CN113355417B

CN113355417B - 一种map3k10基因片段及引物在制备颅内动脉瘤检测试剂盒中的用途

Info

Publication number: CN113355417B
Application number: CN202110646306.4A
Authority: CN
Inventors: 黄毅; 孙杰; 高翔; 聂晟
Original assignee: Ningbo First Hospital
Current assignee: Ningbo First Hospital
Priority date: 2021-06-09
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2041-06-09
Also published as: CN113355417A

Abstract

本发明公开了一种MAP3K10基因片段在颅内动脉瘤的临床诊断检测试剂盒的开发及其应用，所述的检测试剂盒内包括一对MAP3K10基因甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物：其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对颅内动脉瘤的检测，检测效率高，针对性强，同时，以MAP3K10基因甲基化为靶点的药物有望成为颅内动脉瘤辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

Description

一种MAP3K10基因片段及引物在制备颅内动脉瘤检测试剂盒中的用途

技术领域

本发明涉及颅内动脉瘤的辅助诊断技术领域，具体涉及MAP3K10基因片段在颅内动脉瘤的临床诊断检测试剂盒的开发及疗效监测和预后判断领域的应用。

背景技术

颅内动脉瘤(Intracranial aneurysms，IA)是一种死亡率极高的脑血管病，其主要是指颅内动脉血管壁脆弱等原因导致内腔局限性异常膨胀形成一种突出的瘤状。大多数IA破裂前没有任何症状，一旦破裂出血患者死亡率高达40％，并且半数在48小时内死亡。患者即使幸存下来，也有1/3可发生再次出血，发生再次出血者的死亡率高达70-80％。IA发病年龄一般在40-50岁之间，发病凶而急，手术抢救后患者也可能留下不同程度的残疾和后遗症，给患者家庭和社会带来沉重的负担。IA的发病原因尚不十分清楚。目前，研究认为IA的发生、形成是一个复杂的多基因，多生物因子共同作用的过程。吸烟饮酒等不良生活习惯等多种因素通过表观遗传影响相关基因DNA甲基化进而改变基因表达参与到IA的病理过程中。因此，表观遗传学变化在IA致病机理研究中越来越受到重视。

丝裂原活化蛋白3激酶10(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase10，MAP3K10)是MAPK信号通路中的一个激酶，通过多种途径作用于JNK信号通路，在血管炎症，细胞凋亡，神经元分化等方面发挥着重要作用。MAP3K10在人体大脑皮层，海马区，杏仁体，小脑，下丘脑以及肌肉组织中均有着丰富的表达量。人体中MAP3K10含量的平衡有着重要的作用，其基因持续高表达将导致MAPK信号通路中JN和P38的激活，进而促进脑血管病变后神经细胞凋亡以及神经炎症的发生。DNA甲基化是影响基因表达的一个重要因素，高度甲基化能有效降低基因的表达。目前，国内外没有公开任何关于MAP3K10基因甲基化与颅内动脉瘤相关的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测效率高，针对性强的一种辅助诊断颅内动脉瘤的检测试剂盒的开发及其应用，其中MAP3K10基因甲基化水平与颅内动脉瘤的患病率呈负相关。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一组MAP3K10甲基化扩增引物在制备颅内动脉瘤检测试剂盒中的用途，所述的检测试剂盒内包括一对MAP3K10基因甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物：

甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5’-ATTTGGAGTTGGAGAGTTTTAAG-3’；

甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5’-Biotin-CTAAATACAAAACCCCTCACTCACCAAAAC-3’；

甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：

5’-GAGAGTTTTAAGAAGGATTT-3’。

一种辅助诊断颅内动脉瘤的检测试剂盒的应用，所述的检测试剂盒能用于颅内动脉瘤辅助诊断、疗效预后或筛查药物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了用于检测与颅内动脉瘤相关的MAP3K10基因甲基化程度的检测试剂盒及其应用，MAP3K10基因的低甲基化水平导致MAP3K10基因的高表达，引起相关信号通路变化，从而引起脑部动脉血管的紊乱引发疾病，因此，MAP3K10基因内甲基化水平与颅内动脉瘤的患病率呈负相关。以检测MAP3K10基因内甲基化水平为基础的检测试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对颅内动脉瘤的检测，检测效率高，针对性强，同时，以MAP3K10基因甲基化为靶点的药物有望成为颅内动脉瘤辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

附图说明

图1为MAP3K10基因被检测序列所在区域具体位置为hg38，Chr19：40，214，098-40，214，178，该区域所检测的14个CpG位点分布位置；

图2为MAP3K10基因甲基化水平检测结果示例(图中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图示有CpG1到CpG14的甲基化程度分别为93％，90％，86％。70％，73％，79％，98％，68％，91％，68％，83％，95％，16％，81％)；

图3为颅内动脉瘤与对照组间MAP3K10基因甲基化差异图表(表1)；

图4为不同性别颅内动脉瘤与对照组之间MAP3K10基因甲基化差异(颅内动脉瘤患者MAP3K10基因甲基化程度显著低于对照组)；

图5为MAP3K10基因甲基化与颅内动脉瘤的敏感性和特异性(AUC_CpG1＝0.811，最佳临界点时的敏感度为97.9％，特异性为54.2％)；

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5’-ATTTGGAGTTGGAGAGTTTTAAG-3’；

甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5’-Biotin-CTAAATACAAAACCCCTCACTCACCAAAAC-3’；

甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：

5’-GAGAGTTTTAAGAAGGATTT-3’。

1、研究对象的收集

募集愿意参加研究的志愿者，根据颅内动脉瘤的国际诊断标准收集病例组，健康志愿者作为对照组，并采用调查表的形式调查志愿者的一般情况，同时采取静脉血，进行一般血生化检测，具体如下：

从某医院神经外科住院部收集经磁共振成像和血管造影术证实的颅内动脉瘤患者48例(24男；24女)，同时收集性别匹配、年龄相仿的48名正常人作为对照组(24男；24女)。所有参与研究的对象均排除心源性休克、重度心力衰竭、严重室性心律失常、伴有其他严重疾病如恶性肿瘤、严重肝肾疾病等。记录所有研究对象空腹抽血检测血脂、血糖等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，以备用于标本统一提取基因组DNA。

2、基因组DNA的提取

使用基因组DNA抽提试剂盒(QIAGEN)提取研究对象的全血基因组DNA，再通过核酸蛋白测定仪检测所得DNA的浓度，以供PNPLA6基因DNA甲基化水平的检测。

3、DNA甲基化水平测定

本研究采用焦磷酸测序技术对MAP3K10基因内位置为hg38，Chr19：40，214，098-40，214，178区域的的14个CpG位点(如图1)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：

(1)甲基化特异性上游引物(Forward primer)

5’-ATTTGGAGTTGGAGAGTTTTAAG-3’(SEQ ID NO.1)；

(2)甲基化特异性下游引物(Reverse primer)

5’-Biotin-CTAAATACAAAACCCCTCACTCACCAAAAC-3’(SEQ ID NO.2)；

(3)甲基化特异性测序引物(Sequencing primer)

5’-GAGAGTTTTAAGAAGGATTT-3’(SEQ ID NO.3)。

具体实验步骤：

步骤A.采用QIAGEN

亚硫酸氢盐处理试剂盒(EpiTech Bisulfite Kits；Qiagen；#59104)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。

步骤B.取步骤A中转化过的DNA样本20ng加入到Pyromark PCR试剂盒(PyromarkPCR Kit；Qiagen；#978703)，并加入上述一对MAP3K10基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃15min的变性；接着95℃15s，Tm 30s，72℃20s，共40个循环的退火反应；然后延伸反应72℃5min。(注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)

步骤C.焦磷酸测序：

1.在48孔PCR反应板中加入反应结合珠2μL，结合缓冲液38μL，PCR产物40μL，室温下充分混匀10min；

2.开启真空泵吸取结合珠及PCR产物混悬液，依次浸入70％乙醇，0.2M NaOH和冲洗缓冲液中各5s；

3.关闭真空泵，后将探头上结合珠及PCR产物置于40μL退火缓冲液(含测序引物1.5μL)中，85℃变性2min，冷却至室温，使引物与模板退火杂交；

4.根据Pyrosequencing软件序列设计信息所计算出剂量，在试剂舱中依次加入底物混合物、酶混合物及四种dNTP(QIAGEN)；

5.将试剂舱及48孔反应板放入Pyrosequencing检测仪(PyroMark Q48 ID，QLAGEN)进行反应，然后应用使用焦磷酸测序仪自带的Pyro Q-CpG软件自动分析每个位点甲基化状态(甲基化水平检测结果见图2)。

4、数据分析

本次研究采用SPSS 20.0对数据进行整理分析，本研究设计的引物能够检测出MAP3K10基因内位置为hg38，Chr19：40，214，098-40，214，178区域的的14个CpG位点的甲基化情况。通过病例对照组比较，我们发现颅内动脉瘤患者中MAP3K10基因CpG1(p＜0.001)，CpG2(p＜0.001)，CpG3(p＝0.003)，CpG4(p＜0.001)，CpG6(p＜0.001)，CpG7(p＝0.007)，CpG8(p＜0.001)，CpG10(p＝0.001)，CpG11(p＝0.002)，CpG12(p＝0.035)，CpG14(p＝0.001，图2)位点以及平均甲基化程度(p＜0.001，图3)均低于对照组。在男性和女性颅内动脉瘤患者中MAP3K10基因平均甲基化水平也显著低于对照组(男性p＜0.05；女性p＜0.01，图4)。MAP3K10基因甲基化与颅内动脉瘤诊断的敏感性和特异性分析(见图5)，显示CpG1位点的线下面积AUC＝0.811，最佳临界点时的敏感度为97.9％，特异性为54.2％。

本发明辅助诊断颅内动脉瘤的检测试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。采用上述试剂盒对MAP3K10基因甲基化水平进行检测，能够快速、可靠地为颅内动脉瘤的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。

本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。

<110> 宁波市第一医院

<120> 一种MAP3K10基因片段及引物在制备颅内动脉瘤检测试剂盒中的用途

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

atttggagtt ggagagtttt aag 23

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

ctaaatacaa aacccctcac tcaccaaaac 30

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

gagagtttta agaaggattt 20

Claims

1.一对MAP3K10基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物在制备颅内动脉瘤检测试剂盒中的用途，其特征是：

甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5’-ATTTGGAGTTGGAGAGTTTTAAG-3’；

甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5’-Biotin-CTAAATACAAAACCCCTCACTCACCAAAAC-3’；

甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：

5’-GAGAGTTTTAAGAAGGATTT-3’；

MAP3K10基因被检测序列所在区域的具体位置为hg38，Chr19:40,214,098-40,214,178区域的14个CpG位点；采用焦磷酸测序技术对MAP3K10基因内的14个CpG位点进行DNA甲基化水平分析，MAP3K10基因内甲基化水平与颅内动脉瘤的患病率呈负相关。