CN107502610A - 一种靶向STAT3信号通路miRNA及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向STAT3信号通路miRNA及其制备方法和应用，具体涉及一种靶向抑制STAT3基因的小分子RNA‑miR‑1181及其应用，所述miRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或与其具有至少90％同一性的核苷酸序列。本发明miRNA具有内源性、特异性靶向抑制STAT3(信号转导子和转录激活因子3)信号通路，能够制备抑制由于STAT3介导的信号通路异常激活所引起疾病的药物。

Description

一种靶向STAT3信号通路miRNA及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种靶向STAT3信号通路miRNA及其制备方法和应用，具体涉及一种靶向STAT3信号通路的miRNA-miR-1181及其应用，特别涉及hsa-miR-1182在制备由STAT3介导的信号通路异常激活所引起疾病的药物中的应用。
背景技术
信号转导子和转录激活因子3(STAT3)是细胞内重要的具有信号转导功能和转录活化功能的蛋白，在结构上由6个区域组成：N端氨基酸保守序列、螺旋区、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C端的转录活化区。细胞在接受生长因子、细胞因子等外源信号刺激后，经由酪氨酸激酶相关受体以及酪氨酸激酶JAK等分子的信号传递，从而激活STAT3信号通路，最终作用于细胞核内特异的DNA片段，调控靶基因转录。STAT3信号转导通路与细胞生长、分化和程序性死亡及血管形成密切相关。
大量研究结果表明，STAT3激酶信号通路异常激活，与心力衰竭、心肌梗死、压力负荷导致的心肌肥大、缺血预处理诱导的心肌保护、局部缺血再灌注、高血压及心绞痛等心血管疾病的发生和发展密切相关，极具潜力作为心血管疾病治疗的药物新靶点。此外，该信号通路持续活化还与胃肠道疾病、炎症性疾病、白血病、前列腺、神经系统疾病和各种肿瘤(如肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌)等疾病的形成相关。当前，开发STAT3激酶信号通路的抑制剂已经成为新药研究的热点，然而由于目前很多抑制剂具有生物稳定性差、利用度较低、制备工艺繁琐等缺点，至今还没有针对STAT3信号通路的有效抑制物。
CN 1778918A公开了抑制Stat3基因表达的siRNA及其制备方法，该siRNA表达质粒包括pBS/U6载体；编码特异性抑制Stat3基因表达的siRNA的DNA片段。但该抑制剂利用度交底，生物稳定性较差。
目前研究较多的STAT3激酶信号通路抑制剂还包括肽和拟肽类抑制剂，天然产物类抑制剂以及通过计算机药物虚拟筛选技术发现的小分子抑制剂。
(1)肽和拟肽类抑制剂是以STAT3信号通路上相关分子磷酸化产物的氨基酸残基序列为模板设计的磷酸肽，可阻断STAT3信号通路的传递从而达到抑制效果，但此类抑制剂易在体内代谢失活，且生物利用度较低。(2)天然产物类抑制剂主要包括萜类和黄酮类等天然化学产物，对STAT3信号通路具有抑制作用的天然活性分子，但获取该类生物活性化合物工艺复杂，流程繁琐，且不能特异的对STAT3信号通路进行抑制。(3)通过计算机药物虚拟筛选技术，能够获得一系列对STAT3信号通路具有抑制活性的小分子化合物，但很多筛选的小分子化合物合成较为困难，且很难保持高的生物抑制活性。
因此，现有技术还有待于改进和发展，需研发效果更好的STAT3激酶信号通路抑制剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种靶向STAT3信号通路miRNA及其制备方法和应用，所述miRNA具有内源性、特异性靶向抑制STAT3(信号转导子和转录激活因子3)信号通路，能够制备抑制由于STAT3介导的信号通路异常激活所引起疾病的药物。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种靶向抑制STAT3信号通路的miRNA，所述miRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或与其具有至少90％同一性的核苷酸序列。
所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列如下：5’-CCGUCGCCGCCACCCGAGCCG-3’.
根据本发明，所述miRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明中，通过在人肺动脉平滑肌细胞中过表达本发明miRNA，即miR-1181，可抑制血小板衍生生长因子BB(PDGFBB)对STAT3信号通路的激活或表达；通过细胞功能实验，发现过表达本发明miRNA，即miR-1181可抑制血小板衍生生长因子BB(PDGFBB)激活STAT3信号通路诱导的，人肺动脉平滑肌细胞的异常增殖。
本发明中，所述miRNA的制备方法包括成熟序列全基因合成和克隆表达的方法，所述克隆表达的方法为本领域的常规技术，本领域技术人员可以根据需要采用合适的方法进行构建，在此不作特殊限定。
在一个具体的实施例中，所述miRNA的构建方法包括如下步骤：
(1)设计引物，以人基因组DNA为模板，进行PCR扩增；
(2)将PCR扩增的片段插入plv4/EGFP慢病毒载体的XhoI和EcoRI之间；
(3)将构建的慢病毒载体转染细胞，表达miRNA。
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示；
所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：5’-CCGCTCGAGCGCCCGATGACGCGGAGT-3’；
所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列如下：5’-CCGGAATTCGGTCCCTGGGCAGTATCG-3’.
第二方面，本发明提供如第一方面所述的miRNA在制备用于诊断、预防、治疗或预后评估疾病的药物或试剂盒的用途。
根据本发明，所述疾病为STAT3介导的信号通路异常激活引起的疾病。
根据本发明，所述疾病为心脑血管疾病，胃肠道疾病、炎症性疾病、白血病、前列腺、神经系统疾病或肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述心脑血管疾病包括心肌肥厚、脑缺血再灌注损伤、心力衰竭、心肌梗死、局部缺血再灌注、高血压及动脉粥样硬化等心脑血管疾病；所述肿瘤包括食道癌或卵巢癌等恶性肿瘤。
本发明中的“脑缺血再灌注”是指结扎小鼠冠状动脉左前降支造成心肌缺血一段时间之后，松开结扎线使心肌达到再灌注。
第三方面，本发明提供一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含如第一方面所述的miRNA的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第三方面所述的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述组合物包括如第一方面所述的miRNA。
根据本发明，所述miRNA的有效剂量为10-200mg/kg，例如可以是10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、120mg/kg、130mg/kg、150mg/kg、160mg/kg、180mg/kg或200mg/kg。
根据本发明，所述药物组合物还包括药学上可接受的病毒、载体或辅料中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，包括药学上可接受的病毒、载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体或纳米颗粒等。
第六方面，本发明提供一种用于诊断和/或预后评估疾病的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的miRNA和/或用于特异性检测miRNA的探针或引物。
根据本发明，所述探针或引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示；
所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：5’-CCGCTCGAGCGCCCGATGACGCGGAGT-3’；
所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列如下：5’-CCGGAATTCGGTCCCTGGGCAGTATCG-3’.
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明发现小miRNA以STAT3为靶点，通过抑制STAT3分子的表达从而抑制该信号通路的活性，可作为一种新的STAT3激酶抑制剂用于治疗由STAT3激酶信号通路异常激活所引起的疾病；
(2)本发明的miRNA是人体内源性miRNA，对人体的毒性较小，能够较好的被人体利用，可通过静脉注射导入人体内，通过血液循环运输到特定部位，从而达到治疗目的；
(3)本发明的miRNA可作为一种新的STAT3激酶信号通路抑制剂用于治疗心血管疾病，胃肠道疾病、炎症性疾病、前列腺、神经系统疾病和恶性肿瘤等；
(4)本发明的miRNA制备方法简单，既可以采用全基因合成也可以采用克隆表达，制备得到的miRNA可通过静脉注射导入人体内，通过血液循环运输到特定的部位，从而起到相应的抑制效果。
附图说明
图1A为miR-1181与STAT3的3’-UTR结合位点；
图1B为过表达miR-1181对STAT3-UTR或STAT3-UTR-mut荧光素酶活性的影响，其中，STAT3-UTR-mut为基于结合位点构建3’-UTR的突变载体；
图1C为过表达miR-1181对人肺动脉平滑肌细胞STAT3总蛋白表达影响，其中，Mimic Ctrl为化学合成的miR-1181类似物；
图1D为过表达miR-1181对PDGFBB刺激人肺动脉平滑肌细胞后，磷酸化激活状态STAT3蛋白表达影响，其中，Mimic Ctrl为化学合成的结构相似但无意义的序列，MimicCtrl-1未用PDGF处理，Mimic Ctrl-2用PDGF处理；
图2A为EdU检测PDGFBB刺激人肺动脉平滑肌细胞后，过表达miR-1181对细胞增殖影响的典型荧光图片，其中，Mimic Ctrl为化学合成的结构相似但无意义的序列，MimicCtrl-1未用PDGF处理，Mimic Ctrl-2用PDGF处理；
图2B为EdU检测PDGFBB刺激人肺动脉平滑肌细胞后，过表达miR-1181对细胞增殖影响的统计结果，其中，Mimic Ctrl为化学合成的结构相似但无意义的序列，Mimic Ctrl-1未用PDGF处理，Mimic Ctrl-2用PDGF处理；
图2C为PDGFBB刺激人肺动脉平滑肌细胞后，过表达miR-1181对PCNA蛋白表达的影响，其中，Mimic Ctrl为化学合成的结构相似但无意义的序列，Mimic Ctrl-1未用PDGF处理，Mimic Ctrl-2用PDGF处理。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
除非特别说明，以下实施例中所采用的各种原料均来源于市售，所采用的方法均为常规技术手段。
实施例1 miRNA miR-1181的制备
miR-1181的成熟序列为5’-CCGUCGCCGCCACCCGAGCCG-3’(22bp，SEQ ID NO.1)可通过以下方式制得：
1)化学合成
miR-1181的类似物(miR-1181mimic)有广州瑞博生物科技有限公司合成，为双链RNA，能模拟内源性成熟miR-1181高水平表达；标准纯化，于-20℃保存。用无RNA酶的水溶解配置成20M的储存液，置于-80℃备用，使用时稀释成所需浓度。
2)病毒载体介导的miR-1181的表达
(1)在miRBase(http://www.mirbase.org/)数据库中得到miR-1181的成熟序列和前体序列(pre-miRNA)信息。在人基因组数据库中找到成熟序列两个约300bp的侧翼序列，依据侧翼序列设计引物，并分别加上XhoI和EcoRI的酶切位点和保护碱基，设计引物：
上游引物5’-CCGCTCGAGCGCCC GATGACGCGGAGT-3’(SEQ ID NO.2)；
下游引物的序列为5’-CCGGAATTCGGTCCCTGGGCAGTATCG-3’(SEQ ID NO.3)；
(2)以人基因组DNA为模板，通过设计的引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃变性2分钟，95℃30秒，55℃30秒，72℃40秒进行35个循环，72℃延伸3分钟；
(3)将扩增的PCR产物琼脂糖凝胶调用后，用胶回收试剂盒(E.Z.N.A GelExtraction Kit，Omgega)进行片段回收，用限制性内切酶XhoI和EcoRI(NEB)进行双酶切，将酶切后的PCR片段按DNA纯化试剂盒(E.Z.N.A Cycle-Pure Kit，Omgega)说明进行回收后作为插入片段，插入PLV4/EGFP慢病毒载体中；载体以限制性内切酶XhoI和EcoRI NEB)进行双酶切后进行回收、纯化作为载体片段；
(4)将插入片段与载体片段利用T4连接酶(Promega)与16℃连接2h，然后将连接产物转化至大肠杆菌感受态STBL3，37℃过夜培养后挑取生长良好的单菌落在含有载体相应抗生素的LB培养基中扩增，提取质粒后进行测序验证；
(5)制得的DNA载体可转染入细胞，瞬时表达miRNA，即miR-1181。
制得的慢病毒载体可用于慢病毒包装，步骤如下所述：
(1’)慢病毒包装所需细胞系为HEK293T细胞系，所需质粒包括慢病毒表达载体pLVX-miR-1181和慢病毒包装质粒。细胞转染采用常规磷酸钙转染方法，用2M CaCl2与质粒混匀，然后逐滴加入2×HBS溶液并轻摇混匀，最后将混合溶液缓慢均匀加入细胞培养液中。转染12小时后更换培养液；
(2’)转染48-72小时后，收集含有病毒颗粒的细胞培养液，4000rpm室温离心10分钟，收集上清液并分装置于-80℃备用；
(3’)包装好的慢病毒可用于感染所选的细胞，通过抗生素嘌呤霉素筛选后获得可稳定过表达miR-1181的细胞。
实施例2 miR-1181靶向抑制STAT3分子及其信号通路
(1)细胞培养：HEK293A细胞(购自ATCC，Manassas，VA)，用含10％胎牛血清的DMEN培养基培养，收集生长状态良好的细胞，以6×104/孔接种于24孔板内，37℃，5％CO2培养24小时；
(2)人肺动脉平滑肌细胞购自Lonza(Walkersville,MD)，于含有5％血清的SMCM完全培养基中培养，收集生长状态良好的细胞，离心技术，以6×105接种于60mm皿内，37℃，5％CO2培养24小时；
(3)转染：待细胞密度达70％时用磷酸钙法转染细胞，共转染CSTAT3的3’-UTR双荧光素酶报告载体或突变的3’-UTR双荧光素酶报告载体，miR-1181过表达载体pLVX-CMV-miR-1181或pLVX-CMV-control，转染两天后，移去培养液，PBS清晰两次后用50μL 1×裂解液裂解细胞；
(4)将化学合成的miR-1181类似物(mimic)用于过表达或抑制miR-1181的表达，以cel-miR-67作为阴性对照，均购自广州瑞博生物。将细胞种于培养皿中，当细胞密度达到70％时，通过Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染，转染6小时后更换培养基，继续培养24小时用于实验；
荧光素酶检测
利用双荧光素酶检测(E1810,Promega)试剂盒参考说明书进行荧光素酶活性检测，用萤火虫荧光素酶数值除以内参海肾荧光素酶读值，即可得到校正的荧光素酶活性数值。将CSTAT3的3’-UTR载体的荧光素酶活性数值与对照组进行比较。
所述miR-1181与STAT3的3’-UTR结合位点如图1A所示，荧光霉素检测结果如图1B所示，与对照相比，过表达miR-1181组的STAT3荧光素酶活性显著降低，说明miR-1181可能与STAT3的3’-UTR能够靶向结合；基于结合位点构建3’-UTR的突变载体STAT3-UTR-mut，利用突变体载体再次进行双荧光素酶活性检测，与野生型UTR相比，STAT3结合位点的突变引起荧光素酶活性的恢复。
蛋白杂交检测
收集细胞总蛋白，经蛋白定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用STAT3蛋白抗体检测STAT3表达，如图1C所示，与对照相比，过表达miR-1181可抑制人肺动脉平滑肌细胞内源性STAT3的表达；利用STAT3磷酸化抗体检测磷酸化STAT3，与对照相比(Ctrl-1为PDGF未处理表示细胞功能正常状态，Ctrl-2为PDGF处理表示细胞功能异常状态)，如图1D所示，过表达miR-1181可显著抑制STAT3的磷酸化。
本实施例结果表明：miR-1181通过靶向STAT3的3’-UTR抑制STAT3的表达以及STAT3激酶信号通路。
实施例3 miR-1181抑制血小板衍生生长因子BB(PDGFBB)诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖。
为探讨miR-1181对血小板衍生生长因子BB(PDGFBB)激活STAT3信号通路，从而引起人肺动脉平滑肌细胞功能异常的调控作用：用表达miR-1181的慢病毒感染来提高人肺动脉平滑肌细胞中的miR-1181的水平，然后通过细胞增殖标志蛋白PCNA和EdU细胞增殖检测确定细胞的增殖水平。
使用EdU细胞增殖检测试剂盒(锐博生物)进行EdU标记，根据试剂盒说明书进行实验操作，主要步骤如下：1)细胞转染：接种1×104个细胞于48孔板，培养24h后进行转染实验，第二天培养24h后用无血清培养基进行饥饿处理，然后加入血小板衍生生长因子BB(PDGFBB)以及20μM EdU继续4小时；2)细胞染色拍照：将细胞用4％多聚甲醛室温固定30分钟，0.5％Triton X-100进行膜通透10分钟，PBS清洗，然后每孔加入150μL 1×Apollo染色也孵育30分钟，DNA用1×Hochest(每孔150μL)染色5分钟，在荧光显微镜下拍照。
结果如图2A、图2B和图2C所示，从图2A和图2B可见，在PDGFBB刺激下，与对照相比(Ctrl-1为PDGF未处理表示细胞功能正常状态，Ctrl-2为PDGF处理表示细胞功能异常状态)，过表达miR-1181分别是人肺动脉平滑肌细胞增殖下降30％；从图2C可见，过表达miR-1181还使人肺动脉平滑肌增殖标记蛋白PCNA表达下调33％；说明miR-1181对生长因子引起的肺动脉平滑肌细胞增殖具有明显的抑制作用。
综上所述，本发明发现小miRNA以STAT3为靶点，通过抑制STAT3分子的表达从而抑制该信号通路的活性，可作为一种新的STAT3激酶抑制剂用于治疗由STAT3激酶信号通路异常激活所引起的疾病。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 一种靶向STAT3信号通路miRNA及其制备方法和应用
<130> 2017
<141> 2017-09-13
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工合成序列()
<400> 1
ccgucgccgc cacccgagcc g 21
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 2
ccgctcgagc gcccgatgac gcggagt 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 3
ccggaattcg gtccctgggc agtatcg 27

Claims (10)

1.一种靶向STAT3信号通路的miRNA，其特征在于，所述miRNA的核苷酸序列为SEQ IDNO.1或与其具有至少90％同一性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的miRNA在制备用于诊断、预防、治疗或预后评估疾病的药物或试剂盒的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述疾病为STAT3介导的信号通路异常激活引起的疾病；
优选地，所述疾病为心脑血管疾病，胃肠道疾病、炎症性疾病、白血病、前列腺、神经系统疾病或肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
5.一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包含如权利要求1或2所述的miRNA的核苷酸序列。
6.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求5所述的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1或2所述的miRNA。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述miRNA的有效剂量为10-200mg/kg；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的病毒、载体或辅料中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种用于诊断和/或预后评估疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的miRNA和/或用于特异性检测miRNA的探针或引物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述探针或引物的核苷酸序列如SEQID NO.2-3所示。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110853706A (zh) * 2018-08-01 2020-02-28 中国科学院深圳先进技术研究院 一种整合表观遗传组学的肿瘤克隆组成构建方法及系统
CN116077491A (zh) * 2023-02-21 2023-05-09 中山大学 一种喹啉类snx3抑制剂在制备抗心力衰竭组合物中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642914B (zh) * 2013-11-29 2015-02-25 中国人民解放军第四军医大学 与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用
CN106609301B (zh) * 2015-10-26 2019-10-25 北京大学人民医院 一种辅助诊断1型糖尿病的试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S SUBRAMANIAN.ET AL: "MicroRNA expression signature of human sarcomas", 《ONCOGENE 》 *
李永光等: "STAT3在血管平滑肌细胞中的作用及其机制的最新进展", 《上海医学》 *
王杰等: "miRNA-1181通过抑制STAT3影响人胰腺癌细胞的侵袭转移能力", 《贵州医科大学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110853706A (zh) * 2018-08-01 2020-02-28 中国科学院深圳先进技术研究院 一种整合表观遗传组学的肿瘤克隆组成构建方法及系统
CN110853706B (zh) * 2018-08-01 2022-07-22 中国科学院深圳先进技术研究院 一种整合表观遗传组学的肿瘤克隆组成构建方法及系统
CN116077491A (zh) * 2023-02-21 2023-05-09 中山大学 一种喹啉类snx3抑制剂在制备抗心力衰竭组合物中的应用
CN116077491B (zh) * 2023-02-21 2024-02-02 中山大学 化合物在制备snx3表达抑制剂中的应用

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