CN116179681B - 环状rnazbtb10及其检测引物和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测领域,具体涉及一种环状RNAZBTB10及其检测引物和用途。本发明提供的环状RNA ZBTB10的检测引物可以用于检测环状RNA ZBTB10。本发明提供的环状RNAZBTB10检测引物及相应的试剂盒可用于无创检查、诊断和/或筛查FGR,应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域,具体涉及一种环状RNAZBTB10及其检测引物和用途,以及一种试剂盒。
背景技术
胎儿生长受限(Fetal growth restriction,FGR)是指各类原因所导致的胎儿体质量低于同孕龄平均体质量第10百分位数或低于同孕龄平均体质量的2个标准差。国内外研究报道FGR的发生率为5%~10%,是围产期死亡的第二大常见原因。FGR不仅在孕期可能出现死胎,出生后新生儿的呼吸窘迫综合征、低体温、脑出血及智力障碍等远近期并发症的发生风险也显著增加。目前,临床上主要通过超声监测胎儿生长指标,计算预测胎儿体质量(EFW)来诊断FGR,但该方法诊断FGR的准确性差。
胎盘介于母体与胎儿之间,对维持妊娠和胎儿生长发育具有重要作用。胎盘功能不全被认为是FGR的最主要病因,故将胎盘功能不全的标记物或联合胎儿生长指标用于诊断/预测FGR,可能具有良好的诊断效能。由于胎盘与母体血直接接触,胎盘细胞及其代谢产物,包括蛋白质、DNA、RNA和细胞外囊泡等,能通过各种途径进入母体血循环,从而可能成为反映胎盘功能的外周血胎盘标记物。
环状RNA(circRNA)是一种具有共价闭合环的单链RNA。大量动态表达的环状RNA已经被识别出来,并被证明在不同物种的各种细胞系和组织中具有功能。此外,环状RNA比线性RNA更稳定,因此可能作为人类疾病的血液诊断标志物。一些特定的环状RNA已被发现与癌症的临床特征相关,包括乳腺癌和肝癌。然而,胎盘环状RNA在发育过程和FGR中的表达模式和功能尚未见报道,基于胎盘的环状FGR标记物,特别是在无创FGR检测中的标记物仍然未知。
发明内容
本发明提供了一种环状RNAZBTB10及其检测引物和用途,以及一种试剂盒,旨在通过检测环状RNAZBTB10,实现对胎儿生长受限的无创检测、诊断和/或筛查。
本发明的发明人首次发现并鉴定了环状RNAZBTB10,并且确定其在胎儿生长受限病人胎盘中上调。同时,通过实验确认了在滋养层细胞中环状RNA ZBTB10敲低后,细胞迁移侵袭能力升高,从而提升胎盘机能,缓解胎儿生长受限。
相应地,本发明第一方面,提供了一种环状RNA,将其命名为环状RNA ZBTB10(下文也称circZBTB10),该环状RNA是由ZBTB10基因(NCBI GeneID:65986)的第二个外显子经过反相拼接形成的环状RNA。本发明提供的环状RNAZBTB10的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
环状RNAZBTB10的核苷酸序列(SEQ ID NO:1):
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taagaacatcctggttgcaggcagccgtttctttaagactttatattgcttttcaaacaaagaaagccctaaccaaaacaat
actacccacttagatattgctgcagttcaaggtttttcagtcatcttggacttcttgtattctggtaacctggtgctcacaagc
caaaatgccattgaagttatgaccgtggccagctatcttcaaatgagtgaagttgttcaaacttgccgaaatttcattaaag
atgccttaaatataagcattaaatcagaagctccagagtctgtagttgtggactataataatagaaaaccagttaatagaga
tggtctgtcttcatcacgggatcaaaaaattgccagtttttgggcaacacggaatcttaccaatttggcaagtaatgtaaag
attgaaaatgatggttgtaatgtcgacgagggccaaatagaaaactaccaaatgaatgacagtagttgggtccaggatg
gatctcctgaaatggctgaaaatgaatctgaaggtcaaacaaaagtgtttatttggaataatatgggctcccagggaattc
aagagactggcaaaacaaggaggaaaaaccaaactacaaaaagatttatttataatattccacctaataatgaaacgaat
ttagaagattgctcagtaatgcagccacctgttgcctatccagaagaaaatacactactcatcaaggaagaaccag
本发明第二方面,提供了所述环状RNA(即,环状RNAZBTB10)的检测引物,其包括正向引物和反向引物,所述正向引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的序列;所述反向引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:3所示的序列。
在一些实施方案中,所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
用于检测环状RNAZBTB10的正向引物(circZBTB10-F)的核苷酸序列(SEQ ID NO:2):
gattgctcagtaatgcagccacc
用于检测环状RNAZBTB10的反向引物(circZBTB10-R)的核苷酸序列(SEQ ID NO:3):
catttagttgtcgcagaagttgatagc
本发明第三方面,提供了所述检测引物在制备检测、诊断和/或筛查胎儿生长受限的试剂盒中的用途。
本发明第四方面,提供了一种试剂盒,其包含本发明所述的检测引物。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包含用于检测内参基因的引物、反转录缓冲液、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP混合物、氯化镁、水中的至少一种。
在一些实施方案中,所述内参基因为管家基因,包括但不限于β-肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、转录延伸因子基因、泛素基因、β2-微球蛋白基因、18S rRNA等;优选地,所述内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、β-肌动蛋白基因(ACTB)。
在一些优选实施方案中,所述用于检测内参基因GAPDH的引物包括正向引物和反应引物,所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
用于检测内参基因GAPDH的正向引物GAPDH-F的核苷酸序列(SEQ IDNO:4):
agccacatcgctcagacac
用于检测内参基因GAPDH的反向引物GAPDH-R的核苷酸序列(SEQ IDNO:5):
gcccaatacgaccaaatcc
在一些优选实施方案中,所述RNA酶抑制剂的浓度为1IU/μL-40IU/μL。
在一些优选实施方案中,所述氯化镁的浓度为15~30mmol/L。
在一些优选实施方案中,所述水为DEPC水。
在一些实施方案中,所述试剂盒与待测样品进行PCR反应。优选地,所述PCR反应为实时荧光定量PCR反应。其中,所述待测样品是从孕妇血液样品或胎盘组织中提取的RNA。
在一些实施方案中,所述待测样品是从全血或胎盘组织中提取的RNA。然后将所得RNA进行逆转录反应,得到cDNA后,进行实时荧光定量PCR反应,检测环状RNAZBTB10的情况。
在一些优选实施方案中,所述逆转录反应体系如表1所示:
表1
在一些实施方案中,所述逆转录反应的条件是先在42℃反应60min,然后在75℃下反应15min。
在一些实施方案中,所述PCR反应的反应体系如表2所示。
表2
具体地,表2中,在对待测样品进行FGR的诊断和/或筛查时,进行两次所述PCR反应;一次是以本发明实施例提供的所述环状RNAZBTB10的检测引物(正向引物如SEQ ID NO:2所示,反向引物如SEQ ID NO:3所示)进行反应,另一次是以检测内参基因的引物(当内参基因为GAPDH时,其正向引物如SEQ ID NO:4所示,反向引物如SEQ ID NO:5所示)进行反应。表2中,模板cDNA为前述逆转录反应获得的cDNA。
此外,表2所示的反应体系的各成分的量可根据以下原则自行调整:
1.一般来说反应体系中引物终浓度为0.2μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时,可以在终浓度0.1-1.0μM范围内调整引物浓度。
2.qPCR灵敏度极高,建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中,这样可以有效提高实验的重复性。
3.如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
在一些优选实施方案中,所述PCR反应的反应程序依次为:预变性、循环反应和熔解程序。在一具体实施方案中,所述预变性是在95℃下反应30秒(一个循环);所述循环反应包括:(i)在95℃下反应10秒;(ii)在60℃下反应30秒;所述循环反应的步骤(i)和(ii)循环40次(即,循环反应为40个循环);所述熔解程序包括:(i)在95℃下反应15秒;(ii)在60℃下反应60秒;(iii)在95℃下反应15秒(一个循环)。
本发明第五方面,提供了所述试剂盒在检测环状RNAZBTB10中的用途。
本发明第六方面,提供了所述试剂盒在检测、诊断和/或筛查胎儿生长受限中的用途。
本发明第七方面,提供了一种检测、诊断和/或筛查胎儿生长受限的方法,包括:
(1)提供待测样品和本发明所述试剂盒;
(2)提取所述待测样品的RNA;
(3)将所述RNA进行逆转录反应,得到cDNA;
(4)将所述cDNA与所述试剂盒中的组分进行混合处理后,进行QPCR扩增反应;
根据扩增反应结果,计算环状RNAZBTB10的相对表达量(即,相对于内参基因的表达量),当相对表达量大于1.24时,则所述待测样品所来源的孕妇患有胎儿生长受限。
在一些实施方案中,步骤(1)中,所述待测样品为孕妇血液样品或胎盘组织。优选地,所述孕妇血液样品是取自年龄大于18岁的孕妇,更优选妊娠晚期血浆。
步骤(2)中,从血液样品或胎盘组织中提取RNA可使用本领域已知方法进行。
在一些实施方案中,步骤(3)中,所述逆转录反应体系如表1所示。
在一些实施方案中,步骤(4)中,所述QPCR扩增反应的反应程序依次为:预变性、循环反应和熔解程序。在一具体实施方案中,所述预变性是在95℃下反应30秒(一个循环);所述循环反应包括:(i)在95℃下反应10秒;(ii)在60℃下反应30秒;所述循环反应的步骤(i)和(ii)循环40次(即,循环反应为40个循环);所述熔解程序包括:(i)在95℃下反应15秒;(ii)在60℃下反应60秒;(iii)在95℃下反应15秒(一个循环)。
本发明具有如下有益效果:
本发明提供的环状RNA ZBTB10的检测引物可以用于检测环状RNA ZBTB10。由于环状RNAZBTB10在FGR病人胎盘中上调,因此该检测引物及相应的试剂盒可通过检测血浆中环状RNAZBTB10的表达,进而提前预测到FGR的发生,可用于无创检查、诊断和/或筛查FGR,具有准确率高、特异性强、检测时间短的优点,应用前景良好。
附图说明
图1显示了实施例2中的环状RNAZBTB10的扩增曲线;
图2显示了实施例2中的内参基因GADPH的扩增曲线;
图3是在ABI QuantStudioTMDesign&Analysis Software软件中显示的扩增曲线,其中,左边峰为内参基因GADPH的峰,右边峰为环状RNAZBTB10的峰;
图4显示了实施例2中FGR组与对照组血浆中相对环状RNAZBTB10表达水平差异;
图5显示了实施例2中血浆环状RNAZBTB10表达水平对FGR预测ROC曲线;
图6的火山图显示了实施例4中正常孕妇胎盘和FGR病人胎盘中环状RNA表达的差异分析,其中,圆圈圈起来的点表示环状RNAZBTB10;
图7显示了实施例4中环状RNAZBTB10在FGR胎盘组织和正常对照胎盘组织的相对表达量;
图8显示了实施例5中敲低环状RNAZBTB10滋养细胞后相对RNA表达量变化,其中,sh-circZBTB10表示敲低circZBTB10表达的组;linZBTB10表示线性RNAZBTB10的表达;
图9显示了实施例5中敲低环状RNAZBTB10后滋养细胞的迁移和侵袭能力的变化,其中,sh-circZBTB10表示敲低circZBTB10表达的组;
图10显示了环状RNAZBTB10的形成与sanger测序分析结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明作进一步阐述,但这些实施例不对本发明构成任何限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
一种用于诊断FGR疾病的试剂盒,其组分如下:
(11)环状RNAZBTB10的QPCR检测正向引物和反向引物,其中,正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
(12)内参基因GAPDH的QPCR检测正向引物GAPDH-F(SEQ ID NO:4)和反向引物GAPDH-R(SEQ ID NO:5)。
(13)扩增酶(2×ChamQ SYBR qPCRMasterMix)和超纯水。
实施例2
(21)使用实施例1提供的试剂盒,选择80例FGR病人(FGR组)以及76例孕周匹配的正常孕妇(对照组),检测环状RNAZBTB10表达水平。收集各孕妇的静脉全血到10ml含有K2EDTA的真空管中,并在抽血后2h内转移至15ml无RNase的试管中,3000转离心10min,取血浆至无RNA酶的离心管中。血浆加入6倍体积的Trizol,剧烈摇动10秒钟,然后在-80℃下保存直至使用。
(22)取1μg RNA加入0.5μl Random 6mers(100μM)引物(随机引物,用于反转录RNA模板,是Promega反转录试剂盒的组分之一),补水到5μl。75℃下反应5min,冰上淬冷。使用实施例1所得试剂盒,根据下表2配方配制逆转录反应液,再分别加入到淬冷后的管中。反应条件是先在42℃下反应60min,再在75℃下反应15min,4℃保存。
表3
(23)根据诺唯赞Q311-03 QPCR Mix(ChamQ SYBR qPCR MasterMix,用于QPCR的酶)分别进行两次实时荧光定量PCR反应,反应程序如表3所示,反应体系如表2所示:
表4
表5
其中,第一次实时荧光定量PCR反应中,表5中的正向引物如SEQ ID NO:2所示,反向引物如SEQ ID NO:3所示,其扩增结果如图1所示;第二次实时荧光定量PCR反应中,表5中的正向引物如SEQ ID NO:4所示,反向引物如SEQ ID NO:5所示,其扩增结果如图2所示。
(24)结果:计算circZBTB10的相对表达量。
表达量的为2^-ΔΔCt法,过程如下:从qPCR仪器中得到circZBTB10和内参基因GAPDH的Ct值,算出正常孕妇GAPDH Ct值的均值,用每组的circZBTB10 Ct值减去内参基因的Ct值均值得到ΔCt,计算对照正常孕妇组中ΔCt的均值,再用FGR组的每一个Δct减去计算的对照组的Δct均值,得到ΔΔct。2^-ΔΔct即为circZBTB10相对于对照组的相对表达量。
(25)结果分析:如图4所示,FGR病人组较对照组血浆中相对环状RNA ZBTB10表达水平明显较多,说明在血浆中环状RNAZBTB10表达水平上调,其可以作为FGR诊断的标记物。
在血浆中模型的阈值为1.24,大于1.24诊断为FGR阳性,小于等于1.24为FGR阴性。血浆环状RNAZBTB10表达水平对FGR预测ROC曲线如图5所示。以血浆中环状RNAZBTB10为自变量,以FGR为因变量,预测曲线下面积为0.91(95%CI:0.83-0.98),80个FGR病人中预测出76例;对照孕妇76例,根据表达量诊断出69例为FGR阴性,7例为FGR阳性。最后计算灵敏度为91.6%,特异性为94.5%。由此可得:血浆中环状RNAZBTB10表达水平预测FGR发生的准确性较高。具体数据如表6所示。
表6
表6中,“表达量”指的是环状RNA ZBTB10的相对表达量;“实际”指的是对应序号的受试者实际上是否为FGR患者,其中,“是”指的是该受试者实际上是FGR患者,“否”指的是该受试者实际上不是FGR患者;“预测”指的是在实验中预期对应序号的受试者是否为FGR患者,其中,“是”指的是预测该受试者是FGR患者,“否”指的是预测该受试者不是FGR患者。
实施例3胎儿生长受限胎盘组织中环状RNAZBTB10的表达
(31)实验对象
严格按照卫生部教材《妇产科学》第9版规定的胎儿生长受限和正常出生体重的诊断标准来收集标本。按照医学伦理学的要求规定,收集前均征得孕妇的同意。本实施例收集2018年1月至2021年12月于佛山妇幼保健院的产妇样本,胎盘共113例:FGR胎盘53例(FGR组),及同期住院分娩的作为对照的正常出生体重胎儿60例(对照组)。
FGR胎儿出生体重均符合FGR的诊断:处于同孕龄胎儿的平均体重的两个标准差或第10百分位数线下,或孕37周分娩后出生体重不足2500g。
正常对照组胎儿的出生体重均符合诊断:胎儿出生体重大于等于2500g但未到达4000g。两组产妇在孕早期通过超声检测己经核对孕周,两组产妇均为单胎妊娠,两组产妇在孕期均不伴其他合并症,如糖尿病,高血压,甲状腺功能异常,心肝肾异常,遗传疾病,吸烟酗酒滥用药物等;且分娩新生儿Apgar评分均在7分以上。
(32)实验方法
3.2.1标本收集及储存
胎盘标本:在孕妇分娩时,尽量控制在胎盘娩出后的30分钟内,避开胎盘母面的钙化灶和机化灶,刀片划取大小约1.5×1.5×1.0cm的胎盘小块,迅速置于带有RNALOCKER液体的痰杯中,放置在4度保存,24h内将胎盘标本转移置于液氮中储存。
3.2.2qPCR验证环状RNAZBTB10的表达
(1)用Trizol试剂提取组织总RNA;
a)用液氮研磨组织至粉末,加入1ml Trizol试剂,吹打混匀,使组织充分裂解,静置5min;
b)第一步中组织的体积不要超过Trizol试剂的体积的1/10;
c)向组织匀浆中加入氯仿200μl,为使有机相充分接触水相,剧烈混匀振荡EP管1min后,然后室温下静置5min;
d)提前将离心机降温至4℃以下,然后14,000g下离心15min;
e)此时EP管可见已分为三层,上层水相中即含有RNA,吸取上层水相转移至另一个不含RNase的新EP管,再加入相同体积的异丙醇;
f)轻柔地充分地摇晃EP管,室温下静置EP管10min,后4℃下,14,000g离心10min;
g)在管底即可看到白色的RNA沉淀,弃上清;75%的乙醇洗涤底部RNA沉淀两次;
h)用于洗涤乙醇的体积应不小于1ml,4℃下短暂离心,倒掉酒精;
i)超净台下风干EP管,然后在EP管中加入20μl DEPC水用于溶解RNA沉淀。
(2)去基因组DNA
a)使用RNase-free的DNaseⅠ(Promega),按以下体系配置反应液,37℃消化30min,65℃灭活10min;
表7去基因组DNA体系
b)加入相同体积的苯酚,轻柔充分地上下颠倒;
c)将EP管在10,000rpm下离心5min,吸取上清转移至新的EP管中,再加入相同体积的氯仿;轻柔充分地上下颠倒;
d)将EP管在10,000rpm下离心10min,吸取上清转移至新的EP管中,再加入相同体积的异丙醇,轻柔充分地上下颠倒;
e)将EP管放置于-20℃下静置15min后,取出EP管在4℃下,10,000g速度下离心10min;
f)此时可见管底的白色沉淀,倒掉上清;
g)用75%乙醇洗涤RNA沉淀两次后,置于超净台下风干;随后加入15-40μl的DEPC水溶解RNA沉淀。
(3)总RNA纯度检测
a)紫外吸收测定法检测总RNA纯度:使用NanoDrop ND-1000检测样本总RNA的纯度和浓度。A280峰值代表着蛋白的浓度,A260峰值代表着核酸的浓度,A230峰值代表着碳水化合物的浓度。A260/A280比值(260nm和280nm处波长读数的比值)即代表RNA纯度,比值范围为1.8-2.1。如样品中混有蛋白质或酚的污染,则该比值将明显<2.0。A260/A230比值则反映是否混有机成分或混有碳水化合物的污染,比较纯净的核酸,其A260/A230的比值在1.8-2.2,若该比值偏低,提示标本中存在碳水化合物等污染。
(4)逆转录反应
表1
(33)实验结果
3.3.1研究对象的临床基本资料
两组间年龄、孕前BMI、终止孕周、HCG水平比较无显著性差异(P>0.05);FGR组的胎儿体重、PAPP-A水平显著低于对照组(P<0.05)。
表8两组胎盘组织提供者的一般临床资料比较
3.3.2环状RNAZBTB10在FGR胎盘组织及正常对照组织中的表达情况
为获得环状RNA ZBTB10在FGR胎盘组织中表达情况,同时为检测在FGR胎盘组织和正常对照胎盘组织中表达存在明显差异的环状RNAZBTB10,选取3例FGR胎盘组织和3例正常对照胎盘组织进行环状RNAZBTB10的高通量芯片检测。
绘制火山图(图6)可视化FGR胎盘组织环状RNA表达谱,X轴和Y轴分别代表变化倍数FC值和统计学P值,处于垂直线外侧的红色散点则代表有统计学差异表达的circRNA。最终在FGR胎盘组织中发现100个上调及144个下调的circRNA(FC值≥1.5且P值<0.5)。通过图6可以看出,环状RNA ZBTB10在FGR病人胎盘中上调最明显。
3.3.3qRT-PCR验证FGR胎盘组织中差异表达的环状RNAZBTB10
以GATDH作为内参基因,计算PCR反应得出的CT值,采用相对定量法比较FGR胎盘组织和正常对照胎盘组织中环状RNAZBTB10的表达量。结果表明:53例FGR病人的胎盘组织中得到的circZBTB10相对表达量均大于1.28,全部大于对照组。环状RNAZBTB10在FGR病人胎盘中表达上调(图7)。
实施例4环状RNAZBTB10对人胎盘滋养层细胞的生物学行为影响
(41)实验对象
细胞株:人滋养层细胞株HTR-8/SVneo。
(42)实验方法
4.2.1Transwell小室迁移实验
1)收集个处理组细胞,计数1×105个细胞,用100μl无血浆培养基重悬,加入Transwell细胞培养板的小室上室,在下室加入600μl完全培养基;
2)在37℃,5%CO2孵育12-48小时后,取出小室,用棉签擦去上室的细胞,4%多聚甲醛固定20min,PBS洗涤一次,结晶紫染色10min,PBS洗涤一次,显微镜下观察细胞是否穿过小孔,如有穿过终止其他实验组,并拍照统计。
4.2.2Transwell小室侵袭实验
1)4℃溶解Matrigel基质胶过夜,用预冷的无血浆培养基以1:3的体积比稀释Matrigel,取40μl加入预冷的Transwell小室中,37℃孵育2h使Matrigel凝固;
2)吸走小室中多余的液体,并在上室、下室分别加入100μl及600μl无血浆培养基,37℃平衡过夜;
3)细胞转染第二天,计数1×105个细胞,用100μl无血浆DMEM-F12\MEM培养基重悬,加入Transwell小室上室,在下室加入600μl完全培养基;
4)在37℃,5%CO2孵育24、48小时后,取出小室,用棉签擦去上室的细胞,4%多聚甲醛固定15min,PBS洗涤一次,结晶紫染色10min,PBS洗涤一次,检测细胞是否穿过小孔,如有穿过止其他实验组,并拍照统计。
(43)实验结果
4.3.1在人绒毛膜滋养层细胞HTR8/SVneo细胞中敲低环状RNAZBTB10滋养细胞,环状RNAZBTB10表达水平降低,其所在的线性基因表达水平不变(图8)。其中,线性基因的表达水平的检测方式参照实施例2的步骤,将正向引物替换为linZBTB10-F(ccacttagatattgctgcagttcaagg,SEQ ID NO:6),反向引物替换为linZBTB10-R(ccaaattggtaagattccgtgttgcc,SEQ ID NO:7)。
4.3.2敲低环状RNAZBTB10对滋养层细胞迁移侵袭能力的影响
环状RNAZBTB10上调可以引起胎盘迁移侵袭能力下降,敲低环状RNA ZBTB10会使细胞的迁移侵袭能力上调(图9)。说明敲低环状RNAZBTB10可以增强胎盘机能,说明其可以作为药物的靶点。
实施例5
环状RNAZBTB10的发现过程:
取三例FGR病人的胎盘组织和三例孕周匹配的正常胎盘组织做二代测序与生物信息学分析,发现ZBTB10基因的第二个外显子会形成反相拼接,预测其第二个外显子可以成环。因此,在拼接位点的两端设计引物扩增出含拼接位点的序列(引物即环状RNAZBTB10的正向引物和反向引物),用一代测序发现拼接位点真实存在,由此证明了环状RNAZBTB10的存在(图10)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (13)
1.一种环状RNA,其特征在于,所述环状RNA由ZBTB10基因的第二个外显子经过反相拼接形成;所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述环状RNA的检测引物,其特征在于,所述检测引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的序列;所述反向引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:3所示的序列。
3.权利要求2所述的检测引物在制备检测、诊断和/或筛查胎儿生长受限的试剂盒中的用途。
4.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求2所述的检测引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包含用于检测内参基因的引物、反转录缓冲液、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP混合物、氯化镁、水中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述内参基因为管家基因。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述内参基因选自β-肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、转录延伸因子基因、泛素基因、β2-微球蛋白基因、18S rRNA。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因或β-肌动蛋白基因。
9.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒与待测样品进行PCR反应。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应为实时荧光定量PCR反应。
11.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应的反应程序包括:预变性、循环反应和熔解程序。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其特征在于,所述预变性是在95℃下反应30秒;
所述循环反应包括:
(i)在95℃下反应10秒;
(ii)在60℃下反应30秒;
所述循环反应的步骤(i)和(ii)循环40次;
所述熔解程序包括:
(i)在95℃下反应15秒;
(ii)在60℃下反应60秒;
(iii)在95℃下反应15秒。
13.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述待测样品是从孕妇血液样品或胎盘组织中提取的RNA。
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Denomination of invention: Circular RNA ZBTB10 and Its Detection Primers and Applications Granted publication date: 20230922 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Foshan Zumiao Sub-branch Pledgor: Long peptide biopharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2024980000968 |
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