CN106609301B - 一种辅助诊断1型糖尿病的试剂盒 - Google Patents

一种辅助诊断1型糖尿病的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒。本发明所提供的辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒包括用于检测hsa‑miR‑1181的产品；所述hsa‑miR‑1181的序列如序列表中序列1所示。实验证明，本发明提供的试剂盒可以辅助诊断1型糖尿病，利用miRNA分子标记物hsa‑miR‑1181可以辅助诊断1型糖尿病，具有良好的灵敏度和特异性，miRNA分子标记物hsa‑miR‑1181用于指导临床进行糖尿病分型具有重要价值，对于1型糖尿病的诊断和治疗具有重大价值。

Description

一种辅助诊断1型糖尿病的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种辅助诊断1型糖尿病的试剂盒。
背景技术
1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，胰岛B细胞受到免疫性损伤，导致机体胰岛素分泌功能的下降，使葡萄糖不能被摄取和利用，出现以血糖升高为特征的代谢性紊乱，严重者导致酮症酸中毒，甚至死亡。患者需要长期注射胰岛素来维持生命。长期的高血糖，如果得不到满意的控制，将会导致肾脏、视网膜、神经和心血管系统的损伤，这些慢性并发症是1型糖尿病患者主要的致残和致死原因。
目前1型糖尿病的诊断主要依据患者的临床特征。1型糖尿病常发病早，有酮症酸中毒或自发性酮症病史，血清胰岛素和C肽水平低，不伴有肥胖等代谢综合征的表现，口服降糖药物疗效差，需要依赖胰岛素治疗。利用自身抗体检测有助于1型糖尿病诊断，包括胰岛细胞抗体、谷氨酸脱羧酶抗体和胰岛素抗体等，但不是所有的患者均能检测到这些自身抗体，且随着病程的延长，抗体滴度逐渐下降，直到不能测出。而且从检测技术上看，目前大多数临床医院采用酶联免疫法，仍存在假阳性和假阴性可能。另外，某些1型糖尿病，像成人隐匿性免疫性糖尿病，临床表现与非肥胖胰岛素缺陷为主要特征的2型糖尿病(非肥胖伴低胰岛素的2型糖尿病)非常相似，这些2型糖尿病缺乏代谢综合征各个组分的特征(如肥胖)，临床鉴别诊断难度很大，尤其在1型糖尿病相关抗体检测阴性的患者。因此，找到一种新的生物标志物用于指导临床进行糖尿病分型具有重要价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何辅助诊断1型糖尿病。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种辅助诊断1型糖尿病的试剂盒。
本发明所提供的辅助诊断1型糖尿病的试剂盒包括用于检测hsa-miR-1181的产品；所述hsa-miR-1181的序列如序列表中序列1所示。
所述试剂盒还可包括外参miRNA和用于检测所述外参miRNA的产品。
所述试剂盒还可包括miRNA检测外参和用于检测miRNA检测外参的产品。
所述试剂盒还可包括记载有如下判断标准的载体：如果待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量为0.00131以下、待测者为或疑似为1型糖尿病患者，如果待测者血清中hsa-miR-1181的相对表达量大于0.00131、待测患者不为或疑似不为1型糖尿病患者。所述相对表达量具体可为所述hsa-miR-1181相对所述cel-mir-39的表达量。
所述试剂盒还可包括记载有如下操作步骤和判断标准的载体：
(b1)检测待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量；
(b2)根据已诊断为1型糖尿病的患者人群血清中和已诊断为非肥胖伴低胰岛素的2型糖尿病的患者人群血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量做受试者工作特征曲线，约登指数最大点对应的临界值作为阈值；
如果所述(b1)中待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量为所述阈值以下、待测者为或疑似为1型糖尿病患者；如果所述(b1)中待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量大于所述阈值、待测者不为或疑似不为1型糖尿病患者。
用于检测所述hsa-miR-1181的产品在制备辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒中应用也属于本发明的保护范围；所述hsa-miR-1181的序列如序列表中序列1所示。
用于检测hsa-miR-1181的产品、外参miRNA和用于检测所述外参miRNA的产品在制备辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒中应用也属于本发明的保护范围；所述hsa-miR-1181的序列如序列表中序列1所示。
用于检测hsa-miR-1181的产品、外参miRNA、用于检测所述外参miRNA的产品和记载有判断标准的载体甲在制备辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒中应用也属于本发明的保护范围；所述hsa-miR-1181的序列如序列表中序列1所示；
用于检测hsa-miR-1181的产品、外参miRNA、用于检测所述外参miRNA的产品、记载有判断标准的载体甲、和、记载有操作步骤和判断标准的载体乙在制备辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒中应用也属于本发明的保护范围；所述hsa-miR-1181的序列如序列表中序列1所示；
所述载体甲中记载的判断标准可如下：如果待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量为0.00131以下、待测者为或疑似为1型糖尿病患者，如果待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量大于0.00131、待测患者不为或疑似不为1型糖尿病患者；
所述载体乙中记载的操作步骤和判断标准可如下：
(b1)检测待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量；
(b2)根据已诊断为1型糖尿病的患者人群血清中和已诊断为非肥胖伴低胰岛素的2型糖尿病的患者人群血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量做受试者工作特征曲线，约登指数最大点对应的临界值作为阈值；如果所述(b1)中待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量为所述阈值以下、待测者为或疑似为1型糖尿病患者；如果所述(b1)中待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量大于所述阈值、待测者不为或疑似不为1型糖尿病患者。
在本发明中所述1型糖尿病的患者人群具体为28个1型糖尿病患者组成的人群。
在本发明中所述非肥胖伴低胰岛素的2型糖尿病的患者人群的患者人群具体为21个非肥胖伴低胰岛素的2型糖尿病患者组成的人群。
上述任一所述用于检测hsa-miR-1181的产品可为检测hsa-miR-1181的表达量的产品或检测hsa-miR-1181相对表达量的产品。
上述任一所述相对表达量具体可为所述hsa-miR-1181相对所述cel-mir-39的表达量。
上述任一所述用于检测hsa-miR-1181的产品可为引物或探针。所述用于检测所述hsa-miR-1181的产品具体可为天根生化科技(北京)有限公司货号为CR201-t1的产品。
上述任一所述外参miRNA具体可为cel-mir-39，即序列表中序列2所示miRNA。
上述任一所述miRNA检测外参可为天根生化科技(北京)有限公司生产的货号为CR100-01的产品。
上述任一所述用于检测miRNA检测外参的产品可为天根生化科技(北京)有限公司生产的货号为CR201-t2的产品。
实验证明，本发明提供的试剂盒可以辅助诊断1型糖尿病。利用miRNA分子标记物hsa-miR-1181可以辅助诊断1型糖尿病，具有良好的灵敏度和特异性，miRNA分子标记物hsa-miR-1181用于指导临床进行糖尿病分型具有重要价值，对于1型糖尿病的诊断和治疗具有重大价值。
附图说明
图1为荧光定量PCR检测hsa-miR-1181的熔解曲线。
图2为1型糖尿病组、非肥胖伴低胰岛素组和正常对照组的血清中hsa-miR-1181的相对表达量。
图3为1型糖尿病组与非肥胖伴低胰岛素组的血清中hsa-miR-1181表达量的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的各个试验均是在各受试者知情同意的前提下进行的。
下述实施例中所涉及的名词解释：
受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)：是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以灵敏度(真阳性率)为纵坐标，1-特异性为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。
“灵敏度”即真阳性率：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想值为100％。
“特异性”即真阴性率：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异性越大越好，理想值为100％。
下述实施例中的miRNeasy Min Kit为德国QIAGEN公司的产品，货号为217004；miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒均为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号分别为KR201-02和FP401；荧光定量PCR仪为ABI公司的产品，型号为VIIA7。
用41μl RNase-Free ddH2O溶解miRNA检测外参(天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CR100-01；miRNA检测外参即cel-mir-39，其序列如序列表中序列2所示)，获得浓度为100μM的外参贮存液。将外参贮存液用RNase-Free ddH2O稀释100倍，称为1μM的外参工作液。
实施例1、利用miRNA分子标记物hsa-miR-1181辅助诊断1型糖尿病
一、样本
1、正常对照组：以无糖尿病和其他疾病史、无药物服用史的入组人群、均完成口服葡萄糖耐量实验(OGTT实验)后确诊的45例正常人作为正常对照组(BMI<24kg/m2；腰围<85cm(男)和<80cm(女)；血压正常(平均收缩压＜140mmHg，平均舒张压＜90mmHg)；空腹血浆血糖＜6.1mmol/L，4.0mmol/L＜2小时血浆血糖＜7.8mmol/L；糖化血红蛋白＜6.0％；血清谷丙转氨酶<40U/L，血清谷草转氨酶<40U/L；血清肌酐＜100μmol/L；血清尿酸＜428μmol/L；总胆固醇＜6.2mmol/L，甘油三酯＜1.7mmol/L，低密度脂蛋白胆固醇＜4.1mmol/L，高密度脂蛋白胆固醇≥0.9mmol/L(男)或≥1.0mmoI/L(女)；尿白蛋白比肌酐＜30mg/g；空腹血清胰岛素水平在我科既往流调人群(平谷代谢性疾病研究队列基线人群，剔除糖尿病和缺失值后血糖正常3102人)中空腹胰岛素水平的25％分位值(P25％)＝5.49μIU/ml与75％分位(P75％)值＝12.06μIU/ml之间)。
2、1型糖尿病组：以2012年6月至2013年12月间招募的居住在北京确诊为1型糖尿病患者的受试者28例作为1型糖尿病组。
3、非肥胖伴低胰岛素组：以非肥胖伴低胰岛素的2型糖尿病患者的受试者21例作为非肥胖伴低胰岛素的2型糖尿病组(BMI<24kg/m2；腰围<85cm(男)和<80cm(女)；FPG≥7mmol/l或者PPG≥11.1mmol/l；HDL>1mmol/l；空腹血清胰岛素水平<正常人群P25％＝5.49μIU/ml)。以下简称非肥胖伴低胰岛素组。
以上三组样本的血清均由北京大学人民医院提供。
二、miRNA的提取和逆转录
1、miRNA的提取
用miRNeasy Min Kit提取样本血清中的miRNA，具体步骤如下：
(1)取EP管，加入样本血清200μl，加入700μl QIAZOL，涡旋混匀，室温放置5min。再加1μl的外参工作液。
(2)完成步骤(1)后，取EP管，加入140μl氯仿，涡旋混匀15s，室温静置3min，4℃、12000rpm离心15min。
(3)完成步骤(2)后，小心吸取500μl上清到新的1.5ml离心管中，加入750μl的无水乙醇，涡旋混匀。
(4)完成步骤(3)后，转移至离心柱(最大体积700μl)中，12000rpm离心30s。
(5)完成步骤(4)后，向离心柱中加入700μl Buffer RWT，室温、12000rpm离心15s，弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中。
(6)完成步骤(5)后，向离心柱中加入500μl Buffer RPE，室温、12000rpm离心15s，弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中，空柱离心1min。
(7)完成步骤(6)后，将离心柱放置到新的收集管中，在柱底部滤过膜中心加25μlRNase-free ddH2O，室温、20000rpm离心1min。
(8)完成步骤(7)后，收集管中的液体即为提取的含有miRNA的Total RNA，利用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific公司产品)测定浓度及OD260/OD280。
QIAZOL、离心柱、Buffer RWT、Buffer RPE和RNase-free ddH2O均为miRNeasy MinKit中的组件。
2、miRNA的逆转录
用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒对步骤一提取的miRNA进行逆转录，具体步骤如下：
(1)miRNA 3'末端加Poly(A)处理：冰上预冷RNase Free的反应管，然后加入表1中的试剂至总体积20μl(最后加入E.coli Poly(A)Polymerase)，用移液器轻轻混匀，短暂离心后37℃反应60min，得到反应液。E.coli Poly(A)Polymerase、10×Poly(A)PolymeraseBuffer和5×rATP Solution均为miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒中的组件。
表1.miRNA 3'末端加Poly(A)处理的试剂
试剂组分 体积
步骤1提取的Total RNA 6μl
E.coli Poly(A)Polymerase(5U/μl) 0.4μl
10×Poly(A)Polymerase Buffer 2μl
5×rATP Solution 4μl
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 7.6μl
Total volume 20μl
(2)Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应：按照表2中的试剂组分配制反应液，移液器轻轻混匀，短暂离心后37℃反应60min，得到cDNA反应液，用cDNA反应液进行荧光定量检测。10×RT Primer、10×RT Buffer、Super Pure dNTPs、RNasin和Quant RTase均为miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒中的组件。
表2.Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应的试剂
试剂组分 体积
步骤(1)获得的反应液 4μl
10×RT Primer(10μM) 2μl
10×RT Buffer 2μl
Super Pure dNTPs(2.5mM each) 1μl
RNasin(40U/μl) 1μl
Quant RTase 0.5μl
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 9.5μl
Total volume 20μl
三、荧光定量PCR检测
每个样本设置3个平行孔，用miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒进行荧光定量PCR，具体步骤如下：
(1)室温融化2×miRcute miRNA premix和Reverse primer。
(2)使用前将2×miRcute miRNA premix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并轻轻离心后使用。
(3)将试剂置于冰上，并按表3配制反应体系。混匀后，进行荧光定量PCR。反应程序为：94℃2min；94℃20s，64℃30s，5个循环；72℃34s；94℃20s，60℃34s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s，1个循环。
2×miRcute miRNA premix(含SYBR和ROX)和Reverse primer为miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒中的组件；鉴定hsa-miR-1181的试剂为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CR201-t1；鉴定外参cel-mir-39的试剂为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CR201-t2。
表3.荧光定量PCR反应试剂
试剂组分 体积
2×miRcute miRNA premix(含SYBR和ROX) 5μl
Reverse primer(10μM) 0.2μl
Forward primer(10μM) 0.2μl
miRNA第一链cDNA 1μl
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 3.6μl
Total volume 10μl
通过荧光定量PCR检测样本血清中hsa-miR-1181的相对表达量(以cel-mir-39基因为外参)。每个样本血清中hsa-miR-1181的相对表达水平根据ΔCt计算，ΔCt＝Ct(hsa-miR-1181)-Ct(cel-miR-39)，ΔΔCt＝ΔCt实验组(ΔCt1型糖尿病组或ΔCt非肥胖伴低胰岛素组)－ΔCt正常对照组，相对表达量＝2-ΔΔCt，以公式2-ΔΔCt来计算每个样本血清hsa-miR-1181相对表达水平。
结果表明(图1)，荧光定量PCR扩增的扩增曲线光滑，且熔解曲线为单一尖锐的荧光峰(Tm＝80℃)，表明，PCR扩增产物为特异性的PCR产物。各个样本血清中的hsa-miR-1181的相对表达量见表4，各组样本血清中的hsa-miR-1181的相对表达量见表5和图2，各组样本血清中的hsa-miR-1181的相对表达量比较结果见表6。结果表明，非肥胖伴低胰岛素组和1型糖尿病组的血清中hsa-miR-1181的表达量有明显差异。
以非肥胖伴低胰岛素组的血清中hsa-miR-1181的表达量为对照，根据1型糖尿病组的血清中hsa-miR-1181的表达量用SPSS 16.0软件进行ROC曲线分析，实验结果见图3。结果表明，ROC曲线下的面积(AUC)是0.794，表明在1型糖尿病组的血清中hsa-miR-1181的表达量可以准确的对1型糖尿病进行预测。ROC曲线上的最优值即为阈值，综合考虑敏感性和特异性，是指在特异性最大的基础上灵敏度尽可能的大。基于这个方法，ROC曲线的最优值为0.00131，即阈值为0.00131。在这一节点上，hsa-miR-1181的表达量显示出81％的灵敏度和75％的特异性，95％的阳性预测值(置信区间为0.664-0.924)。可见利用miRNA分子标记物hsa-miR-1181可以辅助诊断1型糖尿病。
表4.各个样本血清中hsa-miR-1181的相对表达量
表5.各组样本血清中hsa-miR-1181的相对表达量
分组 hsa-miR-1181相对表达量
正常对照组(n＝45) 0.03006(0.00110，0.74785)
非肥胖伴低胰岛素组(n＝21) 0.00321(0.00142，0.03628)
1型糖尿病组(n＝28) 0.00072(0.00031，0.00140)
注：相对表达量按中位数(25％分位数，75分位数)表示；NOB：非肥胖胰岛素缺陷T2DM。
表6.各组样本血清中的hsa-miR-1181的相对表达量比较
不同组别比较 p 表达方向
非肥胖伴低胰岛素组vs.正常对照组 0.012 下调
1型糖尿病组vs.正常对照组 0.001 下调
非肥胖伴低胰岛素组vs.1型糖尿病组 0.000 上调

Claims (5)

1.用于检测hsa-miR-1181的产品在制备辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒中应用；所述hsa-miR-1181的序列如序列表中序列1所示。
2.用于检测hsa-miR-1181的产品、外参miRNA和用于检测所述外参miRNA的产品在制备辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒中应用；所述hsa-miR-1181的序列如序列表中序列1所示。
3.用于检测hsa-miR-1181的产品、外参miRNA、用于检测用于所述外参miRNA的产品和记载有判断标准的载体甲在制备辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒中应用；所述hsa-miR-1181的序列如序列表中序列1所示；
所述载体甲中记载的判断标准如下：如果待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量为0.00131以下，待测者为或疑似为1型糖尿病患者；如果待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量大于0.00131，待测患者不为或疑似不为1型糖尿病患者。
4.用于检测hsa-miR-1181的产品、外参miRNA、用于检测用于所述外参miRNA的产品、记载有判断标准的载体甲和记载有操作步骤及判断标准的载体乙在制备辅助诊断1型糖尿病患者的试剂盒中应用；所述hsa-miR-1181的序列如序列表中序列1所示；
所述载体甲中记载的判断标准如下：如果待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量为0.00131以下，待测者为或疑似为1型糖尿病患者；如果待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量大于0.00131，待测患者不为或疑似不为1型糖尿病患者；
所述载体乙中记载的操作步骤和判断标准如下：
（a1）检测待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量；
（a2）根据已诊断为1型糖尿病的人群血清中和已诊断为非肥胖伴低胰岛素的2型糖尿病的患者人群血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量做受试者工作特征曲线，约登指数最大点对应的临界值作为阈值；
如果所述（a1）中待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量为所述阈值以下，待测者为或疑似为1型糖尿病患者；如果所述（a1）中待测者血清中所述hsa-miR-1181的相对表达量大于所述阈值，待测者不为或疑似不为1型糖尿病患者。
5.如权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述用于检测hsa-miR-1181的产品为检测hsa-miR-1181的表达量的产品或检测hsa-miR-1181相对表达量的产品。
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