CN108531549A - 核酸分子检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明的题目是核酸分子检测方法及检测试剂盒。本发明提供一种核酸分子检测方法。核酸分子检测方法包括下列步骤：准备寡核酸探针以及双链嵌合染料，寡核酸探针包括寡核酸链、报道荧光分子与荧光淬灭分子，其中报道荧光分子连接于寡核酸链的第一端，且荧光淬灭分子连接于所述寡核酸链的相对于第一端的第二端；使寡核酸探针结合至目标核酸，以形成局部双链结构；双链嵌合染料嵌入至局部双链结构中，藉此双链嵌合染料激发报道荧光分子发出荧光信号；以及根据荧光信号探测目标核酸。本发明还提供一种核酸分子检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明关于一种检测方法及检测试剂盒，特别关于一种核酸分子检测方法及检测试剂盒。
背景技术
寡核苷酸(Oligonucleotides)指短链的脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子，其广泛地应用于基因检测、科学研究及法医鉴定。在分子生物学领域，寡核苷酸常被制成具有特定核酸序列的单链分子，用于基因合成、聚合酶链式反应、脱氧核糖核酸测序、基因库的构建及作为分子探针。
因核苷酸之间的配对关系，可依使用者需求来设计寡核苷酸探针的核酸序列，以用于探测具有特定核酸序列的脱氧核糖核酸分子或核糖核酸分子(目标核酸)。目前已知有一种荧光探针为一端接有报道荧光分子的寡核苷酸探针。当此种荧光探针结合到互补的核酸序列时，若提供特定波长的激发光，则报道荧光分子可与嵌入在双链结构中的另一种荧光分子(即双链嵌合染料)发生荧光共振能量转移(FRET)，使报道荧光分子产生特定波长的发射光。
然而，前述荧光探针本身会形成分子内或分子间局部双链结构，而产生明显的背景信号，进而影响扩增曲线或熔解曲线的判读。虽然良好的探针序列设计可以稍微减轻背景信号，但是大部分的基因探测需针对特定的核酸位置，使得探针设计无法有太大灵活性，因此背景信号难以消除。此缺陷使得此种荧光探针的技术缺乏实用性难以被广泛接受。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的为提供一种核酸分子检测方法及检测试剂盒，其能够有效消除探针本身所产生的背景信号，并可用于聚合酶链式反应中以有效地定量目标核酸，或用来进行基因分型。
为达上述目的，依据本发明的一种核酸分子检测方法，用以探测目标核酸。所述核酸分子检测方法包括下列步骤：准备寡核酸探针以及双链嵌合染料，寡核酸探针包括寡核酸链、报道荧光分子与荧光淬灭分子，其中报道荧光分子连接于寡核酸链的第一端，且荧光淬灭分子连接于所述寡核酸链的相对于第一端的第二端；使寡核酸探针结合至目标核酸，以形成局部双链结构；双链嵌合染料嵌入至局部双链结构中，藉此双链嵌合染料激发报道荧光分子发出荧光信号；以及根据荧光信号探测目标核酸。
在实施方式中，寡核酸探针未结合至目标核酸时，荧光淬灭分子吸收报道荧光分子发出的荧光信号。
在实施方式中，寡核酸链为寡肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)链、寡锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)链或寡核苷酸(DNA/RNA)链。
在实施方式中，寡核酸链的长度为15单体单元至70单体单元。
在实施方式中，荧光淬灭分子吸收报道荧光分子发出的荧光信号后，不发出发射光或发出波长大于报道荧光分子的荧光信号的发射光。
在实施方式中，报道荧光分子选自HEX、Cy5、ROX、Bodipy 630/650与LCRed 640。
在实施方式中，荧光淬灭分子选自DABCYL、BHQ、Iowa Black、QSY与羧基四甲基罗丹明。
在实施方式中，双链嵌合染料选自SYBR Green I、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen。
为达上述目的，依据本发明的一种核酸分子检测试剂盒，用以探测目标核酸。所述核酸分子检测试剂盒包括双链嵌合染料以及寡核酸探针。寡核酸探针包括寡核酸链、报道荧光分子及荧光淬灭分子。报道荧光分子连接于寡核酸链的第一端。荧光淬灭分子连接于寡核酸链的相对于第一端的第二端。其中双链嵌合染料嵌入至寡核酸探针结合至目标核酸后所形成的局部双链结构，并藉由双链嵌合染料激发报道荧光分子所发出的荧光信号来探测目标核酸。
在实施方式中，寡核酸探针未结合至目标核酸时，荧光淬灭分子吸收报道荧光分子发出的荧光信号。
在实施方式中，寡核酸链为寡肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)链、寡锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)链或寡核苷酸(DNA/RNA)链。
在实施方式中，寡核酸链的长度为15单体单元至70单体单元。
在实施方式中，荧光淬灭分子吸收报道荧光分子发出的荧光信号后，不发出发射光或发出波长大于所述报道荧光分子的所述荧光信号的发射光。
在实施方式中，报道荧光分子选自HEX、Cy5、ROX、Bodipy 630/650与LCRed 640。
在实施方式中，荧光淬灭分子选自DABCYL、BHQ、Iowa Black、QSY与羧基四甲基罗丹明。
在实施方式中，双链嵌合染料选自SYBR Green I、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen。
承上所述，本发明的核酸分子检测方法及核酸分子检测试剂盒，利用具有报道荧光分子及荧光淬灭分子的寡核酸探针搭配双链嵌合染料来探测目标核酸。当寡核酸探针形成分子间或分子内的局部双链结构时，即形成非特异性配对时，由于报道荧光分子靠近荧光淬灭分子，荧光淬灭分子会吸收报道荧光分子所发出的特定波长的荧光信号。也就是说，寡核酸探针未结合至目标核酸时，荧光淬灭分子会吸收报道荧光分子发出的荧光信号。因此，在应用于聚合酶链式反应时，可有效消除非特异性配对所产生的背景信号，使得扩增曲线或熔解曲线更为清晰且易于判读，以有效地定量目标核酸或进行基因分型。
附图说明
图1为本发明实施方式的一种核酸分子检测方法的流程示意图。
图2A为本发明实施方式的核酸分子检测方法产生荧光信号的示意图。
图2B及图2C为寡核酸探针形成非特异性配对的示意图。
图3A为寡核酸探针与目标核酸形成完美配对或具有错误配对的熔解曲线示意图。
图3B为将图3A的熔解曲线微分后所得的熔解曲线示意图。
图4为利用不具有荧光淬灭分子的寡核酸探针所得的扩增曲线。
图5为利用具有荧光淬灭分子的寡核酸探针所得的扩增曲线。
图6为利用不具有荧光淬灭分子的寡核酸探针进行本发明实施例1所得的熔解曲线。
图7为利用具有荧光淬灭分子的寡核酸探针进行本发明实施例1所得的熔解曲线。
图8A、图8B及图8C分别为利用不同的报道荧光分子与荧光淬灭分子进行本发明实施例2所得的熔解曲线。
图9A及图9B分别为进行本发明实施例3所得的熔解曲线。
图10A及图10B为不具有荧光淬灭分子的寡核酸探针形成非特异性配对的示意图。
具体实施方式
以下将参照相关附图，说明依本发明优选实施方式的一种核酸分子检测方法及检测试剂盒，其中相同的元件将以相同的附图标记加以说明。
图1为本发明实施方式的一种核酸分子检测方法的流程示意图。如图1所示，本实施方式的核酸分子检测方法包括下列步骤：准备寡核酸探针以及双链嵌合染料，所述寡核酸探针包括寡核酸链、报道荧光分子与荧光淬灭分子，其中所述报道荧光分子连接于所述寡核酸链的第一端，且所述荧光淬灭分子连接于所述寡核酸链的相对于所述第一端的第二端(步骤S1)；使所述寡核酸探针结合至所述目标核酸，以形成局部双链结构(步骤S2)；所述双链嵌合染料嵌入至所述局部双链结构中，藉此所述双链嵌合染料激发所述报道荧光分子发出荧光信号(步骤S3)；以及根据所述荧光信号探测所述目标核酸(步骤S4)。
图2A为本发明实施方式的核酸分子检测方法的荧光信号产生示意图，请同时参照图1及图2A。于步骤S1中，准备双链嵌合染料1及寡核酸探针2。双链嵌合染料(doublestrand intercalating dye)指与双链核酸结合的荧光染料，其可与双链核酸嵌合。与双链核酸嵌合后，激发双链嵌合染料1时，其会发出特定波长的荧光。在本实施方式中，双链嵌合染料1可例如为SYBR Green I荧光染料。在其他实施方式中，双链嵌合染料1可选自SYBRGreen I、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen。
寡核酸探针2包括寡核酸链21、报道荧光分子22与荧光淬灭分子23。在本实施方式中，寡核酸链21可为寡肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)链、寡锁核酸(Locked nucleicacid，LNA)链或寡核苷酸(DNA/RNA)链，且寡核酸链21的长度为15单体单元(mer)至70单体单元。报道荧光分子22连接于寡核酸链21的第一端211，而荧光淬灭分子23连接于寡核酸链21的相对于第一端211的第二端212。其中，寡核酸链21的第一端211可为寡核酸链21的5’端或3’端，可依设计寡核酸探针2的实际需要调整，本发明并不限制。而本发明所属领域普通技术人员则可推知寡核酸链21的第二端212相对于第一端211而为对应的5’端或3’端。换言之，本发明并不限制报道荧光分子22及荧光淬灭分子23连接于5’端或3’端，且经实验证明报道荧光分子22及荧光淬灭分子23连接于5’端或3’端并不影响寡核酸探针2所能达到的功效，这将于实施例3中详述。在本实施方式中，报道荧光分子22可选自HEX(Hexachlor-fluorescein，可购自Thermo Fisher Scientific Inc.)、Cy5(Cyanine 5)、罗丹明X(Rhodamine X，ROX)、二吡咯亚甲基硼(Borondipyrromethene，Bodipy 630/650)与Red 640(LCRed 640，可购自罗氏公司)。在本实施方式中，荧光淬灭分子23可为黑洞淬灭分子(Black hole quencher，BHQ)，其可例如为BHQ1、BHQ2或BHQ3。在其他实施方式中，荧光淬灭分子23可选自DABCYL、BHQ家族(例如BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3，可购自Sigma-Aldrich)、Iowa Black(例如IowaFQ或IowaRQ，可购自IntegratedDNA Technologies,Inc.)、QSY家族(例如7、9、21、35，可购自Thermo Fisher Scientific Inc.)与羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine，又简称为TAM或TAMRA，可购自Sigma-Aldrich)。
于步骤S2中，寡核酸探针2结合至目标核酸NT，以形成局部双链结构。目标核酸NT是本实施方式的核酸分子检测方法所要探测的一段核酸，而寡核酸探针2的寡核酸链21上的核酸序列被设计为与目标核酸NT上的一段核酸序列互补。因此在适当的环境下(例如具有合适的缓冲液且在合适的温度下)，寡核酸探针2会结合至目标核酸NT，而形成局部双链结构。
在寡核酸探针2与目标核酸NT形成局部双链结构后，进行步骤S3，即双链嵌合染料1会嵌入至局部双链结构中。接着，以一特定波长的光(激发光)LEx激发双链嵌合染料1，使双链嵌合染料1产生另一特定波长的光。由于双链嵌合染料1靠近报道荧光分子22，双链嵌合染料1所产生的光的能量会经由荧光共振能量转移(FRET)的过程激发报道荧光分子22(如图2A所示的空心箭头)，使得报道荧光分子22发出又一特定波长的荧光信号LEm。
现以SYBR Green I荧光染料作为双链嵌合染料1为例来进一步说明本实施方式。在寡核酸探针2与目标核酸NT形成局部双链结构后，SYBR Green I荧光染料会嵌入至局部双链结构中。接着，以一波长约为483nm的光激发SYBR Green I荧光染料，使SYBR Green I荧光染料产生波长约为522nm的荧光，而此荧光的能量会经由荧光共振能量转移的过程激发报道荧光分子22，使得报道荧光分子22发出特定波长的荧光信号LEm。
在步骤S4中，可根据荧光信号LEm探测目标核酸NT。由于寡核酸探针2与目标核酸NT为特异性结合，特定波长的荧光信号LEm的荧光强度会与目标核酸NT的量成正比，因此可用于定量目标核酸NT。
荧光淬灭分子(quencher molecule)是可吸收荧光团(例如为本发明的报道荧光分子)的激发能量并以热能形式或以再次发射光能的方式来消散其所吸收的能量的一种物质。因此，当报道荧光分子被激发时，若荧光淬灭分子及报道荧光分子的距离够近，报道荧光分子的发射光可被附近的荧光淬灭分子吸收，而不被探测到。例如，在报道荧光分子与荧光淬灭分子相距约(angstrom)时，可达到约94％淬灭效率(quenching efficiency)，而在报道荧光分子与荧光淬灭分子相距约时，可达到69％淬灭效率。若荧光淬灭分子吸收了荧光团的激发能量而以热能形式来消散其所吸收的能量，则为暗荧光淬灭分子(dark quencher)，例如为DABCYL、BHQ(BHQ1、BHQ2或BHQ3)、Iowa Black或QSY等等。然而，一般的荧光淬灭分子吸收了荧光团的激发能量后，会将大部分其所吸收的能量以光的形式再次发射出去。在一些实施方式中，报道荧光分子及荧光淬灭分子的选择以报道荧光分子的发射光(荧光信号)的发射波长与荧光淬灭分子的波长吸收范围能够搭配来考虑，且荧光淬灭分子的发射光的发射波长大于报道荧光分子的荧光信号的发射波长。例如是羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethyl rhodamine)。
如图2A所示，当寡核酸探针2与目标核酸NT结合时，因碱基配对关系，使寡核酸探针2上的报道荧光分子22与荧光淬灭分子23的距离增加，此距离使荧光淬灭分子23不会影响报道荧光分子22的荧光信号LEm。
然而，寡核酸探针会形成分子间(inter-molecular)或分子内(intra-molecular)的局部双链结构，称之为非特异性配对。图2B及图2C为寡核酸探针2形成非特异性配对的示意图。图10A及图10B为不具有荧光淬灭分子的寡核酸探针形成非特异性配对的示意图。请同时参照图2B及图10A，当寡核酸探针2因其寡核酸链21上的核酸序列互补而形成如图2B所示的非特异性配对时，即当两条寡核酸探针2互相结合时，由于其仍会形成局部双链结构，故双链嵌合染料1可嵌入所述双链结构中。如前所述，以一特定波长的光(激发光)激发双链嵌合染料1时，可经由荧光共振能量转移的过程激发报道荧光分子22，使得报道荧光分子22发出又一特定波长的荧光信号。然而，由于报道荧光分子22靠近荧光淬灭分子23，荧光淬灭分子23会吸收报道荧光分子22所发出的特定波长的荧光信号。故在探测报道荧光分子22发出的特定波长的荧光信号时，仅能探测到寡核酸探针2与目标核酸NT形成特异性配对的情形下所产生的荧光信号。
同样地，如图10A所示，当两条不具有荧光淬灭分子的寡核酸探针8互相结合而形成非特异性配对时，双链嵌合染料1也会嵌入两条寡核酸探针8所形成的双链结构中。且以一特定波长的光(激发光)激发双链嵌合染料1时，也能经由荧光共振能量转移的过程激发报道荧光分子82，使得报道荧光分子82发出又一特定波长的荧光信号。由于寡核酸探针8不具有荧光淬灭分子，故在此非特异性配对的情况下报道荧光分子82所产生的特定波长的荧光信号不会被吸收而形成背景信号。因此，在探测报道荧光分子82发出的特定波长的荧光信号时，除了可探测到寡核酸探针8与目标核酸NT形成特异性配对所产生的荧光信号，亦可探测到两条寡核酸探针8形成非特异性配对所产生的荧光信号，即无法排除非特异性配对所产生的背景信号。相反地，使用本实施方式中具有荧光淬灭分子23的寡核酸探针2则可有效消除非特异性配对所产生的背景信号。
除了上述两条寡核酸探针互相结合而形成的分子间非特异性配对，个别寡核酸探针本身也可能形成分子内非特异性配对。也就是说，因碱基配对关系，个别寡核酸探针本身形成局部双链结构。如图2C所示，由于报道荧光分子22靠近荧光淬灭分子23，荧光淬灭分子23会吸收报道荧光分子22所发出的特定波长的荧光信号。而如图10B所示，寡核酸探针8不具有荧光淬灭分子，故报道荧光分子82所产生的特定波长的荧光信号不会被吸收而形成背景信号。由此可知，在本实施方式中，当寡核酸探针2未结合至目标核酸NT时，即寡核酸探针2形成分子间或分子内的局部双链结构时，荧光淬灭分子23会吸收报道荧光分子22发出的荧光信号。双链嵌合染料1、报道荧光分子22、82及荧光淬灭分子23的作用可参照前述分子间非特异性配对，在此不再赘述。
本发明还提供一种核酸分子检测试剂盒，用以探测目标核酸。核酸分子检测试剂盒包括双链嵌合染料以及寡核酸探针。寡核酸探针包括寡核酸链、报道荧光分子及荧光淬灭分子。报道荧光分子连接于寡核酸链的第一端。荧光淬灭分子连接于寡核酸链的相对于第一端的第二端。双链嵌合染料嵌入至寡核酸探针结合至目标核酸后所形成的局部双链结构，并藉由双链嵌合染料激发报道荧光分子所发出的荧光信号来探测目标核酸。
本发明所提供的核酸分子检测方法及检测试剂盒可用于基因分型(genotyping)。请参照图3A及图3B，图3A为寡核酸探针与目标核酸形成完美配对或具有错误配对的熔解曲线(melting curve)示意图，图3B为将图3A的熔解曲线微分后的熔解曲线示意图。微分后，熔解曲线的波峰所对应的温度即为寡核酸探针与目标核酸的解链温度(meltingtemperature，Tm)。解链温度是DNA双螺旋体解开为单链所需的温度。因此，当目标核酸与寡核酸探针序列完全互补而形成完美配对(perfect match)时，需消耗较多能量才能使双螺旋体解开，故解链温度Tm2较高。反之，当目标核酸与寡核酸探针序列之间有错误配对(mismatch)时，则解链温度Tm1较低。由于寡核酸探针的序列依使用者需求而设计，因此可藉由比较目标核酸与寡核酸探针的解链温度来判断两者间为完美配对或具有错误配对，进而判断目标核酸的基因型。
另外，本发明所提供的核酸分子检测方法及检测试剂盒可提供信号更清晰的扩增曲线(amplification curve)，以定量目标核酸。请参照图4及图5，图4为利用不具有荧光淬灭分子的寡核酸探针所得的扩增曲线，图5为利用具有荧光淬灭分子的寡核酸探针所得的扩增曲线。每条扩增曲线旁的数字作为聚合酶链式反应模板(template)的目标核酸的起始拷贝数(copy number)，而基线为无模板的对照组所得的线。由图可知，利用不具有荧光淬灭分子的寡核酸探针所得的扩增曲线信号较杂乱不易判读。相反地，利用具有荧光淬灭分子的寡核酸探针所得的扩增曲线信号则清晰且易于判读。依据扩增曲线定量目标核酸为本发明所属领域的通常知识，在此不再赘述。
以下以实施例确认本发明所提供的核酸分子检测方法及检测试剂盒可搭配熔解曲线的分析进行基因分型。
实施例1：利用熔解曲线进行基因分型
本实施例使用寡核酸探针探测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的23s rRNA基因V区域上的点突变r.2063A>G或r.2064A>G。首先，利用聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)放大所要探测的肺炎支原体基因片段(目标核酸)，再搭配熔解曲线分析，藉由熔解曲线的波峰位置区分基因片段(目标核酸)上是否具有点突变。
聚合酶链式反应以下列反应物来进行：20μl的反应体积中，加入1倍聚合酶链式反应混合物(PCR Mix)(含有50mM Tris(pH8.5)、3mM氯化镁(MgCl2)、0.5mg/ml BSA及dNTP(每种各200μM))、0.25μM MP-F引物(primer)：5’-TCCAGGTACGGGTGAAGACA-3’、0.083μM MP-R引物：5’-GCTCCTACCTATTCTCTACATGAT-3’、0.25μM寡核酸探针：5’-ROX-GCGCAACGGGACGGAAAGAC-BHQ1-3’、0.5U Taq DNA聚合酶、1/20000倍SYBR Green I以及肺炎支原体检体核酸(目标核酸)。其中，寡核酸探针的浓度在0.12μM～1μM的范围内均可有相当的效果。
聚合酶链式反应的条件为：反应温度为95℃作用5分钟，重复95℃5秒、56℃3秒、72℃15秒循环70次，每一循环在56℃时探测一次荧光信号，70个循环过后于72℃作用1分钟。最后进行熔解曲线分析：在95℃反应30秒后，降温到40℃反应10秒，再以每秒上升0.7℃的速度增加到95℃，期间以每秒1次的探测速度探测610nm的荧光信号。
探测荧光信号时，激发光的波长设定在约483nm，探测光的波长设定在寡核酸探针的报道荧光分子的最大发射光附近。本实施例使用的报道荧光分子是ROX，故探测光波长设定在610nm。若使用LCRed 640作为报道荧光分子，探测光波长则设定在640nm。
接着，绘出以每秒1次的探测速度所探测到610nm的荧光信号的荧光值(F)对温度(T)的曲线，即可得到初步的熔解曲线，然后再以色光补偿(color compensation)公式扣除SYBR Green I的背景值即可得到所需的熔解曲线。接着，将熔解曲线对温度微分后取负值(-dF/dT)，得到微分后的熔解曲线。同时，利用不具有荧光淬灭分子的寡核酸探针进行上述实验，实验结果分别示于图6及图7。
此外，亦可绘出每一循环在56℃时(退火阶段)所测得的荧光信号以得到初步的扩增曲线，然后再以色光补偿公式扣除SYBR Green I的背景值即可得到所需的扩增曲线(图未示)。利用扩增曲线可进一步定量目标核酸。
请参照图6及图7，图6为利用不具荧光淬灭分子的寡核酸探针进行本实施例所得的熔解曲线，图7为利用具有荧光淬灭分子的寡核酸探针进行本实施例所得的熔解曲线。如图6所示，无目标核酸存在时，寡核酸探针本身即产生很强的背景信号。同时，完美配对的目标核酸及错误配对的目标核酸的熔解曲线均会受到所述背景信号的影响而干扰波峰位置的判读。然而，如图7所示，使用具有荧光淬灭分子的寡核酸探针时，无目标核酸存在时，几乎不具有背景信号。且因有效降低背景信号，使得熔解曲线较为清晰而易于判读。
请参照图7，熔解曲线波峰位置在72℃的为野生型的目标核酸，而熔解曲线波峰位置在68℃的为具有点突变的目标核酸。由于寡核酸探针的核酸序列依据野生型的目标核酸设计，故寡核酸探针与野生型的目标核酸间为完美配对，而寡核酸探针与具有点突变的目标核酸间具有错误配对。即，野生型的目标核酸为完美配对的目标核酸，而具有点突变的目标核酸为错误配对的目标核酸。因此，与具有点突变的目标核酸相比，寡核酸探针与野生型的目标核酸的解链温度较高。而且，当无目标核酸(肺炎支原体基因片段)存在时，则不会有熔解曲线波峰产生。
实施例2：不同报道荧光分子及荧光淬灭分子的比较
本实施例使用寡核酸探针探测人类细胞KRAS基因密码子12位置上的基因突变，以K562细胞株基因组DNA作为野生型DNA模板，即完美配对的目标核酸，并使用TSGH细胞株基因组DNA(其在KRAS密码子12上带有一个碱基突变)作为突变型DNA模板，即错误配对的目标核酸。
在本实施例中为比较不同的报道荧光分子及荧光淬灭分子的效果，将探针的5’端及3’端分别以不同的报道荧光分子及荧光淬灭分子进行标记，并以不同的探针分别进行聚合酶链式反应。在本实施例中所使用的引物及探针整理于下表1。其中，引物与探针的序列由5’端至3’端表示。
表1
| 引物/探针 | 序列(5’→3’) | 5’端标记 | 3’端标记 |
| 正向引物 | ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG | ||
| 反向引物 | CAAAGAATGGTCCTGCACCAG | ||
| 探针-5HEX-3Q1 | CCTACGCCACCAGCTCCAAC | 5’HEX | 3’BHQ1 |
| 探针-5R640-3Q2 | CCTACGCCACCAGCTCCAAC | 5’LCRed 640 | 3’BHQ2 |
| 探针-5Cy5-3Q3 | CCTACGCCACCAGCTCCAAC | 5’Cy5 | 3’BHQ3 |
聚合酶链式反应以下表2中所列的反应物来进行，反应体积共20μl。
表2
聚合酶链式反应的条件为：反应温度为95℃作用5分钟，重复98℃10秒、60℃10秒、72℃20秒循环50次，每一循环在60℃时探测一次荧光信号，50个循环过后于72℃作用2分钟。最后进行熔解曲线分析：在95℃反应1秒后，降温到40℃反应1秒，再以每秒上升0.06℃的速度增加到95℃，期间以每℃探测2次的速度探测荧光信号，最后再降至40℃作用30秒。
探测荧光信号时，激发光的波长设定在约483nm，探测光的波长设定在寡核酸探针的报道荧光分子的最大发射光附近。本实施例分别使用HEX、LCRed 640及Cy5作为报道荧光分子，因此探测光波长分别设定在560nm、640nm及670nm。
接着，如实施例1所述的方法绘出熔解曲线，并分别示于图8A、图8B及图8C。图8A中所使用的探针包含HEX作为报道荧光分子，并包含BHQ1作为荧光淬灭分子。图8B中所使用的探针包含LCRed 640作为报道荧光分子，并包含BHQ2作为荧光淬灭分子。图8C中所使用的探针包含Cy5作为报道荧光分子，并包含BHQ3作为荧光淬灭分子。
请参照图8A、图8B及图8C，其分别为利用不同的报道荧光分子与荧光淬灭分子进行本发明实施例2所得的熔解曲线。如图所示，完美配对的目标核酸的熔解曲线波峰位置均约在72℃，而错误配对的目标核酸的熔解曲线波峰位置均约在62℃，且在无目标核酸存在时背景信号都很低。由此可知，使用例如为HEX、LCRed 640及Cy5的报道荧光分子及例如BHQ1、BHQ2及BHQ3的荧光淬灭分子，可有效消除非特异性配对所产生的背景信号，使得熔解曲线更为清晰且易于判读，以有效地进行基因分型。
实施例3：报道荧光分子在寡核酸探针5’端或3’端的差异比较
本实施例中所使用的目标核酸、引物、聚合酶链式反应的反应物及聚合酶链式反应的条件均与实施例2相同。然而，因为本实施例要探讨将报道荧光分子接在寡核酸探针5’端或3’端是否会对寡核酸探针的功效产生影响，因此使用将报道荧光分子接在不同端的寡核酸探针，即使用如下表4所示的探针分别进行聚合酶链式反应。
表4
| 探针 | 序列(5’→3’) | 5’端标记 | 3’端标记 |
| 探针-5ROX-3Q2 | CCTACGCCACCAGCTCCAAC | 5’ROX | 3’BHQ2 |
| 探针-5Q2-3ROX | CCTACGCCACCAGCTCCAAC | 5’BHQ2 | 3’ROX |
同样地，在探测荧光信号时，激发光的波长设定在约483nm，探测光的波长设定在寡核酸探针的报道荧光分子的最大发射光附近。本实施例使用的报道荧光分子是ROX，故探测光波长设定在610nm。
接着，如实施例1中所述的方法绘出熔解曲线。实验结果分别示于图9A及图9B，图9A中所使用的探针在5’端包含ROX作为报道荧光分子，并在3’端包含BHQ2作为荧光淬灭分子，而图9B中所使用的探针则在5’端包含BHQ2作为荧光淬灭分子，并在3’端包含ROX作为报道荧光分子。
请参照图9A及图9B，完美配对的目标核酸的熔解曲线波峰位置均约在72℃，而错误配对的目标核酸的熔解曲线波峰位置均约在62℃，且在无目标核酸存在时背景值都很低。由此可知，报道荧光分子及荧光淬灭分子接在寡核酸链的哪一端(5’端或3’端)并不影响本发明寡核酸探针的功效，均可有效消除非特异性配对所产生的背景信号，使得熔解曲线更为清晰且易于判读，以有效地进行基因分型。
综上所述，本发明的核酸分子检测方法及核酸分子检测试剂盒，利用具有报道荧光分子及荧光淬灭分子的寡核酸探针搭配双链嵌合染料来探测目标核酸。当寡核酸探针形成分子间或分子内的局部双链结构时，即形成非特异性配对时，由于报道荧光分子靠近荧光淬灭分子，荧光淬灭分子会吸收报道荧光分子所发出的特定波长的荧光信号。也就是说，寡核酸探针未结合至目标核酸时，荧光淬灭分子会吸收报道荧光分子发出的荧光信号。因此，在应用于聚合酶链式反应时，可有效消除非特异性配对所产生的背景信号，使得扩增曲线或熔解曲线更为清晰且易于判读，以有效地定量目标核酸或进行基因分型。
以上所述仅为示例性的，而非为限制性的。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等价修改或变更，均应包含于所附的权利要求中。
Claims (14)
1.一种核酸分子检测方法，用以探测目标核酸，所述核酸分子检测方法包括下列步骤：
准备寡核酸探针以及双链嵌合染料，所述寡核酸探针包括寡核酸链、报道荧光分子与荧光淬灭分子，其中所述报道荧光分子连接于所述寡核酸链的第一端，且所述荧光淬灭分子连接于所述寡核酸链的相对于所述第一端的第二端；
使所述寡核酸探针结合至所述目标核酸，以形成局部双链结构；
所述双链嵌合染料嵌入至所述局部双链结构中，藉此所述双链嵌合染料激发所述报道荧光分子发出荧光信号；以及
根据所述荧光信号探测所述目标核酸。
2.如权利要求1所述的核酸分子检测方法，其中所述寡核酸探针未结合至所述目标核酸时，所述荧光淬灭分子吸收所述报道荧光分子发出的所述荧光信号。
3.如权利要求1所述的核酸分子检测方法，其中所述寡核酸链为寡肽核酸链、寡锁核酸链或寡核苷酸链。
4.如权利要求1所述的核酸分子检测方法，其中所述寡核酸链的长度为15单体单元至70单体单元。
5.如权利要求1所述的核酸分子检测方法，其中所述报道荧光分子选自HEX、Cy5、ROX、Bodipy 630/650与LCRed 640。
6.如权利要求1所述的核酸分子检测方法，其中所述荧光淬灭分子选自DABCYL、BHQ、Iowa Black、QSY与羧基四甲基罗丹明。
7.如权利要求1所述的核酸分子检测方法，其中所述双链嵌合染料选自SYBR Green I、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen。
8.一种核酸分子检测试剂盒，用以探测目标核酸，所述核酸分子检测试剂盒包括：
双链嵌合染料；以及
寡核酸探针，所述寡核酸探针包括：
寡核酸链；
报道荧光分子连接于所述寡核酸链的第一端；以及
荧光淬灭分子连接于所述寡核酸链的相对于所述第一端的第二端，
其中所述双链嵌合染料嵌入至所述寡核酸探针结合至所述目标核酸后所形成的局部双链结构，并藉由所述双链嵌合染料激发所述报道荧光分子所发出的荧光信号来探测所述目标核酸。
9.如权利要求8所述的核酸分子检测试剂盒，其中所述寡核酸探针未结合至所述目标核酸时，所述荧光淬灭分子吸收所述报道荧光分子发出的所述荧光信号。
10.如权利要求8所述的核酸分子检测试剂盒，其中所述寡核酸链为寡肽核酸链、寡锁核酸链或寡核酸链。
11.如权利要求8所述的核酸分子检测试剂盒，其中所述寡核苷酸链的长度为15单体单元至70单体单元。
12.如权利要求8所述的核酸分子检测试剂盒，其中所述报道荧光分子选自HEX、Cy5、ROX、Bodipy 630/650与LCRed 640。
13.如权利要求8所述的核酸分子检测试剂盒，其中所述荧光淬灭分子选自DABCYL、BHQ、Iowa Black、QSY与羧基四甲基罗丹明。
14.如权利要求8所述的核酸分子检测试剂盒，其中所述双链嵌合染料选自SYBR GreenI、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen。
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