JP4939767B2 - 多重蛍光物質ディテクターシステム - Google Patents

Description

本発明は、概して、核酸標的配列を検出するための方法に関する。具体的には、本発明は、核酸の高感度の検出に有用である、多数の蛍光物質を含むディテクターオリゴヌクレオチドに関する。

生物学的試料内のユニークなＤＮＡまたはＲＮＡの配列、あるいは特定の遺伝子の同定は、癌または病原体感染のような生理学的または病理学的状態の存在を示す可能性がある。例えば、農業および食品加工産業では、植物病原体または有害なバクテリアを検出するために、核酸ハイブリダイゼーション分析を用いてもよい。

外部エネルギー源による励起の際に光を発する発光性標識は、核酸分子を検出するためおよびこれらの分子間の相互作用を検査するために有用であると判明している。これらの標識は、例えば：（１）赤外光、可視光または紫外光の電磁放射線ユニットによって励起可能である光輝性または蛍光性の標識；（２）化学反応からエネルギーを得る化学発光性の標識；（３）高エネルギー粒子からのエネルギーによって励起可能である放射線発光性の標識；および（４）生体系内で供給されるエネルギーによって励起可能である生物発光性の標識のように、励起エネルギー源によって類別される。発光性標識の使用は、発光性標識で標識されたプローブが標的と結合される際に異なる発光特性を示し、それによって、非結合の標識されたプローブを除去することを不要にする「均一系」の分析技術を可能にする（非特許文献１参照）。

また、発光性標識は、核酸増幅技術においても有用であると判明している。核酸増幅の検出での使用に関して、増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位の下流の標的配列にハイブリダイズする発光シグナルプライマー（「ディテクタープローブ」とも称される）が記載されている。参照により本明細書中に組み込まれる特許文献１を参照のこと（特許文献１参照）。シグナルプライマーは、ポリメラーゼによって増幅プライマーの伸長と同様の方法で伸長される。増幅プライマーの伸長は、シグナルプライマーの伸長生成物を標的増幅依存性の方法で置換し、標的増幅を示す検出可能な二本鎖の二次的な増幅生成物を生成する。シグナルプライマーから生成される二次的な増幅生成物は、参照により本明細書中に組み込まれる特許文献２（脂溶性染料および制限部位の組み込み）および特許文献３（蛍光偏光検出）に例証されるように、様々な手段によって検出される可能性がある（特許文献２、３参照）。

蛍光エネルギーの移動は、様々なハイブリダイゼーション方法において相補的核酸間の相互作用を検査するために有利に使用されている。蛍光エネルギーの移動は、クエンチャーの吸収スペクトルがドナーの発光スペクトルと重なり合い、かつドナー蛍光物質とクエンチャー分子（蛍光物質であってもなくてもいい）とが十分至近距離にある場合に、ドナー蛍光物質とクエンチャー分子との間に生じる。ドナーの励起状態エネルギーは、共鳴双極子−誘導双極子相互作用によって近傍のクエンチャーに移動されて、ドナーの蛍光の消光をもたらす。いくつかの場合において、クエンチャーも同様に蛍光物質であるならば、その蛍光強度が増大される可能性がある。エネルギー移動の効率は、当技術分野で周知のように、ドナーおよびクエンチャー間の距離に依存する。

最近、蛍光消光の変化を示すことができる分子内塩基対合性の二次構造を含むプローブすなわちプライマーが、核酸標的配列の検出に用いられている。これらのシステムにおいて、プローブすなわちプライマーの塩基対合性の二次構造中で至近距離にあるドナーおよびクエンチャー蛍光物質は、標的との塩基対合による二次構造の解きほぐし（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）によって空間的に分離されるようになる。２つの蛍光物質の標的依存性の分離は、ドナー蛍光物質の消光を低減させ、それはドナーの蛍光強度を増大させる。例えば、５’および３’末端において蛍光物質で標識された自己相補オリゴヌクレオチドは、エネルギー移動および消光が生じ得るように、２つの蛍光物質を至近距離の状態にさせるヘアピンを形成する。標的オリゴヌクレオチド上の相補体に対する自己相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ヘアピンを破壊しおよび２つの蛍光物質間の距離を増大させて、それによって消光を低減させる。このように標識されたヘアピン構造は、例えば、非特許文献２に記載される（非特許文献２参照）。

ヘアピン構造の不利点は、ヘアピン構造が非常に安定であり、および消光されていないハイブリダイズされた形態への変換が、たいてい緩速であり、およびエネルギー的に中程度に好ましいにしかすぎないことである。例えば、非特許文献２に開示される構造の場合、標的配列は、ヘアピン構造を形成する相補配列とハイブリダイゼーションを競争せねばならず、それによって性能を低下させる（非特許文献２参照）。

また、ドナー／クエンチャー対で標識された、部分的に一本鎖で部分的に二本鎖のシグナルプライマーが記載されている。例えば、特許文献４は、一本鎖の制限エンドヌクレアーゼ認識部位の両側に位置するドナー／クエンチャーの対を有するシグナルプライマーを開示する（特許文献４参照）。標的の存在下で、制限部位は二本鎖となり、そして制限エンドヌクレアーゼによって切断可能になる。切断は、ドナー／クエンチャー対を分離してドナーの消光を低減させる。

他の方法は、制限エンドヌクレアーゼ部位を用いて、ドナー／アクセプター対を分離している。特許文献５は、エネルギー移動対で標識された一本鎖のポリヌクレオチドプローブに対して一本鎖の標的をハイブリダイズさせることによってポリヌクレオチドを測定するための方法を開示する（特許文献５参照）。次いで、二本鎖のハイブリッドは制限酵素によってそれら標識間で切断され、およびそれら標識の一方の蛍光が測定される。本方法の不利点は、プローブ中の制限部位が、検出される標的配列中にも同様に存在しなければならないことである。非特許文献３は、蛍光共鳴エネルギー移動法を用いて分析される、蛍光物質で標識されたオリゴヌクレオチドの制限酵素を触媒とする切断を記載する（非特許文献３参照）。この分析において、標識されたオリゴヌクレオチドは、同様に標識された相補配列にハイブリダイズされて、切断可能な二本鎖の制限部位を生成する。この方法の不利点は、２つの鎖のそれぞれを蛍光性の標識で修飾する必要性である。

また、ドナー／アクセプター対は、参照により全体として本明細書中に組み込まれる特許文献６、７および８に記載される鎖置換増幅（ＳＤＡ）法のような増幅法において使用されている（特許文献６、７、８参照）。これらの特許は、ドナー／アクセプター対に対する連結（ｌｉｎｋａｇｅ）によって修飾される一本鎖のシグナルプライマーを開示する。シグナルプライマーは、ドナーとアクセプターとの間に制限エンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含んでもよい。シグナルプライマーが相補標的配列と二重鎖を形成する際、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は二本鎖にされ、および制限エンンドヌクレアーゼによって切断可能またはニッキング可能にされる。切断またはニッキングはドナーおよびアクセプターを分離し、および低減される消光による蛍光の変化は標的配列増幅の指標として検出される。

米国特許第５，５４７，８６１号明細書 米国特許第５，５５０，０２５号明細書 米国特許第５，５９３，８６７号明細書 欧州特許第０８７８５５４号明細書 特公平５−１５４３９号公報 米国特許第５，９１９，６３０号明細書 米国特許第５，８４６，７２６号明細書 米国特許第６，０５４，７２９号明細書 米国特許第６，２１６，０４９号明細書 米国特許第５，８６３，７３６号明細書 米国特許第５，７９８，４９１号明細書 米国特許第５，６０７，９２４号明細書 米国特許第５，４５５，１６６号明細書 米国特許第５，２７０，１８４号明細書 欧州特許第０６８４３１５号明細書 米国特許第６，０６６，４５８号明細書 米国特許出願第１０／６２６，５８２号明細書 欧州特許出願公開第１１５８４４９号明細書 米国特許出願第０９／５７４，０３１号明細書 Anal. Biochem. 183:231(1989) Nature Biotech. 14:303-308(1996) Nucl. Acids Res. 22:3155-3159(1994) BIOPHYSICAL CHEMISTRY, D. Freifelder, ed., W. H. Freeman and Company, San Francisco (1976) at page 426-28 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (2001) at Chapter 10

ヌクレオチド配列の検出のための改善された方法の必要性が残存する。具体的には、標的増幅を示す蛍光シグナルと、光散乱および非消光性の蛍光により生じるバックグラウンドシグナルとの間の比を改善させる必要がある。また、増幅検出のより効率的な手段および蛍光検出方法のより高い感度の必要性が存在する。

本発明は、ドナー蛍光物質およびクエンチャー分子の多数の対であって酵素的または化学的に切断されることが可能である切断部位で分離される対を含むディテクターオリゴヌクレオチドを提供することによって、これらの必要性を満たす。本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを、均一系分析システムにおける増幅とともに用いてヌクレオチド配列を検出してもよく、または、ディテクターオリゴヌクレオチドを、増幅を伴わない非相同の分析システムにおいて用いてもよい。多数のドナー／クエンチャー対の使用は、標的増幅を示す蛍光シグナルとバックグラウンドシグナルとの間の比を増大させ、それによって検出の感度および効率の両方を高める。同一のディテクターオリゴヌクレオチド上に多数の蛍光物質を使用することによって、さらなる利点が達成される。すなわち、増幅反応がより効率的である。なぜならば、ディテクターオリゴヌクレオチドを伸長させるためには、１つの相補的アダプター分子だけしか必要とされないからである。さらに、他のディテクターと同一のシグナルを生成するためには、より少量のディテクターオリゴヌクレオチドしか必要とされない。

本発明のディテクターオリゴヌクレオチドの蛍光物質ドナーは、ドナーとクエンチャーとの間にエネルギー移動が生じるように、クエンチャー分子に十分に近接している。１つの実施形態におけるドナー／クエンチャー対は、切断部位を提供することが可能な限り少ない核酸塩基で分離されてもよい。ドナーおよびクエンチャー分子の様々な配置が可能である。例えば、限定目的ではないが、ドナー蛍光物質は２つ以上のクエンチャー分子の間に配置されてもよく、またはクエンチャー分子は２つ以上のドナー蛍光物質の間に配置されてもよい。

１つの実施形態において、ディテクターオリゴヌクレオチドは一本鎖であり、およびドナー蛍光物質およびクエンチャー分子の多数の対を含み、それぞれの対におけるドナー蛍光物質およびクエンチャー分子は、ディテクターオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと二重鎖を形成する際に、切断可能である部位で分離される。本実施形態の第２のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の存在下で形成されることが可能である。

ディテクターオリゴヌクレオチドは、ドナーおよびクエンチャー分子の付着を可能にするために、リンカー部分のような１つまたは複数の化学修飾を有するポリヌクレオチドを含んでもよい。ディテクターオリゴヌクレオチドの主鎖は、ディテクターオリゴヌクレオチドがさらなるドナー／クエンチャー対を収容してもよいように、分枝構造を有してもよい。

本発明の他の態様では、本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを使用して試料中の標的核酸を検出するための方法が提供される。該方法は、ディテクターオリゴヌクレオチド（すなわち「第１のオリゴヌクレオチド」）を第２のオリゴヌクレオチドと接触させて、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとの間に二重鎖を形成させることを含む。第１のオリゴヌクレオチドは、ドナー蛍光物質およびクエンチャー分子の多数の対を含み、それぞれの対におけるドナー蛍光物質およびクエンチャー分子は、切断部位で分離される。第２のオリゴヌクレオチドの存在は、標的核酸の存在を示す。第２のオリゴヌクレオチドの切断部位は、第１および第２のオリゴヌクレオチドによって形成される二重鎖の中の二本鎖であり、切断部位が切断されてシグナルを生成することを可能にする。切断に続くドナー蛍光物質の蛍光パラメータにおける変化の検出は、標的核酸の存在を示す。標的核酸はディテクターオリゴヌクレオチドとの二重鎖形成の前に二重鎖から解離される必要がある可能性があることを、当業者は容易に理解するであろう。

ドナー蛍光物質の検出は、蛍光性の変化の程度および／または速度の監視を含んでもよい。１つの実施形態では、ドナーの蛍光発光の変化を監視して、試料中の標的核酸の存在または不在を示し、またはその概算数を提供する。特に、蛍光物質でもあるクエンチャー分子の蛍光発光の変化の程度および／または速度の変化の測定によって、同様に、監視工程を行うことができる。

本発明のさらに別の態様では、本発明に従うディテクターオリゴヌクレオチドを含むキットが提供される。また、該キットは、標的核酸を検出するためのキットを使用するための使用説明書はもちろん、内部標準、対照、核酸を増幅することが可能な酵素、化学試薬、ディテクターオリゴヌクレオチドに対して付着されることができる蛍光物質および／またはクエンチャーのようなさらなる構成要素を含んでもよい。該キットは、例えば、限定目的ではないが、標的オリゴヌクレオチドの相補体と二重鎖を形成することが可能である第１の部分と、第２の部分であって、該第２の部分の相補体がディテクターオリゴヌクレオチドの第１の部分と二重鎖を形成することが可能である第２の部分とを含むアダプターオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。

本発明の他の特徴および利点は、以下の図面および好ましい実施形態の記載から、およびまた、添付される特許請求の範囲から明白になるであろう。

本発明は、標的核酸を検出するためにディテクターオリゴヌクレオチドを用いる。ディテクターオリゴヌクレオチドは、ドナー蛍光物質およびクエンチャー分子の多数の対を含み、これらは改善された蛍光シグナル対バックグラウンド比、および標的核酸のより効率的な検出を提供する。本発明の目的のために、「ドナー蛍光物質およびクエンチャー分子の多数の対」は「多数のドナー／クエンチャー対」と同義語である。ドナー／クエンチャー対の中のドナー蛍光物質およびクエンチャー分子は、切断部位で分離される。１つの実施形態では、該部位は、ディテクターオリゴヌクレオチドが、標的核酸の存在下で形成される第２のオリゴヌクレオチドと二重鎖を形成する際に、切断可能である。

本発明のドナー／クエンチャー対は、「ドナー蛍光物質」および「クエンチャー分子」を含む。励起状態におけるドナー蛍光物質は、ドナーの至近距離にあるクエンチャー分子の存在に対して感受性がある。すなわち、２者が至近距離にあるという条件で、クエンチャー分子は、ドナーから移動される共鳴エネルギーのアクセプターとして作用する。クエンチャー分子は、共鳴エネルギーのアクセプターとなるために蛍光物質である必要はない。エネルギー移動は、蛍光物質とクエンチャー分子とが数十オングストロームのオーダーの距離（例えば、約６０Å以内）で分離されているという条件、およびドナーの蛍光の発光スペクトルがクエンチャー分子の吸収スペクトルと著しく重なり合うという条件で、蛍光物質とクエンチャー分子との間に生じることができる。用語「至近距離」は、本発明において、ひとたびドナーとクエンチャーが分離されたならば、蛍光パラメータの検出可能な変化に十分であるドナーとアクセプター分子との間の距離として定義される。

蛍光パラメータの検出可能な変化を、標的配列の存在の表示として監視する。「蛍光パラメータ」は、ドナーの蛍光強度の増大、（クエンチャー分子が蛍光物質の場合）クエンチャーの蛍光強度の低減、蛍光強度の変化の速度、切断前後の蛍光の比、またはそれらの組み合わせを含むが、しかしそれらに限定されない。ドナーの蛍光強度の変化を監視することが好ましい。なぜならば、この変化は、クエンチャーの蛍光強度の変化よりも典型的に大きいからである。ドナーとクエンチャーとの間の相互作用の変化を検出するために用いてもよい他の蛍光パラメータは、（切断前後での蛍光物質の移動度の相対的変化を測定するための）偏光異方性の変化、あるいは励起または発光スペクトルの波長シフトを含むが、しかしそれらに限定されない。１つの実施形態では、アルゴリズムを使用して、１つまたは複数の蛍光パラメータの変化を解析してもよい。参照により本明細書に組み込まれる特許文献９および１０を参照のこと（特許文献９、１０参照）。

本発明のための適当な蛍光物質は、フルオレセイン、スルホローダミン１０１、ピレンブタノアート（ｐｙｒｅｎｅｂｕｔａｎｏａｔｅ）、アクリジン、エテノアデノシン（ｅｔｈｅｎｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、エオシン、ローダミン、およびエリスロシンを含むが、しかしそれらに限定されない。多くのドナー／クエンチャー対が当技術分野で知られており、および本発明において有用である。これらは、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）（分子プローブ）、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−１−ピレンブチラート（ＰＹＢ）、ＦＴＩＣ／エオシンイソチオシアナート（ＥＩＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−１−ピレンスルホナート（ＰＹＳ）／ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、およびＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、フルオレセイン／ローダミンＸ、ローダミンＸ／Ｃｙ５、またはフルオレセイン／Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）を含むが、しかしそれらに限定されない。ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＭＢＩ、ＤＡＢＳＹＬまたはメチルレッドのような非蛍光性のクエンチャー分子は、特に有用である。ＤＡＢＣＹＬは、隣接する蛍光物質、例えばフルオレセインまたは５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン（ＥＤＡＮＳ）からの蛍光を効率的に消光する非蛍光性のクエンチャー染料である。１つの実施形態では、ドナーおよびクエンチャーは同一の蛍光物質であり、該蛍光物質は重なり合う吸収スペクトルおよび発光スペクトルを有する。特定のドナー／クエンチャー対を明細書および以下の実施例の中に記す；しかしながら、当業者は他の対が本発明において有用であることを理解するであろう。すなわち、特定のドナー／クエンチャー対の選択は、本発明にとって決定的に重要ではない。本発明に有用なドナー／クエンチャー対において、ドナー蛍光物質の発光波長は、クエンチャー分子の励起波長と十分に重なり合って、効率的なエネルギー移動、電荷移動または蛍光消光を可能にする。ドナーおよびクエンチャーを、当技術分野で知られる慣例の末端標識法および内部標識法を用いて、ディテクターオリゴヌクレオチド中のそれぞれの部位で結合してもよい。

ポリヌクレオチドの標的を検出するための手段として、ドナー蛍光物質の使用に加えて他の発光性標識、特に化学発光剤の使用も同様に、本発明の範囲内である。

用語「標的」または「標的核酸」は、検出される核酸のことを言い、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡのような、遭遇するこれらの分子の任意の配置を有するＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。例えば、標的核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、あるいは二次構造を有していてもよい。二本鎖の核酸の標的は、検出が求められる鎖である。検出が二本鎖の標的核酸または二次構造を有する核酸との二重鎖の形成を必要とする場合、検出は標的核酸を一本鎖にすることによって促進されるであろうことを、当業者は理解するであろう。本発明の目的のために、標的核酸は、単離されていても、または天然のものでもよく、および生体外または原位置(in situ)で検出されてもよい。本発明の１つの実施形態では、標的核酸を検出する方法は、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される増幅反応を含む。本発明によって包含される増幅のためのテンプレートは、核酸それ自体、標的核酸の相補鎖、および複製または増幅によって作り出されるオリジナル配列のコピーのどちらか一方の鎖を含む。また、標的核酸は、ハイブリダイズされるプライマーのテンプレートからの伸長のためのテンプレートであってもよい。１つの実施形態では、標的核酸は病原体から抽出される。

オリゴヌクレオチドの「切断」は、ＤＮＡまたはＲＮＡの二重鎖の両方の鎖のリン酸ジエステル結合の分解、または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのリン酸ジエステル結合の分解を言う。これは、ＤＮＡまたはＲＮＡの二重鎖の２つの鎖のうちの一方のみのリン酸ジエステル結合の分解を言う「ニッキング」とは対照をなす。ドナー蛍光物質とクエンチャーとの間の切断部位は、部位が二本鎖の形態であるときに切断される可能性がある。「切断部位」は、切断試薬によって特異的に切断される二本鎖の核酸の塩基の伸長部である。１つの実施形態では、切断部位は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位である。制限エンドヌクレアーゼの様々な認識部位は、当技術分野で周知である。また、適当な切断試薬は、切断部位の両方の鎖を切る化学的切断試薬を含む。例えば、限定目的ではないが、参照によって本明細書中に組み込まれる特許文献１１および１２に記載されるタイプの部位特異性の光活性化される切断試薬を使用することができるであろう（特許文献１１、１２参照）。

ディテクターオリゴヌクレオチドの切断の際の蛍光強度の変化は、切断されていないディテクターオリゴヌクレオチド内のドナー蛍光物質とクエンチャー分子とを分離する距離に依存する（特許文献６参照）。エネルギー移動の効率は、以下の式によって支配される：

式中、Ｒはドナーとクエンチャーとの間の距離であり、およびＲ_０は各ドナー／クエンチャー対に関する定数であり、よく知られている方法に従ってそれぞれの吸収および発光スペクトルの特定のパラメータから計算することができる。参照によって本明細書中に組み込まれる非特許文献４を参照のこと（非特許文献４参照）。

一般に、二本鎖の切断に続くドナーの発光の変化の大きさは、元のままのディテクターオリゴヌクレオチド内のドナーとクエンチャーとの間の距離の減少に伴い増大する。しかしながら、ドナーとクエンチャーとの間の距離を調整して、切断のより高い効率を提供してもよい。例えば、限定目的ではないが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が切断部位として使用されるならば、ドナーとクエンチャーとの間の分離を調整して、認識部位に対する制限エンドヌクレアーゼの結合を適応させることができ、それによって、さもなければ完全な切断を妨げる可能性のある立体障害を回避または制限する。１つの実施形態において、ドナー蛍光物質およびクエンチャー分子は、ヌクレオチド約５〜２０個で、または好ましくはヌクレオチド約６〜８個で分離される。

その構造の様々な態様を変更する一方で本発明のディテクターオリゴヌクレオチドの利点は保持される可能性があるということを、当業者は理解するであろう。例えば、限定目的ではないが、ドナー／クエンチャー対の数を変更してもよい。ディテクターオリゴヌクレオチドに対するさらに多くのドナー／クエンチャー対の追加は、二本鎖の切断部位の切断後に観察可能な全蛍光の量を増加させると予想される。ディテクターオリゴヌクレオチドに対して追加してもよいドナー／クエンチャー対の数に上限はない。１つの実施形態において、ドナー／クエンチャー対の数は少なくとも２つである。他の実施形態において、ディテクターオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ以上のドナー／クエンチャー対を含有する。他の実施形態において、ディテクターオリゴヌクレオチドは少なくとも１０、２０、３０または５０対を含有してもよく、あるいは最適なシグナル−ノイズ比および分析感度を生み出すために必要とされる際には数百ものドナー／クエンチャー対を含有してもよい。

いくつかの実施形態において、ドナー／クエンチャー対を収容するために必要とされるオリゴヌクレオチドの長さは、２００塩基を超え、または５００塩基以上でさえある。さらに、ディテクターのオリゴヌクレオチド主鎖は、ドナー／クエンチャー対を含有してもよいさらなるオリゴヌクレオチド配列を提供するための分枝を含有してもよい。分枝または多分枝のオリゴヌクレオチドを作り出すための方法は、当技術分野においてよく知られている。従って、本明細書中で使用される際に、「オリゴヌクレオチド」は、長さがヌクレオチド約２〜２０個の直鎖型核酸に限定されない。

さらに、ドナー／クエンチャー対が配列される様態または順序は、本発明にとって決定的に重要ではない。例えば、限定目的ではないが、ドナー蛍光物質（「Ｄ」）およびクエンチャー分子（「Ｑ」）は、Ｄ／Ｑ、Ｄ／Ｑのように順序付けられてもよく、または、ドナー蛍光物質がクエンチャー分子の至近距離にあるという条件で、Ｑ／Ｄ、Ｄ／Ｑ、Ｄ／Ｑ／Ｄ、Ｑ／Ｄ／Ｑのように順序付けられてもよい。１つの実施形態において、ドナーおよびクエンチャーを、Ｄ／ＱＱＱ／ＤまたはＱ／ＤＤＤ／Ｑの配列で配置してもよい。これらの実施形態において、ドナーとクエンチャーとの間の切断部位は、スラッシュ記号によって示される。従って、本発明の目的のために、「ドナー／クエンチャー対」は、ドナー蛍光物質をクエンチャー分子の至近距離に含み、そこでドナーおよびクエンチャーは切断部位で分離され、および切断部位に隣接するドナーまたはクエンチャーのどちらかの至近距離にさらなるドナー蛍光物質またはクエンチャー分子を含んでもよい。Ｄ／Ｑ／ＤまたはＱ／Ｄ／Ｑのような３つのドナーおよびクエンチャーと２つの切断部位とを有する配置を、各対がドナー蛍光物質またはクエンチャー分子のどちらかを共有するにもかかわらず、２つの「ドナー／クエンチャー対」として定義する。

本発明の１つの実施形態において、ディテクターオリゴヌクレオチドを、増幅反応でのディテクターオリゴヌクレオチドの使用を含む標的核酸を検出する方法において使用する。鎖置換型増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、自律的な配列複製（３ＳＲ）、Ｑβレプリカーゼベースの増幅、固相増幅、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅、および転写介在型増幅（ＴＭＡ）を含むがそれらに限定されない核酸増幅の様々な方法が、当技術分野において知られており、および本発明に適用できる。

「増幅プライマー」は、プライマー伸長法による標的配列の増幅のためのプライマーである。例えば、ＳＤＡでは、増幅プライマーの３’末端は、標的核酸の３’末端でハイブリダイズする。増幅プライマーは、その５’末端の近傍に制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含み、認識部位が半修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）される際にＤＮＡまたはＲＮＡの二重鎖がニックされるのを可能にする（特許文献１３、１４および１５参照）。また、増幅プライマーは、増幅プライマーの標的結合配列が標的核酸に対してハイブリダイズされる際に、ＤＮＡポリメラーゼによって３’末端から伸長可能である。増幅プライマーを、標的核酸の指数関数的な増幅をもたらす反応において使用してもよい。

ＰＣＲのための増幅プライマーは、標的結合配列のみから構成されてもよい。なぜならば、増幅反応を推進するために特殊な配列または構造は必要とされないからである。それに反して、３ＳＲおよびＮＡＳＢＡのような他の増幅方法に有用な増幅プライマーは、５’末端の近傍にＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含む。プロモータは、プライマーと標的核酸との間の二重鎖形成によって標的核酸に付加され、および標的の多数のＲＮＡコピーの転写を導くことによって増幅反応を推進するように働く。当技術分野で知られている他の増幅プライマーもまた、本発明にとって有用である可能性がある。

「伸長生成物」は、プライマー、またはプライマーの一部、およびプライマー結合部位の下流の標的核酸の相補体である新たに合成された鎖を含む核酸である。伸長生成物は、標的配列に対するプライマーのハイブリダイゼーションおよび標的核酸をテンプレートとして用いるポリメラーゼによるプライマーの伸長によってもたらされる。

当業者は、本明細書中で使用される「ハイブリダイゼーション」および「二重鎖形成」は、厳密な塩基対塩基の相補性を必要としないことを理解するであろう。すなわち、ミスマッチ塩基対を含有した２つの核酸間で二重鎖を形成することができる。完全に相補的である核酸またはミスマッチ塩基対を含有する核酸がハイブリダイズして二重鎖を形成する条件は、本技術分野でよく知られており、および例えば、参照によって本明細書中に組み込まれる非特許文献５に記載される（非特許文献５参照）。

図１は、本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを伴う反応を説明する。プライマーＰ_１は、標的核酸Ｔに対してハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼ（本発明の工程（ａ））は、Ｐ_１から相補鎖を伸長して鎖１を形成する。オリゴヌクレオチドの「バンパー」Ｂ_１は、Ｐ_１の上流で結合する。プライマーＰ_１およびバンパーＢ_１は、典型的には一緒に加えられるが、しかし別々に加えられてもよい。ポリメラーゼがＢ_１から相補鎖を伸長する際に、鎖１は標的鎖Ｔから除去される（工程（ｂ））。次に、プライマーＰ_２は鎖１に対してハイブリダイズし、アダプターオリゴヌクレオチドはＰ_２の下流でハイブリダイズし、および両者はポリメラーゼによって伸長される（工程（ｃ））。Ｐ_２から伸長される鎖（鎖２）は、アダプターオリゴヌクレオチドから伸長される鎖に衝突する（工程（ｄ））。次に、Ｐ_１は鎖２に対してハイブリダイズし、および該鎖は再度伸長される（工程（ｅ））。Ｐ_１が伸長された鎖は、その５’末端に位置する制限エンドヌクレアーゼ部位でニックされ、および該鎖は、ＳＤＡによって増幅されて鎖３を形成する（工程（ｆ））。工程（ａ）から（ｆ）までは、Ｐ_１によって開始される単一の標的特異的ハイブリダイゼーション事象からの鎖３の多数のコピーをもたらす。

多重ディテクターオリゴヌクレオチドに対する鎖３のハイブリダイゼーションは、ポリメラーゼ伸長のための開始テンプレートを形成し、このテンプレートはディテクターオリゴヌクレオチドを二本鎖の切断可能な形態に変換する。具体的には、鎖３は、その３’末端において多重ディテクターオリゴヌクレオチド上の相補配列と二重鎖を形成する（工程（ｇ））。ひとたびポリメラーゼによって伸長されたならば（工程（ｈ））、多重ディテクターオリゴヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼで切断される（工程（ｉ））。制限エンドヌクレアーゼでの消化がドナーとクエンチャーとの物理的分離をもたらすように、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、ディテクターオリゴヌクレオチド上のドナー蛍光物質とクエンチャー分子との間に位置する。ドナーとクエンチャーとの分離は、ドナーの増大された蛍光をもたらし、それによって標的Ｔの存在を示す。

シグナルを、反応において選択される終点またはリアルタイムで検出してもよい。例えば、限定目的ではないが、鎖３と多重ディテクターオリゴヌクレオチドとの間のハイブリッドの伸長反応と同時に鎖３を増幅することによって、シグナルを検出してもよい。そのような均一系のリアルタイム分析を使用して、存在する標的の初期量についての半定量的または定量的情報を提供してもよい。すなわち、標的配列のより多くの初期コピーが存在する時は、閾値シグナル水準を越える蛍光シグナルを生成するために、増幅のより少ないラウンドが必要とされる。このタイプの分析における標的核酸の初期量は、既知量の精製された標的核酸に関する結果に対する実験結果の比較によって測定される。また、分析の測定値を解析するための方法は、それぞれの内容が参照によって本明細書に組み込まれる特許文献９、１６、１０、１７、および２００１年１１月２８日に公開された特許文献１８に相当する特許文献１９に見出される（特許文献９、１０、１６、１７、１８、１９参照）。

前述のように、プライマー１、プライマー２およびアダプタープライマーを用いる標的依存性の増幅反応を通じて鎖３の多数のコピーを生成することによって、シグナルを増幅してもよい。上記の方法のような、当該技術で知られている代替の増幅方法を用いて、本発明で使用することができる鎖３の同等物を生成してもよい。

あるいはまた、ディテクターオリゴヌクレオチドを使用して、増幅反応なしで標的核酸を検出してもよい。例えば、限定目的ではないが、ディテクターオリゴヌクレオチドは、直接標的核酸とハイブリダイズする領域を含んでもよい。本実施形態では、ディテクターオリゴヌクレオチドは、標的核酸と二重鎖を形成することが可能である一本鎖の部分を含むという条件で、部分的に二本鎖であってもよい。他の実施形態では、ディテクターオリゴヌクレオチドは完全または実質的に一本鎖であってもよく、およびディテクターオリゴヌクレオチドは、ディテクターオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に形成される二重鎖において開始されるポリメラーゼ伸長反応によって二本鎖にされる。この二重鎖は、例えば、限定目的ではないが、ディテクターの５’の部分と制限消化などによって生成された標的核酸の断片の３’の部分との間に形成されてもよい。さらに別の実施形態では、標的配列の断片を増幅し、およびディテクターオリゴヌクレオチドを、増幅された標的核酸自体または標的核酸の増幅された相補鎖と接触させる。これらの実施形態では、好ましくは、ディテクターオリゴヌクレオチドは非相同の形式で使用される。すなわち、ディテクターオリゴヌクレオチドを標的核酸と反応させ、そして切断部位が切断を受ける前に、標的核酸と二重結合を形成しないディテクターオリゴヌクレオチドを洗い落とす。

さらに別の実施形態では、ディテクターオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドを通じて標的核酸と相互作用する。アダプターオリゴヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズする配列を含み、およびディテクターオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする別個の部分を含む。アダプターオリゴヌクレオチドとディテクターオリゴヌクレオチドとの間に形成されるハイブリッドは、オリゴヌクレオチドを二本鎖にするディテクターオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長のためのテンプレートを作り出す。

ディテクターオリゴヌクレオチドを、当技術分野で知られている様々な方法で、直接または二本鎖にされた後のどちらかで検出してもよい。例えば、限定目的ではないが、見かけの分子量に基づくポリアクリルアミドゲル電気泳動、標識化されたプローブに対するハイブリダイゼーション、ディテクターオリゴヌクレオチド特異的プローブを用いる固相捕捉（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｃａｐｔｕｒｅ）、または制限エンドヌクレアーゼでの切断によって、ディテクターオリゴヌクレオチドを検出してもよい。

以下の実施例は、本発明によって網羅される実施形態の代表であり、および本発明によって包含される対象を制限することを意図しない。

（実施例１）
ＳＤＡ反応を、本発明の増幅プライマーおよびディテクターオリゴヌクレオチドを用いて実施してもよい。本実施例では、ＨＩＶ−１ ｐｏｌ遺伝子の領域を検出するように、ディテクターを設計する。ＳＤＡを、約５２℃において、少なくとも１つ、好ましくは２５０コピーのクローン化された二本鎖のＤＮＡ標的核酸の存在下で、増幅プライマー５００ｎＭ、バンパープライマー５０ｎＭおよびディテクターオリゴヌクレオチド２００ｎＭを使用して実施してもよい。対照反応を、二本鎖の標的核酸の非存在下で実施する。ＢｓｏＢＩ認識配列によって分離され、および至近距離に配置される、多数のドナー蛍光物質／クエンチャー蛍光物質対（ローダミン／ＤＡＢＣＹＬまたはフルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬのどちらか一方）で、ディテクターを蛍光的に標識する。ドナーの蛍光を、反応の過程において監視する。

ドナーの蛍光は、標的ＤＮＡが存在する時、反応の過程において有意に増大し、ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が切断されることを示す。対照的に、標的ＤＮＡの非存在下では、蛍光は反応の間中、首尾一貫して小さいままである。

（実施例２）
ＳＤＡ反応を、本発明の増幅プライマーおよびディテクターオリゴヌクレオチドを使用して実行して、ＨＩＶ ＲＮＡ転写物を検出した。ＳＤＡは以下のように実施した：標的緩衝液を、５０ｍＭのＫＯＢ、１２０ｍＭのビシンで調製し、および反応あたり０コピーまたは反応あたり２０００コピーのどちらかでＲＮＡ標的核酸を加えた。示される試薬濃度で調製された標的緩衝液６５μｌを、ブランクの容器（ｗｅｌｌ）にスポットした。試料緩衝液１５０μｌを標的緩衝液の容器に分注し、溶液を混合し、および容器を５０℃に２０分間置いた。ＲＴ試薬を以下に示すように調製した。

加熱スパイク容器（ｈｅａｔ ｓｐｉｋｅ ｗｅｌｌ）中の溶液１５０μｌを、５分間でＲＴ容器に移動させた。増幅ミックスを、以下に示すように調製した：

増幅ミックスを、１００μｌでブランク容器中へスポットし、および容器を、５４℃の定温放置の終了前に、６０℃の加熱区画上に１０分間配置した。ＲＴ工程において増幅ミックス６２μｌを容器に移動させ、容器に覆いをつけ、およびＰＲＯＢＥＴＥＣ蛍光光度計を使用してプレートを読み取った。

本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを、ヘアピンプローブと比較した。結果を以下および図２Ａ〜２Ｆに示す。ＣＴＣＧＶｎｖ３はヘアピンプローブであり；Ｄ＝ｄａｂａｙｌ；Ｒ＝ローダミン；ＲＤＲＤ２．６Ｂプローブは、ＤＡＢＣＹＬとローダミンとの間に６塩基を有し；ＲＤＲＤ２．７Ｂプローブは、ＤＡＢＣＹＬとローダミンとの間に７塩基を有し；およびＲＤＲＤ２．８Ｂプローブは、ＤＡＢＣＹＬとローダミンとの間に８塩基を有する。
結果：

結果は、本発明のディテクターオリゴヌクレオチドが、他のプローブ、例えばＣＴＧＣＵｎｖ３プローブよりも良好に作用することを実証する。実施例２で用いられた様々なディテクターオリゴヌクレオチドのプローブの設計は、ローダミンとＤＡＢＣＹＬとの間の塩基の数に従って変化する。また、ローダミン部分とＤＡＢＣＹＬ部分との間に１つまたは２つの付加的な塩基を加えると、改善がみられることを実証する（ＲＤＲＤ２．７ＢおよびＲＤＲＤ２．８Ｂ参照のこと）。

上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に究明することができ、およびその精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、様々な用法および条件に適合させることができる。

標的配列の検出のための増幅反応における本発明のディテクターオリゴヌクレオチドの使用の図解である。 本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを既知のディテクタープローブと比較する実施例２において行われた実験の結果を示すグラフである。 本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを既知のディテクタープローブと比較する実施例２において行われた実験の結果を示すグラフである。 本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを既知のディテクタープローブと比較する実施例２において行われた実験の結果を示すグラフである。 本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを既知のディテクタープローブと比較する実施例２において行われた実験の結果を示すグラフである。 本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを既知のディテクタープローブと比較する実施例２において行われた実験の結果を示すグラフである。 本発明のディテクターオリゴヌクレオチドを既知のディテクタープローブと比較する実施例２において行われた実験の結果を示すグラフである。

Claims (11)

1. 標的核酸を検出するための少なくとも２対のドナー蛍光物質／クエンチャー分子を至近距離に含むディテクターオリゴヌクレオチドであって、前記対のそれぞれにおける前記ドナー蛍光物質および前記クエンチャー分子は、二本鎖の形態において切断可能である切断部位で分離され、および前記切断部位での切断は、標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを生み出すことが可能であることを特徴とするディテクターオリゴヌクレオチド。
2. 前記蛍光物質（Ｄ）、及びクエンチャー分子（Ｑ）が、Ｄ／Ｑ、Ｑ／Ｄ、Ｄ／Ｑ／Ｄ、Ｑ／Ｄ／Ｑ、Ｄ／ＱＱ／Ｄ、Ｑ／ＤＤ／Ｑ、Ｑ／ＤＤＤ／Ｑ、Ｄ／ＱＱＱ／Ｄ、Ｑ／Ｄ／Ｑ／Ｄ、又はこれらの組合せの群からなる選択される順に配置されていることを特徴とする請求項１に記載するディテクターオリゴヌクレオチド。
3. 前記ドナー蛍光物質および前記クエンチャー分子が、ヌクレオチド約６から８個で分離されていることを特徴とする、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 前記切断部位が、エンドヌクレアーゼによって切断可能であることを特徴とする、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 少なくとも１つの前記ドナー蛍光物質が、フルオレセイン、スルホローダミン１０１、ピレンブタノアート、アクリジン、エテノアデノシン、エオシン、ローダミン、およびエリスロシンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２または３に記載のディテクターオリゴヌクレオチド。
6. 標的核酸を検出するための方法であって：
   ａ. （ｉ）少なくとも２対のドナー蛍光物質およびクエンチャー分子を至近距離に含む一本鎖の部分を含む第１のディテクターオリゴヌクレオチドであって、前記対のそれぞれにおける前記ドナー蛍光物質および前記クエンチャー分子は切断部位で分離される第１のディテクターオリゴヌクレオチドを、（ｉｉ）その存在が標的核酸の存在を表示する一本鎖の第２のオリゴヌクレオチドと接触させて、前記第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとの間に二重鎖を形成させる工程と；
   ｂ． 二重鎖を伸長させて、第１のディテクターオリゴヌクレオチドの前記一本鎖の部分を二本鎖にする工程と；
   ｃ． 少なくとも１つの前記切断部位を切断する工程と；
   ｄ． 前記ドナー蛍光物質を検出する工程と
   を含み、前記ドナー蛍光物質の蛍光パラメータの検出可能な変化は、前記標的核酸の存在を表示することを特徴とする方法。
7. 第２のオリゴヌクレオチドを増幅することをさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記増幅が、鎖置換型増幅（ＳＤＡ），ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、自律的な配列複製（３ＳＲ）、Ｑβレプリカーゼベースの増幅、固相増幅、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅、および転写介在型増幅（ＴＭＡ）からなる群から選択される方法によることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記少なくとも１つの前記対が、フルオレセイン／ローダミンＸ、ローダミンＸ／Ｃｙ５、またはフルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬからなるドナーおよびクエンチャー分子の群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
10. 標的核酸を検出するための方法であって：
    ａ． （ｉ）プライマーＰ１を前記標的核酸に対してハイブリダイズさせて、および（ｉｉ）ポリメラーゼの使用によってＰ１を伸長させて鎖１を形成させる工程であって、プライマーＰ１は、標的核酸に対してハイブリダイズしない前記プライマーＰ１の５’の部分にエンドヌクレアーゼ認識部位を含む工程と；
    ｂ． （ｉ）バンパーＢ１を前記プライマーＰ１の上流において前記標的核酸に対してハイブリダイズさせ、および（ｉｉ）バンパーＢ１を伸長させ、および前記標的核酸から鎖１を除去する工程と；
    ｃ． アダプターを鎖１に、およびプライマーＰ２を鎖１に対してハイブリダイズさせる工程であって、プライマーＰ２はアダプターの上流にハイブリダイズする工程と；
    ｄ． （ｉ）アダプターを伸長させて鎖２を形成させ、および（ｉｉ）プライマーＰ２を伸長させて鎖１から鎖２を除去する工程と；
    ｅ． （ｉ）プライマーＰ１を鎖２に対してハイブリダイズさせ、および（ｉｉ）プライマーＰ１を伸長させてプライマーＰ１が伸長された鎖を形成させる工程と；
    ｆ． （ｉ）プライマーＰ１が伸長された鎖を、プライマーＰ１が伸長された鎖に組み込まれているエンドヌクレアーゼ認識部位でニックして、および（ｉｉ）ニック部位から伸長して、鎖３を形成し、およびニック部位の下流のプライマーＰ１が伸長された鎖と衝突する工程と；
    ｇ． 鎖３をオリゴヌクレオチドの一部分に対してハイブリダイズさせる工程であって、該オリゴヌクレオチドは、ドナー蛍光物質およびクエンチャーの多数の対を含み、前記対のそれぞれにおけるドナー蛍光物質およびクエンチャーは、前記切断部位が二本鎖であるときに、切断可能である部位で分離される工程と；
    ｈ． （ｉ）鎖３を伸長させて切断部位を二本鎖にし、および（ｉｉ）少なくとも１つの切断部位を切断する工程と；
    ｉ． 前記ドナー蛍光物質を検出する工程と
    を含み、前記蛍光物質の蛍光パラメータの検出可能な変化は前記標的核酸の存在を表示することを特徴とする方法。
11. 少なくとも２対のドナー蛍光物質およびクエンチャー分子を至近距離に含む一本鎖の第１のディテクターオリゴヌクレオチドを含むキットであって、前記対のそれぞれにおける前記ドナー蛍光物質と前記クエンチャー分子は、二本鎖の形態において切断可能である切断部位で分離され、および標的核酸の存在下で形成されることが可能な第２のオリゴヌクレオチドと第１のディテクターオリゴヌクレオチドが二重鎖を形成するとき、切断部位は二本鎖であることを特徴とするキット。

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