CN107385035B - 与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 - Google Patents
与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107385035B CN107385035B CN201710584620.8A CN201710584620A CN107385035B CN 107385035 B CN107385035 B CN 107385035B CN 201710584620 A CN201710584620 A CN 201710584620A CN 107385035 B CN107385035 B CN 107385035B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- hsa
- mirna
- diabetic retinopathy
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Abstract
本发明提供了一种与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物和应用。本发明与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物为hsa‑let‑7a‑5p、hsa‑miR‑novel‑chr5_15976、hsa‑miR‑28‑3p、has‑miR‑20a‑5p、has‑miR‑151a‑5p、has‑miR‑148a‑3p和has‑miR‑223‑3p中的一种或两种以上的组合。本发明miRNA作为2型糖尿病视网膜病变诊断标记物，且稳定，可在早期对糖尿病患者是否合并DR进行辅助诊断，可以对糖尿病视网膜病变患者疾病进展的动态监测。其能够在制备2型糖尿病及其糖尿病视网膜变性早期诊断产品中应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及一种与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标记物及其应用。
背景技术
糖尿病是一种以血糖升高为特征、以胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足为病理生理基础的代谢紊乱性疾病，因其发病率高、并发症多、严重影响患者生存质量和增加社会医疗支出而成为各个国家和政府重点防治的慢性重大疾病。在临床上糖尿病分为1型糖尿病和2型糖尿病；其中2型糖尿病占糖尿病患者90%以上。根据2007-2009年全国流行病学调查显示，我国20岁以上人口中糖尿病总患病率已高达9.7%。更为触目惊心的是，2010年全国糖尿病流行病学调查显示，糖尿病患病率已升高至11.6%，糖尿病前期的患病率高达50.1%。纵观我国历年的糖尿病流行病学资料，我国糖尿病发病率随着我国经济发展而快速增长。由于糖尿病治疗手段不断进步，新的降糖药物不断涌现，糖尿病患者的寿命得到有效延长，因而产生大量长病程的糖尿病患者，这部分患者是糖尿病各种慢性并发症的主要人群。由于现有的糖尿病人群数目庞大，给我国以及世界各国的医疗资源带来沉重的负担，糖尿病慢性并发症的防治已经成为刻不容缓的公共卫生问题。
糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy, DR）是一种特征性的糖尿病慢性并发症，是中老年人群失明致盲的主要原因。根据一项大型meta分析显示，我国糖尿病人群中DR发病率为23%，非增殖型DR（non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR）为19.1%，增殖型DR（proliferative diabetic retinopathy, PDR）为2.8%。而美国成人糖尿病患者DR发病率在40%以上。
DR根据其临床表现分为2型6期，即增殖型（PDR）和非增殖型（NPDR），I-III期为NPDR，属于早期DR；IV-VI期为PDR，属于晚期DR。两型的划分以新生血管的出现为界。DR的发病机制尚未完全明了。主要的病理改变有毛细血管外周细胞的减少、内皮细胞增生、基底膜增厚。这些改变导致毛细血管管腔狭窄、血流阻力升高、毛细血管壁膨隆形成微血管瘤。加上糖尿病患者血流粘滞度高、血小板容易聚集，因而容易导致毛细血管闭塞、视网膜缺血无血流灌注、血-视网膜屏障破坏；视网膜毛细血管通透性增加、渗出，新生血管形成、玻璃体出血、纤维组织形成及牵拉、视网膜剥离而致失明。早期DR缺乏特异性临床症状，而目前DR临床诊断主要根据1985年的诊断标准，通过眼底检查明确。但是，当眼底照相或荧光造影确诊时往往眼底已经发生不可逆的病理改变，致使患者失去早期诊断和防治的机会。因此，积极寻找DR的早期诊断和预测的因子是当前糖尿病视网膜病变防治中重大而迫切的课题。
目前糖尿病视网膜病变的临床诊断主要依赖形态学（眼底照相与眼底荧光血管造影）指标。但是，形态学的改变往往反映的是病理变化的终点而不是起点，因此形态学指标并不具有早期诊断价值；另外，形态学改变的发现并不能解释病变的机理，因而也很难为新治疗药物的研发提供有价值的信息。为了能从分子水平上筛选出早期DR病人，为更合理有效的个体化治疗提供依据，近年来，许多学者从分子水平对与DR发病有关的分子标记物进行了大量研究，发现了一些对分期和诊断有一定价值的分子标记物，包括血管内皮生长因子（VEGF），血小板生长因子，成纤维细胞生长因子，肿瘤坏死因子，生长激素，以及CRP等。但总的来说，这些分子标记物的敏感性和特异性较低，而且类似的研究结果常常大相径庭。至今尚无一种分子标记物或分子指标系统能在临床上应用于DR的早期诊断和分子分期。
微小RNA （microRNA, miRNA）是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分子，能够在转录后水平调控基因的表达。大量的研究表明，miRNA 调控紊乱可影响细胞的代谢，分化、增殖、凋亡等生物学过程中并导致各种疾病的发生发展。研究表明，miRNA与胰岛的发育、胰岛素的分泌、以及血糖调控过程密切相关。在胰岛B细胞的发育过程中，miRNAs缺失可导致Notch 信号通路功能失调，胰岛细胞死亡。胰岛B细胞中miR-375的过度表达可导致胰岛B细胞数量减少并抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌；相反，抑制内源性miR-375的功能则增强胰岛素分泌。miR-375基因敲除后胰腺细胞数量增加，血浆胰岛素水平上。葡萄糖刺激能够改变B细胞中miRNA水平。Tang等的研究筛查出了61种受葡萄糖调节的miRNA；当血糖升高时，绝大多数miRNA（如miR-124a, miR-107, miR-30d）表达上调, 另有少数miRNA（miR-296, mir-69）表达下调。MiR-30d的过度表达可增加胰岛素基因的表达；相反，抑制miR-30d后，葡萄糖调节的胰岛素基因表达下降。miR-24, miR-26, miR-182 andmiR-148调控胰岛素抑制基因（Bhlhe22， Sox6）的功能；胰腺dicer 酶的缺失可引起胰腺B细胞内miR-24, miR-26, miR-182 and miR-148表达下调，血糖升高及血中胰岛素水平的降低以及Bhlhe22、Sox6表达上调。在糖尿病动物模型中miR-103/107表达上调与高血糖，高胰岛素水平密切相关，抑制miR-103/107表达后可降低体内糖及胰岛素的水平。
Dicer 是miRNA形成过程中的关键酶。当敲除Dicer后，血管内皮中的let-7 家族miRNAs的表达被抑制，从而抑制血管包括内皮细胞的增殖，迁移，及毛细血管的形成。miR-126是血管内皮细胞特异表达的miRNA，是血管新生信号通路中的正调节因子，对维持体内血管的完整性起关键作用，如果敲除miR-126则导致血管发生塌陷。miR-132是调节血管生长的开关和血管内皮细胞活化的标志分子，通过抑制pl20RasGAP的表达，引起Ras活化，促进血管新生，调节内皮细胞的增殖，生存，迁移和毛细血管的形成。研究表明，很多特异性的miRNAs，比如miRNA-9，miRNA-23b, miRNA-26a, miRNA-30c, miRNA-425b, miRNA-481,miRNA-482, miRNA-483, miRNA-484, miRNA-204, miRNA-205, miRNA-210, miRNA-211,miRNA-219, miRNA-320等在视网膜组织中具有特异性的表达。在对人和小鼠视网膜miRNA表达进行的分析发现，视网膜组织中有67种miRNA可以对以往报道的320种视网膜基因中的一个或多个进行调节。在已经出现DR的大鼠视网膜和高糖刺激下的人视网膜血管内皮细胞中，miRNA-200b，血管内皮生长因子的mRNA 和蛋白表达均显著增高；用基因干扰技术阻断miRNA-200b的表达后，可明显降低血管内皮生长因子mRNA和蛋白质的表达，同时也抑制了糖尿病引起的视网膜血管通透性的增加和新生血管的生成。因此，针对miRNA的研究可能成为未来DR 治疗的新靶点。由此可见，miRNA调控异常与糖尿病以及DR的血管病理改变有密切关系。但是，至今为止有关miRNA异常谱与DR关系的研究信息均来自组织标本。由于组织标本的获取具有创伤性，对视网膜进行活检采样用于DR的诊断具有很高的危险性，因而在临床上不可能具有实际应用价值。因此，在无（低）创性的样本中研究合并DR 以及未合并DR的糖尿病患者之间不同的miRNA谱，并探讨特异的miRNA谱在诊断DR中的作用及其价值，对于更准确地阐明DR发病机理，发现新的DR治疗靶点和为DR早期诊断提供新的检测方法具有重大的现实意义及应用价值。
许多研究证明，病变组织通过坏死和凋亡等机制可以释放大量的miRNA 到血循环内。并且随着生理状况、疾病的种类和病程的不同, miRNA分子在血清和血浆中存在的种类和数量将发生变化。外周血中的miRNA具有稳定性，能抵抗40C-800C的温度变化及低温冻融，这种稳定性有利于miRNA成为疾病诊断的标记物；另外，循环miRNA异常表达谱与相应的病变组织中miRNA表达谱有很高的一致性，这一特性使得循环miRNA谱作为疾病特异分子标记物具有巨大的潜力；由于miRNA参与疾病的发病过程，循环miRNA异常谱可在疾病的早期被检测到，因而循环miRNA具有早期诊断价值。
然而，目前还没有血清miRNA与T2DM诱发的DR发生发展的关系的报道。若能筛选出与DR病变有特异关系的血清miRNA作为生物标记物，并研制相应的疾病诊断及检测试剂盒，对DR的诊断及防治将起到有力的推动作用。
发明内容
本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用，以解决目前不能有效对2型糖尿病视网膜病变起到早期诊断的技术问题。
为了实现上述发明目的，作为本发明的一方面，提供了一种与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物。与2型糖尿病视网膜病变相关的所述血清/血浆miRNA标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-148a-3p和hsa-miR-223-3p中的一种或两种以上的组合。
作为本发明的另一方面，提供了本发明与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物的应用方法。所诉与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物用于制备2型糖尿病及其糖尿病视网膜病变早期诊断产品。
作为本发明的又一方面，提供了序列用于检测与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物的引物。所述miRNA标志物为本发明所述的miRNA标志物；其中，所述hsa-let-7a-5p的上游引物为SEQ ID No.8，下游引物为SEQ ID No.9; 所述hsa-miR-novel-chr5_15976的上游引物为SEQ ID No.10，下游引物为SEQ ID No.11；所述hsa-miR-28-3p的上游引物为SEQ ID No.12，下游引物为SEQ ID No.13；所述hsa-miR-20a-5p的上游引物为SEQ ID No.14，下游引物为SEQ ID No.15；所述hsa-miR-151a-5p的上游引物为SEQID No.16，下游引物为SEQ ID No.17；所述hsa-miR-148a-3p的上游引物为SEQ ID No.18，下游引物为SEQ ID No.19；所述hsa-miR-223-3p的上游引物为SEQ ID No.20，下游引物为SEQ ID No.21。
作为本发明的再一方面，提供了一种糖尿病视网膜病变早期诊断试剂盒。所述糖尿病视网膜病变早期诊断试剂盒包括含有上述本发明用于检测与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物的引物的试剂。
与现有技术相比，上述与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物具有以下优异技术效果：
（1）与DNA及蛋白质等传统临床应用的生物标记物相比，上述血清/血浆miRNA标志物更加稳定，取样微创，易于检测，定量准确，将大大提高糖尿病视网膜病变诊断的敏感性和特异性；
（2）上述miRNA标志物与2型糖尿病视网膜病变密切相关，通过对该些miRNA标志物的检测，可以对糖尿病视网膜病变患者疾病进展的动态监测，有助于治疗效果的评价，为医生快速准确掌握患者病情，及时采取更具个体化更精准的治疗方案提供科学依据；
（3）采用上述miRNA标志物作为诊断标记物，可避免侵入性诊断，并可在早期对糖尿病患者是否合并DR进行辅助诊断，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取治疗措施提供支持。
上述本发明与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物的应用方法中，根据本发明miRNA标志物的生物学信息制备的相应产品能够对本发明miRNA标志物进行定量准确检测，而且敏感性和特异性高，从而对2型糖尿病及其糖尿病视网膜病变实现早期诊断。
上述用于检测本发明miRNA标志物的引物依据本发明miRNA标志物的核苷酸序列设计，其具有对本发明相应miRNA标志物的特异性高，而且退火稳定性高。
上述糖尿病视网膜病变早期诊断试剂盒所含的引物与待测样品中的目标miRNA有高特异性，能够对待测样品中的目标，定量准确检测，而且敏感度高，能够实现糖尿病视网膜病变早期诊断，并能够对糖尿病视网膜病变患者疾病进展的动态监测，使得医生能够针对个体化做出更精准的治疗方案提供科学依据。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1 hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p组合对DR的ROC曲线；
图2 hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p组合对早期DR的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物。所述与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-148a-3p和hsa-miR-223-3p中的一种或两种以上的组合。经验证，该些miRNA标志物能够有效诊断2型糖尿病视网膜病变，特别是诊断早期（I-II期）2型糖尿病视网膜病变。
经进一步验证，作为一实施例，上述7条miRNAs标志物中的如下hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-148a-3p这5条miRNAs标志物经验证能够有效诊断2型糖尿病视网膜病变，特别是诊断I-IV期2型糖尿病视网膜病变。
作为本发明的另一实施例，上述7条miRNAs标志物中的如下hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p7三条miRNAs标志物能够有效区分DR和T2DM无DR，而且，三者的组合能够有效提高诊断2型糖尿病视网膜病变，特别是提高早期2型糖尿病视网膜病变诊断效果和灵敏度以及特异度。
上述各实施例中miRNAs标志物的选定方法可以按照下文第三节中的采用一期和二期临床验证获得，而且采用多个miRNAs的组合能更好的将DR甚至早期DR和无DR者区分开来。
经过分别对上述临床验证获7条miRNAs标志物进行测序，其核苷酸序列分别如下表1中所示。
表1
| miRNA名称 | 核苷酸序列 | SEQ ID No |
| hsa-let-7a-5p | UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU | 1 |
| hsa-miR-novel-chr5_15976 | AGCAGCAUUGUACAGGGCU | 2 |
| hsa-miR-28-3p | CACUAGAUUGUGAGCUCCUGGA | 3 |
| hsa-miR-20a-5p | UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG | 4 |
| hsa-miR-151a-5p | UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU | 5 |
| hsa-miR-148a-3p | AAAGUUCUGAGACACUCCGACU | 6 |
| hsa-miR-223-3p | UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA | 7 |
上述各实施例中的与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物是采用严密、多阶段的识别、验证、及评价体系，初期通过无偏差的全基因组RNA测序发现并筛选出多种DR相关的miRNAs，应用real-time PCR分别在两个独立人群样本中进行二次验证，确定与DR有密切关系的miRNAs，保证了该血清miRNAs标记物的准确性和可靠性。因此，通过对该些miRNA标志物的检测，可以对糖尿病视网膜病变患者疾病进展的动态监测，有助于治疗效果的评价，为医生快速准确掌握患者病情，及时采取更具个体化更精准的治疗方案提供科学依据；另一方面与DNA及蛋白质等传统临床应用的生物标记物相比，上述各miRNA标志物更加稳定，取样微创，易于检测，定量准确，将大大提高糖尿病视网膜病变诊断的敏感性和特异性；第三方面，采用上述miRNA标志物作为诊断标记物，可避免侵入性诊断，并可在早期对糖尿病患者是否合并DR进行辅助诊断，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取治疗措施提供支持。
正因上述miRNA标志物具有如上述优点和作用，其能够被用于制备2型糖尿病及其糖尿病视网膜病变早期诊断产品。其中，该产品应该理解的是能够利用上述特定miRNA标志物和上述的其所具有的优点和作用而开发的相关产品。一实施例中，上述早期诊断产品包括早期诊断试剂和早期诊断试剂盒。具体实施例中，该早期诊断试剂是含有能够测试上述miRNA标志物的临床应用的试剂。上述早期诊断试剂盒是能够特异检测上述miRNA标志物定性或定量的试剂盒。
另一方面，对于上述miRNA标志物的应用方法中，其中最重要的一点是利用上述miRNA标志物生物信息，也即是miRNA标志物的核苷酸序列。因此，基于上述miRNA标志物的核苷酸序列，本发明实施例还提供了用于检测与上文所述的miRNA标志物的引物。一实施例中，根据上文所述的miRNA标志物核苷酸序列，设计的各miRNA标志物的引物如下表4所示：
上述各miRNA标志物的引物是根据各标志物的核苷酸序列进行设计，其具有一般引物具有的性能的基础上，还对上述相应miRNA标志物特异性高，而且退火稳定性高。
又一方面，基于上述miRNA标志物和根据上述miRNA标志物设计的引物，本发明实施例还提供了一种糖尿病视网膜病变早期诊断试剂盒。所述试剂盒包括含有利用上文所述的miRNA标志物而设计的引物，具体的是根据上文所述miRNA标志物的靶基因设计的引物。一实施例中，上文所述miRNA标志物的靶基因为上文表1中所示的序列SEQ ID No.1至SEQID No.7。在具体实施例中，上述试剂盒所含的引物为上文表2中所示的序列SEQ ID No.8至SEQ ID No.21。这样，上述糖尿病视网膜病变早期诊断试剂盒所含的引物与待测样品中的目标miRNA有高特异性，能够对待测样品中的目标，定量准确检测，而且敏感度高，能够实现糖尿病视网膜病变早期诊断，并能够对糖尿病视网膜病变患者疾病进展的动态监测，使得医生能够针对个体化做出更精准的治疗方案提供科学依据。
理所当然的是，上述糖尿病视网膜病变早期诊断试剂盒所含的上文所述的序列引物置于溶剂中保存的，一实施例中，各对引物在溶液中的浓度为但不仅仅为20μM，体积是但不仅仅为50μl。
当然，上述糖尿病视网膜病变早期诊断试剂盒还可以设置与该引物试剂配套的Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液等试剂，还可以配制PCR所需的其他常规的试剂，如dNTP 混合液，PCR缓冲液等。
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实验步骤如下：
第一节：研究对象选择和分组
本发明人与2014年10月到2016年10月间从深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）收集符合研究条件要求的成年（≥18岁）糖尿病DR患者及糖尿病无DR对照个体的血清样本，提供样本者均签署了知情同意书。研究方案得到医院医学伦理委员会的审核通过。
糖尿病的诊断根据WHO诊断标准（任意时间血浆葡萄糖≥11.1mmol/L，或空腹血糖FPG≥7.0mmol/L，或OGTT2h PG≥11.1mmol/L）。血糖测定使用全自动生化分析仪（BeckmanCoulter：AU5421）。
DR的临床诊断以眼底照相与眼底荧光血管造影为主要手段。眼底照相/眼底荧光造影使用眼底荧光血管造影仪（蔡司VISUCAM NM/FA）。根据眼底改变，目前将糖尿病视网膜病变分为六期（Ⅰ期：视网膜有微动脉瘤或并有小出血点； Ⅱ期：视网膜有黄白“硬性渗出”或并有出血斑；Ⅲ期：视网膜有白色“软性渗出”或并有出血斑；Ⅳ期：视网膜有新生血管和/或玻璃体出血；Ⅴ期：视网膜有新生血管和纤维增殖；Ⅵ期：视网膜有新生血管和纤维增殖并发现网膜脱离。 I-III期统称为单纯型糖尿病视网膜病变；IV-VI期统称为增殖型视网膜病变。
通过对样本资料的分析整理，从中选择了符合下列标准的样本作为二代测序及后续一系列qRT-PCR 验证的实验样品：
A组: 糖尿病未合并DR组
1. 经临床检查诊断为糖尿病
2. 经眼底镜检查未发现有视网膜病变；
B组： DR组
1. 经临床检查诊断为糖尿病
2. 经眼底镜检查发现有视网膜病变。
第二节：血清中miRNA的测序实验
在上述符合条件的个体中选取年龄匹配的正常对照、糖尿病未合并DR患者、DR患者各3位，将这三组人群经测序获得相关实验数据。具体步骤如下：
1. 分别取每位受试对象的250μl血浆液体，转至1.5ml的离心管中，加入750μl的TRIzol LS Reagent 试剂和20μl冰醋酸，手动剧烈振荡管体至混匀；
2. 两相分离：匀浆后样品于15-30°C孵育5分钟，加入0.2 ml的氯仿，手动剧烈振荡管体15秒后，15到30°C孵育2到3分钟。4°C下12,000 ×g离心15分钟；离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中；
3. RNA沉淀：将水相转移到新离心管中，并加入500μl异丙醇，混匀后15到30°C孵育10分钟后，于4°C 12,000×g离心10分钟；RNA沉淀在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块；
4. RNA清洗：移去上清液，加入1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀；振荡后，4°C 7,500×g离心5分钟；
5. 重新溶解RNA沉淀：去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟；加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55-60°C孵育10分钟，获得的RNA溶液保存于-70°C；
6. RNA质量检测：用NanoDrop® ND-1000测定RNA浓度和纯度；
7. 小RNA文库构建：总RNA样本在T4 RNA连接酶的作用下加上3’及5’接头，经cDNA合成后进行RT-PCR 扩增，扩增产物用病变聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（PAGE）纯化分离135-155bp(相应于15-33nt small RNA)的扩增片段，然后用Agilent2100 Bioanalyzer对文库进行定量和质量分析；
8. Cluster生成及测序：将small RNA文库样本稀释至8Pm，使用Illumina cBotcluster生成系统（TruSeq Rapid SR cluster kit）进行测序文库的扩增，然后在IlluminaHiSeq 2000 测序仪上按TruSeq Rapid SBS试剂盒说明书进行高通量测序；
9. 测序数据的处理：原始数据经去接头、去污染、去低质量等处理，获得有效序列进行后续分析；首先Nonoalign 软件将有效序列与miRBase数据库中已知的人类miRNA进行序列比对（碱基配错小于或等于1），获得样本已知的miRNA序列（read）；miRNA表达水平用TPM [转录本（transcript）/每百万总miRNA序列）] 表示。
10. 各组间miRNA表达差异用fold change (t检验)来进行比较。
第三节：qRT-PCR 方法测量血浆miRNA表达量
根据RNA测序结果，选择满足下列条件的mRNA用qRT-PCR方法进一步验证测序结果：在两组中差异表达≥2.0，P值<0.05。最终选择的miRNA如表1和2中的miRNA。我们对糖尿病组(n=6)及对照组(n=11)的血浆中的7个miRNAs (hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-148a-3p和hsa-miR-223-3p) 作qRT-PCR检测。所设计的相应miRNA引物见表2。在实验过程中每个样本连续检测3次。为了避免人为的偏差，所有检测均采用盲法，即实验者在不清楚样本背景的情况下对样本进行实验。
表2
制备cDNNA样品：
1）制备RT混合反应液：dNTP(2.5mM each) 2ul；10X RT Buffer 2ul；RT特异引物(1uM) 0.3ul；Total RNA 160ng；MMLV反转录酶(200U/ul) 0.2ul；RNA酶抑制剂(40u/ul)0.3ul；无RNA酶水 up to 20ul；
2）在PCR扩增仪进行RT反应：16℃ 30min；42℃ 40min；85℃ 15min。
进行Realtime PCR反应：
1）将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系；体系配置如下：2 × MasterMix 5 µl；10uM 的PCR特异引物F 0.5µl；10uM 的PCR特异引物R 0.5µl；加水至总体积为 8µl；5000 rpm短暂离心；
2）加样：a. 将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中； b. 再加入对应的2µlcDNA；c. 小心粘上Sealing Film 封口膜，并短暂离心混合；d. 在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上；
3）将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应；程序如下：95℃，10min；40个PCR循环（95℃，10秒；60℃，60秒（收集荧光））；为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按（95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒）；并从60℃缓慢加热到99℃（仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒）；
4）结果与计算：各样品的目的miRNA和内参hsa-miR-425-5p（其引物如表4所示）分别进行Realtime PCR反应；数据采用2 -△△ CT法进行分析。
qRT-PCR 测定结果表明在DR患者组（n=10）及T2DM无合并DR组(n=10)间有如表1和2中的7种miRNAs在两组间的表达有显著性差异，如表3所示。
第四节血浆miRNA在DR病人及T2DM无DR合并患者中差异表达qRT-PCR实验第二阶段验证
根据上述结果，将表1和表2中的7种miRNAs与DR发病相关的miRNAs在另一组DR病人及T2DM无DR合并患者中进行进一步检测。我们发现在DR组（n=28）血浆中，hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p的表达均显著高于T2DM无DR组（n=51）；而hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-148a-3p的表达显著低于T2DM无DR组，如表4所示。当分析限于早期DR(I-II期)与对照（T2DM无DR）组时，早期DR患者血浆中hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p的表达显著高于对照组；而hsa-miR-151a-5p，hsa-miR-148a-3p，hsa-miR-223-3p显著低于对照组，如表4所示。
表4
第五节血浆hsa-let-7a-5p, hsa-miR-novel-chr5_15976, hsa-miR-28-3p单独和组合对DR的诊断及ROC曲线
根据上述real-time qPCR结果，通过对28例DR患者及51例T2DM无DR患者血浆miRNA表达水平进行了进一步分析。我们分别以T2DM无DR者hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p表达量的95百分位数为阈值，对hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p进行评分。表达量小于95百分位数评分为0，表达量大于等于95百分位数评分为1，进一步求得总得分，以此绘制ROC曲线来评估诊断糖尿病合并DR的灵敏度和特异度。hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p组合的ROC曲线如图1所示。ROC 分析结果表明，hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p区分DR的AUC(ROC曲线下面积)为93.7%。灵敏度和特异度分别为0.923、0.950，如图1所示，三个miRs的单个ROC曲线数据如表5所示。hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p的组合以90.1%的AUC将区分早期DR，灵敏度为87.5%，特异度92.7%。结果说明三个miRNAs的组合提高了诊断效率及灵敏度和特异度，如图2所示，三个miRs的单个ROC曲线数据如表6所示。
表5
表6
因此，本发明人证明了采用多个miRNAs的组合能更好的将DR甚至早期DR和无DR者区分开来。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 与2型糖尿病视网膜病变相关的血清血浆miRNA标志物及其应用
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210>1
<211> 22
<212> RNA
<213> 天然序列，来源于人（human）血清
<220>
<223> microRNA: has-let-7a-5p
<400> 1
UGAGGUAGUA GGUUGUAUAG UU 22
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 天然序列，来源于人（human）血清
<220>
<223> microRNA: has-miR-chr5-15976
<400> 2
AGCAGCAUUG UACAGGGCU 19
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 天然序列，来源于人（human）血清
<220>
<223> microRNA: has-miR-28-3p
<400> 3
CACUAGAUUG UGAGCUCCUG GA 22
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 天然序列，来源于人（human）血清
<220>
<223> microRNA: has-miR-20a-5p
<400> 4
UAAAGUGCUU AUAGUGCAGG UAG 23
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 天然序列，来源于人（human）血清
<220>
<223> microRNA: hsa-miR-151a-5p
<400> 5
UCGAGGAGCU CACAGUCUAG U 21
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 天然序列，来源于人（human）血清
<220>
<223> microRNA: hsa-miR-148a-3p
<400> 6
AAAGUUCUGA GACACUCCGA CU 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 天然序列，来源于人（human）血清
<220>
<223> microRNA: hsa-miR-223-3p
<400> 7
UGUCAGUUUG UCAAAUACCC CA 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> has-let-7a-5p 上游引物
<400> 8
GGGGTGAGGT AGTAGGTTG 19
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> has-let-7a-5p 下游引物
<400> 9
TGCGTGTCGT GGAGTC 16
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> has-miR-novel-chr5-15976 上游引物
<400> 10
GGGGGGAAGC AGCATTGTA 19
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> has-miR-novel-chr5-15976 下游引物
<400> 11
GTGCGTGTCG TGGAGTCG 18
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-28-3p 上游引物
<400> 12
GGGGGACACT AGATTGTGAGC 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-28-3p 下游引物
<400> 13
GTGCGTGTCG TGGAGTCG 18
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-20a-5p上游引物
<400> 14
GGGGGTAAAG TGCTTATAGT GC 22
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-20a-5p 下游引物
<400> 15
GTGCGTGTCG TGGAGTCG 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-151a-5p 上游引物
<400> 16
GGGGTCGAGG AGCTCACAG 19
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-151a-5p 下游引物
<400> 17
GTGCGTGTCG TGGAGTCG 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-148a-3p 上游引物
<400> 19
GGGGTCAGTG CACTACAGAA 20
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-148a-3p 下游引物
<400> 19
CAGTGCGTGT CGTGGAGT 18
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-223-3p上游引物
<400> 20
GGGGTGTCAG TTTGTCAAA 19
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-223-3p下游引物
<400> 21
CAGTGCGTGT CGTGGAGT 18
Claims (7)
1.一种与2型糖尿病视网膜病变早期相关的血清/血浆miRNA标志物，其特征在于：所述miRNA标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novel-chr5_15976、hsa-miR-28-3p的组合；
所述hsa-let-7a-5p的序列为SEQ ID No.1；
所述hsa-miR-novel-chr5_15976的序列为SEQ ID No.2；
所述hsa-miR-28-3p的序列为SEQ ID No.3。
2.检测如权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物表达水平的试剂在制备2型糖尿病视网膜病变早期诊断产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述早期诊断产品包括早期诊断试剂或早期诊断试剂盒。
4.检测血清/血浆miRNA标志物hsa-miR-novel-chr5_15976表达水平的试剂在制备2型糖尿病视网膜病变早期诊断产品中的应用。
5.一种糖尿病视网膜病变早期诊断试剂盒，包括用于扩增如权利要求1所述miRNA标志物的引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述引物为
所述hsa-let-7a-5p的上游引物为SEQ ID No.8，下游引物为SEQ ID No.9;
所述hsa-miR-novel-chr5_15976的上游引物为SEQ ID No.10，下游引物为SEQ IDNo.11；
所述hsa-miR-28-3p的上游引物为SEQ ID No.12，下游引物为SEQ ID No.13。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：还包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710584620.8A CN107385035B (zh) | 2017-07-18 | 2017-07-18 | 与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710584620.8A CN107385035B (zh) | 2017-07-18 | 2017-07-18 | 与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107385035A CN107385035A (zh) | 2017-11-24 |
| CN107385035B true CN107385035B (zh) | 2021-01-08 |
Family
ID=60340027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710584620.8A Active CN107385035B (zh) | 2017-07-18 | 2017-07-18 | 与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107385035B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108796063A (zh) * | 2018-06-13 | 2018-11-13 | 云南省第二人民医院 | Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用 |
| CN109991342B (zh) * | 2019-03-08 | 2022-02-15 | 首都医科大学附属北京同仁医院 | 一种诊断或预防糖尿病视网膜病变的生物标志物、检测试剂及用途 |
| CN109825575A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-05-31 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | 辅助诊断结核病的miRNA标志物及其应用 |
| CN111394447B (zh) * | 2020-02-17 | 2023-01-20 | 天津医科大学眼科医院 | 一种血浆小细胞外囊泡miR-431-5p的应用 |
| CN111518883B (zh) * | 2020-04-02 | 2022-12-30 | 深圳大学 | 一种用于冠心病诊断的血浆miRNA标志物及其应用 |
| CN111748635B (zh) * | 2020-05-27 | 2022-07-29 | 北京信诺卫康科技有限公司 | 胆管癌的miRNA标记物及其应用 |
| CN111926072A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-13 | 蒋沁 | 一种眼底血管性疾病诊断环状rna标志物、诊断试剂盒及应用 |
| CN113981064B (zh) * | 2021-10-20 | 2022-10-28 | 南京医科大学眼科医院 | 糖尿病性视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012078558A2 (en) * | 2010-12-06 | 2012-06-14 | Rush University Medical Center | microRNAs AS NEW THERAPEUTIC TARGETS FOR THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF RETINOPATHY |
| CN105483230A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-04-13 | 宁波大学 | 用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用 |
| CN105483231A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-04-13 | 宁波大学 | 用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-2116-5p分子标记物及其扩增引物和应用 |
| CN106148537A (zh) * | 2016-08-08 | 2016-11-23 | 南京市妇幼保健院 | 一种与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2890789A1 (en) * | 2012-08-31 | 2015-07-08 | Aptamir Therapeutics, Inc. | Mirna modulators of chronic visceral inflammation |
-
2017
- 2017-07-18 CN CN201710584620.8A patent/CN107385035B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012078558A2 (en) * | 2010-12-06 | 2012-06-14 | Rush University Medical Center | microRNAs AS NEW THERAPEUTIC TARGETS FOR THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF RETINOPATHY |
| CN105483230A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-04-13 | 宁波大学 | 用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用 |
| CN105483231A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-04-13 | 宁波大学 | 用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-2116-5p分子标记物及其扩增引物和应用 |
| CN106148537A (zh) * | 2016-08-08 | 2016-11-23 | 南京市妇幼保健院 | 一种与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Angiogenic microRNAs Linked to Incidence and Progression of Diabetic Retinopathy in Type 1 Diabetes;Anna Zampetaki等;《Diabetes》;20160131;第65卷;第216-227页 * |
| Characterisation of isomiRs in stem cells;Tan Geok Chin;《Imperial College London》;20130331;第178,185页表S3.1 * |
| Comparisons of Serum miRNA Expression Profiles in Patients With Diabetic Retinopathy and Type 2 Diabetes Mellitus;Jianping Ma等;《Clinics》;20161215;第72卷(第2期);第111-115页 * |
| Differentially Expressed MicroRNAs in the Development of Early Diabetic Retinopathy;Qiaoyun Gong等;《J Diabetes Res》;20170615;第1-10页 * |
| let-7 Contributes to Diabetic Retinopathy but Represses Pathological Ocular Angiogenesis;Qinbo Zhou等;《Mol Cell Biol.》;20170605;第37卷(第16期);第2页第3段，第3页第1-2段、图1B，第11页第2段 * |
| Serum MiRNA Biomarkers serve as a Fingerprint for Proliferative Diabetic Retinopathy;Shao Qing等;《Cellular Physiology and Biochemistry》;20141112;第34卷;第1736页第2段，第1737页表1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107385035A (zh) | 2017-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107385035B (zh) | 与2型糖尿病视网膜病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 | |
| CN109295218B (zh) | 环状RNA标志物hsa_circ_0001788及其应用 | |
| WO2010105275A2 (en) | Method to assess human allograft status from microrna expression levels | |
| WO2016186987A1 (en) | Biomarker micrornas and method for determining tumor burden | |
| CA2982486A1 (en) | Nucleic acid markers for rapid diagnosis of kawasaki disease and kit for detection of the nucleic acid markers | |
| CN113249486B (zh) | 一种检测vgll3基因dna甲基化程度的试剂盒及其应用 | |
| CN106434982B (zh) | 缺血性脑卒中相关的分子标记物及其应用 | |
| CN107779504B (zh) | 结直肠癌microRNA分子标志物及其用途 | |
| CN106701962B (zh) | 用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒 | |
| JP2018522558A (ja) | 外傷性脳損傷のためのマイクロｒｎａバイオマーカー、及びその使用方法 | |
| CN107460241B (zh) | 外泌体小分子rna在急性心肌梗死风险评估中的应用 | |
| JP7436004B2 (ja) | うつ病の診断補助方法及び診断用キット | |
| CN108728532B (zh) | 一种微小rna标志物及其应用 | |
| CN107937532B (zh) | 胶质瘤诊断标志物hsa_circ_0021827及应用 | |
| CN114015767B (zh) | 一种鉴别颅缝早闭的血清circRNA标志物及其应用 | |
| CN108410977B (zh) | 酒精性股骨头坏死患者血清miRNAs超早期检测试剂盒 | |
| CN113355417B (zh) | 一种map3k10基因片段及引物在制备颅内动脉瘤检测试剂盒中的用途 | |
| CN110656171A (zh) | 小核仁核糖核酸snord33作为生物标记物用于制备检测试剂盒中的用途 | |
| CN107937538B (zh) | 胶质瘤诊断标志物circ1:201817088|201817285及应用 | |
| CN109609620B (zh) | 用于辅助诊断血行播散型肺结核的试剂盒 | |
| Sheikh et al. | The mir-21 inhibition enhanced HUVEC cellular viability during hypoxia-reoxygenation injury by regulating PDCD4 | |
| CN109735612B (zh) | 川崎病冠状动脉瘤并发症的生物分子标志物及其试剂盒 | |
| CN112852950A (zh) | 急性心肌梗死生物标志物及其应用 | |
| CN107190073B (zh) | hsa_circRNA_104907在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 | |
| CN110988346A (zh) | 一种辅助诊断肺癌的标记物以及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |