CN101215567A - 奇异变形杆菌的核酸标识序列及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了奇异变形杆菌特异的核酸标识序列及PCR检测方法与应用。其目的是提供奇异变形杆菌特异的核酸标识序列及奇异变形杆菌的定性、定量PCR检测方法和在制备奇异变形杆菌的定性、定量PCR检测试剂盒中的应用。所述奇异变形杆菌特异的核酸标识序列是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列具有90％以上同源性且为奇异变形杆菌特异的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明可用于奇异变形杆菌的定性、定量分子检测(包括普通PCR、定量PCR、芯片和杂交等检测方法)中，应用前景广阔。

Description

奇异变形杆菌的核酸标识序列及检测方法

技术领域

本发明涉及奇异变形杆菌特异的核酸标识序列及检测方法与应用，特别是涉及奇异变形杆菌特异的核酸标识序列及奇异变形杆菌的定性、定量PCR检测和在制备奇异变形杆菌的定性、定量PCR检测试剂盒中的应用。

背景技术

变形杆菌(Proteus species)存在于水、土壤、腐败的有机物以及人和动物的肠道中，为条件致病菌，常引起继发感染，如慢性中耳炎、创伤感染等，也可引起膀胱炎、婴儿腹泻和食物中毒等病症(Coker C，Poore CA，Li X et al.Pathogenesisof Proteus mirabilis urinary tract infection[J].Microbes Infect，2000，2：1497-1505.Mobley HL，and Belas R.Swarming and pathogenicity of Proteusmirabilis in the urinary tract[J].Trends Microbiol，1995，3：280-284.)。变形杆菌属包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、莫根变形杆菌、雷极变形杆菌和无恒变形杆菌，其中普通变形杆菌和奇异变形杆菌与临床关系较密切。奇异变形杆菌是一种常见的可引起食物中毒的病原菌，它引起的食物中毒多呈胃肠炎或过敏反应的症状，主要表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、头晕、头痛及发热等(Mobley HL，IslandMD，Massad G.Virulence determinants of uropathogenic Escherichia coli andProteus mirabilis[J].Kidney Int Suppl，1994，47：S129-S136.)，严重时还可引起败血症，并有一定的病死率(Watanakunakorn C，Perni SC.Proteus mirabilisbacteremia：a review of 176 cases during 1980-1992[J].Scand J Infect Dis，1994，26：361-367.)。近年来，临床上由奇异变形杆菌引起的食物中毒发生率显著提高，严重威胁到人们的健康。但是，有关奇异变形杆菌的检测方法还比较落后，国内外专门开展该菌检测方法研究的报道也较少(Schneider R，Lockatell CV，JohnsonD et al.Detection and mutation of a luxS-encoded autoinducer in Proteusmirabilis[J].Microbiology，2002，148：773-782.Takeuchi H，Yamamoto S，TeraiA et al.Detection of Proteus mirabilis urease gene in urinary calculi bypolymerase chain reaction[J].Int J Urol，1996，3：202-206.)。目前，奇异变形杆菌的检测主要依靠实验室分离和生化鉴定，但是此类方法存在检测周期长、步骤烦琐等缺点，难于进行推广应用。基于细菌特异的标识序列或抗原的检测能够快速特异地检测和分析病原菌，但是，这类检测方法的前提是知道病原特异的核酸序列。迄今为止，有关奇异变形杆菌的序列信息还很少，也没有能够用于鉴定的特异核酸序列。

PCR技术作为新型的基因检测手段，具有快速、准确、特异性强等特点，已成为细菌检测方法发展的必然趋势。PCR技术自1989年开始应用以来，不仅在分子生物学领域成为常规的方法和手段，而且在遗传性疾病的诊断、病原体的检测、法医学标本的鉴定等多方面得到了广泛的应用。并且该项技术不断得到改进。1996年，美国Applied Biosystems公司推出了实时荧光定量PCR(real-time fluorescentquantification PCR，real-time FQ PCR)技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记来进行定量，不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、无污染、自动化程度高等特点。该技术是将DNA探针连接荧光试剂，待此DNA探针与PCR产物结合后，通过检测荧光光量，并用计算机软件进行辅助分析，进行量化计算，灵敏度为0.1％。定量PCR不仅可以应用在基础研究、临床检测，还可以在海关及食品卫生检疫方面发挥重要的作用。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针(TaqMan探针)，探针只与模板特异结合，其结合位点位于两条引物之间，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的Taqman荧光探针为寡核苷酸，其5′端标记有报告荧光基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有淬灭荧光基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，每个循环结束后检测一次荧光强度，信号强度代表模板DNA的拷贝数，整个反应结束后，便可得到一条工作曲线，根据该曲线可对未知模板进行定量分析。

发明内容

本发明的目的是提供奇异变形杆菌的特异核酸标识序列。

本发明所提供的奇异变形杆菌的特异核酸标识序列，来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列的全部或部分具有90％以上同源性且为奇异变形杆菌特异的核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：1由510个碱基组成。

含有本发明奇异变形杆菌特异核酸标识序列的载体及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增本发明奇异变形杆菌特异核酸标识序列中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的第二个目的是提供一种筛选上述奇异变形杆菌特异核酸标识序列的方法。

本发明所提供的筛选上述奇异变形杆菌特异核酸标识序列的方法，可包括以下步骤：

1)构建奇异变形杆菌的基因组文库；

2)随机测定基因组文库中克隆插入片段的序列，再将其与GenBank数据库中的序列进行比对，根据序列的相似性，得到奇异变形杆菌的特异性序列；

3)根据步骤2)获得的特异性序列分别设计PCR扩增引物，再分别以不同的奇异变形杆菌临床分离株及其相近菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，根据所述特异性序列在奇异变形杆菌临床分离株及其相近菌株中的分布情况，得到所述奇异变形杆菌的特异标识序列。

上述筛选方法也能用于筛选其它细菌的特异核酸标识，其它通过这种方法筛选得到的核酸标识序列也在本发明的保护范围之内。

根据上述奇异变形杆菌特异的核酸序列，可得到用于对奇异变形杆菌进行定性、定量PCR检测的引物和探针。

本发明所提供的用于对奇异变形杆菌进行普通定性PCR检测的引物，其上游引物可具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，下游引物可具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

将上游引物命名为PRM0007-F，序列表中的SEQ ID NO：2由17个碱基组成；将下游引物命名为PRM0007-R，序列表中的SEQ ID NO：3由19个碱基组成。

上述引物适用于奇异变形杆菌的常规PCR检测技术中，其检测的对象是本发明奇异变形杆菌特异的核酸序列，即以待测样品的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行PCR扩增，若扩增产物中有408bp大小的条带，则表明样品中含有奇异变形杆菌。

本发明的另一个目的是提供用于对奇异变形杆菌进行SYBR Green I实时荧光定量PCR检测的试剂盒。

本发明所提供的用于对奇异变形杆菌进行SYBR Green I实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括用于对奇异变形杆菌进行SYBR Green I实时荧光定量PCR检测的引物，其上游引物具有序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

将上游引物命名为PRM0007-F1，序列表中的SEQ ID NO：4由19个碱基组成；将下游引物命名为PRM0007-R1，序列表中的SEQ ID NO：5由22个碱基组成。

基于SYBR Green I荧光染料的实时荧光PCR反应的特异性评定是通过分析PCR产物的熔链曲线来实现的，不同的PCR产物其熔链曲线也不同。可将实时定量PCR产物从50℃缓慢而均匀地升温至95℃，温度每升高0.2℃读一次荧光值，每两次读值间隔1s，由实时荧光定量PCR仪自动绘制溶解曲线。最后，根据标准溶解曲线得到待测样品的起始拷贝数。

本发明还提供了一种检测奇异变形杆菌的TaqMan探针实时荧光定量PCR试剂盒。

本发明所提供的检测奇异变形杆菌的TaqMan探针实时荧光定量PCR试剂盒，可包括所述用于对奇异变形杆菌进行定性、定量检测的TaqMan探针和引物，所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO：6的核苷酸序列；所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：8的核苷酸序列。

所述TaqMan探针的5’端标记有报告荧光基团，如FAM或VIC等；3’端标记有淬灭荧光基团，如TAMRA、TAMTA或MGB等。

本发明提供了奇异变形杆菌特异的核酸标识序列。本发明的奇异变形杆菌特异的核酸标识序列是从奇异变形杆菌基因组文库中筛选得到的，具有较高的保守性和特异性，可用于奇异变形杆菌的定性、定量分子检测(包括普通PCR、定量PCR、芯片和杂交等检测方法)和奇异变形杆菌的定性、定量PCR检测试剂盒(包括普通PCR、SYBRGreen I实时荧光定量PCR和TaqMan实时荧光定量PCR等检测试剂盒)的制备中，从而为奇异变形杆菌所致疾病的分子诊断和病原分析奠定了基础，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为用限制性内切酶Sau3AI对奇异变形杆菌的基因组DNA分别酶切消化15、30和60min后的酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为随机挑取的20个克隆中插入片段的PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为奇异变形杆菌基因组文库中插入片段大小的分布情况的统计结果

图4为Taqman探针法定量PCR的标准曲线

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：

《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.Russell，David W.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及测序工作均由上海英俊生物技术有限公司完成。

实施例1、奇异变形杆菌特异的核酸标识序列的筛选

用下述方法筛选奇异变形杆菌特异的核酸标识序列，具体过程包括以下步骤：

一、奇异变形杆菌基因组文库的构建

1、奇异变形杆菌基因组DNA的提取

将于甘油中保存的奇异变形杆菌(菌株号：82009，购自中国药品生物制品检定所)划线接种于LB平板，在37℃下培养24h，挑取长出的单菌落，将其接种于5mL LB液体培养基中，待细菌生长至对数生长中期(OD₆₀₀值为0.8)，离心收集菌体，用基因组提取试剂盒(购自Promega公司)并参照试剂盒说明书提取菌体的基因组DNA，再将提取的基因组DNA用50μl无菌水溶解，最后用NanoDrop核酸蛋白测定仪测定基因组DNA的浓度，测定结果为320μg/mL。

2、奇异变形杆菌基因组DNA和pUC19质粒的酶切

用限制性内切酶Sau3AI对步骤1提取的奇异变形杆菌的基因组DNA进行部分酶切消化，酶切体系为：10×酶切缓冲液5μl，Sau3AI 1U(购自TaKaRa公司)，奇异变形杆菌基因组DNA 2μg，加水补充反应体系至50μl。然后将酶切反应体系于37℃分别放置15、30和60min。酶切结束后，将经不同时间酶切的酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为Marker III DNA分子量标准(购自天根生物技术有限公司)，泳道1-3分别为酶切15、30和60min的酶切产物)，以酶切片段大小均匀分布于0.2-2kb之间为最佳酶切条件，由图1可以看出，酶切30min时的效果相对较好，因此将部分酶切消化的时间定为30min。将奇异变形杆菌基因组DNA用上述酶切体系酶切消化30min后，用DNA胶回收及纯化试剂盒(购自Promega公司)并参照试剂盒说明书回收并纯化0.2-2kb范围内的DNA片段。将质粒pUC19(购自TaKaRa公司)用限制性内切酶BamH I(购自TaKaRa公司)进行完全消化后，回收并纯化经BamH I消化的质粒pUC19，将其用碱性磷酸酶(购自TaKaRa公司)进行去磷酸化处理，以防止载体的自身连接，50μl去磷酸化反应体系为：10×酶切缓冲液5μl，碱性磷酸酶2μl，线性pUC19质粒DNA 1μg，加水补充反应体系至50μl，反应条件为：37℃处理2小时，反应结束后，得到线性化的质粒pUC19。

3、奇异变形杆菌基因组文库的获得及库容量的测定

将步骤2回收并纯化的经Sau3AI酶切消化30min的奇异变形杆菌的基因组DNA片段与步骤2获得的pUC19线性质粒按10∶1的比例混合，用T4 DNA连接酶(购自NEB公司)在16℃下连接过夜(8-16小时)。反应结束后，取部分连接产物用CaCl₂法转化大肠杆菌JM109感受态细胞(购自Tiangen公司)，然后将转化子与1mL SOB培养基(购自生工公司)，混合，在37℃下复苏1h。复苏后，取100μl复苏产物，10倍系列稀释，将系列稀释产物分别涂于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上，在37℃下培养16h后，用能够清晰观察到单克隆的稀释度计数，根据计数结果推算基因组文库的库容量，结果用本发明方法构建的奇异变形杆菌基因组文库的库容量为1.1×10⁵cfu。将其余复苏产物加入30％(V/V)的甘油，分装后于-20℃保存。

二、奇异变形杆菌基因组文库的分析

1、检测奇异变形杆菌基因组文库中插入片段大小的分布情况

取步骤一构建的保存于甘油中的奇异变形杆菌基因组文库50μl，加入150ulLB，混匀后涂布于含50ug/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上，在37℃下培养16h后，然后随机挑取在抗性平板上长出的100个单克隆，分别煮沸变性后作为模板，用位于pUC19质粒多克隆位点两侧的测序引物(引物序列为：pUC19-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTG-3’和pUC19-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR扩增结果分析含插入片段的克隆的比例以及插入片段大小的分布情况。其中20个单克隆的PCR扩增产物的检测结果如图2所示(泳道M为Marker III DNA分子量标准(购自Tiangen公司)，泳道1-20分别为20个单克隆的PCR扩增产物)，由图2可以看出，插入片段大小分布不均一，然后对插入片段大小的分布情况进行统计，结果如图3所示，所分析的100个克隆中有91％的克隆都含有插入片段，以200-500bp的小片段为主(占70％)，插入片段大小在500-800bp之间的克隆占18％，而插入片段大小大于800bp的克隆只占3％。

2、插入片段的测序及同源性比对

根据步骤1获得的奇异变形杆菌基因组文库中插入片段大小的分布情况，选择插入片段大于500bp的14个克隆(编号为PRM0001-PRM0014)，将其分别接种于5mL LB液体培养基中，在37℃下培养过夜后，送测序公司进行序列测定，在去除测定序列中的载体序列后，得到了插入片段的核苷酸序列，其中，PRM0007具有序列表中SEQ IDNO：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO：1由510个碱基组成。然后，将测定的插入片段核苷酸序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，以确定序列的特异性，同源性比对结果如表1所示，仅有5个序列与其它细菌的序列有一定相似性，另外9个序列在GenBank数据库中没有找到相似的序列。

表1插入片段核苷酸序列的同源性比对结果

序列名称	长度	同源序列覆盖率	同源性最高的物种或基因
				PRM0001PRM0002PRM0003PRM0004PRM0005PRM0006PRM0007PRM0008PRM0009PRM0010PRM0011PRM0012PRM0013PRM0014	7657055141984271077510746623103234710371073514	--47％--10％-14％47％---22％-	--Proteus sp.LE138 locus--P.mirabilis urease operon-Photorhabdus luminescens subspProteus vulgaris orf operon---Photorhabdus luminescens subsp-

注：“-”表示没有发现相似序列。

3、奇异变形杆菌特异的核酸标识序列的获得与验证

根据步骤2的序列比对结果，从中选取了11条相对特异的序列，对应于表1中的PRM0001-PRM0011，并根据这些序列分别设计PCR扩增引物，其中扩增PRM0007的引物如下：

PRM0007-F(上游引物)：5’-ACGGAATGAAAGGAGTC-3’

PRM0007-R(下游引物)：5’-CACCAGCAAGAATAGAACA-3’；

然后，分别以从食物中毒标本中分离的30株奇异变形杆菌(分离方法参见王勇等，解放军预防医学杂志，2007，25(2)：94-97)的基因组DNA为模板，分别在上述11对引物的引导下，用PCR的方法验证11条序列的保守性，同时用与奇异变形杆菌相近的一些菌株(王勇等，解放军预防医学杂志，2007，25(2)：94-97)的基因组DNA为模板，用相同的PCR方法验证上述11条序列的特异性。序列的保守性检测结果如表2所示，由表2可以看出，序列PRM0007的保守性最强，在所分析的30株奇异变形杆菌中的26株中都有分布。这些序列均具有较高的特异性，在所检测的其它细菌中没有分布。

表2各序列在分离株中的分布情况

片段名	PRM0001	PRM0002	PRM0003	PRM0004	PRM0005	PRM0006
							分布数	2	1	13	16	11	8
片段名	PRM0007	PRM0008	PRM0009	PRM0010	PRM0011
							分布数	26	13	11	9	17

上述检测结果表明，序列PRM0007优选为本发明的奇异变形杆菌特异核酸标识序列，可用于奇异变形杆菌的定性、定量分子检测(包括普通PCR、定量PCR、芯片和杂交等检测方法)中。

实施例2、奇异变形杆菌的普通PCR检测

用实施例1获得的根据奇异变形杆菌的特异核酸标识序列PRM0007设计的普通PCR检测引物PRM0007-F(上游引物)：5’-ACGGAATGAAAGGAGTC-3’(序列表中序列2)和PRM0007-R(下游引物)：5’-CACCAGCAAGAATAGAACA-3’(序列表中序列3)对奇异变形杆菌标准菌株(奇异变形杆菌82009，购自中国药品生物制品检定所)和其它菌株(王勇等，解放军预防医学杂志，2007，25(2)：94-97)进行PCR检测，具体检测方法如下：

以各待测菌株的基因组DNA为模板，在引物PRM0007-F和PRM0007-R的引导下进行PCR扩增，PCR反应体系(25μl)为：1×PCR缓冲液(包括10mM Tris·HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM KCl)2.5μl，200μM dNTPs，上、下游引物各0.2μM，模板2μl，1U Taq DNA聚合酶。PCR循环参数为：先94℃变性5min；然后94℃45s，52℃45s，72℃60s，共32个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果奇异变形杆菌82009菌株可扩增出408bp DNA条带(PRM0007的自5’端第80-487位碱基)，其余菌株均未扩增出该DNA条带，与预期结果相符。上述检测结果表明根据奇异变形杆菌的特异核酸标识序列PRM0007设计的引物PRM0007-F和PRM0007-R可用于奇异变形杆菌的定性PCR检测，并可进一步研制出含有该引物对的奇异变形杆菌的定性PCR试剂盒。

实施例3、奇异变形杆菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测

根据实施例1获得的奇异变形杆菌的特异核酸标识序列PRM0007设计SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测引物PRM0007-F1(上游引物)：5’-ATGAATACCGTGCCCAAGA-3’(序列表中序列4)和PRM0007-R1(下游引物)：5’-CACCAGCAAGAATAGAACAAGA-3’(序列表中序列5)对待测菌株(奇异变形杆菌，菌株号82009，购自中国药品生物制品检定所)和其它菌株(王勇等，解放军预防医学杂志，2007，25(2)：94-97)进行SYBR Green I定量PCR检测，具体检测方法如下：

以待测菌株的基因组DNA为模板，在引物PRM0007-F和PRM0007-R的引导下用实时荧光定量PCR仪Lightcycler 2.0进行PCR扩增，SYBR Green I实时荧光定量PCR反应体系(20μl)为：2ul 10×PCR缓冲液，2μl MgCl₂(25mmol/L)，0.4μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，1μl SYBR Green I(1∶1000，购自罗氏公司)，0.2μldNTPs(10mmol/L)，上、下游引物(10mmol/L)各0.15μl，9.7μl H₂O，2μl模板。反应条件为：①预变性：95℃，3min；②扩增：95℃，2s；56℃，8s；72℃，11s；在72℃时荧光信号收集方式设为“SINGLE”；仪器检测通道选择F1，共50个循环；③熔解曲线：95℃，0s；50℃，30s；95℃，0s(温度变化速率为0.20℃/s)；④冷却40℃，0s。反应条件中未标注的温度变化速率均为20.00℃/s。

SYBR Green I实时荧光定量PCR反应系统敏感性测试及线性标准曲线绘制：提取阳性质粒pUC19-PRM0007(从文库中PRM0007号克隆中提取出来的质粒pUC19-PRM0007，该质粒是在pUC19的BamHI位点克隆了PRM0007片段)，用Nanodrop核酸蛋白微量分析仪(Nanodrop公司)定量后10倍系列稀释，分别取每个稀释度的稀释液2μl作为PCR模板，使每20μl反应体系中含有模板拷贝数分别为10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸，其余反应体系及反应条件同上，同时设立以水和空载质粒为模板(即靶基因拷贝为0)的对照反应。

结果在10¹至10⁸DNA拷贝/每反应范围内，Ct值(C代表cycle，T代表threshold；CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数)和DNA拷贝数呈线性关系。所建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应系统的检测最低限度可达10拷贝/反应。利用该方法，能够对10¹至10⁸DNA拷贝范围内的模板进行准确定量。同样，以其它细菌的DNA(同特异性筛选用模板)为模板时，没有扩增产物，表明该方法是特异的。上述检测结果表明，用本发明引物对建立的基于SYBR Green I双链嵌合染料的实时荧光定量PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广的特点，可进一步制备出含有该引物对的奇异变形杆菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂盒。

实施例4、奇异变形杆菌的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测

根据实施例1获得的奇异变形杆菌的特异核酸标识序列PRM0007设计TaqMan探针及TaqMan探针实时荧光定量PCR检测引物，其中，TaqMan探针P0007P：5’-ACAACAATAGCGGCACGAGTGACC-3’(序列表中序列6，5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团Eclipse，并将探针的3’端进行磷酸化处理。)，TaqMan探针实时荧光定量PCR检测引物为：P0007-F(上游引物)：5’-TCAACAATTTCAAAGGAGGGA-3’(序列表中序列7)和P0007-R(下游引物)：5’-TTATATTGCAGGTGCTGATGT-3’(序列表中序列8)。用上述探针及引物对待测菌株(奇异变形杆菌，菌株号82009，购自中国药品生物制品检定所)和其它菌株(王勇等，解放军预防医学杂志，2007，25(2)：94-97)进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测，具体检测方法如下：

以待测菌株的基因组DNA为模板，在引物P0007-F和P0007-R的引导下用在实时荧光定量PCR仪Light Cycler 2.0上进行PCR扩增，反应体系为(20ul)：10×Buffer2ul；dNTP(2.5mmol/L)1.6ul；Mgcl2(25mmol/L)1.6ul；上游引物(10mmol/L)0.5ul；下游引物(10mmol/L)0.5ul；探针(10mmol/L)0.5ul；Taq酶(5U/ul)0.4ul；Rox 0.4ul；模板DNA 2ul；水10.1ul。反应条件为：先95℃3min；然后95℃5s，60℃8s，共50个循环。

TaqMan探针实时荧光定量PCR线性标准曲线绘制：提取参比模板质粒(将上述PCR扩增产物纯化后，用T克隆试剂盒(TaKaRa公司)克隆至pMD18T载体中得到重组质粒，由上海生物工程公司进行序列测定，测定结果表明获得了插入序列正确的携带有目的片段的参比模板质粒)，用Nanodrop核酸及蛋白分析仪定量后分级10倍稀释，分别取每一数量级稀释液2μl作为PCR模板，使每20μl反应体系中含有模板拷贝数分别为10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸，其余反应体系及反应条件同上。结果在10⁰至10⁸DNA拷贝/每反应范围内，Ct值和DNA拷贝数呈线性关系(见图4)，所建立的TaqMan实时荧光定量PCR反应系统的检测最低限度可达1拷贝/反应。以其它细菌为模板时，没有扩增产物，表明该方法是特异的。上述检测结果表明，用本发明的TaqMan探针及引物建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广的特点，可进一步制备出含有该TaqMan探针及引物对的奇异变形杆菌的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒。

序列表

<160>8

<210>1

<211>510

<212>DNA

<213>奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)

<400>1

ggatcccttg accatcaaca aaaacaagtt gcggtttttg cttgatgccc tgccaagctt     60

ctaataacgc gggacactca cggaatgaaa ggagtccggg aatataaggt agtaatgttg    120

caatacgggc tatttgatat tcaacaattt caaaggaggg ataatgcata acaacaatag    180

cggcacgagt gaccgcaccg ctattttcaa atccgacatc agcacctgca atataagttg    240

gtgccataaa ttggtcggtt aagataatct gttgagcttt ctctgtctgc tcttgacgta    300

attgctgagt attaatcatt atcctgatga taaggcttcg atagacggtg aaccgcatca    360

ataaatgctc cagcatgcgc tggtggaaca tcttgatgaa taccgtgccc aagattaaag    420

acatgaccag tacctttgcc aaagccagct aaaatcgtag cgacttcttg ttctattctt    480

gctggtggcg catacaacat agaaggatcc                                     510

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

acggaatgaa aggagtc                                                    17

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

caccagcaag aatagaaca                                                  19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atgaataccg tgcccaaga                                                  19

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

caccagcaag aatagaacaa ga                                              22

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

acaacaatag cggcacgagt  gacc                                           24

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

tcaacaattt caaaggaggg a                                               21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ttatattgca ggtgctgatg t                                               21

Claims (10)

1.奇异变形杆菌特异的核酸标识序列，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列的全部或部分具有90％以上同源性且为奇异变形杆菌特异的核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的奇异变形杆菌特异的核酸标识序列，其特征在于：所述核酸标识序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

3.一种筛选权利要求1或2所述奇异变形杆菌特异核酸标识序列的方法，包括以下步骤：

1)构建奇异变形杆菌的基因组文库；

2)随机测定基因组文库中克隆插入片段的序列，再将其与GenBank数据库中的序列进行比对，根据序列的相似性，得到奇异变形杆菌的特异性序列；

3)根据步骤2)获得的特异性序列分别设计PCR扩增引物，再分别以不同的奇异变形杆菌临床分离株及其相近菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，根据所述特异性序列在奇异变形杆菌临床分离株及其相近菌株中的分布情况，得到权利要求1或2所述的奇异变形杆菌的特异标识序列。

4.权利要求1或2所述的奇异变形杆菌特异的核酸标识序列在检测奇异变形杆菌中的应用。

5.用于对奇异变形杆菌进行定性PCR检测的引物，其上游引物具有序列表中SEQID NO：2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

6.定性检测奇异变形杆菌的普通PCR试剂盒，包括权利要求5所述的引物。

7.用于对奇异变形杆菌进行SYBR Green I实时荧光定量PCR检测的引物，其上游引物具有序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

8.对奇异变形杆菌进行SYBR Green I实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求7所述的引物。

9.用于对奇异变形杆菌进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针和引物，所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO：6的核苷酸序列；所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：8的核苷酸序列。

10.对奇异变形杆菌进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求9所述的TaqMan探针和引物。

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