CN111154899B

CN111154899B - 4种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法

Info

Publication number: CN111154899B
Application number: CN202010064128.XA
Authority: CN
Inventors: 吴清平; 周宝青; 叶青华; 吴诗; 张菊梅; 丁郁; 薛亮; 王涓; 陈谋通; 李滢; 韦献虎; 庞锐
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111154899A

Abstract

本发明公开了4种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法，本发明方法提供了用于鉴别4种常见可致病葡萄球菌——金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌的共19个新特异性分子检测靶标，以及对应的PCR引物组和PCR快速检测方法。本发明的检测方法可用于检测某些生化反应不敏感的菌株，弥补生化鉴定的缺陷，增强了实用性；本发明的检测方法还具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低的优点。

Description

4种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，涉及鉴别葡萄球菌的方法，具体涉及4种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法。

背景技术

葡萄球菌(staphylococci)是最常见的医院病原体之一，也是动物(奶牛)乳腺炎直接相关的重要病原菌。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为葡萄球菌属中模式菌，是四大食源性致病菌之一。研究表明，每年由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒事件占食源性微生物食物中毒事件的25％，其产生的肠毒素可导致呕吐腹泻给人类造成重大危害。根据《食品安全国家标准食品中致病菌限量》(GB 29921-2013)，样品中金黄色葡萄球菌浓度均不得超出100CFU/g。本研究团队前期对常见人源、食品、环境等样本中微生物分离鉴定中发现，表皮葡萄球菌(Staphylococcu sepidermidis)(31.45％)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)(24.52％)及人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)(12.26％)检出率最高，且这三种菌也是临床发生交叉感染的常见可致病葡萄球菌(Kilic等，2011)，其易感人群为老人、儿童、免疫力低下患者，严重感染可导致菌血症、败血病和心内膜炎等(Pereira等，2010)。由于疾病严重程度及治疗方式取决于感染葡萄球菌的种类及数量，快速精确鉴定不同种致病性葡萄球菌显得尤为重要。

常见葡萄球菌检测主要利用国标规定的传统培养方法(GB 4789.4-2016)，该方法结果较为准确，但检测时间较长(5d以上)，操作复杂(预增菌、选择性培养、显色培养、生化鉴定)、成本高，无法实现快速检测。此外，应用生化试验鉴定葡萄球菌，生化反应不稳定，鉴定结果重复性差，易造成误判。随着分子生物学的发展，以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。

目前，国内外PCR检测方法对上述四种常见可致病葡萄球菌检测的分子检测靶标及引物已有一定的报道，其中金黄色葡萄球菌常见的特异性基因有nuc、Sa422、entC、entB、mecA、FemA、FemB、Kan、tuf；表皮葡萄球菌特异性基因recN、tuf、Serp0107、Se705、Se-fib、gseA、atlE、sodA；而溶血葡萄球菌特异性基因仅发现mvaA、Shae 2个，人葡萄球菌特异性基因仅有gap 1个。在实际应用中发现，已报道的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌靶标基因数量虽然较多，但属内具有较高同源性，其特异性较差，易造成假阳性结果导致误判。例如，选用实验室已有的17种葡萄球菌对金葡菌nuc基因设计的引物进行特异性验证发现，松鼠葡萄球菌和路邓葡萄球菌扩增结果均为阳性，无法通过此靶标鉴定。而溶血葡萄球菌和人葡萄球菌在现有报道基因靶标中十分少，难以满足实际检测的需要。随着临床治疗过程中葡萄球菌新种的不断发现，基于原有的葡萄球菌分子靶标的精准鉴定面临了巨大的挑战。寻找新型特异性靶标分子用于常见可致病葡萄球菌快速、精确检测具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供用于鉴别4种常见可致病葡萄球菌，即金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)的特异性新分子靶标及相应的检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明要求保护一组用于鉴别葡萄球菌的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1～19所示，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌。

通过生物信息学分析得到4种葡萄球菌中(葡萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌)分别含有的特异性序列片段，如SEQ ID NO.1～19所示；所述片段可作为鉴别这4种葡萄球菌的特异性新分子靶标。通过检测待检测物是否含有相应的序列即可得到待检测物是否含有所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌中的至少一种。

进一步地，所述序列SEQ ID NO.1～5用于鉴别金黄色葡萄球菌；所述序列SEQ IDNO.6～10用于鉴别表皮葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.11～15用于鉴别溶血葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.16～19用于鉴别人葡萄球菌。

进一步地，本发明还要求保护用于鉴别葡萄球菌的引物组，所述引物组为根据如SEQ ID NO.1～19所示核苷酸序列设计得到。

所述引物组对应的产物为SEQ ID NO.1～19所示核苷酸序列全部或部分序列。

通过根据相应的核苷酸序列设计对应的用于PCR的引物组，每一个引物组包括一条正向引物和一条反向引物，对应检测一个核苷酸序列。所述引物组扩增产物对应如SEQID NO.1～19所示核苷酸序列的全部或部分序列。

作为本发明的优选实施方式，所述引物组的核苷酸序列按5’到3’如SEQ ID NO.20～57所示；其中：

SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21为对应SEQ ID NO.1序列的引物组；

SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23为对应SEQ ID NO.2序列的引物组；

SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25为对应SEQ ID NO.3序列的引物组；

SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27为对应SEQ ID NO.4序列的引物组；

SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29为对应SEQ ID NO.5序列的引物组；

SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31为对应SEQ ID NO.6序列的引物组；

SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33为对应SEQ ID NO.7序列的引物组；

SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35为对应SEQ ID NO.8序列的引物组；

SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37为对应SEQ ID NO.9序列的引物组；

SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39为对应SEQ ID NO.10序列的引物组；

SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41为对应SEQ ID NO.11序列的引物组；

SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43为对应SEQ ID NO.12序列的引物组；

SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45为对应SEQ ID NO.13序列的引物组；

SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47为对应SEQ ID NO.14序列的引物组；

SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49为对应SEQ ID NO.15序列的引物组；

SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51为对应SEQ ID NO.16序列的引物组；

SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53为对应SEQ ID NO.17序列的引物组；

SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55为对应SEQ ID NO.18序列的引物组；

SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57为对应SEQ ID NO.19序列的引物组。

进一步地，所述引物组可用于鉴别金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌。

本发明还提供了用于鉴别葡萄球菌的方法，包括如下步骤：

S1：使用所述的引物组中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增；

S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；

S3：观察扩增产物是否符合预期。

一般地，一个PCR体系中仅含有一组引物；可通过设置多个PCR体系，同时对单个菌的DNA使用不同引物进行扩增，提高检测效率。本发明的引物对应的产物特异性较好，通过观察扩增产物是否在预期位置即可判断是否存在所述葡萄球菌。

作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增体系包括：PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTP、模板DNA、引物组、Tag酶和灭菌双蒸水。

作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂ 2μL，2.5mM dNTP 1μL，模板DNA 100ng，5μM引物各1μL，Tag酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL。

作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55～58℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。

本发明公开了用于鉴别4种常见可致病葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌)的特异性分子靶标，并提供了相关的引物组，以及对应的PCR检测方法。与现有技术相比，本发明的检测方法可用于检测某些生化反应不敏感的菌株，弥补生化鉴定的缺陷，增强了实用性；本发明的检测方法还具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低的优点。

附图说明

图1为实施例2中金黄色葡萄球菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。

图2为实施例3中表皮葡萄球菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。

图3为实施例4中溶血葡萄球菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。

图4为实施例5中人葡萄球菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 4种常见可致病葡萄球菌的特异性新分子靶标的挖掘

根据GenBank数据库及本团队自测的葡萄球菌全基因组DNA序列，进行生物信息学分析；筛选得到4种常见致病葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌)的特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～19所示。

其中，所述序列SEQ ID NO.1～5用于鉴别金黄色葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.6～10用于鉴别表皮葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.11～15用于鉴别溶血葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.16～19用于鉴别人葡萄球菌。

实施例2所述葡萄球菌的快速检测方法

1)引物设计

根据实施例1中的所述序列SEQ ID NO.1～19设计特异性PCR扩增引物组(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表1。

表1特异性PCR检测引物组

2)鉴别葡萄球菌的方法，步骤如下：

S1 DNA模板制备：将待测菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

S2 PCR扩增：使用所述的引物组1～19中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增

①PCR检测体系：

其中：

当模板DNA用于鉴别是否存在金黄色葡萄球菌时，使用引物组1～5任一组引物；

当模板DNA用于鉴别是否存在表皮葡萄球菌时，引物为引物组6～10任一组引物；

当模板DNA用于鉴别是否存在溶血葡萄球菌时，引物为引物组11～15任一组引物；

当模板DNA用于鉴别是否存在人葡萄球菌时，引物为引物组16～19任一组引物；

②PCR扩增程序：

其中：

使用引物组1～5中的引物，退火温度为58℃；

使用引物组6～10中的引物，退火温度为57℃；

使用引物组11～19中的引物，退火温度为55℃。

S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳；

S4：观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如果存在，说明样品中含有对应的葡萄球菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有对应的葡萄球菌。

实施例3金黄色葡萄球菌PCR检测方法的特异性评价

取金黄色葡萄球菌91株，非目标葡萄球菌16株(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、路邓葡萄球菌等)，非葡萄球菌90株(沙门氏菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物组1～5中任一种引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表2所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1所示；其中，(a)为1～91为91金黄色葡萄球菌；(b)为1～90为非葡萄球菌，91为阳性对照；(c)为1～16为16株非目标葡萄球菌，17为阳性对照；M为2000Maker，C为空白对照。

表2本发明金黄色葡萄球菌检测特异性评价试验结果

由图1和表2可得，5种引物组的检测结果均只有金黄色葡萄球菌显示出特异性扩增条带，非目标葡萄球菌及非葡萄球菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。

实施例4表皮葡萄球菌PCR检测方法的特异性评价

取91株表皮葡萄球菌，非目标葡萄球菌16株(金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、路邓葡萄球菌等)，非葡萄球菌90株(沙门氏菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物组6～10中任一种引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表3所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图2所示；其中，(a)为1～91为91表皮葡萄球菌；(b)为1～90为非葡萄球菌，91为阳性对照；(c)为1～16为16株非目标葡萄球菌，17为阳性对照；M为2000Maker，C为空白对照。

表3本发明表皮葡萄球菌检测特异性评价试验结果

由图2和表3可得，5种引物组的检测结果均只有表皮葡萄球菌显示出特异性扩增条带，非目标葡萄球菌及非葡萄球菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。

实施例5溶血葡萄球菌PCR检测方法的特异性评价

取33株溶血葡萄球菌，非目标葡萄球菌16株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、路邓葡萄球菌等)，非葡萄球菌90株(沙门氏菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物组11～15中任一种引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表4所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1所示；其中，(a)为1～33为33溶血葡萄球菌和1～16为16株非目标葡萄球菌，17为阳性对照；(b)为1～90为非葡萄球菌，91为阳性对照；M为2000Maker，C为空白对照。

表4本发明溶血葡萄球菌检测特异性评价试验结果

由图3和表4可得，5种引物组的检测结果均只有溶血葡萄球菌显示出特异性扩增条带，非目标葡萄球菌及非葡萄球菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。

实施例6人葡萄球菌PCR检测方法的特异性评价

取75株人葡萄球菌，非目标葡萄球菌16株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、路邓葡萄球菌等)，非葡萄球菌90株(沙门氏菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物组16～19中任一种引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表5所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图4所示；其中，(a)为1～75为75人葡萄球菌；(b)为1～90为非葡萄球菌，91为阳性对照；(c)为1～16为16株非目标葡萄球菌，17为阳性对照；M为2000Maker，C为空白对照。

表5本发明人葡萄球菌检测特异性评价试验结果

由图4和表5可得，4种引物组的检测结果均只有人葡萄球菌显示出特异性扩增条带，非目标葡萄球菌及非葡萄球菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。

实施例7葡萄球菌疑似菌株的检测

根据实施例2的PCR检测方法对283株从人源样品中分离葡萄球菌疑似菌株进行检测，人源样品采集于广东省梅州市蕉岭县长寿乡，样品处理及疑似菌株的分离参见国标法。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组1～19中任一组的引物。检测结果如表6。

表6葡萄球菌疑似菌株的检测结果

葡萄球菌	本发明检测法	16s rDNA鉴别
			表皮葡萄球菌	107	107
人葡萄球菌	96	96
			溶血葡萄球菌	36	36
金黄色葡萄球菌	4	4
			头状葡萄球菌	\	13
沃氏葡萄球菌	\	7
			腐生葡萄球菌	\	3
松鼠葡萄球菌	\	3
			继发性葡萄球菌	\	3
路邓葡萄球菌	\	2
			科氏葡萄球菌	\	2
巴氏葡萄球菌	\	2
			坐骨葡萄球菌	\	2
猪葡萄球菌	\	1
			施氏葡萄球菌	\	1
显微葡萄球菌	\	1

由表6可得，利用本发明方法，目标葡萄球菌检出菌株数分别如下：表皮葡萄球菌107株、人葡萄球菌96株、溶血葡萄球菌36株、金黄色葡萄球菌4株，经16S rDNA鉴定方法是4种常见可致病葡萄球菌，其他疑似菌株经鉴定为其他葡萄球菌。通过本实施例说明本发明的4种常见可致病葡萄球菌的19种PCR检测方法可靠性高，能有效识别所述4种常见可致病葡萄球菌。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省微生物研究所

<120> 4种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法

<130> 2020

<160> 57

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 486

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

atgacaaata atgacaccat catgttacga cattatgtcc cacaagatta ttcgatgtta 60

gaagcttttc aattaagtga aagtgatttg aagtttgtta aaacgccaga ggaaaatatt 120

acagctgcaa tgtctgataa tgaaaggtat cccatcgttg taatggatgg caggcaatgt 180

gtggcctttt ttacattaca tcgtggaaaa ggtgtcgcac catttagcga taaccaagat 240

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<210> 2

<211> 1083

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<213> Staphylococcu sepidermidis

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atgttagaaa cacatagatt aaagctagtg aagcctaatt tgagttatac agatgaactt 60

tatcaattgc atacaaataa ggtagctaca aagtatacac ctaaaggtat tcatcagaat 120

aaagtagcaa cccaagattt tattaaagga tggatgaggc attgggatga atatcaattt 180

ggttacttca ttttaattat gagagataat cacgaagtag tgggaatagc gggatttgag 240

tatcgtacaa ttcatcaaca acagtttctt aatgcgtatt atagaatctt tccatcgtat 300

actggtgttg gtttagcttt tgagtcaatg gaggagattg cccgtcattt aaaaaagcat 360

gataccataa caccaaaatt aattcgaaca aatcaatata atacaaattc tattaaatta 420

gcacaaaaac ttggatataa ttatgatgct aactgggacg atgtaattaa taaaggagat 480

cgttgttttt ttaatctaca aacgttggat aataactaa 519

<210> 7

<211> 1185

<212> DNA

<213> Staphylococcu sepidermidis

<400> 7

atgtcacgca tagtattagc tgaagcatat cgaacaccta taggcgtgtt tggtggtgta 60

tttaaggata tacctgccta tgaactaggt gcaacagtta ttcgtcaaat tttagaacat 120

agtcaaatag atcctaatga aatcaatgaa gttattctag gaaacgtatt acaggcaggt 180

caaggacaaa atcctgctcg tattgctgcg attcatggtg gtgtgccaga agcggtacct 240

tcttttactg taaataaagt ttgcggttct ggattaaaag cgattcaact tgcctatcaa 300

tctattgtag cgggagataa tgagattgtt atcgctggag gcatggaaag tatgtctcaa 360

tctccaatgc ttcttaaaaa tagtcgtttc ggttttaaaa tgggaaatca aactttagaa 420

gatagtatga tagctgatgg tttaactgat aagtttaatg attaccatat gggtatcaca 480

gccgaaaatc tagttgaaca gtatcagatt agtcgtaaag aacaagatca atttgcattc 540

gattctcaac aaaaagcatc acgtgcacaa caagctggtg tatttgatgc tgaaattgta 600

cctgtagagg taccacaacg taaaggcgac cccctaatta tttctcaaga tgaaggcatt 660

agacctcaaa cgacaattga taagttagca caactccgtc cagcatttaa aaaagatgga 720

tcagtaactg ctggtaatgc atccggtatc aatgacggtg ctgctgctat gctcgttatg 780

acggaggaca aagcgaaagc attgggctta caacctatag ctgtattaga tagttttggt 840

gcgagtggtg tggcgccttc aattatgggt attggtccag ttgaagcgat acataaagct 900

ttaaaacgtt ctaataaagt gataaatgat gttgatattt ttgaattaaa cgaagctttt 960

gcagcgcaat caattgctgt aaaccgtgag ttgcaattac cgcaagataa agtcaatgtt 1020

aatggtggtg cgattgcact aggacatccg ataggggctt cgggtgcgcg tactttagtt 1080

tcattattac atcaattaag tgatgctaag ccaacaggtg tggcatcttt atgtatcggt 1140

ggcggtcaag gtatcgctac ggttgtatct aaatatgaag tttaa 1185

<210> 8

<211> 957

<212> DNA

<213> Staphylococcu sepidermidis

<400> 8

atgttacttt ttttatgttt tctaatcgaa ttattactta ttgttttatt atatacgaag 60

caatcgttta ctcttaattt atttagtttc atcttatata acatcattgg ttttgttatg 120

atgacttatc atatggtaac tgtatcaata ccatatgata tgtttatcat tgtaattgta 180

gcaatgatac tgttgttgat taaacatcgt tatattttca agttgcaaac aggacgtttt 240

tttattttac aacttagtca tcatttttat actgtggggc tatttgctgt gagttgttta 300

tatataagta ctattcccct aattatcatt aatagcttag ctttatgggc cgctaccatt 360

gcatttagta caatttattc atttatcgga tacttatctt ggtctacagc ttttgaaaat 420

catcaatatt ataaacacgt aaagttaatt atggtgcttg gagctggaat tttctctgaa 480

gaagtgacta cgcttcttgc tgcaagactt gataaagctt tatctgttta tcattcacaa 540

cggactaaac ctatcatcat tgtaagtggt ggccaaggtc ctgacgaacc aatttcagaa 600

gcacttgcga tgaaaagata ccttatagct cacaacgttc cggaaaacca tatatttatg 660

gagaatcaat ccacgaatac acgaaccaat ttcttatact ctaaatctat cattcattcg 720

atgatgccta cttcaaatca tatgttgtgt gtaacaagtc aatttcatgt tttaagagcg 780

cttaaatttg ctaaaaaagc tcatctttct ttcgatggca ttggaagtcg tacaccatac 840

cactttttgg cacaatctat gattatagac tttttgggtt taatgtatca atataaaaca 900

atacttacta tttatttcgc tatgttgttt tggcttgcaa tactacaaac catataa 957

<210> 9

<211> 819

<212> DNA

<213> Staphylococcu sepidermidis

<400> 9

atgaaaataa atgttttatg cgagaagagg gacaatatgg atattaaaca atcttcagag 60

aaacaaggtc gaccgcatca tttatcagac agtaggacag ttttaaaaag aaattttata 120

ttaataccaa cttatatttt attacaaagt atcataccaa tcattgttgt tttcggctca 180

ttaggcatca ctgccatgat aacacaacag gcaccaccac aatggttgta tcattgttca 240

ttgagtttaa gttttgtgat tgctcaaggt ctaatattaa ttatctttta taaaatacat 300

caatctgtaa taaatgatgt gatgaagcaa caatggataa ttgcaaagaa taaaataatt 360

aaaattgtaa tagttgcgat tgtcgtatat ttattattac ttataattcg ggtgattgga 420

acatcattac ctaatcattt aagttatcat ctcactcaat ccgaacaacg tacgctaggg 480

ctatttaaat caccatatgt gttgttagtt acttttatat ccatggtatt cttacgtcca 540

atggtagaac aaatcattta tagatatctc atcatccatg aattaggaaa agtatggaat 600

agacaatttg taattggttt gtctattgtt attgaaacga tcgtacatgt ttacgacatg 660

gcatcgattt ttgaaatttt tccatatatc gttattgctt cagcagctac aatactatat 720

attaaatcgc gggataattt aattgtcgct tatatatttc aagtgatttt gcaatgtatc 780

ctttttatag aaattttatg taagtatacc aacttttaa 819

<210> 10

<211> 804

<212> DNA

<213> Staphylococcu sepidermidis

<400> 10

atgaaaaaaa ttgcagcgat aatattttta ataggcttgt cactaattat tatttgtagc 60

gtgggagttt atgcacaaaa taaaaaattg agtaaagaca atcaatataa taatcaaaca 120

acaaatttaa tgaaaaacta tgatgataat actgtgaaaa gtatttacgt tgatggaaaa 180

gtaagtgata taactgtgaa aaaaggtaaa catttttcgg ttaagtccaa agggaatgac 240

aaaaatttaa acgtaactag caaggtgaac aatcaacgtt gggtaattac agagcgtcaa 300

acaagtccac atattaattt tagaatacaa ggtaaagtta gtaatcacat tacgattaca 360

gtacctaaat atattaaaaa catagatatt aaaactaatg ccggggattt aaatattgtt 420

ggagtaaata gtggcacagg aagatttgat gctgaatctg gagacattaa agttcaaaaa 480

ggacgatata aaaaggtgac acttcataat gaggatgggg atattcatac gaaagatatt 540

cattttaatc aagctaatat tcaaaatgac aatggggata ttcaaatgaa acaattagac 600

cctgatattc ctttacgtat taaaaatgaa gaaggggata taaacttgaa ttataaaaaa 660

gaacttcatc acacccaaat catcactcgt aatgaagaag gggaaacaga catcgatcat 720

cgtgtgttat ataatagtaa agttgaaaat ggaaataata aagtgaaatt aatcaatgaa 780

aatggagata ttaaagtaaa ataa 804

<210> 11

<211> 687

<212> DNA

<213> Staphylococcus haemolyticus

<400> 11

atgaataaac aaataagtga aatttcacct aagatgacgt tgcctatgtt catgattggg 60

ttaattattt ttgtcgttgt tgcaataaat gtaattcacg atacattatt ggttcaaaat 120

gtcgatatag gttctttaca ttggctgaca gattattttg gtgagccgga acgtaaatac 180

ggcgatggta tttggcataa tttcatgact ttttgtgctg agataggaga agtaaagtca 240

gttatctata tcacactatt tttagcaatt gttttattgt ttaaacatta taaattatcg 300

atttggatgg ttttaactat aacgagtggt acgttattaa attatttaat taaacaactc 360

atcgagagac aacgtccatt taatcatttg atgcgagacc acggatattc atttccaagt 420

gggcattcta atgcaagtac gttacttgct ttaatattgt taattatttt aattccttta 480

ataaaactca aagcaataag gataatagcc aatactatca ctattatcat ttggataggt 540

gtgctgtgtt gccgactata ttttcatgcg cattatatta cagatgtagt tggaggcgtt 600

acactaggta tcatttgggt agcattgttt ttaatgatat taccattgtt ttatcttaat 660

ttacgtaata agcctaataa taaatag 687

<210> 12

<211> 318

<212> DNA

<213> Staphylococcus haemolyticus

<400> 12

atgatgccaa aggtttatgg ctcacttgta gacaatgaaa cacgatgcac acattaccat 60

acttttttag atgttatagc aataaaattc aaatgctgca ataaatatta tccgtgttat 120

caatgtcacg aagaacacga aacacaccct atcaaaagat ggtcagaaca agaatttgat 180

gaaaaggcaa ttatgtgtgg tgtatgtaaa catgaaatgt ctattcaaga ttatatgatg 240

acagagctat gtcctaaatg ccaagcacat tttaatagtc gttgtaaatt ccactatcat 300

ttatattttg aattataa 318

<210> 13

<211> 465

<212> DNA

<213> Staphylococcus haemolyticus

<400> 13

atggaaattc gaccatattc aaatcaagat aaaccattat tagatgtatt tgaaatatta 60

ccagaagata gaaaattcac tcggacacct atccaaaata ttgatttagc taaaggagac 120

gacgagcgtc acccgactct tgttatgaga gataatcaat gtgtgggctt ctttacttta 180

catgaaggtc agggtgttaa accatatagt gacaataata aagctatatt tttccgttca 240

tttagtgtgg atgcacgata tcgtggtcaa ggtcttggaa aagcagtgat tcaacaacta 300

ccaagctata taaattcaac atttccttac attaatgaaa taatattaac tgtgaatact 360

gacaacgaca aagccatcgg attatataag cgagcccaat attctattac tggagatgca 420

attttagaag ggcgaccagt ttacgttatg aattttaaaa tatag 465

<210> 14

<211> 732

<212> DNA

<213> Staphylococcus haemolyticus

<400> 14

atggagaaac tgttgttcta tacaggcacg gtattactaa ttattgcgat tatattaatc 60

ttgttcgcta ttgtggcagt atttaaaaat aagaattatt ttaaatattt tgcgatggct 120

attacgatta ttctactaag tatacttgct ttaggcattc ataaaatgat tgaaagtaat 180

aatccatcta aaaatcaagc aactcaatct aaagataagc aatctaaaga ggataaatca 240

tctaaagata aaaagaaaaa agacaaaaaa atggacgaca aagatgataa taatgttact 300

caagaagaac aaaatcgttc tgaagaaaca tcaactaatg aagaattaaa tactcaagaa 360

caacaaagct cacaacaaga gcaaccaaca accgaagaat caaataacga agcaccttct 420

actcaacaag atactacaca ggataatact gtaaacaatc aaaataatac ttcttctaat 480

aataatcaaa atgcgaatca agcaaacgac acaaatcaaa actataatca aagtaataga 540

aatagtaata acaatggtga taatagcggt tcaaacggaa atgtttctac agaggatagt 600

tcaagtactg agaatcagtc taatgaaaat caaacacaga catattcaga aaatagctcc 660

gctgaacaat ctgaaaatgg cgaagcaata actgagacta atacagatga atcaaataat 720

agtgcaaact aa 732

<210> 15

<211> 738

<212> DNA

<213> Staphylococcus haemolyticus

<400> 15

atgacgaaca ttataacgtt acttgatatt gaatataaat tattatttcg acgcaaatta 60

tcatcattta tggctttcat cttccctttg gcattctatt tattgtttac atcattaatt 120

gatatgccag cagatgcgaa aaaagtattt tacaaagagt atatgtatag tatgacggta 180

ttcagtttaa tgggattttg cctgatgcaa tttccattag aaataatcga ggaaagaaac 240

agtggttggt ataaaagatt aatttctaca ccgatcacag tgttaaatta ttatttagct 300

aagattatta aaactatgac tttattttta gcttcaatat tgcttttatt ctgcgtagca 360

cacttctata aaggggtaga tctaagtgta agtgaatgga ttttatctgg tgtctcttta 420

tggttaggtg ctagcatgtt tttgacatta ggtttaatca ttacgcaatt tactgaaaca 480

cagaaagcaa gcagcgtagc taatctatgt aatattgtat tagccattat tggtggattg 540

tggttccctg ttagtacatt tcctgattgg atgcaaacaa ttgctaaact aacaccaacg 600

tatcatttac gtcatttggc acttgaattt ggtaaaggta atggctttaa tgtacaatca 660

ttcataattt taggtattta tagcattatt ttcttaatta ttgcattatt aattaataag 720

agcaaagagg tggaataa 738

<210> 16

<211> 441

<212> DNA

<213> Staphylococcus hominis

<400> 16

ttgaatttag aatttaacat tgccgttcac gtacttagct ttttagtaaa acacgacaac 60

caacaattca gtagtcaaac tttagcaaaa ttaacctgcc tcaatccagt tcaattacgt 120

agagtaacta cggttttaaa tcaatatcag tttattcata cttcccgtgg taaaaatggt 180

ggatatagtg caaattattc aactgctagt attaagctat cagtactata tcgtatattt 240

gtgcttgaaa aagatagcca acagcgtatt ttcacaggtc atgagcagag cgattgtgaa 300

atatcaagaa acatagcaaa gaccatgtca cactataatc aaaaagaaca tcgtgttatt 360

ttaaattttt atgataccct cactattaat gatgtaatta atgatacact tcaggaggat 420

acaacatatg acacattata a 441

<210> 17

<211> 957

<212> DNA

<213> Staphylococcus hominis

<400> 17

atgctagcaa tcattttatt atttattgtt ttaattatta tcctaagtgt tttgtttaat 60

ataagacact ttatctctct ttcttttttt attacaagcg tgatattatg tttcaccatt 120

agtctcatta atatcatgac catgacccta ccaactggat tgtttatatt aattatcatt 180

tctaccatcg gtttgcttgt caaacattct catctattca aaattaaaaa aggaacccgt 240

ttcttaaata aaatgtttcg tagattaata aatggtgtct tatttattgg tatatttata 300

tatcttagta caataccatt acctatttta aatggcatgt ttttatggat tgctttaatt 360

ttatttagtg cttgttacgc tttcattata tatttaattt tttcttctgc atttgaacgt 420

gctaaaaccc ataaacaata tgatatgatt cttatacttg gcgcaggtat attcaatgaa 480

acagtcactc ctatgctagc ctctagactg gatagagctt tagaaatcta taaagtacag 540

tcgcataatt gcaatatatt ggtaagtggt ggtcaaggtc ctgacgaacc aatttcagag 600

gccttagcaa tgaagaatta tctcattaaa tgtggtgtat catcttcttc aatattgatg 660

gaatcacaat caagcagtac atatgagaac tttttatatt ctaaatcttt cattaataca 720

tcgtttgaaa atgtccctag tattttatgc gtgacgagtc aatttcatat tttaagagcc 780

ttacgttttg cacaaaagtt aaatataaaa ataataggat taggaagttc aacgccttat 840

cattttctag ataaagcgct cttacgagat tttcttgcac ttatatatca atataaatta 900

cttttgactt tgtatttagt cggagtattt atagcgtcaa tttggatatt actttaa 957

<210> 18

<211> 957

<212> DNA

<213> Staphylococcus hominis

<400> 18

atgaaacaac atctatattt aacattttca gtttggacac ttttcttatg tatcataatg 60

gctataagtc ttttttggga tttagggtca ttacatcaag catttaatca aatgattttt 120

tttaaagtta gagttcctag aacatttgag gcgcttatgg taggagctat attaacgttg 180

acgggtcaat tatttcaaac ggtattaaat aatcctttag cagatagctt tacacttggt 240

ttagcgagtg gagcgacttt tggatcaagt ttagctatat ttttaggcgt atcttttcta 300

tttattccaa ttttttctat catttttagt atcacgacac ttttacttgt tgttataatg 360

acaatcgtat tgtctagaaa ttttccaatt agagtactca tcatatctgg acttatggta 420

ggcgcttttt ttaatgcatt aatatatata cttacactca ttaaaccaga acgtacgaat 480

cgtatgttag cctattattt cggaggattt gcgaatgccg aaatgaatga gctcgtttat 540

attacaatgg tttctttgcc aatcattatt gtgatgtata gtttagttac acccattaag 600

ctcttgcaat taggagaagc taaaagtaag tctctagggt taaatgtgca atggataaca 660

tttattgtac ttttgttaac atctattatg acagctatag cagtagcgtt tataggtgtg 720

ataggtttta ttggcatcat tgtacctcaa ttaattagac gatattattt tcaatatagt 780

cttgctatac aaatgacatt aaacatattg ataggtgcat taacgatgct attcgctgat 840

gttataggaa agatggttat caatccagtg caaattccag caagtattat tttatcactt 900

gttgggatac ccatattatt ttatatttta gtcactcaat ctaatacaac acgttag 957

<210> 19

<211> 810

<212> DNA

<213> Staphylococcus hominis

<400> 19

atgacttcgg aacataatga tacatactac caaacctcag aacagcgacc gataagaaat 60

gaatttgatt caaaacgtat tgttaaacgt gatttttggc taatacctac atacttagtc 120

atgaatattg tttttccatt gattcttaca tttattgtga tggcaatgat ttcaggcatc 180

acaggtggtc atatatcgga aagtaagttt acaaaatatt atttaggata tgcgcaagtc 240

tttacgttaa ttggtcaatg tcttgtatta gtagtctttt atttaatgca tcgcaaaacc 300

attattccta ttgccatctc acgttttaaa gctttaaaaa aacatattcc actcattatt 360

attgtgatgg tggcccttta tgtgttgcaa ggtgcatatg gttatttagt agaattttta 420

ccgaaacaat atcagtttga tgatacagaa aataacaaaa tgattattaa aatgtttgaa 480

atcaattggc tttggcctgt tttattttta gatattgtga ttattacacc tgttgtagaa 540

gaattattat tcagacattt gttaattcat gagttaggta aaaaattaac gtatggtgtg 600

atgtatgtcg tgtcagtact cggatttgca ggattacata tgacaagtgc atcatcacca 660

tttgaagttg gtccttatat aattatggct acaggatttg ttgtggcata tcacttaagt 720

ggtcgaaatt tagcgatgac gattacccta catatgataa ataactttgt ttcttttata 780

gcgattatta tgagtatcat ttggggttaa 810

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gcaccattta gcgataacca ag 22

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aacaggtctt ccgacgaaca tac 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aagttcgcaa agttcatcac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctgacagaag ttgtttcggt 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gtgagcgaga cagatgaacc t 21

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgtaactgag caaagaaatg agc 23

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ggtcatcagt ccgacaatca c 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tataacgcct caagctctgc c 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tacaggacga tttattgcca g 21

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gttcccgatt cttatctaca gc 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cagaataaag tagcaaccca ag 22

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tacatcgtcc cagttagcat c 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gagattgtta tcgctggagg c 21

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgctggacgg agttgtgct 19

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ggggctattt gctgtgagtt 20

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ggttcgtgta ttcgtggatt g 21

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tgttttatgc gagaagaggg 20

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

cgttgttcgg attgagtgag atg 23

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tttgtagcgt gggagtttat g 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tacgagtgat gatttgggtg t 21

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

catttccaag tgggcattc 19

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

taacgcctcc aactacatct g 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aggtttatgg ctcacttgta g 21

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

atgtgcttgg catttagg 18

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gtgtgggctt ctttacttt 19

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

taatccgatg gctttgtc 18

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ttttgcgatg gctattacg 19

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tgattcttcg gttgttggtt 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ggctttcatc ttccctttgg 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gctacgctgc ttgctttctg 20

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

cctgcctcaa tccagttcaa t 21

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tttcacaatc gctctgctca t 21

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tcatttctac catcggtttg c 21

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

caggaccttg accaccactt 20

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gggtcattac atcaagcatt t 21

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

cattcatttc ggcattcg 18

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cagcgaccga taagaaat 18

<210> 57

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

cacaacaaat cctgtagcc 19

Claims

1.核苷酸序列组合作为被检测靶标在非疾病诊断和治疗目的的鉴别葡萄球菌的应用，其特征在于，所述核苷酸序列组合如SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.19所示；所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.1~5用于鉴别金黄色葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.6~10用于鉴别表皮葡萄球菌；所述序列SEQID NO.11~15用于鉴别溶血葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.16~19用于鉴别人葡萄球菌。

2.用于鉴别葡萄球菌的引物组，其特征在于，所述引物组为根据权利要求1所述核苷酸序列组合设计得到；所述引物组的序列按5’到3’如SEQ ID NO.20~57所示；其中：

SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21为对应SEQ ID NO.1序列的引物对；

SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23为对应SEQ ID NO.2序列的引物对；

SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25为对应SEQ ID NO.3序列的引物对；

SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27为对应SEQ ID NO.4序列的引物对；

SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29为对应SEQ ID NO.5序列的引物对；

SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31为对应SEQ ID NO.6序列的引物对；

SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33为对应SEQ ID NO.7序列的引物对；

SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35为对应SEQ ID NO.8序列的引物对；

SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37为对应SEQ ID NO.9序列的引物对；

SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39为对应SEQ ID NO.10序列的引物对；

SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41为对应SEQ ID NO.11序列的引物对；

SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43为对应SEQ ID NO.12序列的引物对；

SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45为对应SEQ ID NO.13序列的引物对；

SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47为对应SEQ ID NO.14序列的引物对；

SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49为对应SEQ ID NO.15序列的引物对；

SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51为对应SEQ ID NO.16序列的引物对；

SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53为对应SEQ ID NO.17序列的引物对；

SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55为对应SEQ ID NO.18序列的引物对；

SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57为对应SEQ ID NO.19序列的引物对；

所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌。

3.如权利要求2所述引物组在非疾病诊断和治疗目的的鉴别葡萄球菌中的应用，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌。

4.用于鉴别葡萄球菌的非疾病诊断和治疗目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：使用如权利要求2所述引物组对待测样品DNA进行PCR扩增；

S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；

S3：观察引物组中各引物对对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明待测样品中含有对应的葡萄球菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则待测样品中不含有对应的葡萄球菌；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中的PCR扩增体系包括：PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTP、模板DNA、引物组、Tag酶和灭菌双蒸水。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5 μL，25 mM MgCl₂ 2 μL，2.5 mM dNTP 1 μL，模板DNA 100 ng，5 μM上下游引物各1 μL，Tag酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25 μL。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；55~58℃退火30 s；72℃延伸30 s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10 min。