CN105087794B - 一种检测结核病的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与结核病相关的microRNA标志物,该标志物为microRNA 451a,microRNA542,microRNA125b,microRNA146a,microRNA29c,microRNA365,microRNA889,microRNA335和microRNA342。可以通过核酸芯片、qPCR或者测序等技术对上述microRNA标志物进行定量检测,从而用于临床上对结核病的辅助诊断或者对治疗结果的评估等,提高结核病诊断的灵敏度和特异性,为临床治疗评估提供新的依据。
Description
技术领域
本发明涉及microRNA的检测及其运用,更具体的,本发明涉及microRNA 451a,microRNA542,microRNA125b,microRNA146a,microRNA29c,microRNA365,microRNA889,microRNA335,microRNA342在结核病诊断及治疗评估中的作用。
背景技术
结核病是全球最严重的传染性疾病之一,给全人类的健康带来了重大的威胁。然而,目前却缺乏有效的诊断技术。结核诊断金标准-结核菌培养,耗时2-6周,检出率只有30%左右;痰涂片检出率不到30%左右;结核抗体快速检测(胶体金检测),虽然快速,但是检出率不到50%;核酸检测(GeneXpert)虽然方便快速,但是对于菌阴患者灵敏低且费用高;干扰素释放检测(IGRA),虽然灵敏,但是操作复杂,且价格昂贵,而且还不能却分潜伏感染和活性结核。因此,新的诊断技术对于结核病的防治具有重要的意义。
MicroRNA是一类长约19~24 nt的非编码单链小RNA分子。在细胞内microRNA发挥了重要的作用,它可以通过与靶基因3’UTR区互补结合, 抑制靶基因翻译,进而调控生物体的生长发育, 并参与多种疾病过程。 研究表明microRNA在细胞生长、凋亡、分化、极性形成、分泌、代谢等过程中发挥重要作用。 通过对microRNA在不同组织和疾病中的表达谱分析发现, microRNA的表达谱具有明显的组织特异性,在一些疾病中microRNA的表达谱改变具有明显的特征,因此可以作为疾病诊断及治疗标志物。MicroRNAs作为分子标志物,克服了蛋白质分子标志物在抗体制备和定量分析上所遇到的瓶颈。尤其是血清microRNAs具有样本易于采集、保存期长及检测手段简便等特点,临床应用价值也更明显,已成为生物标志物及转化医学研究的热点领域。
关于microRNA与结核病的相关性,目前已经有些报道。但是目前还没有确定哪些microRNA和TB具有明确的相关,可以用于TB的诊断或者治疗评估。本专利公开了几个与TB相关的microRNA,及其检测引物和在TB诊断和治疗评估中的运用。
发明内容
为了解决以上问题,本发明公开了与结核病相关的microRNA序列及其检测引物和探针,以及在结核病的检测、预后中的运用。
本发明的目的在于提供一种检测结核病的试剂盒。
本发明所采取的技术方案是:
一种检测结核病的试剂盒,该试剂盒含有对microRNA 451a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889中至少一种microRNA进行定量检测的试剂。
microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889联合作为结核病检测和/或预后的生物标记物的应用。
一种检测结核病的试剂盒,该试剂盒含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
进一步的,该试剂盒含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行荧光定量PCR检测引物SEQ ID NO:10~27。
进一步的,该试剂盒中含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行反转录的引物SEQ ID NO:1~9。
进一步的,该试剂盒中含有如下探针序列SEQ ID NO:28~36。
一种检测结核病的核酸芯片该芯片含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
一种结核病的预后诊断试剂盒,该试剂盒含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
一种结核病的预后诊断核酸芯片,其特征在于:该芯片含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
本发明的有益效果是:
本发明为结核病提供了新的诊断和预后评估的方法。本发明检测血浆/血清中的稳定的microRNA,而传统潜在分子诊断方案检测蛋白质,在定量测定方面,microRNA的定量精度和灵敏度非常高,使用qPCR技术甚至可以达到单分子检测的能力;而传统方法检测蛋白质,灵敏度较低,且定量精度较差。
附图说明
图1为microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889在结核病不同阶段的表达情况;
图2为microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA8895单独区分TB感染者和健康者的ROC曲线;
图3为microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA8895联合区分TB感染者和健康者的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
实施例1
样本:健康人血清50份,结核菌潜伏感染者血清50份,活动性结核病患者血清50份,结核病治愈者血清50份;
本实施例对上述样本血清中的microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测,具体操作步骤如下:
1)血清microRNA提取:提取试剂盒:GIAGEN公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit。
)逆转录:将上步提取的microRNA利用Tiangen生物科技有限公司的逆转录试剂盒Quant qRT-PCR kit (SYBR Green)进行逆转录;逆转录引物如下:
microRNA125b逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACgtccca(SEQ ID NO:1);
microRNA146a逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaaccca(SEQ ID NO:2);
microRNA29C逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACtaaccg(SEQ ID NO:3);
microRNA365逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACataagg(SEQ ID NO:4);
microRNA335逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacattt(SEQ ID NO:5);
microRNA542逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACtttcag(SEQ ID NO:6);
microRNA342逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacgggt(SEQ ID NO:7);
microRNA889逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacaatg(SEQ ID NO:8);
microRNA451a逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaactca(SEQ ID NO:9);
其中选择microRNA29C作为内参基因。
)荧光定量PCR:取上步反转录产物作为模板,分别对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行qPCR定量检测,qPCR的操作按照Tiangen生物科技有限公司的试剂盒SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)进行操作;qPCR的引物如下:
microRNA125b-F: CGCTCACAAGTCAGGCTCT(SEQ ID NO:10),
microRNA125b-R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:11);
microRNA146a-F: CGCCGTGAGAACTGAATTCCA(SEQ ID NO:12),
microRNA146a -R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:13);
microRNA29c-F: CGCCGTAGCACCATTTGAAAT(SEQ ID NO:14),
microRNA29c -R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:15);
microRNA365-F: CGCCGTAATGCCCCTAAAAAT(SEQ ID NO:16),
microRNA365-R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:17);
microRNA335-F: CGCCGTCAAGAGCAATAACG(SEQ ID NO:18),
microRNA335-R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:19);
microRNA542-F: CGCCGTGTGACAGATTGATAA(SEQ ID NO:20),
microRNA542-R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:21);
microRNA342-F: CGCTCTCACACAGAAATCGC(SEQ ID NO:22),
microRNA342-R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:23);
microRNA889-F: CGCCGTTAATATCGGACAAC(SEQ ID NO:24),
microRNA889-R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:25);
microRNA451a-F: CGCCGAAACCGTTACCATTAC(SEQ ID NO:26),
microRNA451a-R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:27)。
检测探针分别为:
microRNA125b-P: CGCTCACAAGTCAGGCTCT(SEQ ID NO:28);
microRNA146a-P:GCCGTGAGAACTGAATTCCA(SEQ ID NO:29);
microRNA29c-P:CGCCGTAGCACCATTTGAAAT(SEQ ID NO:30);
microRNA365-P:CGCCGTAATGCCCCTAAAAAT(SEQ ID NO:31);
microRNA335-P:CGCCGTCAAGAGCAATAACG(SEQ ID NO:32);
microRNA542-P:CGCCGTGTGACAGATTGATAA(SEQ ID NO:33);
microRNA342-P:CGCTCTCACACAGAAATCGC(SEQ ID NO:34);
microRNA889-P:CGCCGTTAATATCGGACAAC(SEQ ID NO:35);
microRNA451a-P:CGCCGAAACCGTTACCATTAC(SEQ ID NO:36);
荧光定量PCR反应条件:50℃ 2min; 95℃ 2min; 95℃ 15s,60℃ 32s,40 循环;获取溶解曲线。
)结果分析:
各样品中microRNA 451a,microRNA542,microRNA125b,microRNA146a,microRNA29c,microRNA365,microRNA889,microRNA335和microRNA342的荧光定量PCR检测结果如图1所示,从图1中可看出所检测的9个microRNA在结核病患者外周血清中显著上调,在治愈的TB患者外周血中又显著下调,说明microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889可以作为结核病检测和预后的生物标记物。
利用统计法,对上述9个microRNA单独作为临床诊断结核分枝杆菌感染指标的诊断进行效能评估,检测单个指标检测TB的灵敏度和特异性性,及对应的ROC曲线,如图2和表1所示。
表1为9种microRNA单独区分结核分枝杆菌感染者和健康者的效能评价
从图2和表1中可以看出,各microRNA诊断效能ROC (Receiver OperatingCharacteristic)曲线下面积(Area Under the ROC Curve,AUC)均在0.66以上,说明利用上述9种microRNA可用于检测结核分枝杆菌,可见这些指标在活动性结核的诊断上具有一定的意义。(请确认上述描述是不可行)
利用统计法,对上述9个microRNA联合作为临床诊断结核分枝杆菌感染的指标,对联合指标的诊断效能进行评估,检测联合指标检测TB的灵敏度和特异性性,及对应的ROC曲线,如图3和表2所示。
表2为9种microRNA联合区分结核分枝杆菌感染者和健康者的效能评价
从图3和表2中可以看出,其诊断效能为:ROC (Receiver OperatingCharacteristic)曲线下面积(Area Under the ROC Curve,AUC)为0.925,非常接近1,说明利用上述9种microRNA可用于检测结核分枝杆菌的正确率非常高。其区分的效能分别为敏感性95、特异性90,可见本发明9种microRNA的联合指标在活动性结核的检测上具有很好正确率、高灵敏性及高特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广东省结核病控制中心
<120> 一种检测结核病的试剂盒
<130>
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (6)
1.microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889联合制备结核病检测和/或预后的试剂盒的应用。
2.含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂在制备检测结核病试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,所述试剂盒包括对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行荧光定量PCR检测引物SEQ ID NO:10~27、反转录引物SEQ ID NO:1~9、探针序列SEQ ID NO:28~36。
4.含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂在制备检测结核病核酸芯片中的应用。
5.含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂在制备结核病预后诊断试剂盒中的应用。
6.含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂在制备结核病预后诊断核酸芯片中的应用。
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Comparative miRNA Expression Profiles in Individuals with Latent and Active Tuberculosis;Wang c等;《plos one》;20111007;第6卷(第10期);1-11 * |
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Tuberculosis-related miRNAs have potential as disease biomarkers;xu yh等;《Journal of Tuberculosis Research》;20131231;第1卷(第2期);17-27 * |
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