CN114015767B - 一种鉴别颅缝早闭的血清circRNA标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种鉴别颅缝早闭的血清circRNA标志物及其应用，属于生物技术、预防医学和临床医学领域。该标志物选自hsa_circ_0003568、hsa_circ_0000945中的一种或多种。该标志物组合对颅缝早闭具有特异性和敏感性，可用于颅缝早闭早期诊断或监测的试剂盒，为今后颅缝早闭circRNA的研究提供了理论依据，并为从分子水平诊断及治疗颅缝早闭提供了新的思想，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。

Description

一种鉴别颅缝早闭的血清circRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和临床医学领域，尤其是涉及一种鉴别颅缝早闭的血清circRNA标志物及其应用。
背景技术
颅缝早闭(CS)是一种婴儿早期颅骨骨连接的出生缺陷，是一种由异常和非生理性缝合融合引起的先天性颅面畸形，被认为是一种不良的发育结果。颅缝过早闭合会导致一条或多条颅缝过早融合，从而导致颅骨畸形和面部不对称。据估计，约每2500例活产儿中就有一例。如果不及时治疗，CS可能导致严重的并发症，包括颅高压症状、精神和智力障碍、头面部畸形、视力障碍以及其他特殊畸形的特殊综合征。因此对颅缝早闭的诊断和治疗显得尤为重要。随着分子生物学研究日益受到国内外的重视，希望能从分子水平上揭示颅缝早闭的发生、发展，对颅缝早闭在分子水平上有更准确的认识。早期予以确诊，并实施有效的干预手段是提高患者生存及生活质量的关键。
环状RNA(circular RNA，circRNA)是近年来新发现的一类特殊的非编码RNA分子，通过反向剪接形成的闭环，研究表明，circRNA分子因富含微小RNA(miRNA)结合位点，在细胞中以一种类似于“miRNA海绵”的形式发挥作用，它可以解除miRNA对其靶基因的抑制。其主要参与调控基因的表达、基因转录和蛋白质生成。越来越多的研究提示circRNA的异常表达与疾病的发生、发展密切相关。
目前，颅缝早闭的诊断标准主要是头型异常及3D的颅骨CT的三维重建。但由于颅缝早闭临床上的高度异质性，很难在早期准确诊断。近年来的研究发现一些特定的circRNA具有疾病和组织特异性，而且由于其特殊的闭环结构，circRNA对核酸酶不敏感，因而具有良好的稳定性，这使得circRNA在作为临床生物标志物的开发应用上具有明显优势，circRNA在血浆中可长期稳定存在，RNA酶降解作用、煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会造成其损失。正是其良好的稳定性，以及参与机体重要的生理和病理过程，因此极有可能作为一种重要的分子标志物和药物的开发靶点。
目前国内外最新研究成果发现血浆中存在上百种的circRNA，表达量丰富、相对稳定、易于定量检测且特异性较高。研究表明，在结肠癌、肺癌等疾病已经证实血浆circRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在标志物，但是对颅缝早闭相关的circRNA研究和开发的报道较少。因此，筛选出颅缝早闭特异性异常表达的circRNA，并研制其诊断试剂盒对于颅缝早闭的早期诊断具有重要意义，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供颅缝早闭患者血浆circRNA标志物，为临床上颅缝早闭患者的早期发现及早期治疗提供支持。本发明提供的circRNA标志物组合具有较高的特异性和灵敏度。
本发明的另一目的是提供该血浆circRNA标志物检测试剂的应用。
本发明的又一目的是提供一种颅缝早闭辅助诊断试剂。
本发明的具体实施技术方案如下：
一种与颅缝早闭相关的血浆circRNA标志物，所述circRNA标志物选自hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945中的任意一种或两种。
本发明所述的circRNA标志物中，hsa_circ_0003568的核苷酸序列如：
GTTGCTGATCAGCTCTGTGCCAAGTATAGCAAGGAATATGGCAAGCTATGTAGGACCAACCAGATTGGAACTGTGAATGACAGGCTAATGCACAAGCTGAGTGTGGAAGCCCCACCCAAAATCCTGGTGGAGAGATACCTGATTGAAATTGCAAAGAATTACAACGTACCCTATGAACCTGACTCTGTGGTCATG(SEQ ID No.1)所示，；
hsa_circ_0000945的核苷酸序列如
GCAGTGGCGTTGGTGGGAAGCGCAGCTCGAAAAGCGATGCCGATTCTGGTTTCCTGGGGCTGCGGCCCACTTCGGTGGACCCAGCGCTGAGGCGGCGGCGGCGAGGCCCAAGAAATAAGAAGCGGGGCTGGCGGCGGCTTGCTCAGGAGCCGCTGGGGCTGGAG(SEQ ID No.2)所示。
作为本发明的一种优选，所述circRNA标志物为hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945的组合。
检测本发明所述的与颅缝早闭相关的血浆circRNA标志物的试剂在制备颅缝早闭辅助诊断试剂中的应用。
作为本发明的一种优选，检测本发明所述的与颅缝早闭相关的血浆circRNA标志物的试剂为检测所述的circRNA标志物的特异性引物。
作为本发明的进一步优选，检测hsa_circ_0003568的引物如下所示：
hsa_circ_0003568Forward：ACGTACCCTATGAACCTGACTC(SEQ ID NO.3)；
hsa_circ_0003568Reverce：TGGTCCTACATAGCTTGCCA(SEQ ID NO.4)；
检测hsa_circ_0000945的引物如下所示：
hsa_circ_0000945Forward：CGAGGCCCAAGAAATAAGAA(SEQ ID NO.5)；
hsa_circ_0000945Reverce：AGCCCCAGGAAACCAGAAT(SEQ ID NO.6)。
检测本发明所述与颅缝早闭相关的血浆circRNA标志物的试剂，所述的试剂为检测本发明所述的circRNA标志物的特异性引物。
检测hsa_circ_0003568的引物如下所示：hsa_circ_0003568Forward：ACGTACCCTATGAACCTGACTC(SEQ ID NO.3)；
hsa_circ_0003568Reverce：TGGTCCTACATAGCTTGCCA(SEQ ID NO.4)；
检测hsa_circ_0000945的引物如下所示：
hsa_circ_0000945Forward：CGAGGCCCAAGAAATAAGAA(SEQ ID NO.5)；
hsa_circ_0000945Reverce：AGCCCCAGGAAACCAGAAT(SEQ ID NO.6)。
一种辅助诊断颅缝早闭试剂盒，该试剂盒含有检测本发明所述的circRNA标志物的特异性引物。
作为本发明的一种优选，所述试剂盒还包括检测内参GAPDH基因的引物对，逆转录试剂及荧光定量PCR反应液；具体为：
(1)检测GAPDH的正向和反向引物；
(2)DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、水和核酸染料中的至少一种。
作为本发明的进一步优选，所述的检测内参GAPDH基因的引物对序列如下：
GAPDH Forward:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG(SEQ ID NO.7)，
GAPDH Reverse:AGGGGCCATCCACAGTCTTC(SEQ ID NO.8)。
本发明提供一种检测所述circRNA的检测方法，具体包括：
(1)提取外周血血浆：每个研究对象均采用真空抗凝EDTA采血管采集起空腹静脉血5ml,按标准方法在12小时内离心，分离血浆至1.5ml离心管中，保存两份，-80℃冷冻保存备用；
(2)血浆RNA的提取：参照Invitrogen公司Trizol LS试剂操作流程提取血浆RNA，提起前12000rpm 4℃离心10min对血浆进行预处理，获得的RNA-80℃保存备用，RNA的纯度和浓度采用NanoDrop ND-2000仪器检测；
(3)通过Human circular RNA Array V2.0芯片筛选出候选的circRNA，建立颅缝早闭血浆circRNA表达谱。筛选出具有差异表达的circRNA，即hsa_circ_0003568、hsa_circ_0000945。
(4)qRT-PCR检测circRNA：设计circRNA特异性反向引物，采用Takara公司生产的逆转录试剂盒进行RNA逆转录成cDNA，然后采用SYBR-Green染料法(Real-time qPCRMaster Mix,Takara,Japan)检测血浆circRNA表达水平，反应体系和条件参照试剂盒说明书进行。
(5)采用2-ΔΔCt法进行hsa_circ_0003568、hsa_circ_0000945相对于内参的定量。进一步的，采用ROC(receiver operator characteristic curve)法分析评价血浆hsa_circ_0003568，hsa_circ_0000945表达对颅缝早闭患者的早期诊断价值。
本发明的有益效果：本发明提供了与颅缝早闭相关的血浆circRNA标志物，通过绘制颅缝早闭患者与对照人群血浆hsa_circ_0003568表达值的ROC曲线、hsa_circ_0000945表达值的ROC曲线，以及颅缝早闭患者与对照人群血浆hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945组合表达值的ROC曲线，结果显示，hsa_circ_0003568曲线下的面积为0.8329(95％CI：0.7410-0.9248)，hsa_circ_0000945曲线下面积为0.8372(95％CI：0.7430-0.9314)hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945组合的曲线下面积为0.9016(95％CI：0.8289-0.9744)。这些结果表明hsa_circ_0003568、hsa_circ_0000945可被确定为诊断颅缝早闭的强有力的诊断因素。因此，该标志物组合对颅缝早闭具有特异性和敏感性，该标志物的检测试剂可用于制备颅缝早闭早期诊断或监测的试剂盒，为今后颅缝早闭circRNA的研究提供了理论依据，并为从分子水平诊断及治疗颅缝早闭提供了新的思想，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。
附图说明
图1：颅缝早闭患者与对照人群血浆hsa_circ_0003568表达值的ROC曲线。
图2：颅缝早闭患者与对照人群血浆hsa_circ_0000945表达值的ROC曲线。
图3：颅缝早闭患者与对照人群血浆hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945组合表达值的ROC曲线。
具体实施方式
下面将对本发明具体实施的技术方案作进一步详细地说明，以下描述了本发明的优选实施方式，实施中未注明的条件和方法均按照常规进行。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：样本收集
本发明人于2018年7月到2020年10月从南京市儿童医院收集符合要求的颅缝早闭患儿和正常对照血液样本，通过对资料的整理，从中选择了符合要求的40例健康对照、40例颅缝早闭患儿作为实验对象。所有研究对象监护人均签署知情同意书。
实施例2：血浆RNA的提取
采用invitrogen公司Trizol LS(10296028)试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：
①300uL的血浆样本加入750uL Trizol LS试剂，②混匀样本，在室温(15-30℃)放置5min；③加入200μl氯仿，斡旋振荡器上剧烈震荡30s，冰上放置10-15min，4℃12000rpm离心10min取上清；④加入与上清相等体积的异丙醇，室温放置10min后，⑤4℃12000rpm离心15min，弃上清。⑥加入1mL 75％的无水乙醇，混匀，4℃7500g离心10min，弃上清,洗两次⑦室温干燥RNA沉淀至透明，加入适量DEPC水，4℃放置2-3小时，使RNA充分溶解，测定浓度，-70℃保存。
实施例3circRNA表达谱的筛选
选取颅缝早闭患儿和正常对照各5例，委托上海康成生物工程有限公司，利用Arraystar公司Human circular RNA Array V2.0芯片建立circRNA的表达谱，筛选出具有差异的circRNA，随后扩大样本进行验证。
实施例4制备cDNA样本和实时定量PCR：
(1)配制逆反应体系如表1所示：
表1
Figure BDA0003362445200000051
χ反应体系可按要求相应增加，10μL反应体系最大可用500ng的Total RNA。所有操作均在冰上进行。
(2)逆转录：
首先进行逆转录反应(37℃，15min)，再进行逆转录酶的灭活反应(85℃，5s)，结束时温度降至4℃，样品放于4℃冰箱保存
所用引物由上海英骏(Invitrogen)生物有限公司设计并合成，具体序列如表2所示：
表2
Figure BDA0003362445200000061
(3)检测样品中circRNA的表达水平，使用反应体系(10uL)如下：
Figure BDA0003362445200000062
其中逆转录的cDNA原液稀释10倍后加PCR反应体系。
(4)qRT-PCR的反应条件：
Figure BDA0003362445200000063
用罗氏RT-PCR LC480 II进行实时荧光定量PCR反应，反应结束后，在软件上分析溶解曲线，计算Ct值。以GAPDH作为内参来校正PCR的循环拷贝数，通过计算2(-△△Ct)来比较各基因在处理组与对照组之间的差异。
(5)实验结果
hsa_circ_0003568在40例颅缝早闭患者和40例对照人群中的表达值由表1可见，hsa_circ_0003568的表达值在40例颅缝早闭患者的血浆中的表达水平显著高于40例对照组(P＝4.2x10-7)。hsa_circ_0000945在颅缝早闭患者和对照人群中的表达值由表3可见，hsa_circ_0000945的表达值在颅缝早闭患者的血浆中的表达水平显著高于对照组(P＝2.1x10-7)。表3：qRT-PCR检测颅缝早闭患者和对照人群血浆中hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945的表达值和检验P值
对照组 颅缝早闭组 P值
has_circ_0003568 2.3±1.1 3.8±1.2 4.2x10-7
has_circ_0000945 1.8±0.6 3.0±0.9 2.1x10-7
对标志物表达进行ROC分析，判断标志物的诊断效能。图1-3的ROC曲线分析结果显示，hsa_circ_0003568曲线下的面积为0.8329(95％CI：0.7410-0.9248)，hsa_circ_0000945曲线下面积为0.8372(95％CI：0.7430-0.9314)hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945组合的曲线下面积为0.9016(95％CI：0.8289-0.9744)。这些结果表明hsa_circ_0003568、hsa_circ_0000945可被确定为诊断颅缝早闭的强有力的诊断因素。而且，由hsa_circ_0003568、hsa_circ_0000945组成的组合具有比单个circRNA更高的诊断价值。
序列表
<110> 南京市儿童医院
南京医科大学
<120> 一种鉴别颅缝早闭的血清circRNA标志物及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 195
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
gttgctgatc agctctgtgc caagtatagc aaggaatatg gcaagctatg taggaccaac 60
cagattggaa ctgtgaatga caggctaatg cacaagctga gtgtggaagc cccacccaaa 120
atcctggtgg agagatacct gattgaaatt gcaaagaatt acaacgtacc ctatgaacct 180
gactctgtgg tcatg 195
<210> 2
<211> 164
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
gcagtggcgt tggtgggaag cgcagctcga aaagcgatgc cgattctggt ttcctggggc 60
tgcggcccac ttcggtggac ccagcgctga ggcggcggcg gcgaggccca agaaataaga 120
agcggggctg gcggcggctt gctcaggagc cgctggggct ggag 164
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgtacccta tgaacctgac tc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggtcctaca tagcttgcca 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaggcccaa gaaataagaa g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agccccagga aaccagaat 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggggccatc cacagtcttc 20

Claims (5)

1.检测与颅缝早闭相关的血浆circRNA标志物表达水平的试剂在制备颅缝早闭辅助诊断试剂中的应用；所述circRNA标志物为hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945；hsa_circ_0003568的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； hsa_circ_0000945的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测与颅缝早闭相关的血浆circRNA标志物表达水平的试剂为检测与颅缝早闭相关的血浆circRNA标志物的特异性引物。
3.检测与颅缝早闭相关的血浆circRNA标志物表达水平的特异性引物在制备颅缝早闭辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述circRNA标志物为hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945；hsa_circ_0003568的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； hsa_circ_0000945的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该试剂盒含有检测hsa_circ_0003568和hsa_circ_0000945的引物；
检测hsa_circ_0003568的引物序列如下所示：
hsa_circ_0003568 Forward：SEQ ID NO.3，
hsa_circ_0003568 Reverse：SEQ ID NO.4；
检测hsa_circ_0000945的引物序列如下所示：
hsa_circ_0000945 Forward: SEQ ID NO.5，
hsa_circ_0000945 Reverse: SEQ ID NO.6。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参GAPDH基因的引物对，逆转录试剂及荧光定量PCR反应液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的检测内参GAPDH基因的引物对序列如下：
GAPDH Forward: SEQ ID NO.7，
GAPDH Reverse: SEQ ID NO.8。
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