TW201833328A - 核酸分子檢測方法及檢測套組 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種核酸分子檢測方法。核酸分子檢測方法包括下列步驟：準備一寡核酸探針以及一雙股嵌合染劑，寡核酸探針包括一寡核酸鏈、一報導螢光分子與一螢光熄滅分子，其中報導螢光分子連接於寡核酸鏈之一第一端，且螢光熄滅分子連接於該寡核酸鏈之相對於第一端之一第二端；使寡核酸探針結合至目標核酸，以形成局部雙股結構；雙股嵌合染劑嵌入至局部雙股結構中，藉此雙股嵌合染劑激發報導螢光分子發出一螢光訊號；以及根據螢光訊號偵測目標核酸。本發明更提供一種核酸分子檢測套組。
Description
本發明係關於一種檢測方法及檢測套組，特別係關於一種核酸分子檢測方法及檢測套組。
寡核苷酸(Oligonucleotides)係指短鏈的去氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子，其廣泛地應用於基因檢測、科學研究及法醫鑒定。在分子生物學領域，寡核苷酸常被製成具有特定核酸序列的單股分子，用於基因合成、聚合脢(酶)連鎖反應、去氧核糖核酸定序、基因庫的建置及作為分子探針。
因核苷酸之間的配對關係，可依使用者需求來設計寡核苷酸探針的核酸序列，以用於偵測具有特定核酸序列的去氧核糖核酸分子或核糖核酸分子(目標核酸)。目前已知有一種螢光探針係為一端接有報導螢光分子的寡核苷酸探針。當此種螢光探針結合到互補的核酸序列時，若提供特定波長的激發光，則報導螢光分子可與嵌入在雙股結構中的另一種螢光分子(即雙股嵌合染劑)發生螢光共振能量傳遞(FRET)，使報導螢光分子產生特定波長的放射光。
然而，前述螢光探針本身會形成分子內或分子間局部雙股結構，而產生明顯的背景訊號，進而影響增殖曲線或融離曲線的判讀。雖然良好的探針序列設計可以稍微減輕背景訊號，但是大部分的基因偵測需針對特定的核酸位置，使得探針設計無法有太大彈性，因此背景訊號難以消除。此缺陷使得此種螢光探針的技術缺乏實用性難以被廣泛接受。
有鑑於上述課題，本發明之目的為提供一種核酸分子檢測方 法及檢測套組，其能夠有效消除探針本身所產生之背景訊號，並可用於聚合酶連鎖反應中以有效地定量目標核酸，或是用來進行基因分型。
為達上述目的，依據本發明之一種核酸分子檢測方法，係用以偵測一目標核酸。該核酸分子檢測方法包括下列步驟：準備一寡核酸探針以及一雙股嵌合染劑，寡核酸探針包括一寡核酸鏈、一報導螢光分子與一螢光熄滅分子，其中報導螢光分子連接於寡核酸鏈之一第一端，且螢光熄滅分子連接於該寡核酸鏈之相對於第一端之一第二端；使寡核酸探針結合至目標核酸，以形成局部雙股結構；雙股嵌合染劑嵌入至局部雙股結構中，藉此雙股嵌合染劑激發報導螢光分子發出一螢光訊號；以及根據螢光訊號偵測目標核酸。
在一實施例中，寡核酸探針未結合至目標核酸時，螢光熄滅分子係吸收報導螢光分子發出之螢光訊號。
在一實施例中，寡核酸鏈為一寡肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)鏈、一寡鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)鏈或一寡核苷酸(DNA/RNA)鏈。
在一實施例中，寡核酸鏈之長度為15單體單元至70單體單元。
在一實施例中，螢光熄滅分子吸收報導螢光分子發出之螢光訊號後，不發出放射光或發出波長大於報導螢光分子之螢光訊號的放射光。
在一實施例中，報導螢光分子係選自由HEX、Cy5、ROX、Bodipy 630/650與LCRed 640所組成之群組。
在一實施例中，螢光熄滅分子係選自由DABCYL、BHQ、Iowa Black、QSY與羧基四甲基羅丹明所組成之群組。
在一實施例中，雙股嵌合染劑係選自由SYBR Green I、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen所組成之群組。
為達上述目的，依據本發明之一種核酸分子檢測套組，係用以偵測一目標核酸。該核酸分子檢測套組包括一雙股嵌合染劑以及一寡核酸探針。寡核酸探針包括一寡核酸鏈、一報導螢光分子及一螢光熄滅分子。報導螢光分子連接於寡核酸鏈之一第一端。螢光熄滅分子連接於寡核酸鏈 之相對於第一端之一第二端。其中雙股嵌合染劑係嵌入至寡核酸探針結合至目標核酸後所形成之一局部雙股結構，並藉由雙股嵌合染劑激發報導螢光分子所發出之一螢光訊號來偵測目標核酸。
在一實施例中，寡核酸探針未結合至目標核酸時，螢光熄滅分子係吸收報導螢光分子發出之螢光訊號。
在一實施例中，寡核酸鏈為一寡肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)鏈、一寡鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)鏈或一寡核苷酸(DNA/RNA)鏈。
在一實施例中，寡核酸鏈之長度為15單體單元至70單體單元。
在一實施例中，螢光熄滅分子吸收報導螢光分子發出之螢光訊號後，不發出放射光或發出波長大於該報導螢光分子之該螢光訊號的放射光。
在一實施例中，報導螢光分子係選自由HEX、Cy5、ROX、Bodipy 630/650與LCRed 640所組成之群組。
在一實施例中，螢光熄滅分子係選自由DABCYL、BHQ、Iowa Black、QSY與羧基四甲基羅丹明所組成之群組。
在一實施例中，雙股嵌合染劑係選自由SYBR Green I、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen所組成之群組。
承上所述，本發明之核酸分子檢測方法及核酸分子檢測套組，係利用具有報導螢光分子及螢光熄滅分子的寡核酸探針搭配雙股嵌合染劑來偵測目標核酸。當寡核酸探針形成分子間或分子內之局部雙股結構時，即形成非專一性配對時，由於報導螢光分子靠近螢光熄滅分子，螢光熄滅分子會吸收報導螢光分子所發出之特定波長的螢光訊號。也就是說，寡核酸探針未結合至目標核酸時，螢光熄滅分子會吸收報導螢光分子發出之螢光訊號。因此，在應用於聚合酶連鎖反應時，可有效消除非專一性配對所產生之背景訊號，使得增殖曲線或融離曲線更為清晰且易於判讀，以有效地定量目標核酸或進行基因分型。
1‧‧‧雙股嵌合染劑
2、3‧‧‧寡核酸探針
21‧‧‧寡核酸鏈
211‧‧‧第一端
212‧‧‧第二端
22、82‧‧‧報導螢光分子
23‧‧‧螢光熄滅分子
LEx‧‧‧激發光
LEm‧‧‧螢光訊號
NT‧‧‧目標核酸
S1、S2、S3、S4‧‧‧步驟
圖1為本發明實施例之一種核酸分子檢測方法的流程示意圖。
圖2A為本發明實施例之核酸分子檢測方法產生螢光訊號之示意圖。
圖2B及圖2C為寡核酸探針形成非專一性配對之示意圖。
圖3A為寡核酸探針與目標核酸形成完美配對或具有錯誤配對之融離曲線示意圖。
圖3B為將圖3A之融離曲線微分後所得之融離曲線示意圖。
圖4為利用不具有螢光熄滅分子之寡核酸探針所得之增殖曲線。
圖5為利用具有螢光熄滅分子之寡核酸探針所得之增殖曲線。
圖6為利用不具有螢光熄滅分子之寡核酸探針進行本發明實驗例1所得之融離曲線。
圖7為利用具有螢光熄滅分子之寡核酸探針進行本發明實驗例1所得之融離曲線。
圖8A、圖8B及圖8C分別為利用不同之報導螢光分子與螢光熄滅分子進行本發明實驗例2所得之融離曲線。
圖9A及圖9B分別為進行本發明實驗例3所得之融離曲線。
圖10A及圖10B為不具有螢光熄滅分子之寡核酸探針形成非專一性配對之示意圖。
以下將參照相關圖式，說明依本發明較佳實施例之一種核酸分子檢測方法及檢測套組，其中相同的元件將以相同的參照符號加以說明。
圖1為本發明實施例之一種核酸分子檢測方法的流程示意圖。如圖1所示，本實施例之核酸分子檢測方法包括下列步驟：準備一寡核酸探針以及一雙股嵌合染劑，該寡核酸探針包括一寡核酸鏈、一報導螢光分子與一螢光熄滅分子，其中該報導螢光分子連接於該寡核酸鏈之一第一端，且該螢光熄滅分子連接於該寡核酸鏈之相對於該第一端之一第二端(步驟S1)；使該寡核酸探針結合至該目標核酸，以形成局部雙股結構(步驟S2)；該雙股嵌合染劑嵌入至該局部雙股結構中，藉此該雙股嵌合染劑激 發該報導螢光分子發出一螢光訊號(步驟S3)；以及根據該螢光訊號偵測該目標核酸(步驟S4)。
圖2A為本發明實施例之核酸分子檢測方法的螢光訊號產生示意圖，請同時參照圖1及圖2A。於步驟S1中，準備雙股嵌合染劑1及寡核酸探針2。雙股嵌合染劑(double strand intercalating dye)係指與雙股核酸結合的螢光染劑，其可與雙股核酸嵌合。與雙股核酸嵌合後，激發雙股嵌合染劑1時，其會發出特定波長的螢光。在本實施例中，雙股嵌合染劑1可例如為SYBR Green I螢光染料。在其他實施例中，雙股嵌合染劑1可選自由SYBR Green I、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen所組成之群組。
寡核酸探針2包括寡核酸鏈21、報導螢光分子22與螢光熄滅分子23。在本實施例中，寡核酸鏈21可為寡肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)鏈、寡鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)鏈或寡核苷酸(DNA/RNA)鏈，且寡核酸鏈21之長度為15單體單元(mer)至70單體單元。報導螢光分子22連接於寡核酸鏈21之第一端211，而螢光熄滅分子23連接於寡核酸鏈21之相對於第一端211的第二端212。其中，寡核酸鏈21之第一端211可為寡核酸鏈21的5’端或3’端，可依設計寡核酸探針2之實際需要調整，本發明並不限制。而本發明所屬領域具有通常知識者則可推知寡核酸鏈21之第二端212係相對於第一端211而為對應的5’端或3’端。換言之，本發明並不限制報導螢光分子22及螢光熄滅分子23連接於5’端或3’端，且經實驗證明報導螢光分子22及螢光熄滅分子23係連接於5’端或3’端並不影響寡核酸探針2所能達到的功效，這將於實驗例3中詳述。在本實施例中，報導螢光分子22可選自由HEX(Hexachlor-fluorescein，可購自Thermo Fisher Scientific Inc.)、Cy5(Cyanine 5)、羅丹明X(Rhodamine X，ROX)、二吡咯亞甲基硼(Borondipyrromethene，Bodipy 630/650)與LightCycler® Red 640(LCRed 640，可購自羅氏公司)所組成之群組。在本實施例中，螢光熄滅分子23可為黑洞熄滅分子(Black hole quencher，BHQ)，其可例如為BHQ1、BHQ2或BHQ3。在其他實施例中，螢光熄滅分子23可選自由DABCYL、BHQ家族(例如BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3， 可購自Sigma-Aldrich)、Iowa Black(例如Iowa Black® FQ或Iowa Black® RQ，可購自Integrated DNA Technologies,Inc.)、QSY家族(例如QSY® 7、QSY® 9、QSY® 21、QSY® 35，可購自Thermo Fisher Scientific Inc.)與羧基四甲基羅丹明(Carboxytetramethyl rhodamine，又簡稱為TAM或TAMRA，可購自Sigma-Aldrich)所組成之群組。
於步驟S2中，寡核酸探針2結合至目標核酸NT，以形成局部雙股結構。目標核酸NT係本實施例之核酸分子檢測方法所要偵測的一段核酸，而寡核酸探針2之寡核酸鏈21上的核酸序列被設計為與目標核酸NT上的一段核酸序列互補。因此在適當的環境下(例如具有合適的緩衝液且在合適的溫度下)，寡核酸探針2會結合至目標核酸NT，而形成局部雙股結構。
在寡核酸探針2與目標核酸NT形成局部雙股結構後，進行步驟S3，亦即雙股嵌合染劑1會嵌入至局部雙股結構中。接著，以一特定波長之光(激發光)LEx激發雙股嵌合染劑1，使雙股嵌合染劑1產生另一特定波長的光。由於雙股嵌合染劑1靠近報導螢光分子22，雙股嵌合染劑1所產生之光的能量會經由螢光共振能量傳遞(FRET)的過程激發報導螢光分子22(如圖2A所示之空心箭號)，使得報導螢光分子22發出又一特定波長的螢光訊號LEm。
現以SYBR Green I螢光染料作為雙股嵌合染劑1為例來進一步說明本實施例。在寡核酸探針2與目標核酸NT形成局部雙股結構後，SYBR Green I螢光染料會嵌入至局部雙股結構中。接著，以一波長約為483nm之光激發SYBR Green I螢光染料，使SYBR Green I螢光染料產生波長約為522nm的螢光，而此螢光的能量會經由螢光共振能量傳遞的過程激發報導螢光分子22，使得報導螢光分子22發出特定波長的螢光訊號LEm。
在步驟S4中，可依據根據螢光訊號LEm偵測目標核酸NT。由於寡核酸探針2與目標核酸NT為專一性結合，特定波長的螢光訊號LEm的螢光強度會與目標核酸NT的量成正比，因此可用於定量目標核酸NT。
螢光熄滅分子(quencher molecule)係可吸收螢光團(例如為本發明之報導螢光分子)之激發能量並以熱能形式或以再次發射光能的 方式來消散其所吸收之能量的一種物質。因此，當報導螢光分子被激發時，若螢光熄滅分子及報導螢光分子的距離夠近，報導螢光分子的放射光可被附近的螢光熄滅分子吸收，而不被偵測到。例如，在報導螢光分子與螢光熄滅分子相距約34Å(angstrom)時，可達到約94%熄滅效率(quenching efficiency)，而在報導螢光分子與螢光熄滅分子相距約48Å時，可達到69%熄滅效率。若螢光熄滅分子吸收了螢光團之激發能量而以熱能形式來消散其所吸收的能量，則為暗螢光熄滅分子(dark quencher)，例如為DABCYL、BHQ(BHQ1、BHQ2或BHQ3)、Iowa Black或QSY等等。然而，一般的螢光熄滅分子吸收了螢光團之激發能量後，會將大部分其所吸收的能量以光的形式再次發射出去。在一些實施例中，報導螢光分子及螢光熄滅分子的選擇係以報導螢光分子之放射光(螢光訊號)的發射波長與螢光熄滅分子的波長吸收範圍能夠搭配來考量，且螢光熄滅分子之放射光的發射波長大於報導螢光分子之螢光訊號的發射波長。例如是羧基四甲基羅丹明(Carboxytetramethyl rhodamine)。
如圖2A所示，當寡核酸探針2與目標核酸NT結合時，因鹼基配對關係，使寡核酸探針2上之報導螢光分子22與螢光熄滅分子23之距離增加，此距離使螢光熄滅分子23不會影響報導螢光分子22的螢光訊號LEm。
然而，寡核酸探針會形成分子間(inter-molecular)或分子內(intra-molecular)之局部雙股結構，稱之為非專一性配對。圖2B及圖2C為寡核酸探針2形成非專一性配對之示意圖。圖10A及圖10B為不具有螢光熄滅分子之寡核酸探針形成非專一性配對之示意圖。請同時參照圖2B及圖10A，當寡核酸探針2因其寡核酸鏈21上的核酸序列互補而形成如圖2B所示之非專一性配對時，即當二條寡核酸探針2互相結合時，由於其仍會形成局部雙股結構，故雙股嵌合染劑1可嵌入該雙股結構中。如前所述，以一特定波長之光(激發光)激發雙股嵌合染劑1時，可經由螢光共振能量傳遞的過程激發報導螢光分子22，使得報導螢光分子22發出又一特定波長的螢光訊號。然而，由於報導螢光分子22靠近螢光熄滅分子23，螢光熄滅分子23會吸收報導螢光分子22所發出之特定波長的螢光訊號。故在偵 測報導螢光分子22發出之特定波長的螢光訊號時，僅能偵測到寡核酸探針2與目標核酸NT形成專一性配對的情形下所產生之螢光訊號。
同樣地，如圖10A所示，當二條不具有螢光熄滅分子的寡核酸探針8互相結合而形成非專一性配對時，雙股嵌合染劑1亦會嵌入二條寡核酸探針8所形成之雙股結構中。且以一特定波長之光(激發光)激發雙股嵌合染劑1時，亦能經由螢光共振能量傳遞的過程激發報導螢光分子82，使得報導螢光分子82發出又一特定波長的螢光訊號。由於寡核酸探針8不具有螢光熄滅分子，故在此非專一性配對的情況下報導螢光分子82所產生之特定波長的螢光訊號不會被吸收而形成背景訊號。因此，在偵測報導螢光分子82發出之特定波長的螢光訊號時，除了可偵測到寡核酸探針8與目標核酸NT形成專一性配對所產生之螢光訊號，亦可偵測到二條寡核酸探針8形成非專一性配對所產生之螢光訊號，即無法排除非專一性配對所產生之背景訊號。相反地，使用本實施例中具有螢光熄滅分子23之寡核酸探針2則可有效消除非專一性配對所產生之背景訊號。
除了上述二條寡核酸探針互相結合而形成的分子間非專一性配對，個別寡核酸探針本身亦可能形成分子內非專一性配對。也就是說，因鹼基配對關係，個別寡核酸探針本身形成局部雙股結構。如圖2C所示，由於報導螢光分子22靠近螢光熄滅分子23，螢光熄滅分子23會吸收報導螢光分子22所發出之特定波長的螢光訊號。而如圖10B所示，寡核酸探針8不具有螢光熄滅分子，故報導螢光分子82所產生之特定波長的螢光訊號不會被吸收而形成背景訊號。由此可知，在本實施例中，當寡核酸探針2未結合至目標核酸NT時，即寡核酸探針2形成分子間或分子內之局部雙股結構時，螢光熄滅分子23會吸收報導螢光分子22發出之螢光訊號。雙股嵌合染劑1、報導螢光分子22、82及螢光熄滅分子23之作用可參照前述分子間非專一性配對，在此不再贅述。
本發明更提供一種核酸分子檢測套組，用以偵測一目標核酸。核酸分子檢測套組包括一雙股嵌合染劑以及一寡核酸探針。寡核酸探針包括一寡核酸鏈、一報導螢光分子及一螢光熄滅分子。報導螢光分子連接於寡核酸鏈之一第一端。螢光熄滅分子連接於寡核酸鏈之相對於第一端 之一第二端。雙股嵌合染劑係嵌入至寡核酸探針結合至目標核酸後所形成之一局部雙股結構，並藉由雙股嵌合染劑激發報導螢光分子所發出之一螢光訊號來偵測目標核酸。
本發明所提供之核酸分子檢測方法及檢測套組可用於基因分型(genotyping)。請參照圖3A及圖3B，圖3A為寡核酸探針與目標核酸形成完美配對或具有錯誤配對之融離曲線(melting curve)示意圖，圖3B為將圖3A之融離曲線微分後之融離曲線示意圖。微分後，融離曲線的波峰所對應之溫度即為寡核酸探針與目標核酸的融離溫度(melting temperature，Tm)。融離溫度係DNA雙股螺旋體解開為單股所需的溫度。因此，當目標核酸與寡核酸探針序列完全互補而形成完美配對(perfect match)時，需消耗較多能量才能使雙股螺旋體解開，故融離溫度Tm2較高。反之，當目標核酸與寡核酸探針序列之間有錯誤配對(mismatch)時，則融離溫度Tm1較低。由於寡核酸探針之序列係依使用者需求而設計，因此可藉由比較目標核酸與寡核酸探針之融離溫度來判斷兩者間為完美配對或具有錯誤配對，進而判斷目標核酸之基因型。
另外，本發明所提供之核酸分子檢測方法及檢測套組可提供訊號更清晰的增殖曲線(amplification curve)，以定量目標核酸。請參照圖4及圖5，圖4為利用不具有螢光熄滅分子之寡核酸探針所得之增殖曲線，圖5為利用具有螢光熄滅分子之寡核酸探針所得之增殖曲線。每條增殖曲線旁之數字係作為聚合酶連鎖反應模板(template)之目標核酸的起始分子數(copy number)，而基線為無模板之對照組所得之線。由圖可知，利用不具有螢光熄滅分子的寡核酸探針所得之增殖曲線訊號較雜亂不易判讀。相反地，利用具有螢光熄滅分子的寡核酸探針所得之增殖曲線訊號則清晰且易於判讀。依據增殖曲線定量目標核酸為本發明所屬領域之通常知識，在此不再贅述。
以下係以實驗例確認本發明所提供之核酸分子檢測方法及檢測套組可搭配融離曲線的分析進行基因分型。
實驗例1：利用融離曲線進行基因分型
本實驗例使用寡核酸探針偵測肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的23s rRNA基因V區域上之點突變r.2063 A>G或r.2064 A>G。首先，利用聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)放大所要偵測的肺炎支原體基因片段(目標核酸)，再搭配融離曲線分析，藉由融離曲線的波峰位置區分基因片段(目標核酸)上是否具有點突變。
聚合酶連鎖反應係以下列反應物來進行：20μl的反應體積中，加入1倍聚合酶連鎖反應混合物(PCR Mix)(含有50mM Tris(pH8.5)、3mM氯化鎂(MgCl2)、0.5mg/ml BSA及dNTP(每種各200μM))、0.25μM MP-F引子(primer)：5’-TCCAGGTACGGGTGAAGACA-3’、0.083μM MP-R引子：5’-GCTCCTACCTATTCTCTACATGAT-3’、0.25μM寡核酸探針：5’-ROX-GCGCAACGGGACGGAAAGAC-BHQ1-3’、0.5 U Taq DNA聚合酶、1/20000倍SYBR Green I以及肺炎支原體檢體核酸(目標核酸)。其中，寡核酸探針的濃度在0.12μM~1μM的範圍內皆可有相當的效果。
聚合酶連鎖反應的條件為：反應溫度為95℃作用5分鐘，重複95℃ 5秒、56℃ 3秒、72℃ 15秒循環70次，每一循環在56℃時偵測一次螢光訊號，70個循環過後於72℃作用1分鐘。最後進行融離曲線分析：在95℃反應30秒後，降溫到40℃反應10秒，再以每秒上升0.7℃的速度增加到95℃，期間以每秒1次的偵測速度偵測610nm的螢光訊號。
偵測螢光訊號時，激發光的波長設定在約483nm，偵測光的波長設定在寡核酸探針之報導螢光分子的最大放射光附近。本實驗例使用的報導螢光分子係ROX，故偵測光波長設定在610nm。若係使用LCRed 640作為報導螢光分子，偵測光波長則設定在640nm。
接著，繪出以每秒1次的偵測速度所偵測到610nm的螢光訊號之螢光值(F)對溫度(T)的曲線，即可得到初步的融離曲線，然後再以色光補償(color compensation)公式扣除SYBR Green I的背景值即可得到所需的融離曲線。接著，將融離曲線對溫度微分後取負值(-dF/dT)，得到微分後之融離曲線。同時，利用不具有螢光熄滅分子之寡核酸探針進行上述實驗，實驗結果分別示於圖6及圖7。
此外，亦可繪出每一循環在56℃時(黏合階段)所測得之螢光訊號以得到初步的增殖曲線，然後再以色光補償公式扣除SYBR Green I的背景值即可得到所需的增殖曲線(圖未示)。利用增殖曲線可進一步定量目標核酸。
請參照圖6及圖7，圖6為利用不具螢光熄滅分子之寡核酸探針進行本實驗例所得之融離曲線，圖7為利用具有螢光熄滅分子之寡核酸探針進行本實驗例所得之融離曲線。如圖6所示，無目標核酸存在時，寡核酸探針本身即產生很強之背景訊號。同時，完美配對之目標核酸及錯誤配對之目標核酸的融離曲線皆會受到該背景訊號的影響而干擾波峰位置的判讀。然而，如圖7所示，使用具有螢光熄滅分子之寡核酸探針時，無目標核酸存在時，幾乎不具有背景訊號。且因有效降低背景訊號，使得融離曲線較為清晰而易於判讀。
請參照圖7，融離曲線波峰位置在72℃者為野生型之目標核酸，而融離曲線波峰位置在68℃者為具有點突變之目標核酸。由於寡核酸探針的核酸序列係依據野生型之目標核酸設計，故寡核酸探針與野生型之目標核酸間為完美配對，而寡核酸探針與具有點突變之目標核酸間具有錯誤配對。即，野生型之目標核酸為完美配對的目標核酸，而具有點突變之目標核酸為錯誤配對的目標核酸。因此，與具有點突變之目標核酸相比，寡核酸探針與野生型之目標核酸的融離溫度較高。而且，當無目標核酸(M.pneumoniae基因片段)存在時，則不會有融離曲線波峰產生。
實驗例2：不同報導螢光分子及螢光熄滅分子之比較
本實驗例係使用寡核酸探針偵測人類細胞KRAS基因密碼子12位置上的基因突變，以K562細胞株基因體DNA作為野生型DNA模板，即完美配對的目標核酸，並使用TSGH細胞株基因體DNA(其在KRAS密碼子12上帶有一鹼基突變)作為突變型DNA模板，即錯誤配對的目標核酸。
在本實驗例中為比較不同的報導螢光分子及螢光熄滅分子的效果，將探針的5’端及3’端分別以不同的報導螢光分子及螢光熄滅分子進行標定，並以不同的探針分別進行聚合酶連鎖反應。在本實驗例中所使用之引子及探針整理於下表1。其中，引子與探針的序列係由5’端至3’端表示。
聚合酶連鎖反應係以下表2中所列之反應物來進行，反應體積共20μl。
聚合酶連鎖反應的條件為：反應溫度為95℃作用5分鐘，重複98℃10秒、60℃10秒、72℃20秒循環50次，每一循環在60℃時偵測一次螢光訊號，50個循環過後於72℃作用2分鐘。最後進行融離曲線分析：在95℃反應1秒後，降溫到40℃反應1秒，再以每秒上升0.06℃的速度增加到95℃，期間以每℃偵測2次的速度偵測螢光訊號，最後再降至 40℃作用30秒。
偵測螢光訊號時，激發光的波長設定在約483nm，偵測光的波長設定在寡核酸探針之報導螢光分子的最大放射光附近。本實驗例分別使用HEX、LCRed 640及Cy5作為報導螢光分子，因此偵測光波長分別設定在560nm、640nm及670nm。
接著，如實驗例1所述之方法繪出融離曲線，並分別示於圖8A、圖8B及圖8C。圖8A中所使用之探針包含HEX作為報導螢光分子，並包含BHQ1作為螢光熄滅分子。圖8B中所使用之探針包含LCRed 640作為報導螢光分子，並包含BHQ2作為螢光熄滅分子。圖8C中所使用之探針包含Cy5作為報導螢光分子，並包含BHQ3作為螢光熄滅分子。
請參照圖8A、圖8B及圖8C，其分別為利用不同之報導螢光分子與螢光熄滅分子進行本發明實驗例2所得之融離曲線。如圖所示，完美配對的目標核酸的融離曲線波峰位置皆約在72℃，而錯誤配對的目標核酸的融離曲線波峰位置皆約在62℃，且在無目標核酸存在時背景訊號都很低。由此可知，使用例如為HEX、LCRed 640及Cy5之報導螢光分子及例如BHQ1、BHQ2及BHQ3之螢光熄滅分子，可有效消除非專一性配對所產生之背景訊號，使得融離曲線更為清晰且易於判讀，以有效地進行基因分型。
實驗例3：報導螢光分子於寡核酸探針5’端或3’端的差異比較
本實驗例中所使用之目標核酸、引子、聚合酶連鎖反應之反應物及聚合酶連鎖反應之條件皆與實驗例2相同。然而，因為本實驗例要探討將報導螢光分子接在寡核酸探針5’端或3’端是否會對寡核酸探針的功效產生影響，因此使用將報導螢光分子接在不同端的寡核酸探針，即使用如下表4所示之探針分別進行聚合酶連鎖反應。
同樣地，在偵測螢光訊號時，激發光的波長設定在約483nm，偵測光的波長設定在寡核酸探針之報導螢光分子的最大放射光附近。本實驗例使用的報導螢光分子係ROX，故偵測光波長設定在610nm。
接著，如實驗例1中所述之方法繪出融離曲線。實驗結果分別示於圖9A及圖9B，圖9A中所使用之探針在5’端包含ROX作為報導螢光分子，並在3’端包含BHQ2作為螢光熄滅分子，而圖9B中所使用之探針則在5’端包含BHQ2作為螢光熄滅分子，並在3’端包含ROX作為報導螢光分子。
請參照圖9A及圖9B，完美配對的目標核酸的融離曲線波峰位置皆約在72℃，而錯誤配對的目標核酸的融離曲線波峰位置皆約在62℃，且在無目標核酸存在時背景值都很低。由此可知，報導螢光分子及螢光熄滅分子接在寡核酸鏈的哪一端(5’端或3’端)並不影響本發明寡核酸探針之功效，皆可有效消除非專一性配對所產生之背景訊號，使得融離曲線更為清晰且易於判讀，以有效地進行基因分型。
綜上所述，本發明之核酸分子檢測方法及核酸分子檢測套組，係利用具有報導螢光分子及螢光熄滅分子的寡核酸探針搭配雙股嵌合染劑來偵測目標核酸。當寡核酸探針形成分子間或分子內之局部雙股結構時，即形成非專一性配對時，由於報導螢光分子靠近螢光熄滅分子，螢光熄滅分子會吸收報導螢光分子所發出之特定波長的螢光訊號。也就是說，寡核酸探針未結合至目標核酸時，螢光熄滅分子會吸收報導螢光分子發出之螢光訊號。因此，在應用於聚合酶連鎖反應時，可有效消除非專一性配對所產生之背景訊號，使得增殖曲線或融離曲線更為清晰且易於判讀，以有效地定量目標核酸或進行基因分型。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
Claims (14)
- 一種核酸分子檢測方法，用以偵測一目標核酸，該核酸分子檢測方法包括下列步驟：準備一寡核酸探針以及一雙股嵌合染劑，該寡核酸探針包括一寡核酸鏈、一報導螢光分子與一螢光熄滅分子，其中該報導螢光分子連接於該寡核酸鏈之一第一端，且該螢光熄滅分子連接於該寡核酸鏈之相對於該第一端之一第二端；使該寡核酸探針結合至該目標核酸，以形成局部雙股結構；該雙股嵌合染劑嵌入至該局部雙股結構中，藉此該雙股嵌合染劑激發該報導螢光分子發出一螢光訊號；以及根據該螢光訊號偵測該目標核酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之核酸分子檢測方法，其中該寡核酸探針未結合至該目標核酸時，該螢光熄滅分子係吸收該報導螢光分子發出之該螢光訊號。
- 如申請專利範圍第1項所述之核酸分子檢測方法，其中該寡核酸鏈為一寡肽核酸鏈、一寡鎖核酸鏈或一寡核苷酸鏈。
- 如申請專利範圍第1項所述之核酸分子檢測方法，其中該寡核酸鏈之長度為15單體單元至70單體單元。
- 如申請專利範圍第1項所述之核酸分子檢測方法，其中該報導螢光分子係選自由HEX、Cy5、ROX、Bodipy 630/650與LCRed 640所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之核酸分子檢測方法，其中該螢光熄滅分子係選自由DABCYL、BHQ、Iowa Black、QSY與羧基四甲基羅丹明所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之核酸分子檢測方法，其中該雙股嵌合染劑係選自由SYBR Green I、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen所組成之群組。
- 一種核酸分子檢測套組，係用以偵測一目標核酸，該核酸分子檢測套組包括： 一雙股嵌合染劑；以及一寡核酸探針，該寡核酸探針包括：一寡核酸鏈；一報導螢光分子連接於該寡核酸鏈之一第一端；以及一螢光熄滅分子連接於該寡核酸鏈之相對於該第一端之一第二端，其中該雙股嵌合染劑係嵌入至該寡核酸探針結合至該目標核酸後所形成之一局部雙股結構，並藉由該雙股嵌合染劑激發該報導螢光分子所發出之一螢光訊號來偵測該目標核酸。
- 如申請專利範圍第8項所述之核酸分子檢測套組，其中該寡核酸探針未結合至該目標核酸時，該螢光熄滅分子係吸收該報導螢光分子發出之該螢光訊號。
- 如申請專利範圍第8項所述之核酸分子檢測套組，其中該寡核酸鏈為一寡肽核酸鏈、一寡鎖核酸鏈或一寡核酸鏈。
- 如申請專利範圍第8項所述之核酸分子檢測套組，其中該寡核苷酸鏈之長度為15單體單元至70單體單元。
- 如申請專利範圍第8項所述之核酸分子檢測套組，其中該報導螢光分子係選自由HEX、Cy5、ROX、Bodipy 630/650與LCRed 640所組成之群組。
- 如申請專利範圍第8項所述之核酸分子檢測套組，其中該螢光熄滅分子係選自由DABCYL、BHQ、Iowa Black、QSY與羧基四甲基羅丹明所組成之群組。
- 如申請專利範圍第8項所述之核酸分子檢測套組，其中該雙股嵌合染劑係選自由SYBR Green I、SYBR Gold、LC Green及EvaGreen所組成之群組。
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