CN106566889B

CN106566889B - 检测奇异变形杆菌的引物及探针、试剂盒、方法

Info

Publication number: CN106566889B
Application number: CN201610982728.8A
Authority: CN
Inventors: 石晓路; 扈庆华; 袁建辉; 姜伊祥; 林一曼; 邱亚群; 李迎慧; 江敏; 陈琼城; 白芳
Original assignee: Center Of Diseases Prevention & Control Shenzhen City
Current assignee: Center Of Diseases Prevention & Control Shenzhen City
Priority date: 2016-11-07
Filing date: 2016-11-07
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2036-11-07
Also published as: CN106566889A

Abstract

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测奇异变形杆菌的引物及探针、试剂盒、方法。本发明公开一组用于检测奇异变形杆菌的引物及探针包括：针对检测四种目标序列的引物和探针。一种检测奇异变形杆菌的试剂盒，该试剂盒包括上述检测奇异变形杆菌的引物及探针。本发明提供的引物和探针，能准确检测到奇异变形杆菌，其特异性好，灵敏度高，避免了假阳性的出现，而且试剂盒成本低，使用方便，适用于对奇异变形杆菌的快速筛查。

Description

检测奇异变形杆菌的引物及探针、试剂盒、方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测奇异变形杆菌的引物及探针、试剂盒、方法。

背景技术

奇异变形杆菌(Proteus mirabilis,PM)属于变形杆菌属(Proteus)，为人和动物肠道中的常居菌，它是一种条件致病菌，在一定条件下可引起肠道内感染。某些血清型菌株具有较强的致病性，可通过饮食导致腹泻，奇异变形杆菌是细菌性腹泻的常见病原菌。PM感染主要见于婴幼儿，近年来其在成人腹泻病人中的检出率有所增加，并成为部分地区致腹泻的主要病原菌，且对常用药物逐步出现了耐药性，因此受到了广泛的关注。PM引起的临床症状多为水样腹泻，无法从症状判读致病菌并指导临床用药。

PM鉴定检测的标准方法是传统分离培养技术。而传统PM鉴定方法需要经过一系列复杂的实验步骤，检测周期长，操作繁琐，准确性低，耗时费力，无法满足临床和实际工作的需要。随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术已被广泛应用于细菌的检测和分类。然而常规PCR后电泳容易导致污染，易产生假阳性，使检测结果不准确。人们如果因食物或其他原因中毒而引起致腹泻，需要快速准确判断是何种病菌引起，但迄今为止，没有一种能够准确快速鉴定奇异变形杆菌的方法，目前的检测效率有待提高。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种快速准确检测奇异变形杆菌的引物及探针、试剂盒、方法，以解决目前奇异变形杆菌检测方法周期长、效率低、易产生假阳性等问题。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一组用于检测奇异变形杆菌的引物及探针，包括：

针对目标序列一的上游引物SEQ ID NO:1和下游引物SEQ ID NO:2，以及探针SEQID NO:3；

针对目标序列二的上游引物SEQ ID NO:4和下游引物SEQ ID NO:5，以及探针SEQID NO:6；

针对目标序列三的上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8，以及探针SEQID NO:9；

针对目标序列四的上游引物SEQ ID NO:10和下游引物SEQ ID NO:11，以及探针SEQ ID NO:12。

本发明提供的该组引物和探针，能准确检测到奇异变形杆菌，其特异性好，灵敏度高，避免了假阳性的出现。

本发明还提出一种检测奇异变形杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测奇异变形杆菌的引物及探针。

本发明提供的试剂盒成本低，使用方便，适用于对奇异变形杆菌的快速准确筛查，在临床上有广泛的应用。

本发明还提供一种利用上述试剂盒检测奇异变形杆菌的方法，包括如下步骤：

获取样本核酸；

将所述核酸样本与所述试剂盒配成反应体系，进行荧光定量PCR扩增；

根据所述扩增结果确定所述样本是否含有奇异变形杆菌。

本发明提供的奇异变形杆菌检测方法，可以快速鉴定奇异变形杆菌，其具有灵敏度高，操作简便，特异性好，避免了假阳性的出现等优点，可广泛应用于食品、水源安全等医药卫生领域。

附图说明

图1是实施例中奇异变形杆菌检测的荧光定量PCR扩增结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一组用于检测奇异变形杆菌的引物及探针，其核苷酸序列如表1所示。

表1

发明人通过对奇异变形杆菌进行全基因测序，并通过生物信息学对比分析，获得奇异变形杆菌中有四段特异的基因序列：目标序列一(序列号SEQ ID NO:13)、目标序列二(序列号SEQ ID NO:14)、目标序列三(序列号SEQ ID NO:15)和目标序列四(序列号SEQ IDNO:16)；这四段目标序列具体核苷酸序列如下。

>目标序列一：C02011_Scaffold001_1069603_1193788_()_1200_3058

ATGGCTGATATTATTTACCTAACATTAAATGGAAATAAACAAGGACTTATATCTGCTGGTTGTTCTTCTTATGATTCAATAGGAAATCGTTATCAAAATAATCATAGTGATGAAATTTTAGTATATTCAACAGATTATGATATTAGTCGTCATCAGAATATATCTCACGCCCCTTTTGTTTTTGAAAAAGCTAATGATAAATCCTCTGCCTTGCTTTTATCTAGTATAACAAATATGAAATTTTGGAATGTGATTTTAAATATTATCGTATCGATAAAAACGGAGGGTTATTACACTATAAAACGATCAAATTGA

>目标序列二：C02011_Scaffold001_1069603_1193788_()_88310_92401

TCAATCAAAGCCTTCCAATAAATCATTCACACCATTAGATGTATCTGAAACGATATCATCTAATGCTTTCATGGCTAAAGACTTGTATATCACGGGAATTGTTAAGGTATGTCTAAATTGCAATAATATACTTATAATGTCAGGAATTATGTCATTACTGTATCCCTTAACATAGCCTGAATTAGTTGATATCATTACGTTTTCTGGGATTTTTAAAGAATCTAAAGATAACCGATTATAATAGTCTTTTTCTTTAAAGAAATACTCATTATTCTTTAGCCTAAGTATATCAAAAACAGTATTTTTTAACGAAACTGGATAAGTTATATGAGTAATATACTCACGAAACCCTATAAAATTATTTTCAAAAGAACTATGTGAAAAATCACTTTCTTCAAAAACATATACATTATCAAGAATATTTAGATCACCCAAATTAGCATTACTATATGGTGTTAAAAGTAATTTTAAATCAGAAAAAAAACTAATGCTTGCCCATATTTCTTTGTTGCAATCATCTAAAAAGTCAAGATCTTCTAGTTTTTCTAAATGCTCAAAATATTCAGTGAGACATTTACGAAGAATTGATTTTCTAAAAGAAGCATAGTCAATATCAGAACAGAGCTCAATTATATTTTTATATTTAACAGCACTACCACTCTCATATAACTTTAATAAAAGGTCATCTCTTTTATCCTTAACTTCAATACAAATAAATTCTGCACTAAAATACTCCATAAGTGATTTATGAGACCATCGATAAAGAGCGCCTTCCTTAATAAATAAAGGTACTGAATATGTCAAATCGTTAATAAAAGAAATAGGTTTAACATTAACTCCTTTTAGTTTTTCTGTTATATTAGTTAAAATACTTTCAAGTTCTGCCCTACTAAATTCTAGTTTGCCATTATTTTTTAAACACCAAAATGCAAGCCTACGAAGTATGATGCTAAAGTCAGTTATATCCAAACCAGAAGATTTTTCTCGAACATAACCAGTTTCTTTACTAAGGTCATGGGTTTCAAAAAGAGCTTCAAAAACTTGACTATAAAATAAATCTTTTCGCCTTGGTATAACTGGTTTATACCTATAAGAACAAAATAAAAGGGATACATATAAAGGTGTTGTTAAAAACTCTAAAATAGTATTATTTTCCTTTTCTCTCATTAACTTAATTTCTGTAATTAACTTGTTTGAAAGAATTAGTCTATTTCCTCTTTTGACTAGGTTTATGTCATATAACTTAATAAGATCATATGATTGCTCTATCTCTAATGGCTTAATTTTAAATCTATTAAAAGAATGAAGTTCAAGTAATGATTGATCTGGCCTAGAAGTAATGATAATTTTAGAATTACTCATCTCATCACTAAACACCTTTATTTTCTTTATTAAATCATTCTTTAAATCAAATGGTATTTCATCCACACCATCAAAGAAATATATAAAAGGTATTTTTTTTAAAATGCTATCACTATCATTAACATCATCAAAACCTAATAATTTATTAATTTGCTCTTCAATAGGATTATTGGTGAGAGTTCTTAACTCTATATAAATTGGAATGTATTCTGAATGATCAATAGTATCAATAACTATTTTTTTCATCAGGGTTGATTTTCCCATCCCTGCATTATCAATTATCAATATGTTATTAAATTCACTTAGGAACAAATCACCTCTCTTAATAGTGTGTTCTCTTTCTTCTCTTGAATCCAACATTGATAATGTCAAAGGAATATAAATATCGTTCACTTTTTTTAATACATTAGGAAACGCTAAAGAATTAATTACTGAACACTGGGCTCTAGTTTTAGCTAAATAGTCTGACATCTGACCTTTAAGTTTATATAAATTTTTTTTTCTATTATAAACATCTGCACCTTTACAAAAAACAAAAGGAAGCACCTTCTCTTCAAAAATCTTGAAGGCCCAAGGTTTAAAAAGTTCAACTGCATTTTCAATAGTTATCAT

>目标序列三：C02011_Scaffold001_349442_454423_()_306_8207

ATGAACCTGATCAGACTATTAAAGAGCAATTTGCAACTGTTCAGTCTGTTCTTGAAAAAAAACAATCCCGTTATCAGTAAAATTGATTTTGATTGTGGTCTGTTAGAACAGGTTCTCGATCCAGATAATGTACTCAGTTGGGGATACTGGATTAAACATCATTGTCACTGCGTTTATGGCGAGGACTTAAGCCATCACTTTCAAGCTTTCAAACCTTCAAAAGCTATTGCAGTGGCCGTGAATGGTGACTTTATGGAGGTTTTGGACAAACTAGTCATTCAAATAAAAGCATCTTCTAATGAAAATAAAAAGTTACAGCTTCGGCGCTCGGCTGCACGAAAGCTTATCAGAGCAACCAACATCCTTCGTAGTGAACAAGATAATGACTGGCCGGACTCTCTCCATGAGTACCGCGCCAAATTTAATTCACGGTATCCTGCATTAGCGGAAGATATGGATTACCTATTAGAAATTAGTATTAAACCTCGAGAGAGCATAGCAGACTTTGAAAAACGGGCTATGGCATTTGCCCGCTGGCTTAGCTGCGAATTTAATAACCAAAAAGCCTAA

>目标序列四：C02011_Scaffold006_75379_114777_()_33694_36805

TTATTTAGATAAAGCTTGAGCAAGCAAAATAATATTTTTTTCAATTTCAGAGGGATGGTGTGCGGCATACCCTAATAATATACCCTGTTTAGGATAAGATTGAATACAATAACGCGATAAAGGCTGTATGGCTAACCCAATTTTCCGTCCCTCTTTCACAATATATTCTTCTGTATAACCAGACTGTAACCAGCAGACAATATGGATGCCAGAATCAGTCGGTTCAATACGAAAAATGTGAGAGAGATACTTTTTTATCGTATTGGTTAACGTTAGATAACGTTCATAACAGGCTTTTCTGATCCGTCTAACATGGCGAGCATAATGTCCTTGAGATATAAATAGCGCTAATGTTGCTTGTTCTAAAAAACCAGAATGAGAGTCGGTGTAGTATTTAGCGACTTTAAAGCTGTCAATTAAAGATGGAGGTACCACTAAAAAGCCTAAACGAAATCCCGGGTACATCATTTTTGAAAAGGTTCCGGCATAAATAACCCGCTGATGTTTGTCTAATCCTTGTAGAGCTTGAATGGGTTTAGTGTGATAGCGAAATTCGCTATTGTAATCATCTTCAAAGATCCACATGTTATTGGACGATGCCCACTCTAATAAGGCAATACGACGTGAAAGTGAAAGAGTATTACCTAAAGGGAATTGATGTGAAGGTGTGGTGAAAACTAGTTTTGCTTGCGGGCATTGGTCTATAGCTTGAGAAATATCCATACCGTCACTATCTGAACGAACGGGGTGTATTTTTATACCATACGATGTGAAGATAGCTCGAGCGCTGTCATAACCAGGATCATCTAACCAAGCAGTATCTTCCTCTTGTAATAGCACTCGAGTAGCAAGATTAATCGCTTGCTGTGTGCCATTGACAATGATGACTTGCTCAGGTTGACAGTTAAGCCCACGTGTTGATTGGGCATATTGGCATATCATCTTTTTTAATGGTGTATAGCCTGTTGGCGAGTTAAAGGTTGCGAGTTCTTTTTTGGAGTGTCGCCAAACTCGTCCTAATAATCTTCCCCAAAGCTCATGGGGGAAAAGATCAATACACCCAACACCCACATGAAACATAAAGCGACTATTGGTATTTAGTTGTGATTGTTGCCAAAAAGCATGCATCTTTTGCAAATTAGGATTAAGTGTTCCTAATTCATTATCGATATGCAATGAAGACGTCGGCAGGGTTGTTTTAACCCACTGATTGGAATTAATGCTATCAGGAATGGTATTCGTAACAAAAGTGCCCGACCCGCGACGAGTAAATAAATAGCCTTCATCAATTAAACGTTCAAATCCGGCAATAACAGAATTGCGAGAAATCGACATCATTTCAGCCAATGTGCGACTTGACGGTAGACGGCTACCCGGAGATAGAACGCCTTCTAAAATAGCCTTTCTAACGGCGTAATAGACTTGTGAGCTAATAGACCCTTCTTCTAATACAAGGTTAGGGAAATAAGCTGTTGGTTTCTGTTTCAT

本发明提供的引物和探针，就是针对该四段目标序列的核苷酸序列进行创造性设计得出，能准确检测到奇异变形杆菌。该引物和探针特异性好，灵敏度高，避免了假阳性的出现；显著优于常规方法设计的引物。

具体地，在本实施例中，每条探针5’端连接有荧光基团，分别为HEX、ROX、Cy5和FAM；探针3’端连接有淬灭基团，为DABCYL。

连接至探针5’端的荧光基团可发出荧光信号，连接至探针3’端的淬灭基团可以抑制荧光基团发出的荧光信号，在荧光定量PCR反应过程中，淬灭基团与荧光基团分离，荧光基团可以发出荧光信号，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。

本发明实施例还提供一种用于检测奇异变形杆菌的试剂盒，该试剂盒包括上述检测奇异变形杆菌的引物及探针。在具体实施例中，该引物及探针的各自浓度都为0.1-0.3μM，优选0.2μM。

本实施例提供的试剂盒成本低，使用方便，适用于对致腹泻奇异变形杆菌的快速筛查，在临床上有广泛的应用。

更重要的是，在日常生活中，当人们因食物、水源或其他原因中毒致腹泻时，需要快速判断中毒原因，从而为临床用药提供重要的指导。本发明实施例提供的试剂盒能准确快速鉴定中毒原因是否是奇异变形杆菌感染，而且进一步辅助进行奇异变形杆菌的基因分型，及时指导用药，为国家卫生安全提供有力保障。

具体地，在本实施例中，四种探针序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12的5’端的荧光基团分别依次为HEX、ROX、Cy5和FAM。通过上述探针和荧光组合，使得该反应管体系构成四重反应体系，使得检测结果更易识别，减少了相互干扰，提高了检测准确度。

具体地，在本实施例中，试剂盒还包括：缓冲液、MgCl₂、dNTP、DNA聚合酶；其中MgCl₂的浓度为2-4mM，优选3mM，dNTP的浓度为0.1-0.3mM，优选0.2mM，DNA聚合酶活性浓度为0.8-1.2U/μl，优选1U/μl。

在上述成分及优选的浓度范围内，该试剂盒的性能达到最优。

具体地，在本实施例中，DNA聚合酶为rTaq酶。

具体地，在本实施例中，上述试剂盒还包括Homo-tag序列SEQ ID NO:17，其核苷酸序列如表1所示。该Homo-tag序列浓度为0.5-1μM，优选0.6μM。

该Home-tag序列与上述各对引物的标签部分序列相同(即加尾引物)。该Homo-tag序列系统可有效地抑制引物二聚体的产生，减小多重PCR体系中各基因间扩增效率的差异，提高定量的精确度。

本发明实施例还提供一种利用上述试剂盒对检测奇异变形杆菌的方法，包括如下步骤：

S01：获取样本核酸。

S02：将核酸样本与上述试剂盒配成反应体系，进行荧光定量PCR扩增。

S03：根据扩增结果确定样本是否含有奇异变形杆菌。

本实施例提供的奇异变形杆菌检测方法，可以快速鉴定奇异变形杆菌，其具有灵敏度高，操作简便，特异性好，避免了假阳性的出现等优点，可广泛应用于食品、水源安全等医药卫生领域。。

具体地，在步骤S01中，核酸来自于任何检测样品，比如来源人体粪便、食品、农产品、饮用水等涉及安全卫生方面的环境中，只要能对样品的核酸进行提取即可进行检测。且其中提取核酸可以采用水煮法使菌体破裂而获得DNA，但不限于此方法。

具体地，在步骤S02中，该反应体系为25μl，其中具体组成和含量如下：

具体地，在步骤S02中，上述荧光定量PCR扩增的反应程序为：

95℃预变性3min；

95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸20s，共5个循环；

95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，共40个循环。

在上述体系各具体组成和含量以及反应程序条件下，本实施例中荧光定量PCR的效果达到最佳。

具体地，在步骤S03中，对奇异变形杆菌检测分析主要是根据荧光定量PCR反应体系的荧光强度进行测量分析，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值在35至38之间时，有明显指数扩增判断为阳性，否则为阴性。

本发明实施例的奇异变形杆菌检测方法可快速准确鉴定样本中奇异变形杆菌的存在，该方法还可广泛用于临床及实验室中对于奇异变形杆菌的分析和研究，还可用于对于食品、水源等中是否有奇异变形杆菌感染的检测，以防止食品、水源污染。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1奇异变形杆菌检测试剂盒

1.针对全基因测序得到的目标序列一，目标序列二，目标序列三和目标序列四设计引物和探针，合成其引物和探针的核苷酸序列以及Homo-tag序列(如表1所述)，其中各探针序列3’端均连接有DABCYL，各条探针序列5’端对应的荧光基团为：SEQ ID NO:3对应于HEX，SEQ ID NO:6对应于ROX，SEQ ID NO:9对应于CY5，SEQ ID NO:12对应于FAM。

上述的每条引物和探针制备成0.2μM浓度的储存液，Homo-tag序列制备成0.6μM浓度的储存液。

2.分别制备PCR缓冲液，MgCl₂溶液，dNTP溶液，rTaq酶溶液；其中，MgCl₂浓度为3mM，dNTP浓度为0.2mM，rTaq酶活性浓度为1U/μl。

由上述成分，组装制得奇异变形杆菌检测试剂盒。

实施例2奇异变形杆菌的检测分析

1.样本核酸提取：分别对临床奇异变形杆菌引起的腹泻者和健康人群的粪便样本各取约0.2g或200μl加到1.5ml EP管中，加入标本处理液(PBS缓冲液或生理盐水)，震荡3次，每次10秒。静置10分钟，再以8000rpm离心5分钟，吸取上清直接用水煮法进行核酸提取，获得10-100ng/μl核酸模板。

2.荧光定量PCR反应：

取实施例1制备的检测试剂盒，向每个PCR反应管中加入5.0μl上述步骤1获得的核酸模板，每个PCR反应管中25μl反应体系的成分如下：

然后将PCR反应八联管送入荧光PCR仪(staragene-3005)进行检测，PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸20s(共5个循环)；95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s(共40个循环)，并在第二个循环周期的退火阶段进行荧光信号检测，该程序由仪器自动执行。

3.结果分析

本实施例的结果如图1所示：致腹泻的每个样本PCR反应管中的扩增图都有四条荧光扩增曲线，而健康人群的样本PCR反应管中无扩增曲线。结果说明，该试剂盒和方法能准确鉴定奇异变形杆菌。同时，发明人还用常规方法设计的引物进行对比分析，荧光定量检测结果显示，常规方法设计的引物的扩增结果图无扩增曲线(即阴性)。

表2中是目前已知的跟肠胃疾病相关的菌种，发明人提取其相应菌种的核酸样本并用本实施例的方法检测分析，荧光定量结果图显示：都无扩增曲线(即阴性)。

表2

实施例3特异性分析

申请人同时获得194株涉及肠杆菌、球菌、弧菌等细菌，利用实施例一的检测试剂盒进行特异性分析实验，并以奇异变形杆菌阳性菌株作为对照，检测菌株的情况见表3，其检测结果均为阴性。该实施例的结果表明：本发明实施例1提供的试剂盒中的引物和探针，特异性良好，其未出现非特异性扩增，从而避免了非特异性引起的假阳性的出现。

表3

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市疾病预防控制中心

<120> 检测奇异变形杆菌的引物及探针、试剂盒、方法

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列

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gcaagccctc acgtagcgaa aacaaggact tatatctgct ggttg 45

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcaagccctc acgtagcgaa tactagataa aagcaaggca gagga 45

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<212> DNA

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<212> DNA

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gcaagccctc acgtagcgaa cacaccatta gatgtatctg aaacg 45

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcaagccctc acgtagcgaa atcccagaaa acgtaatgat atca 44

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ccccgtgctt tcatggctaa agacttgtat atcacgggg 39

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gcaagccctc acgtagcgaa atggtgactt tatggaggtt ttg 43

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<212> DNA

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<212> DNA

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ccggctgcac gaaagcttat cagaggccgg 30

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<213> 人工合成

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gcaagccctc acgtagcgaa atgagagtcg gtgtagtatt tagcg 45

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<212> DNA

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<212> DNA

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cccgggcact aaaaagccta aacgaaatcc cggg 34

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<212> DNA

<213> 奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）

<400> 13

atggctgata ttatttacct aacattaaat ggaaataaac aaggacttat atctgctggt 60

tgttcttctt atgattcaat aggaaatcgt tatcaaaata atcatagtga tgaaatttta 120

gtatattcaa cagattatga tattagtcgt catcagaata tatctcacgc cccttttgtt 180

tttgaaaaag ctaatgataa atcctctgcc ttgcttttat ctagtataac aaatatgaaa 240

ttttggaatg tgattttaaa tattatcgta tcgataaaaa cggagggtta ttacactata 300

aaacgatcaa attga 315

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<211> 1974

<212> DNA

<213> 奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）

<400> 14

tcaatcaaag ccttccaata aatcattcac accattagat gtatctgaaa cgatatcatc 60

taatgctttc atggctaaag acttgtatat cacgggaatt gttaaggtat gtctaaattg 120

caataatata cttataatgt caggaattat gtcattactg tatcccttaa catagcctga 180

attagttgat atcattacgt tttctgggat ttttaaagaa tctaaagata accgattata 240

atagtctttt tctttaaaga aatactcatt attctttagc ctaagtatat caaaaacagt 300

attttttaac gaaactggat aagttatatg agtaatatac tcacgaaacc ctataaaatt 360

attttcaaaa gaactatgtg aaaaatcact ttcttcaaaa acatatacat tatcaagaat 420

atttagatca cccaaattag cattactata tggtgttaaa agtaatttta aatcagaaaa 480

aaaactaatg cttgcccata tttctttgtt gcaatcatct aaaaagtcaa gatcttctag 540

tttttctaaa tgctcaaaat attcagtgag acatttacga agaattgatt ttctaaaaga 600

agcatagtca atatcagaac agagctcaat tatattttta tatttaacag cactaccact 660

ctcatataac tttaataaaa ggtcatctct tttatcctta acttcaatac aaataaattc 720

tgcactaaaa tactccataa gtgatttatg agaccatcga taaagagcgc cttccttaat 780

aaataaaggt actgaatatg tcaaatcgtt aataaaagaa ataggtttaa cattaactcc 840

ttttagtttt tctgttatat tagttaaaat actttcaagt tctgccctac taaattctag 900

tttgccatta ttttttaaac accaaaatgc aagcctacga agtatgatgc taaagtcagt 960

tatatccaaa ccagaagatt tttctcgaac ataaccagtt tctttactaa ggtcatgggt 1020

ttcaaaaaga gcttcaaaaa cttgactata aaataaatct tttcgccttg gtataactgg 1080

tttataccta taagaacaaa ataaaaggga tacatataaa ggtgttgtta aaaactctaa 1140

aatagtatta ttttcctttt ctctcattaa cttaatttct gtaattaact tgtttgaaag 1200

aattagtcta tttcctcttt tgactaggtt tatgtcatat aacttaataa gatcatatga 1260

ttgctctatc tctaatggct taattttaaa tctattaaaa gaatgaagtt caagtaatga 1320

ttgatctggc ctagaagtaa tgataatttt agaattactc atctcatcac taaacacctt 1380

tattttcttt attaaatcat tctttaaatc aaatggtatt tcatccacac catcaaagaa 1440

atatataaaa ggtatttttt ttaaaatgct atcactatca ttaacatcat caaaacctaa 1500

taatttatta atttgctctt caataggatt attggtgaga gttcttaact ctatataaat 1560

tggaatgtat tctgaatgat caatagtatc aataactatt tttttcatca gggttgattt 1620

tcccatccct gcattatcaa ttatcaatat gttattaaat tcacttagga acaaatcacc 1680

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ctgggctcta gttttagcta aatagtctga catctgacct ttaagtttat ataaattttt 1860

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<212> DNA

<213> 奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）

<400> 15

atgaacctga tcagactatt aaagagcaat ttgcaactgt tcagtctgtt cttgaaaaaa 60

aacaatcccg ttatcagtaa aattgatttt gattgtggtc tgttagaaca ggttctcgat 120

ccagataatg tactcagttg gggatactgg attaaacatc attgtcactg cgtttatggc 180

gaggacttaa gccatcactt tcaagctttc aaaccttcaa aagctattgc agtggccgtg 240

aatggtgact ttatggaggt tttggacaaa ctagtcattc aaataaaagc atcttctaat 300

gaaaataaaa agttacagct tcggcgctcg gctgcacgaa agcttatcag agcaaccaac 360

atccttcgta gtgaacaaga taatgactgg ccggactctc tccatgagta ccgcgccaaa 420

tttaattcac ggtatcctgc attagcggaa gatatggatt acctattaga aattagtatt 480

aaacctcgag agagcatagc agactttgaa aaacgggcta tggcatttgc ccgctggctt 540

agctgcgaat ttaataacca aaaagcctaa 570

<210> 16

<211> 1488

<212> DNA

<213> 奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）

<400> 16

ttatttagat aaagcttgag caagcaaaat aatatttttt tcaatttcag agggatggtg 60

tgcggcatac cctaataata taccctgttt aggataagat tgaatacaat aacgcgataa 120

aggctgtatg gctaacccaa ttttccgtcc ctctttcaca atatattctt ctgtataacc 180

agactgtaac cagcagacaa tatggatgcc agaatcagtc ggttcaatac gaaaaatgtg 240

agagagatac ttttttatcg tattggttaa cgttagataa cgttcataac aggcttttct 300

gatccgtcta acatggcgag cataatgtcc ttgagatata aatagcgcta atgttgcttg 360

ttctaaaaaa ccagaatgag agtcggtgta gtatttagcg actttaaagc tgtcaattaa 420

agatggaggt accactaaaa agcctaaacg aaatcccggg tacatcattt ttgaaaaggt 480

tccggcataa ataacccgct gatgtttgtc taatccttgt agagcttgaa tgggtttagt 540

gtgatagcga aattcgctat tgtaatcatc ttcaaagatc cacatgttat tggacgatgc 600

ccactctaat aaggcaatac gacgtgaaag tgaaagagta ttacctaaag ggaattgatg 660

tgaaggtgtg gtgaaaacta gttttgcttg cgggcattgg tctatagctt gagaaatatc 720

cataccgtca ctatctgaac gaacggggtg tatttttata ccatacgatg tgaagatagc 780

tcgagcgctg tcataaccag gatcatctaa ccaagcagta tcttcctctt gtaatagcac 840

tcgagtagca agattaatcg cttgctgtgt gccattgaca atgatgactt gctcaggttg 900

acagttaagc ccacgtgttg attgggcata ttggcatatc atctttttta atggtgtata 960

gcctgttggc gagttaaagg ttgcgagttc ttttttggag tgtcgccaaa ctcgtcctaa 1020

taatcttccc caaagctcat gggggaaaag atcaatacac ccaacaccca catgaaacat 1080

aaagcgacta ttggtattta gttgtgattg ttgccaaaaa gcatgcatct tttgcaaatt 1140

aggattaagt gttcctaatt cattatcgat atgcaatgaa gacgtcggca gggttgtttt 1200

aacccactga ttggaattaa tgctatcagg aatggtattc gtaacaaaag tgcccgaccc 1260

gcgacgagta aataaatagc cttcatcaat taaacgttca aatccggcaa taacagaatt 1320

gcgagaaatc gacatcattt cagccaatgt gcgacttgac ggtagacggc tacccggaga 1380

tagaacgcct tctaaaatag cctttctaac ggcgtaatag acttgtgagc taatagaccc 1440

ttcttctaat acaaggttag ggaaataagc tgttggtttc tgtttcat 1488

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

gcaagccctc acgtagcgaa 20

Claims

1.一组用于检测奇异变形杆菌的引物及探针，包括：

针对目标序列一的上游引物SEQ ID NO:1和下游引物SEQ ID NO:2，以及探针SEQ IDNO:3；

针对目标序列二的上游引物SEQ ID NO:4和下游引物SEQ ID NO:5，以及探针SEQ IDNO:6；

针对目标序列三的上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8，以及探针SEQ IDNO:9；

针对目标序列四的上游引物SEQ ID NO:10和下游引物SEQ ID NO:11，以及探针SEQ IDNO:12。

2.如权利要求1所述的检测奇异变形杆菌的引物及探针，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光基团，所述探针3’端连接有淬灭基团；

所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX和Cy5，所述淬灭基团为DABCYL或BHQ。

3.一种用于检测奇异变形杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述检测奇异变形杆菌的引物及探针。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：缓冲液、MgCl₂、dNTP、DNA聚合酶。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述MgCl₂的浓度为2-4mM，所述dNTP的浓度为0.1-0.3mM，所述DNA聚合酶活性浓度为0.8-1.2U/μl，所述引物及探针的浓度为0.1-0.3μM。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为rTaq酶。

7.如权利要求3-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Homo-tag序列SEQ ID NO:17。