JP2009044967A - 二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】
蛍光を検出することによって二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法であって、簡便で様々な反応系に適用することができ、かつ、バックグラウンドシグナルを減少させた高検出感度の方法を提供する。
【解決手段】
二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法であって、一の核酸鎖に標識された標識蛍光色素と、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素との間でエネルギー移動をし得るインターカレーターとからなる検出子の蛍光に係る情報を検出することを特徴とする方法。
【選択図】図１
蛍光を検出することによって二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法であって、簡便で様々な反応系に適用することができ、かつ、バックグラウンドシグナルを減少させた高検出感度の方法を提供する。
【解決手段】
二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法であって、一の核酸鎖に標識された標識蛍光色素と、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素との間でエネルギー移動をし得るインターカレーターとからなる検出子の蛍光に係る情報を検出することを特徴とする方法。
【選択図】図１
Description
本発明は、二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法に関する。より詳しくは、簡便かつ高感度に二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法に関する。
核酸に標識された蛍光色素や、二本鎖核酸の塩基対に結合又は挿入して発光する蛍光色素等に由来する蛍光を測定することにより、ハイブリダイゼーションや二本鎖核酸などを検出する技術（以下「蛍光検出技術」とする）が、サザンブロッティング、ノザンブロッティング、ＤＮＡマイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲなどの分子生物学の様々な分野で既に実用化されている。
前記蛍光検出技術として、第一に、蛍光標識されたターゲット核酸鎖をプローブ核酸鎖が固定化された反応場に加えてハイブリダイゼーションした後に、所定の溶液で反応場を洗浄し、前記ターゲット核酸鎖由来の蛍光を検出する方法が挙げられる。この方法により、プローブ核酸鎖の塩基配列と相補的な塩基配列をもつ核酸がターゲット核酸鎖中に存在しているか否か、すなわち特定遺伝子の発現に関する情報や、病原菌のゲノムＤＮＡ量に関する情報などを得ることができる。
この方法は、サザンブロッティング、ノザンブロッティング、ＤＮＡマイクロアレイなどにおいて用いられている。
この方法は、サザンブロッティング、ノザンブロッティング、ＤＮＡマイクロアレイなどにおいて用いられている。
また第二の技術として、例えば、二本鎖核酸の相補的塩基対間に挿入（インターカレーション）して蛍光を発する「インターカレーター」と称される蛍光色素を用い、ハイブリダイゼーションを検出する技術も用いられている。この検出技術では、遺伝子ごとに専用プローブを必要とせず、実験コストを抑えることができるなどの利点がある。
この方法は、リアルタイムＰＣＲなどにおいて用いられている。
この方法は、リアルタイムＰＣＲなどにおいて用いられている。
さらに、近年では特異的な蛍光プローブを用いて目的遺伝子の増幅を検出する方法も実用化されている。例えば、５’末端を蛍光色素、３’末端を該蛍光色素の蛍光を消光し得るクエンチャー物質で修飾したプローブ核酸鎖（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を用いる方法で、ポリメラーゼ反応が進むことにより蛍光色素がクエンチャーと離れて発する蛍光を測定することにより、目的遺伝子の増幅を検出することができる。
特許文献１には、９−アゾアクリジン誘導体が二本鎖核酸と相互作用することによって生じる蛍光特性の変化を測定することを特徴とする２本鎖核酸の検出方法が開示されている。
特許文献２には、蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ基残基を２個以上含むα−アミノ酸残基からなるペプチドの蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を検出することのできる蛍光性インターカレート基を含有する二本鎖核酸検出用蛍光試薬が開示されている。
特許文献３には、エネルギー供与体とエネルギー受容体とが標識された１本鎖ポリヌクレオチドで構成されるプローブと標識核酸とのハイブリッド形成を行う工程と、前記ハイブリッド形成の前後におけるレーザの照射による前記エネルギー供与体又は前記エネルギー受容体からの蛍光発光の変化を検出する工程とを有し、前記蛍光発光の変化によって前記ハイブリッド形成の有無を検出して前記標的核酸を検出することを特徴とする、核酸の検出方法が記載されている。
特開平１１−２９００９８号公報。
特開２００５−２９１７０３号公報。
特開２００１−２４５６９９号公報。
しかしながら、前記蛍光検出技術は、適用できる反応系に制限がある点や、充分な感度が得られない点において問題があった。
すなわち、前記第一の技術は、ハイブリダイゼーションの後に、蛍光標識されたターゲット核酸鎖を洗浄除去しなければならないため、プローブ核酸鎖が所定の反応場に固定化されている必要があり、溶液中におけるハイブリダイゼーション等に用いることはできなかった。
また、前記第二の技術は、インターカレーターの洗浄除去を必要としないため、溶液中におけるハイブリダイゼーション等の検出にも用いることができるものの、溶液中に遊離するインターカレーターや、副生した二本鎖核酸の塩基対に挿入したインターカレーターの蛍光などが検出されることによるバックグラウンドシグナルが大きく、必ずしも感度が高くないという欠点があった。
さらに、前記第三の技術は、二種類のプローブが隣り合わせでハイブリダイズするように検出対象に特異的なプローブを設計する必要があるため、設計が困難であり、高コストとなるという欠点があった。
すなわち、前記第一の技術は、ハイブリダイゼーションの後に、蛍光標識されたターゲット核酸鎖を洗浄除去しなければならないため、プローブ核酸鎖が所定の反応場に固定化されている必要があり、溶液中におけるハイブリダイゼーション等に用いることはできなかった。
また、前記第二の技術は、インターカレーターの洗浄除去を必要としないため、溶液中におけるハイブリダイゼーション等の検出にも用いることができるものの、溶液中に遊離するインターカレーターや、副生した二本鎖核酸の塩基対に挿入したインターカレーターの蛍光などが検出されることによるバックグラウンドシグナルが大きく、必ずしも感度が高くないという欠点があった。
さらに、前記第三の技術は、二種類のプローブが隣り合わせでハイブリダイズするように検出対象に特異的なプローブを設計する必要があるため、設計が困難であり、高コストとなるという欠点があった。
そこで、本発明では、蛍光を検出することによって二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法であって、簡便な上に様々な反応系に適用することができ、かつ、バックグラウンドシグナルを減少させた高検出感度の方法を提供することを主目的とする。
上記技術的課題を解決するために、まず、第１核酸鎖に標識された標識蛍光色素と、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素との間でエネルギー移動をし得るインターカレーターと、からなる検出子の蛍光に係る情報を検出することによって、前記第１核酸鎖と該第１核酸鎖と相補的な塩基配列を有する第２核酸鎖との間の二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法を提供する。この方法によれば、検出子間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用することにより、蛍光検出の際のバックグラウンドシグナルを減少させることができる。
本発明に係る方法の検出子は、少なくとも、光吸収により得た励起エネルギーを他の蛍光色素に与える励起対象蛍光色素と、他の蛍光色素から励起エネルギーを受け取って発光する検出対象蛍光色素とを有する、複数の蛍光色素群からなるものとすることができる。
また、本発明に係るインターカレーターは、前記蛍光色素を消光するクエンチャーとすることができる。前記インターカレーターをクエンチャーとすることにより、二本鎖核酸の形成を、蛍光の消光によって検出することができる。
さらに、本発明に係る方法は、反応系を特に限定しないが、例えば、前記第１核酸鎖の末端を、反応場表面に固定することができる。
本発明では、蛍光色素が標識された第１核酸鎖と、該第１核酸鎖と相補的な塩基配列を有する第２核酸鎖とのハイブリダイゼーションを進行させようとする工程と、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素とエネルギー移動し得るインターカレーターを添加する工程と、前記蛍光色素と前記インターカレーターとの蛍光に係る情報を検出する工程と、を少なくとも行う、ハイブリダイゼーションに係る情報を得る方法を提供する。
そして、本発明では、プローブ核酸鎖に標識された標識蛍光色素と、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素との間でエネルギー移動をし得るインターカレーターと、からなる検出子の蛍光に係る情報を検出することによって、前記プローブ核酸鎖と相補的な塩基配列を有する核酸鎖の量に関する情報を得る方法を提供する。
本発明に係る方法の検出子は、少なくとも、光吸収により得た励起エネルギーを他の蛍光色素に与える励起対象蛍光色素と、他の蛍光色素から励起エネルギーを受け取って発光する検出対象蛍光色素とを有する、複数の蛍光色素群からなるものとすることができる。
また、本発明に係るインターカレーターは、前記蛍光色素を消光するクエンチャーとすることができる。前記インターカレーターをクエンチャーとすることにより、二本鎖核酸の形成を、蛍光の消光によって検出することができる。
さらに、本発明に係る方法は、反応系を特に限定しないが、例えば、前記第１核酸鎖の末端を、反応場表面に固定することができる。
本発明では、蛍光色素が標識された第１核酸鎖と、該第１核酸鎖と相補的な塩基配列を有する第２核酸鎖とのハイブリダイゼーションを進行させようとする工程と、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素とエネルギー移動し得るインターカレーターを添加する工程と、前記蛍光色素と前記インターカレーターとの蛍光に係る情報を検出する工程と、を少なくとも行う、ハイブリダイゼーションに係る情報を得る方法を提供する。
そして、本発明では、プローブ核酸鎖に標識された標識蛍光色素と、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素との間でエネルギー移動をし得るインターカレーターと、からなる検出子の蛍光に係る情報を検出することによって、前記プローブ核酸鎖と相補的な塩基配列を有する核酸鎖の量に関する情報を得る方法を提供する。
ここで、本発明に関する用語の説明をする。
「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）」とは、ドナーとなる蛍光色素とアクセプターとなる蛍光色素との間の距離が１ｎｍ〜１０ｎｍ程度の近傍にある場合、ドナーを励起するとエネルギーがアクセプターに移動し、アクセプターが励起される現象をいう。
本発明に係る方法によれば、複数種の核酸鎖への蛍光標識を必要とせず、洗浄工程をも要しない簡便な方法で、バックグラウンドシグナルを改善し、高い検出感度で二本鎖核酸の形成に係る情報を得ることができる。また、反応系を限定することなく二本鎖核酸の形成に係る情報を得ることができる。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照としながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
図１は、本発明の第一実施形態に係る方法の概念図である。Ｎ１及びＮ２はそれぞれ本発明に係る第１核酸鎖及び第２核酸鎖であり、Ｘ１は標識蛍光色素、Ｘ２はインターカレーターである。
本発明に係る「検出子」は、本実施形態において、標識蛍光色素Ｘ１とインターカレーターＸ２とからなる。
本発明に係る「検出子」は、本実施形態において、標識蛍光色素Ｘ１とインターカレーターＸ２とからなる。
以下、本発明に係る方法の第一実施形態について概説する。
本発明に係る方法において、標識蛍光色素Ｘ１が標識された第１核酸鎖Ｎ１と、該第１核酸鎖Ｎ１と相補的な塩基配列を有する第２核酸鎖Ｎ２とのハイブリダイゼーションを進行させようとする（図１（１）参照）。
次に、反応系内に、インターカレーターＸ２を添加する（図１（２）参照）。前記インターカレーターＸ２は、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴによって励起エネルギーを前記標識蛍光色素Ｘ１に与える。
通常、前記インターカレーターＸ２の発光波長と、前記標識蛍光色素Ｘ１の励起波長域とが重複している場合に、前記インターカレーターＸ２は前記標識蛍光色素Ｘ１に励起エネルギーを与える。
反応系に、励起対象蛍光色素である前記インターカレーターＸ２の励起波長λＥｘＸ２の励起光Ｐ１を照射し、検出対象蛍光色素である前記標識蛍光色素Ｘ１の蛍光検出波長λＥｍＸ１における蛍光Ｆ１を検出する（図１（３）参照）。
このとき、前記インターカレーターＸ２の発光波長域は前記標識蛍光色素Ｘ１の蛍光検出波長λＥｍＸ１と異なっているため、λＥｍＸ１における前記インターカレーターＸ２由来の蛍光強度は充分に小さい。また、前記標識蛍光色素Ｘ１の励起波長域は前記インターカレーターＸ２の励起波長λＥｘＸ２と異なっているため、λＥｘＸ２の励起光Ｐ１を照射しても前記標識蛍光色素Ｘ１はほとんど励起されず、前記標識蛍光色素Ｘ１が直接励起されることによる蛍光強度も充分に小さい。従って、バックグラウンドシグナルはほとんど検出されない。
反応系内に前記第２核酸鎖Ｎ２が存在せず、二本鎖核酸が形成されない場合、検出子を構成する前記標識蛍光色素Ｘ１と前記インターカレーターＸ２は反応系内にランダムに存在するため、これらの間で蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴの起こる確率は充分に低い（図１（３）（ａ）参照）。従って、反応系内に前記第２核酸鎖Ｎ２が存在せず、前記二本鎖核酸が形成されない場合には、λＥｍＸ１における蛍光はほとんど検出されない。
一方、前記第１核酸鎖Ｎ１と前記第２核酸鎖Ｎ２との間で二本鎖核酸が形成されている場合、前記インターカレーターＸ２は前記二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入する。
その結果、検出子を構成する前記インターカレーターＸ２と前記第１核酸鎖Ｎ１に標識された前記標識蛍光色素Ｘ１とは、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが充分に起こりうる距離に近接する（図１（３）（ｂ）参照）。
その結果、検出子を構成する前記インターカレーターＸ２と前記第１核酸鎖Ｎ１に標識された前記標識蛍光色素Ｘ１とは、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが充分に起こりうる距離に近接する（図１（３）（ｂ）参照）。
この状態において、反応系に前記インターカレーターＸ２の励起波長λＥｘＸ２の光Ｐ１が照射されると、前記標識蛍光色素Ｘ１と前記インターカレーターＸ２との間で蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが起こり、励起された前記インターカレーターＸ２のエネルギーが前記標識蛍光色素Ｘ１に移動する。
蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが起こると、励起された前記インターカレーターＸ２は失活し、前記標識蛍光色素Ｘ１が発光する。従って、λＥｍＸ１において前記標識蛍光色素Ｘ１由来の蛍光Ｆ１が検出される。
蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴは、互いに近傍に位置する前記標識蛍光色素Ｘ１と前記インターカレーターＸ２の対が多いほど、すなわち、形成された二本鎖核酸の数が多いほど、生じる確率が増え、その結果蛍光Ｆ１の強度が増大する。
従って、蛍光Ｆ１の強度を検出することにより、系内の二本鎖核酸の形成に係る情報を得ることができる。
また、あらかじめ蛍光Ｆ１の強度と系内の二本鎖核酸の量との相関を調べておけば、蛍光Ｆ１の強度から系内で形成された二本鎖核酸の量を求めることができる。従って、本発明に係る方法によれば、第１核酸鎖Ｎ１をプローブとして、二本鎖核酸の形成に係る第２核酸鎖の量に関する情報を得ることができる。
以下、本実施形態の詳細について説明する。
前記第１核酸鎖Ｎ１の種類は特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなどとすることができる。
また、前記第１核酸鎖Ｎ１は、どのような反応場に置いてもよく、例えば、リアルタイムＰＣＲなどに用いる場合には、溶液中に存在させることができ、また、ＤＮＡマイクロアレイなどに用いる場合には、末端を反応場表面に固定することもできる。
前記第１核酸鎖Ｎ１に標識する前記標識蛍光色素Ｘ１の種類は、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴによって前記インターカレーターＸ２から励起エネルギーを受け取って、発光するものであれば特に限定されず、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ６１０，ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅｄ６４０，ＷｅｌｌＲｅｄＤ２，Ｃｙ５などを使用することができる。
本発明に係る方法では、前記第１核酸鎖Ｎ１だけを蛍光標識すれば足りるため、複数種の核酸鎖への標識を要する方法や、一つのプローブに複数の標識を要する方法などに比べ、極めて簡便に二本鎖核酸の形成に係る情報を得ることができる。
前記第２核酸鎖Ｎ２は、前記第１核酸鎖Ｎ１と相補的な塩基配列を有するものであれば、その種類などは特に限定されず、前記第１核酸鎖Ｎ１と同様、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなどとすることができる。
具体的には、例えばＤＮＡマイクロアレイなどにおいては、前記第１核酸鎖Ｎ１とハイブリダイゼーションしようとするターゲット核酸鎖とし、リアルタイムＰＣＲなどにおいては、ＰＣＲによって生成する増幅産物とすることができる。
前記インターカレーターＸ２の種類は、前記インターカレーターＸ２の発光波長域が前記標識蛍光色素Ｘ１の励起波長域と重複するものであれば、その種類は特に限定されないが、前記インターカレーターＸ２の発光波長域と前記標識蛍光色素Ｘ１の励起波長域との重なりが大きいほど、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴの起こる確率は高くなる。
前記インターカレーターＸ２の具体例として、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ，ＹＯＹＯ−１、ＬＣＧｒｅｅｎＩ（登録商標）などの中から、標識蛍光色素Ｘ１の種類に応じて適宜選択することができる。
また、本発明において、検出子を構成する蛍光色素の数は特に限定されない。本実施形態では前記インターカレーターＸ２は１種類の蛍光色素としているが、前記インターカレーターＸ２は、少なくとも光吸収により得た励起エネルギーを他の蛍光色素に与える励起対象蛍光色素を有すればよく、２種類以上の蛍光色素を含むことができる。
具体的には、例えば、励起対象蛍光色素から励起エネルギーを受け取り（ＥＴ１）、受け取った励起エネルギーをさらに前記標識蛍光色素Ｘ１に与える（ＥＴ２）蛍光色素などを含むことができる。このような蛍光色素を含むことにより、励起対象蛍光色素と検出対象蛍光色素のみを用いる場合と比較して（図２上図参照）、励起光波長と蛍光検出波長との波長の差を広げることができ、バックグラウンドシグナルを減少させることができる（図２下図参照）。
蛍光Ｆ１の検出手段は特に限定されず、例えば、蛍光顕微鏡、蛍光光度計、マイクロアレイスキャナー、リアルタイムＰＣＲ装置などを用いることができる。
図３は、本発明の第二実施形態に係る方法の概念図である。第一実施形態と同様の点については記載を省略し、相違する点について説明する。
なお、図中のＸ３は本実施形態に係るインターカレーターであり、本発明に係る「検出子」は、本実施形態において、標識蛍光色素Ｘ１とインターカレーターＸ３とからなる。
なお、図中のＸ３は本実施形態に係るインターカレーターであり、本発明に係る「検出子」は、本実施形態において、標識蛍光色素Ｘ１とインターカレーターＸ３とからなる。
本実施形態において、反応系内に添加されるインターカレーターＸ３は、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴにより励起エネルギーを標識蛍光色素Ｘ１から受け取る。
通常、前記インターカレーターＸ３の励起波長域と、前記標識蛍光色素Ｘ１の発光波長域とが重複している場合に、前記インターカレーターＸ３は前記標識蛍光色素Ｘ１から励起エネルギーを受け取る。
本実施形態において、反応系に励起対象蛍光色素である前記標識蛍光色素Ｘ１の励起波長λＥｘＸ１の励起光Ｐ２を照射し、検出対象蛍光色素である前記インターカレーターＸ３の蛍光検出波長λＥｍＸ３における蛍光Ｆ２を検出する（図３参照）。
このとき、前記標識蛍光色素Ｘ１の発光波長域は前記インターカレーターＸ３の蛍光検出波長λＥｍＸ３と異なっているため、λＥｍＸ３における前記標識蛍光色素Ｘ１由来の蛍光強度は充分に小さい。また、前記インターカレーターＸ３の励起波長域は前記標識蛍光色素Ｘ１の励起波長λＥｘＸ１と異なっているため、λＥｘＸ１の励起光Ｐ２を照射しても前記インターカレーターＸ３はほとんど励起されず、前記インターカレーターＸ３が直接励起されることによる蛍光強度も充分に小さい。従って、バックグラウンドシグナルはほとんど検出されない。
反応系内に前記第２核酸鎖Ｎ２が存在せず、二本鎖核酸が形成されない場合、検出子を構成する前記標識蛍光色素Ｘ１と前記インターカレーターＸ３は反応系内にランダムに存在するため、これらの間で蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴの起こる確率は充分に低い（図３（ａ）参照）。従って、反応系内に前記第２核酸鎖Ｎ２が存在せず、前記二本鎖核酸が形成されない場合には、λＥｍＸ３における蛍光はほとんど検出されない。
一方、前記第１核酸鎖Ｎ１と前記第２核酸鎖Ｎ２との間で二本鎖核酸が形成されている場合、前記インターカレーターＸ３は前記二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入する。
その結果、検出子を構成する前記インターカレーターＸ３と前記第１核酸鎖Ｎ１に標識された前記標識蛍光色素Ｘ１とは、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが充分に起こりうる距離に近接する（図３（ｂ）参照）。
その結果、検出子を構成する前記インターカレーターＸ３と前記第１核酸鎖Ｎ１に標識された前記標識蛍光色素Ｘ１とは、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが充分に起こりうる距離に近接する（図３（ｂ）参照）。
この状態において、反応系に前記標識蛍光色素Ｘ１の励起波長λＥｘＸ１の光Ｐ２が照射されると、前記標識蛍光色素Ｘ１と前記インターカレーターＸ３との間で蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが起こり、励起された前記標識蛍光色素Ｘ１のエネルギーが前記インターカレーターＸ３に移動する。
蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが起こると、励起された前記標識蛍光色素Ｘ１は失活し、前記インターカレーターＸ３が発光する。従って、λＥｍＸ３において前記インターカレーターＸ３由来の蛍光Ｆ２が検出される。
蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴは、互いに近傍に位置する前記標識蛍光色素Ｘ１と前記インターカレーターＸ３の対が多いほど、すなわち、形成された二本鎖核酸の数が多いほど、生じる確率が増え、その結果蛍光Ｆ２の強度が増大する。
従って、蛍光Ｆ２の強度を検出することにより、系内の二本鎖核酸の形成に係る情報を得ることができる。
また、λＥｍＸ３における蛍光Ｆ２と同時に前記標識蛍光色素Ｘ１の蛍光検出波長λＥｍＸ１における蛍光Ｆ２’を検出することにより、前記インターカレーターＸ３と蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴを生じない前記標識蛍光色素Ｘ１、すなわち、前記第２核酸鎖Ｎ２と二本鎖核酸を形成しない前記第１核酸鎖Ｎ１に係る情報を同時に得ることができる（図３（ｃ）参照）。
λＥｍＸ３における蛍光Ｆ２とλＥｍＸ１における蛍光Ｆ２’の蛍光強度の比から、前記第１核酸鎖Ｎ１と前記第２核酸鎖Ｎ２との間で形成された二本鎖核酸の割合を求めることができる。
以下、本実施形態の詳細について説明する。
前記第１核酸鎖Ｎ１に標識する前記標識蛍光色素Ｘ１の種類は、励起光Ｐ２を吸収して得た励起エネルギーを、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴによって前記インターカレーターＸ３に与えるものであれば特に限定されず、例えば、ＦＩＴＣなどを使用することができる。
前記インターカレーターＸ３の種類は、前記インターカレーターＸ３の励起波長域が前記標識蛍光色素Ｘ１の発光波長域と重複するものであれば、その種類は特に限定されないが、前記インターカレーターＸ３の励起波長域と前記標識蛍光色素Ｘ１の発光波長域との重なりが大きいほど、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴの起こる確率は高くなる。
前記インターカレーターＸ３として、例えば、ＴＯＴＯ−３，ＴＯ−ＰＲＯ−３，ＹＯＹＯ−３，ＹＯ−ＰＲＯ−３などの中から、前記標識蛍光色素Ｘ１の種類に応じて適宜選択することができる。
また、本発明において、検出子を構成する蛍光色素の数は特に限定されない。本実施形態では前記インターカレーターＸ３は１種類の蛍光色素としているが、前記インターカレーターＸ３は、少なくとも他の蛍光色素から励起エネルギーを受け取って発光する検出対象蛍光色素を有すればよく、２種類以上の蛍光色素を含むことができる。
具体的には、例えば、励起対象蛍光色素である前記標識蛍光色素Ｘ１から蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴによって励起エネルギーを受け取り（ＥＴ１）、そのエネルギーをさらに検出対象蛍光色素に与える（ＥＴ２）蛍光色素などを含むことができる。このような蛍光色素を含むことにより、励起対象蛍光色素と検出対象蛍光色素のみを用いる場合と比較して（図４上図参照）励起光波長と蛍光検出波長との波長の差を広げることができ、バックグラウンドシグナルを減少させることができる（図４下図参照）。
図５は、本発明に係る方法の第三実施形態を示す図である。第一実施形態と同様の点については記載を省略し、相違する点について詳説する。
なお、図中のＸ４は本実施形態に係るインターカレーターであり、本発明に係る「検出子」は、本実施形態において、標識蛍光色素Ｘ１とインターカレーターＸ４とからなる。
なお、図中のＸ４は本実施形態に係るインターカレーターであり、本発明に係る「検出子」は、本実施形態において、標識蛍光色素Ｘ１とインターカレーターＸ４とからなる。
本実施形態において、反応系内に添加されるインターカレーターＸ４は、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴにより励起エネルギーを標識蛍光色素Ｘ１から受け取り、標識蛍光色素Ｘ１を消光する。
なお、前記第一核酸鎖Ｎ１に標識する前記標識蛍光色素Ｘ１の種類は、励起光Ｐ３を吸収して得た励起エネルギーを、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴによって前記インターカレーターＸ４に与えて消光されるものであれば特に限定されず、前記インターカレーターＸ４の種類は、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴによって前記標識蛍光色素Ｘ１の励起エネルギーを受け取って前記標識蛍光色素Ｘ１を消光するものであれば特に限定されない。
本実施形態において、反応系に励起対象蛍光色素である前記標識蛍光色素Ｘ１の励起波長λＥｘＸ１の励起光Ｐ３を照射し、前記標識蛍光色素Ｘ１の蛍光検出波長λＥｍＸ１における蛍光Ｆ３を検出する（図５参照）。
反応系内に前記第２核酸鎖Ｎ２が存在せず、前記二本鎖核酸が形成されない場合、前記標識蛍光色素Ｘ１と前記インターカレーターＸ４は反応系内にランダムに存在するため、これらの間で蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴの起こる確率は充分に低い（図５（ａ）参照）。従って、反応系内に前記第２核酸鎖Ｎ２が存在せず、前記二本鎖核酸が形成されない場合には、前記標識蛍光色素Ｘ１は消光されず、λＥｍＸ１における蛍光Ｆ３が検出される。
一方、前記第１核酸鎖Ｎ１と前記第２核酸鎖Ｎ２との間で二本鎖核酸が形成されている場合、前記インターカレーターＸ４は前記二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入する。
その結果、前記二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入した前記インターカレーターＸ４と前記第１核酸鎖Ｎ１に標識された前記標識蛍光色素Ｘ１とは、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが充分に起こりうる距離に近接する（図５（ｂ）参照）。
その結果、前記二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入した前記インターカレーターＸ４と前記第１核酸鎖Ｎ１に標識された前記標識蛍光色素Ｘ１とは、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが充分に起こりうる距離に近接する（図５（ｂ）参照）。
この状態において、反応系に、前記標識蛍光色素Ｘ１の励起波長λＥｘＸ１の光Ｐ３を照射すると、前記標識蛍光色素Ｘ１と前記インターカレーターＸ４との間で蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが起こり、励起された前記標識蛍光色素Ｘ１のエネルギーが前記インターカレーターＸ４に移動する。
蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが起こると、励起された前記標識蛍光色素Ｘ１は失活し、消光される。従って、λＥｍＸ１において蛍光Ｆ３は検出されない。
蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴは、互いに近傍に位置する前記標識蛍光色素Ｘ１と前記インターカレーターＸ４の対が多いほど、すなわち、形成された二本鎖核酸の数が多いほど、生じる確率が増えるため、蛍光Ｆ３の強度が減少する。
従って、蛍光Ｆ３の強度を検出することにより、系内の二本鎖核酸の形成に係る情報を得ることができる。
また、あらかじめ蛍光Ｆ３の強度と二本鎖核酸を形成しない第１核酸鎖Ｎ１の量との相関を調べておけば、蛍光Ｆ３の強度から系内で二本鎖核酸を形成しない第１核酸鎖Ｎ１の量を求めることができる。
以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
はじめに、本発明に係る方法によって二本鎖核酸の形成に係る情報が得られることの確認を行った。
＜実施例１＞
蛍光色素ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅｄ６４０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）で蛍光標識した塩基数１８ｍｅｒの核酸鎖Ｎ１を含む溶液に、Ｎ１と相補的な塩基配列を有する核酸鎖Ｎ２を含む溶液及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを加えて混合した。これを９５℃、１分間加熱し、２０℃にて５分間インキュベートした後に、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩの励起波長である４９８ｎｍを励起波長とし、分光蛍光光度計により蛍光スペクトルを測定した。測定中の反応液は、２０℃に保たれるようにした。
実験条件を表２に示す
蛍光色素ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅｄ６４０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）で蛍光標識した塩基数１８ｍｅｒの核酸鎖Ｎ１を含む溶液に、Ｎ１と相補的な塩基配列を有する核酸鎖Ｎ２を含む溶液及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを加えて混合した。これを９５℃、１分間加熱し、２０℃にて５分間インキュベートした後に、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩの励起波長である４９８ｎｍを励起波長とし、分光蛍光光度計により蛍光スペクトルを測定した。測定中の反応液は、２０℃に保たれるようにした。
実験条件を表２に示す
＜比較例１＞
蛍光標識されていない核酸鎖Ｎ１を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
蛍光標識されていない核酸鎖Ｎ１を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
実施例１及び比較例１の蛍光スペクトルを図６に示す。
比較例１の蛍光スペクトルにおいて確認されるＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ由来の蛍光（５２０ｎｍ）は、実施例１の蛍光スペクトルではほとんど検出されず、その代わりに核酸鎖Ｎ１に標識されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅｄ６４０の蛍光（６４０ｎｍ）が現われている。
比較例１の蛍光スペクトルにおいて確認されるＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ由来の蛍光（５２０ｎｍ）は、実施例１の蛍光スペクトルではほとんど検出されず、その代わりに核酸鎖Ｎ１に標識されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅｄ６４０の蛍光（６４０ｎｍ）が現われている。
実施例１では、核酸鎖Ｎ１とＮ２との間で形成された二本鎖核酸の塩基対間に、インターカレーターであるＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩが結合又は挿入し、Ｎ１に標識されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅｄ６４０と充分に近接する。この状態でインターカレーターであるＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩが励起されたことにより、核酸鎖Ｎ１に標識されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅｄ６４０との間でＦＲＥＴが起こり、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅｄ６４０の蛍光が検出されたものと推測される。
以上の結果より、本発明に係る方法によって、二本鎖核酸に係る情報を得ることができることが確認された。
次に、本発明に係る方法で、バックグラウンドシグナルの低減が可能であることの確認を行った。
＜実施例２＞
蛍光標識されていない核酸鎖Ｎ１を含む溶液に、Ｎ１と二本鎖核酸を形成しない核酸鎖Ｎ３（塩基配列：ＴＧＣＣＣＡＣＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＧＧ）を含む溶液及びＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩを添加し、蛍光スペクトルを測定した。溶液組成などの実験条件は、実施例１と同様に行った。
蛍光標識されていない核酸鎖Ｎ１を含む溶液に、Ｎ１と二本鎖核酸を形成しない核酸鎖Ｎ３（塩基配列：ＴＧＣＣＣＡＣＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＧＧ）を含む溶液及びＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩを添加し、蛍光スペクトルを測定した。溶液組成などの実験条件は、実施例１と同様に行った。
実施例２の蛍光スペクトルを図７に示す。
二本鎖核酸が形成されないにも関わらず、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩの蛍光波長（５２０ｎｍ）において発光が認められ、バックグラウンドシグナルが観測されていることがわかる。前記バックグラウンドシグナルは５２０ｎｍを極大として波長のシフトに伴い減少することから、本発明に係る方法において、検出対象蛍光色素を選択することにより、バックグラウンドシグナルを低減させることができると考えられる。
二本鎖核酸が形成されないにも関わらず、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩの蛍光波長（５２０ｎｍ）において発光が認められ、バックグラウンドシグナルが観測されていることがわかる。前記バックグラウンドシグナルは５２０ｎｍを極大として波長のシフトに伴い減少することから、本発明に係る方法において、検出対象蛍光色素を選択することにより、バックグラウンドシグナルを低減させることができると考えられる。
次に、核酸鎖Ｎ１に標識する蛍光色素の種類を変えて蛍光強度の比較を行った。ハイブリダイゼーション、蛍光スペクトルの測定は実施例１と同様に行った。
各実施例の条件を表１に示す。
各実施例の条件を表１に示す。
実施例３乃至６の蛍光スペクトルをそれぞれ図８乃至図１１に示す。
図８乃至図１１の蛍光スペクトルを比較すると、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６の順に、検出対象蛍光色素の発光強度が大きい。各実施例に用いられた検出対象蛍光色素を比較すると、用いられた検出対象蛍光色素の励起波長がＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩの発光波長と近いものほど、蛍光強度が大きいことがわかる。
図８乃至図１１の蛍光スペクトルを比較すると、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６の順に、検出対象蛍光色素の発光強度が大きい。各実施例に用いられた検出対象蛍光色素を比較すると、用いられた検出対象蛍光色素の励起波長がＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩの発光波長と近いものほど、蛍光強度が大きいことがわかる。
この結果より、励起対象蛍光色素の発光波長と、検出対象蛍光色素の励起波長との重なりが大きいほど、ＦＲＥＴの生じる確率が大きくなり、その結果検出対象蛍光色素の蛍光強度が大きくなるものと推測される。
本発明に係る方法を用いることにより、サザンブロッティング、ノザンブロッティング、ＤＮＡマイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＴＲＣ法などの様々な系において、二本鎖核酸の形成に係る情報および核酸の量に係る情報を得ることができる。特に、複数種の核酸鎖への蛍光標識を必要とせず、洗浄工程をも要しない簡便な方法で、バックグラウンドシグナルを改善し、高い検出感度で二本鎖核酸の形成に係る情報を得ることができるため、産業上有用である。
Ｎ１ 第１核酸鎖
Ｎ２ 第２核酸鎖
Ｘ１ 標識蛍光色素
Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４ インターカレーター
Ｐ１，Ｐ２,Ｐ３ 励起光
Ｆ１，Ｆ２，Ｆ２’，Ｆ３ 蛍光
ＥＴ 蛍光共鳴エネルギー移動
Ｎ２ 第２核酸鎖
Ｘ１ 標識蛍光色素
Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４ インターカレーター
Ｐ１，Ｐ２,Ｐ３ 励起光
Ｆ１，Ｆ２，Ｆ２’，Ｆ３ 蛍光
ＥＴ 蛍光共鳴エネルギー移動
Claims (6)
- 第１核酸鎖に標識された標識蛍光色素と、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素との間でエネルギー移動をし得るインターカレーターと、からなる検出子の蛍光に係る情報を検出することによって、前記第１核酸鎖と該第１核酸鎖と相補的な塩基配列を有する第２核酸鎖との間の二本鎖核酸の形成に係る情報を得る方法。
- 前記検出子は、少なくとも、光吸収により得た励起エネルギーを他の蛍光色素に与える励起対象蛍光色素と、他の蛍光色素から励起エネルギーを受け取って発光する検出対象蛍光色素と、を有する複数の蛍光色素群からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記インターカレーターは、前記標識蛍光色素を消光するクエンチャーであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記第１核酸鎖の末端が、反応場表面に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 蛍光色素が標識された第１核酸鎖と、該第１核酸鎖と相補的な塩基配列を有する第２核酸鎖とのハイブリダイゼーションを進行させようとする工程と、
二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素とエネルギー移動し得るインターカレーターを添加する工程と、
前記蛍光色素と前記インターカレーターとの蛍光に係る情報を検出する工程と、
を少なくとも行う、ハイブリダイゼーションに係る情報を得る方法。 - プローブ核酸鎖に標識された標識蛍光色素と、二本鎖核酸の塩基対間に結合又は挿入して、前記蛍光色素との間でエネルギー移動をし得るインターカレーターと、からなる検出子の蛍光に係る情報を検出することによって、前記プローブ核酸鎖と相補的な塩基配列を有する核酸鎖の量に関する情報を得る方法。
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