CN113249486B - 一种检测vgll3基因dna甲基化程度的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒及其应用,检测试剂盒内包括一对VGLL3基因DNA甲基化特异性扩增引物及一个VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物:其中特异性扩增上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,特异性扩增下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列,甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列;VGLL3基因DNA被检测序列所在区域为基因前端特定位置并通过焦磷酸测序技术进行DNA甲基化水平分析;VGLL3基因DNA甲基化水平与脑动脉瘤的患病率呈负相关;优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对脑动脉瘤的检测,检测效率高,针对性强,以VGLL3基因DNA甲基化为靶点的药物为脑动脉瘤辅助诊断、检测和筛选有效手段。
Description
技术领域
本发明涉及脑动脉瘤的辅助诊断技术领域,特别涉及一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒及其应用。
背景技术
脑动脉瘤(Intracranial aneurysms, IA)是脑内动脉壁的结构发育不良,或因脑外伤、动脉硬化造成动脉壁损伤或老化,使局部血管壁向外膨大形成的囊状瘤体。脑动脉瘤极易在偶发的紧张、用力、疲劳等血压升高时突然发生破裂,所引起的脑蛛网膜下腔出血及其导致的严重并发症对人生命和健康的威胁很大,死亡率和伤残率都很高。因此,脑动脉瘤被称为脑的“定时炸弹”。脑动脉瘤病因尚不甚清楚,但以先天性动脉瘤占大部分。任何年龄可发病,40~66岁常见。
流行病学调查显示,IA在普通人群中的发生率为1.0%-2.0%,在中国35~75岁成年人中为7.0%。脑动脉瘤的发病机制在很大程度上仍然不十分清楚。目前,最普遍的观念都认为脑动脉瘤的发生、形成是一个复杂的多基因、多生物因子共同作用的过程,遗传和后天不良生活因素(包括生活方式和其他社会心理因素等)共同参与这个过程。因此,越来越多的研究者们都逐渐倾向于颅内动脉瘤的基因和生物因子方面的研究。近年来的研究证明,血管相关基因DNA甲基化程度的变化在脑动脉瘤的发生发展中扮演着重要角色。
退化样蛋白(Vestigial-like 3, VGLL3)是VGLL家族的成员,其成员充当含TEA域的转录因子(TEAD)的辅助因子。在肿瘤细胞中,VGLL3能与TEAD结合通过Hippo 信号通路促进细胞增殖。在人血管稳态中,VGLL3可以与Yes相关蛋白(YAP)竞争性结合TEAD,从而抑制YAP/TEAD诱导的表型转换来维持血管平滑肌细胞的分化状态。研究显示动脉瘤血管壁中YAP表达显著降低后会伴随着血管平滑肌细胞凋亡以及细胞外基质紊乱的发生。VGLL3可能通过抑制YAP在血管相关疾病的发生发展过程中扮演着重要角色。DNA甲基化是外界环境影响基因表达的一个重要因素,高度甲基化能有效降低基因的表达。我们的研究结果显示,脑动脉瘤患者血液中VGLL3基因DNA甲基化显著低于健康对照组,并且患者VGLL3表达也显著高于健康对照组。我们推测患者极有可能在生活环境中由于烟酒,压力等不良的生活习惯促进VGLL3基因DNA甲基化降低,引起VGLL3的高表达,进一步降低血管壁YAP表达量降低,导致了脑动脉瘤的发生和发展。因此,VGLL3基因DNA甲基化程度的检测有望作为脑动脉瘤早期诊断的一个预测因子。目前,国内外没有公开任何关于VGLL3基因DNA甲基化与脑动脉瘤相关的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状,提供检测效率高,针对性强的一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒及其应用,通过检测VGLL3基因DNA甲基化程度辅助诊断脑动脉瘤,其中VGLL3基因DNA甲基化水平与脑动脉瘤的患病率呈负相关,本检测方法简单快速、无创、效率高。。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:
一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒,其中检测试剂盒内包括一对VGLL3基因DNA甲基化特异性扩增引物及一个VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物:
VGLL3基因DNA甲基化特异性上游引物的核苷酸序列:
5’-Biotin- GTTTTATAAGGTTGGGGGTGA -3’;
VGLL3基因DNA甲基化特异性下游引物的核苷酸序列:
5’-ACCCCCCCTAATTACCAATCCCT -3’;
VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物的核苷酸序列:
5’- ATTACCAATCCCTCC -3’。
采取的技术措施还包括:
上述的VGLL3基因DNA被检测序列所在区域为基因前端CpG78区域内。
上述的CpG78区域内的具体位置为hg38, Chr3: 86,990,862 - 86,990,913。
上述的VGLL3基因DNA被检测序列是采用焦磷酸测序技术对VGLL3基因内的12个CpG位点进行DNA甲基化水平分析。
上述的VGLL3基因DNA甲基化水平与脑动脉瘤的患病率呈负相关。
一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒的应用,检测试剂盒能用于脑动脉瘤辅助诊断、预后检测或筛查药物。
一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度试剂盒的辅助诊断脑动脉瘤的检测方法,包括以下步骤:
步骤一、提取检测样本的全血基因组DNA,并检测DNA浓度;
步骤二、亚硫酸氢盐处理试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化;
步骤三、转化后的样本进行甲基化检测;
步骤四、数据分析。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明首次公开了用于检测与脑动脉瘤相关的VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒及其应用,VGLL3基因域的低甲基化水平导致VGLL3基因的高表达,引发Hippo 信号通路的变化,从而血管平滑肌细胞增殖不受控制,从而引起脑部动脉血管的紊乱引发疾病。因此,VGLL3基因DNA甲基化水平与脑动脉瘤的患病率呈负相关。因此,以检测VGLL3基因DNA甲基化水平为基础的检测试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对脑动脉瘤的检测,检测效率高,针对性强,同时,以VGLL3基因甲基化为靶点的药物为脑动脉瘤辅助诊断、检测和筛选的一种创新用途。
脑动脉瘤的传统诊断都是基于影像学手段进行检查,而病人往往都是出现相关症状才到医院就诊。脑动脉瘤破裂前没有任何征兆,其死亡率极高,大概1/3的脑动脉瘤患者都是发病后送往医院救治的过程中死亡。本发明以检测VGLL3基因DNA甲基化水平为基础的检测试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对脑动脉瘤的检测,检测效率高,针对性强,有利于脑动脉瘤的早期发现和及时治疗。
附图说明
图1是本发明VGLL3基因被检测序列所在区域所检测的12个CpG甲基化位点分布位置示意图;
图2是本发明VGLL3基因甲基化水平检测结果示例示意图;
图3是本发明脑动脉瘤与对照组间VGLL3基因DNA甲基化差异示意图;
图4 是本发明不同性别脑动脉瘤与对照组之间VGLL3基因DNA甲基化差异示意图;
图5是本发明脑动脉瘤患者VGLL3 mRNA表达量显著高于对照组示意图;
图6 是本发明VGLL3基因DNA甲基化与脑动脉瘤的敏感性和特异性示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
图1是本发明VGLL3基因被检测序列所在区域所检测的12个CpG甲基化位点分布位置示意图;如图示具体位置为hg38,Chr3:86,990,862-86,990,913,该区域所检测的12个CpG甲基化位点分布位置示意。
图2是本发明VGLL3基因甲基化水平检测结果示例示意图;图中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度,如图示有CpG1到CpG12的甲基化程度分别为16%,11%,15%, 14%,12%,12%,9%,14%,10%,17%,39%,19%示意。
图3是本发明脑动脉瘤与对照组间VGLL3基因DNA甲基化差异示意图;其中*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001示意。
图4 是本发明不同性别脑动脉瘤与对照组之间VGLL3基因DNA甲基化差异示意图;其中脑动脉瘤患者VGLL3基因DNA甲基化程度显著低于对照组,***p<0.001示意。
图5是本发明脑动脉瘤患者VGLL3 mRNA表达量显著高于对照组示意图;其中***p<0.001示意。
图6 是本发明VGLL3基因DNA甲基化与脑动脉瘤的敏感性和特异性示意图;其中女性AUC = 0.81,最佳临界点时的敏感度为75%,特异性为79.2%示意。
如图1至图6所示:
一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒,其中检测试剂盒内包括一对VGLL3基因DNA甲基化特异性扩增引物及一个VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物:
VGLL3基因DNA甲基化特异性上游引物的核苷酸序列:
5’-Biotin- GTTTTATAAGGTTGGGGGTGA -3’;
VGLL3基因DNA甲基化特异性下游引物的核苷酸序列:
5’-ACCCCCCCTAATTACCAATCCCT -3’;
VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物的核苷酸序列:
5’- ATTACCAATCCCTCC -3’。
其中,VGLL3基因DNA被检测序列所在区域为基因前端CpG78区域内,具体位置为hg38, Chr3: 86,990,862 - 86,990,913,同时VGLL3基因DNA被检测序列是采用焦磷酸测序技术对VGLL3基因内的12个CpG位点进行DNA甲基化水平分析。VGLL3基因DNA甲基化水平与脑动脉瘤的患病率呈负相关。
一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒的应用,上述检测试剂盒能用于脑动脉瘤辅助诊断、预后检测或筛查药物。
一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒的应用还包括以下步骤:
步骤一、提取检测样本的全血基因组DNA,并检测DNA浓度;
步骤二、亚硫酸氢盐处理试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化;
步骤三、转化后的样本进行甲基化检测;
步骤四、数据分析。
1、研究对象的收集
募集愿意参加研究的志愿者,根据脑动脉瘤的国际诊断标准,将志愿者分为病例组和对照组,并采用调查表的形式调查志愿者的一般情况,同时采取静脉血,进行一般血生化检测,具体如下:
从某医院神经外科收集经血管造影术证实的脑动脉瘤患者48例(24男;24女,平均年龄46.63±6.04),同时收集性别匹配、年龄严格配对的经CT证实没有心脑血管病历史的48名正常人作为对照组(平均年龄48.08±5.69)。记录所有研究对象空腹抽血检测血脂、血糖等一般生化指标,同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中,于4℃离心机,3000rpm离心20分钟,分别将上清血浆和中间层白细胞保存-80℃低温冰箱,以备用于标本统一提取mRNA和基因组DNA;
2、提取并检测血浆mRNA表达量
采用TRIzol法提取总RNA,以总RNA为模板采用高容量cDNA反转录试剂盒反转录成cDNA。在罗氏LC480实时定量PCR仪上采用SYBR Green PCR 预混试剂进行实时定量PCR分析。相对基因表达量采用2-△△CT法计算。GAPDH作为内源性对照来标准化数据。
3、基因组DNA的提取
应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取上述步骤得到的样本的全血基因组DNA,再通过核酸蛋白测定仪检测所得DNA的浓度,以供VGLL3基因DNA甲基化水平的检测。
4、DNA甲基化水平测定
本研究采用焦磷酸测序技术对VGLL3基因前端CpG78区域内(hg38, Chr3: 86,990,862 - 86,990,913)的12个CpG位点(如图1)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理:用重亚硫酸盐处理DNA样品后,再应用聚合酶链反应(PCR)扩增,可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变,而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U),然后通过测序引物进行PCR测序,从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计,用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下:
(1)VGLL3基因DNA甲基化特异性上游引物的核苷酸序列(Forward primer)
5’-Biotin- GTTTTATAAGGTTGGGGGTGA -3’(SEQ ID NO.1);
(2)VGLL3基因DNA甲基化特异性下游引物的核苷酸序列(Reverse primer)
5’-ACCCCCCCTAATTACCAATCCCT -3’,(SEQ ID NO.2);
(3)VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物的核苷酸序列(Sequencing primer)
5’- ATTACCAATCCCTCC -3’(SEQ ID NO.3)。
具体实验步骤:
步骤A:亚硫酸盐转化. 采用QIAGEN EpiTect® 亚硫酸氢盐处理试剂盒(EpiTechBisulfite Kits; Qiagen; #59104)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化,按照说明书操作,经上样,洗涤,洗脱等步骤得到转化后的DNA。
步骤B: PCR反应.取步骤A中转化过的DNA样本20ng加入到Pyromark PCR试剂盒(Pyromark PCR Kit; Qiagen; #978703),并加入上述一对VGLL3基因甲基化特异性扩增引物,进行PCR扩增,扩增条件:首先95℃ 3 min的变性;接着94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 1min,共40个循环的退火反应;然后延伸反应72℃ 5min。
步骤C:焦磷酸测序的前期准备:在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer; Qiagen; #979009);将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量(每样本3μl)转移到一个Eppendorf管中;在琼脂糖珠中加入结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer; Qiagen; #979006),使得平均每个样品约有50μl的体积,将混合物混匀;将以上混合物加入PCR产物(50μl反应体积)中,每样本50μl;将PCR产物在常温下混匀10分钟,使得磁珠与生物素结合;在真空预备工作站中,四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70%乙醇、洗涤缓冲液(PyroMark Wash Buffer; Qiagen; #979008)和120ml的变性缓冲液(PyroMark Denaturation Solution; Qiagen; #979007);打开真空预备工作站的泵,将真空准备工具在高纯水中清洗30秒;然后将真空准备工具(PyroMarkVacuum Prep Filter Probes; Qiagen; #979010)移到PCR板中,抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作);拿起PCR板,检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上;将真空准备工具放入70%乙醇中5秒;然后移到变性缓冲液中5秒;再移到洗涤缓冲液中清洗5-10秒;关掉泵;将真空准备工具放入含有测序引物的板中,摇动,释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入);使用高纯水清洗真空准备工具;将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟,再冷却到室温,即可进行焦磷酸测序反应。
步骤D:焦磷酸测序:在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上,采用Pyromark Gold Q24试剂盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)对步骤C中的PSQ96板中的样本进行测序,然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析(甲基化水平检测结果见图2)。
4、数据分析
本次研究采用GraphPad Prism 8对数据进行整理分析。本项研究设计的引物能够检测出VGLL3基因内Chr3: 86,990,862 - 86,990,913区域内的12个CpG位点的甲基化情况。通过病例对照组比较,我们发现脑动脉瘤患者中VGLL3基因CpG2(p<0.01), CpG4(p<0.05), CpG5(p<0.001), CpG6(p<0.01), CpG8(p<0.01), CpG10(p<0.01), CpG11(p<0.01), CpG12(p<0.001)以及平均甲基化程度(p<0.001)均低于对照组(图3)。性别分组分析的结果显示,女性脑动脉瘤患者中VGLL3基因平均甲基化水平也显著低于对照组(p <0.001,图4), 而男性患者与对照组间的甲基化没有差异(p>0.05)。通过对病例对照组血浆mRNA表达水平检测的结果显示VGLL3基因表达水平在脑动脉瘤患者中显著高于对照组(p<0.001, 图5)。ROC曲线分析结果显示VGLL3基因甲基化水平在所有研究对象中线下面积AUC= 0.70,男性人群中AUC面积为0.57,而在女性人群中AUC面积为0.81,最佳临界点时的敏感度75.0%,特异性为79.2%。
本发明一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒及其应用,在辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对VGLL3基因DNA甲基化水平进行检测,能够快速、可靠地为脑动脉瘤的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。
本发明的最佳实施例已被阐明,由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。
序列表
<110> 宁波市第一医院
<120> 一种检测VGLL3基因DNA甲基化程度的试剂盒及其应用
<141> 2021-06-28
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> VGLL3基因DNA甲基化特异性上游引物(Homo sapiens)
<400> 1
gttttataag gttgggggtg a 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> VGLL3基因DNA甲基化特异性下游引物(Homo sapiens)
<400> 2
acccccccta attaccaatc cct 23
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物(Homo sapiens)
<400> 3
attaccaatc cctcc 15
Claims (5)
1.一对VGLL3基因DNA甲基化特异性扩增引物及一个VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物在制备用于脑动脉瘤辅助诊断、检测或筛查的试剂盒中用途,其特征是:所述的检测试剂盒内包括一对VGLL3基因DNA甲基化特异性扩增引物及一个VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物:
VGLL3基因DNA甲基化特异性上游引物的核苷酸序列:
5’-Biotin- GTTTTATAAGGTTGGGGGTGA -3’;
VGLL3基因DNA甲基化特异性下游引物的核苷酸序列:
5’-ACCCCCCCTAATTACCAATCCCT -3’;
VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物的核苷酸序列:
5’- ATTACCAATCCCTCC -3’。
2.根据权利要求1所述的一对VGLL3基因DNA甲基化特异性扩增引物及一个VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物在制备用于脑动脉瘤辅助诊断、检测或筛查的试剂盒中用途,其特征是:所述的VGLL3基因DNA被检测序列所在区域为基因前端CpG78区域内。
3.根据权利要求2所述的一对VGLL3基因DNA甲基化特异性扩增引物及一个VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物在制备用于脑动脉瘤辅助诊断、检测或筛查的试剂盒中用途,其特征是:所述的CpG78区域内的具体位置为hg38, Chr3: 86,990,862 - 86,990,913。
4.根据权利要求3所述的一对VGLL3基因DNA甲基化特异性扩增引物及一个VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物在制备用于脑动脉瘤辅助诊断、检测或筛查的试剂盒中用途,其特征是:所述的VGLL3基因DNA被检测序列采用焦磷酸测序技术对VGLL3基因内的12个CpG位点进行DNA甲基化水平分析。
5.根据权利要求4所述的一对VGLL3基因DNA甲基化特异性扩增引物及一个VGLL3基因DNA甲基化特异性测序引物在制备用于脑动脉瘤辅助诊断、检测或筛查的试剂盒中用途,其特征是:所述VGLL3基因DNA甲基化水平与脑动脉瘤的患病率呈负相关。
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CN109777877A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-05-21 | 宁波市第一医院 | 基于ptbp1甲基化辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒及其应用 |
-
2021
- 2021-06-28 CN CN202110719685.5A patent/CN113249486B/zh active Active
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
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A 10‑gene prognostic methylation signature for stage I–III cervical cancer;Shengyun Cai;《Archives of Gynecology and Obstetrics》;20200409;第2020卷(第301期);第1275-1287页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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