归系数为权重，综合考虑每种miRNA的表达情况给每个病人确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝（8.031×miR-610的评分）+（7.464×miR-1224-5p的评分）+（5.327×miR-125a-3p的评分）+（4.113×miR-557的评分），获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于100例黑素瘤病例人群中。
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成（SAS，v.9.1.3）。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
在上述30例符合条件的黑素瘤病例及30例健康对照中，两组年龄按个体精确匹配。将这两组人群样本经Agilent microRNA芯片检测获得相关结果。
通过Agilent microRNA芯片检测，本发明检测到在“黑素瘤病例”组和“健康对照”组的血清中存在差异表达（2组的拷贝数倍数差异大于2）的微小核糖核酸包括：
hsa-let-7b、hsa-let-7i、hsa-miR-106b、hsa-miR-107、hsa-miR-1181、hsa-miR-1182、hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-1226*、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-126、hsa-miR-1274b、hsa-miR-1308、hsa-miR-130a、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-146a、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-1914*、hsa-miR-196b、hsa-miR-197、hsa-miR-19b、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-223、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26a-1*、hsa-miR-30d、hsa-miR-30e、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-484、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-557、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-575、hsa-miR-601、hsa-miR-610、hsa-miR-623、hsa-miR-663、hsa-miR-720、hsa-miR-92a、hsa-miR-940
将表达差异的前10位miRNA包括：hsa-miR-610、hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-202、hsa-miR-557、hsa-miR-1182、hsa-miR-1299、hsa-miR-877、hsa-miR-371-5p。
用Real-time RT-PCR方法在100例黑素瘤病例和100例健康对照中进行再次验证，发现有4种miRNAs（miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p和miR-557）在黑素瘤病例和健康对照组中的表达情况存在显著性差异。
多因素Logistic回归分析结果表明，这4种miRNAs的表达水平均与黑素瘤的发病存在着显著关联：4种miRNAs均在病例中高表达。进一步分析这4种miRNA的组合用于黑素瘤诊断的效果，发现其组合对黑素瘤发病诊断的AUC[AreaUnder the ROC Curve，ROC曲线（Receiver Operating CharacteristicCurve，受试者工作特征曲线）下面积]与单个miRNA相比增加。
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2008年开始至今从第四军医大学附属西京医院收集了大量的恶性黑色素瘤患者和对照的外周血样品（用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一），通过对样品资料的整理，发明人从中选择了260例符合下列标准的样本作为Agilent microRNA芯片检测和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品：
1、新发恶性黑色素瘤病例
2、采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗
3、与病例年龄匹配的健康对照并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。
实施例2血清/血浆中miRNA的Agilent microRNA芯片检测
在上述符合条件的30例恶性黑色素瘤患者和30例健康对照中，两组年龄匹配。将这两组人群经Agilent microRNA芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、用mirVana PARIS microRNA分离试剂盒（mirVana PARIS miRNA Isolationkit）按照厂家（Ambion，Austin，TX）提供的使用说明来抽提总RNA，在抽提的过程中加入终浓度为10-4pmol/μl的人工合成的cel-39（TAKARA）作为内参，用NanoDrop1000分光光度计（NanoDrop Technologies，Waltham，MA）来定量检测其浓度。
2、将RNA样品进行标记及杂交，标记及杂交所需要的试剂均包含在Agilent’smiRNA Complete Labeling and Hyb Kit（p/n5190-0456）中，具体的试剂如下所示：Calf Intestinal Alkaline Phosphatase（CIP）；10×Calf Intestinal PhosphataseBuffer；T4RNA Ligase；10×T4RNA Ligase Buffer；Dimethyl sulfoxide（DMSO）；Nuclease-Free Water；Cyanine3-pCp；10X GE Blocking Agent；2X Hi-RPMHybridization Buffer
3、用1×TE（pH7.5）将RNA样品稀释至50ng/μL。吸取上述稀释后的样品2μL至洁净的1.5mL离心管中，放置冰上备用。
4、配制去磷酸化混合液：0.4μl10×Calf Intestinal Phosphatase Buffer、1.1μlNuclease-Free Water、0.5μl Calf Intestinal Alkaline Phosphatase（CIP）；取上述的混合液2μL至样品管中，总体积为4μL，枪头抽吸混匀。
5、将上述4μL反应混合液置于37℃金属浴中，保温30分钟。
6、在每管样品中添加2.8μL100%DMSO。
7、将上述反应混合液置于100℃金属浴中加热5-10分钟。反应结束后，将样品管迅速转入冰水浴中冷却。
8、将10×T4RNA Ligase Buffer置于37℃温育并间隔涡旋，直至沉淀全部溶解，然后将其冷却至室温备用。
9、按下表配制连接反应混合液：1.0μl10×T4RNA Ligase Buffer、3.0μlCyanine3-pCp、0.5μl T4RNA Ligase。
10、取4.5μL上面的反应混合液至样品管中，总体积为11.3μL，枪头抽吸混匀，稍离心。
11、置于16℃温育2小时。反应结束后，将样品置于真空浓缩仪中完全抽干备用。
12、将抽干的样品重新溶解在18μL nuclease-free水中。
13、在每管中加入4.5μL配制好的10×GE Blocking Agent、22.5μL2×Hi-RPMHybridization Buffer，轻微涡旋混匀，将上述反应混合液放置在100℃金属浴中加热5分钟。
14、反应结束后，迅速将其转至冰水浴中冷却5分钟，然后取45μL反应液和芯片进行杂交，杂交温度设定在55℃，反应结束后洗涤芯片然后使用AgilentScan Control software进行芯片扫描，通过Feature Extraction Software Rev.9.5.3（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）将微阵列图像信息转化成光点强度值。将除掉背景后的信号用稳定的内参cel-39进行标准化。然后，进行底数为2的log转换。一个陈列上重复点的片间变异系数（CV）超过15％或可检测到的信号小于5％为不可信样本，排除上述不可信样本后，进行进一步分析。
实施例3血清/血浆中miRNA的qRT-PCR实验
根据上述Agilent microRNA结果，选择表达差异前10位的miRNAs在30例恶性黑色素瘤患者和30例健康对照中用qRT-PCR方法进行验证：
对所选择的hsa-miR-610、hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-202、hsa-miR-557、hsa-miR-1182、hsa-miR-1299、hsa-miR-877、hsa-miR-371-5p等10个miRNAs设计qRT-PCR的引物。对“恶性黑色素瘤病例”组和“健康对照”组的血清单个个体进行miRNA的qRT-PCR检测。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。分别用染料法和探针法两种方法进行qRT-PCR检测。
（1）制备RNA样品：a）取200μl血清；b）加3倍体积的Trizol室温放置15min，加入终浓度为10-4pmol/μl的人工合成的cel-39（TAKARA）作为内参，然后加入与血浆/血清等体积的氯仿，震荡50s，室温15min，14，000rpm，4℃，离心15min；c）将水相转移到新的1.5ml的离心管，加入1.5倍水相体积的无水乙醇，充分混匀；d）用QIAGEN公司的miRNeasy kit富集RNA。
（2）探针法：使用ABI试剂盒。
a）通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录反应体系包括0.15μl100mMdNTPs混合物、1μl逆转录酶（50U/μL）、1.5μl10X逆转录缓冲液、0.19μl RNA抑制剂以及3μl5×逆转录引物一种或几种的混合物。加入9.16μl的总RNA。反应步骤为16℃孵育30分钟，42℃反应30分钟，85℃孵育5分钟；
b）q-PCR：将cDNA加入5μl水稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.25μl20×MicroRNA检测探针、2.5μl2×基因表达Master Mix、1.25μl双蒸水，5μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行45个循环。
（3）染料法：
a）通过RNA逆转录反应得到cDNA。染料法的逆转录的反应体系包括4μl5×AMV缓冲液、2μl10mM dNTP混合物（Takara公司）、0.5μl RNase抑制剂（Takara公司）、2μl AMV（Takara公司）以及1.5μl miRNA特异性反向引物一种或几种的混合物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；
b）q-PCR：将cDNA按1/5体积稀释，取0.5μl稀释后的cDNA，加入0.15μl Taq酶（Takara公司），0.5μl20×EVA GREEN，0.1μl10μM正向引物一种，0.1μl10μM通用反向引物，0.6μl25mM MgCl2，0.8μl2.5mM dNTP混合物（Takara公司），1μl10×PCR缓冲液，6.75μl双蒸水，10μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行45个循环。
（4）数据处理与分析
两组样品血清miRNAs的表达量比值可用方程2-ΔCt表示，其中ΔCt＝CT样本-CT内参，在每一个样本提取时加入cel-39的RNA作为参照，计算相对表达量（cel-39：TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG）。
探针法和染料法qRT-PCR结果均发现在30对样本中，有4种miRNAs（miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p和miR-557）在两组间的表达情况存在显著性差异，探针法结果见表1，图1，染料法结果因与探针法类似不再列出。其中，图1显示miRNA的表达情况分布，横轴代表4种miRNA，纵轴代表miRNA的表达水平（以2-ΔCt表示）恶性黑色素瘤与健康对照组相比，miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p和miR-557的表达水平均显著升高（*：P<0.05;**：P<0.001）。
表1前期30对样本人群单因素logistic回归分析结果(以对照组表达值的95％参考值为界值)
实施例4血清/血浆中miRNA的qRT-PCR实验的进一步研究
根据上述结果，将这4种与恶性黑色素瘤发病相关的miRNAs在另外100例恶性黑色素瘤患者与100例年龄匹配的健康对照中进行进一步检测。我们发现miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p和miR-557在恶性黑色素瘤病例组血清中的表达均显著高于对照组(表2、图1)，探针法与染料法结果同样一致。
表2后期100对样本人群单因素logistic回归分析结果(以对照组表达值的95％参考值为界值)
实施例5利用危险度评分方法进一步分析4种miRNA的组合对恶性黑色素瘤发病的诊断
根据上述Real-time PCR结果，本发明通过对2组血浆/血清样品（“恶性黑色素瘤病例组”和“健康对照组”）的miRNAs表达水平的分析，以芯片结果中miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p和miR-557表达量的单侧95％参考值范围为标准，对这4种miRNA进行评分，表达量<95%评分为0分，表达量≥95%评分为1分，以回归系数为权重，进一步求得危险分值，以危险分值的中位数（中位数＝2.816）为界值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这4种miRNAs高表达对恶性黑色素瘤发病的判断能力。对4个标志物的联合分析发现，在前期30例样本人群中，这4种miRNAs以90％的AUC将健康对照组和恶性黑色素瘤病例组分开，最佳临界点的灵敏度为90％，特异度：90％；在后期100例验证样本人群中，这4种miRNAs以95.0％的AUC将健康对照组和恶性黑色素瘤病例组分开，最佳临界点的灵敏度为95.0％，特异度：95.0％（图2以及图3）。运用危险分值的界值在探索性样本人群中错判率为10％（3/30），在验证性样本人群中错判率为5％（5/100）（表3）。其中，图2显示前期30例恶性黑色素瘤病例组对健康人群对照组为参照的ROC曲线，图3显示后期100例恶性黑色素瘤病例组对健康人群对照组为参照的ROC曲线。
表3运用30对样本人群ROC曲线的界值所得的错判比例
因此，证明了采用miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p和miR-557能够很好地将健康对照和恶性黑色素瘤患者区分。
实施例6用于恶性黑色素瘤辅助诊断的miRNA试剂盒的制作
miRNA试剂盒的制作和操作流程是基于Agilent microRNA芯片检测和real-time PCR等技术。试剂盒包括血清/血浆miRNA引物（包括下列引物：miR-610的引物为TGAGCTAAATGTGTGCTGGGA；miR-1224-5p的引物为GTGAGGACTCGGGAGGTGG；miR-125a-3p的引物为ACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCC；miR-557的引物为GTTTGCACGGGTGGGCCTTGTCT，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶、通用反向引物等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的。。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测miRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助诊断恶性黑色素瘤，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。

Claims (7)

1.一种与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物，其特征在于：所述与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物是miR-610、miR-1224-5p、miR-125a-3p以及miR-557的组合。 
2.根据权利要求1所述的标志物在制备黑素瘤辅助诊断试剂盒中的应用。 
3.基于与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物的引物在制备黑素瘤辅助诊断试剂盒中的应用；所述基于与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物的引物是： 
miR-610的正向引物是：5’-TGAGCTAAATGTGTGCTGGGA-3’； 
miR-1224-5p的正向引物是：5’-GTGAGGACTCGGGAGGTGG-3’； 
miR-125a-3p的正向引物是：5’-ACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCC-3’； 
miR-557的正向引物是：5’-GTTTGCACGGGTGGGCCTTGTCT-3’。 
4.基于如权利要求1所述的与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物所形成的黑素瘤辅助诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于检测血浆/血清中循环miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p以及miR-557。 
5.根据权利要求4所述的黑素瘤辅助诊断试剂盒，其特征在于：所述黑素瘤辅助诊断试剂盒含有循环miRNA中miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p以及miR-557的引物。 
6.根据权利要求5所述的黑素瘤辅助诊断试剂盒，其特征在于：所述黑素瘤辅助诊断试剂盒含有循环miRNA中miR-610，miR-1224-5p，miR-125a-3p以及miR-557的引物分别是： 
miR-610的正向引物是：5’-TGAGCTAAATGTGTGCTGGGA-3’； 
miR-1224-5p的正向引物是：5’-GTGAGGACTCGGGAGGTGG-3’； 
miR-125a-3p的正向引物是：5’-ACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCC-3’； 
miR-557的正向引物是：5’-GTTTGCACGGGTGGGCCTTGTCT-3’。 
7.根据权利要求4或5或6所述的黑素瘤辅助诊断试剂盒，其特征在于：所述诊断试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。 
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