SK12212000A3 - Metóda na detekciu cieľovej nukleovej kyseliny pomocou PCR - Google Patents
Metóda na detekciu cieľovej nukleovej kyseliny pomocou PCR Download PDFInfo
- Publication number
- SK12212000A3 SK12212000A3 SK1221-2000A SK12212000A SK12212000A3 SK 12212000 A3 SK12212000 A3 SK 12212000A3 SK 12212000 A SK12212000 A SK 12212000A SK 12212000 A3 SK12212000 A3 SK 12212000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- probe
- sequence
- amplification
- fluorescence
- sample
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 132
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 74
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 74
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 60
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 46
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 21
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 11
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 claims description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 16
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 15
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002112 DNA intercalation Effects 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000001649 bromium compounds Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/80—Elimination or reduction of contamination by undersired ferments, e.g. aseptic cultivation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Geophysics And Detection Of Objects (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Oblasé íechm ku
Predkladaný vynález poskytuje metódu na detekciu cieľového polynukleotídu vo vzorke, napríklad monitorovaním amplifikačnej reakcie (prednostne kvantitatívnym spôsobom) a tiež sondy a kity na použitie v týchto metódach. Metóda je tiež vhodná na určenie charakteristík sekvencie, ako napríklad polymorfizmov alebo alelického variantu a tak sa môže použiť v diagnostických metódach.
'Ižoí&'tys-Č β+αν ΆχΛ ru’Ly
Medzi známe metódy monitorujúce fluorescenciu polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR, polymerase chanreaction) patria ako sekvenčne špecifické, tak obecne použiteľné DNA interkalačné techniky. Tieto metódy sa dajú použiť na niekoľkých PCR teplotných cyklátoroch druhej generácie.
Obecne použiteľné metódy používajú DNA interkalačné farbivá, ktoré vykazujú pri naviazaní na dvojreťazcovú DNA zvýšenú fluorescenciu. Zvýšenie fluorescencie vďaka zvýšeniu celkovej koncentrácie DNA počas amplifikácie sa môže použiť na meranie priebehu reakcie a na určenie počtu kópií cieľovej molekuly. Okrem toho je možné sledovaním fluorescencie pri kontrolovanej zmene teploty generovať krivky teplôt charakteristických pre PCR.
Obecne použiteľné DNA metódy monitorujú zvýšenie celkovej koncentrácie nukleových kyselín bez ďalších časových nárokov. V každej reakcii sa môže uskutočniť jednotlivé meranie fluorescencie v ten samý okamih. Na rozlíšenie artefaktov a amplikónov a na rozlíšenie amplikónov sa môže použiť analýza teplôt rozpúšťania na konci reakcie. Aj v koncentráciách, ktoré nie je možné vizualizovať na agarózovom géli, je možné pozorovať piky jednotlivých produktov.
Aby sa získali presné dáta o teplotách rozpúšťania, musí sa tento experiment uskutočniť pomaly, čo na existujúcich prístrojoch zaberie až päť minút. Priebežným monitorovaním fluorescencie pri amplifikácii sa môže ale vytvoriť 3D obraz oneskorenia hydridizácie. Tento 3D obraz je závislý i môže poskytovať dostatok informácií na rozpúšťania na amplikóne rozlíšenie produktu.
Zistilo sa, že analýza kriviek teplôt rozpúšťania DNA je obecne výkonný nástroj na optimalizáciu PCR. Určením teplôt rozpúšťania amplikónov je možné znížiť denaturačnú teplotu v PCR reakcii na túto teplotu. Optimalizácia amplifikácie na základe produktov z prvej generácie amplifikácie (miesto genómovej DNA) obmedzí tvorbu artefaktov, ku ktorej dochádza v neskorších cykloch. Teploty rozpúšťania primerových oligonukleotídov a ich komplementov sa môžu použiť na určenie ich teplôt nasadenia a obmedziť tak nutnosť empirickej optimalizácie.
Obecné interkalačné metódy sú ale iba zdanlivo sekvenčno-špecifické a nie sú teda nijako zvlášť vhodné tam, kde je nutná sekvenčno-špecifická detekcia.
Pre reťazec špecifickej metódy používajú na monitorovanie postupu amplifikačných reakcií ako ďalší reakčný komponent nukleovú kyselinu. Tieto metódy môžu ako základ na detekciu využívať prenos fluorescenčnej energie (FET, fluorescence energy transfer). Jedna alebo viac sond z nukleovej kyseliny sa označí fluorescenčnými molekulami, z ktorých jedna pôsobí ako dodávateľ (donor) energie a druhá ako molekula prijímajúca energiu (akceptor). Tieto molekuly sú tiež známe ako „spravodajská (alebo reportérova) molekula (reportér molecule) a zhášacia molekula, (quencher molecule). Donorová molekula je excitovaná svetlom s určitou vlnovou dĺžkou. Akceptorová molekula je excitovaná pri tejto vlnovej dĺžke tak, že môže pribrať emisnú energiu donorovej molekuly rôznymi, na vzdialenosti závislými, prenosmi energie. Špecifický príklad prenosu fluorescenčnej energie ku ktorému môže dôjsť je „fluorescenčný rezonančný prenos energie, FRET (fluorescence resonance energy transfer) . Obecne akceptorová molekula priberá emisnú energiu donorovej molekuly, keď sú v úzkej blízkosti (t.j. na tej samej alebo susediacej molekule). Základ pre FET alebo FRET detekciu je monitorovanie zmeny pri emisných vlnových dĺžkach donora a akceptora.
Existujú dva bežne používané typy FET a FRET sond -tie,ktoré využívajú hydrolýzu nukleovej kyseliny sondy na oddelenie donora a akcpetora a tie, ktoré používajú na zmenu vzájomnú polohu donorových a akceptorových molekúl, hybridizáciou.
Hydrolyzačné sondy sú komerčne dostupné ako TaqMan™ sondy. Skladajú sa z DNA oligonukleotidov, ktoré sú označené donorovými a akceptorovými molekulami. Sondy sú navrhnuté tak, aby sa viazali na špecifickú oblasť jedného reťazca PCR produktu. Po nasadnutí PCR primérov na tento reťazec, Taq enzým predlžuje svojou 5'3'polymerázovou aktivitou DNA. Taq enzým má ale tiež
5'-3'exonukleázovú aktiviu. TaqMan™ sondy sú na 3'konci fosforované, aby sa zabránilo tomu, že budú pôsobiť ako priméry na Taq predlžovanie. Keď je TaqMan™ sonda hybridizovaná na reťazec produktu, potom postupujúca Taq molekula môže hydrolyzovať sondu a uvoľniť tak donora od akceptora. To je základ na detekciu. Signál je v tomto prípade kumulatívny, kocentrácia voľných donorových a akceptorových molekúl sa v každom cykle amplifikačnej reakcie zvyšuje.
Fakt, že tvorba signálu je závislá na existencii reakcie hydrolyzujúcej sondu znamená, že je s touto metódou spojené časové oneskorenie. Okrem toho môže prítomnosť sondy rušiť bezproblémový priebeh PCR reakcií.
Tiež sa zistilo, že hydrolýza sa môže stať nešpecifickou, najmä pri veľkom počte amplifikačných cykov, napríklad keď je potrebné uskutočňovať viac ako 50 cyklov. V týchto prípadoch bude nešpecifická hydrolýza spôsobovať prehnane vysoký signál.
To znamená, že takéto techniky nie sú príliš kompatibilné s rýchlymi PCR metódami, ktoré sa stávajú s vývojom rýchlych, horúci vzduch využívajúcich teplotných cyklátorov (ako je RapidCycler™ a LightCycler™ od. Idaho Technológie Inc.), stále dôležitejšími. Iné rýchle PCR zariadenia sú opísané napríklad v súčasne prerokovávaných British Patent Aplication 9625442.0 a 9716052.7. Výhody rýchleho cyklovania pred konvenčným teplotným cyklovaním boli opísané inde. Takéto techniky sú najmä užitočné napríklad v detekčných systémoch na biologický boj, kde je rýchlosť získania výsledkov dôležitým faktorom na zabránenie strát na životoch alebo vážnych poškodení.
Hydrolyzačné sondy naviac neposkytujú podstatnú informáciu čo sa týka priebehu rozpúšťania, pretože je signál najviac závislý na hydrolýze sondy, nie na teplote rozpúšťania amplikónu.
Hybridizačné sondy sú dostupné v značnom počte rôznych foriem.„Molekulárne majáky (molecular beacons) sú oligonukleotídy, ktoré majú komplementárne 5'a 3'sekvencie,čím sa tvorí vlásenková slučka. Keď sa vytvorí vlásenka, sú fluorescenčné značky na koncoch v tesnej blízkosti pre FRET. Po hybridizácii molekulárneho majáku na komplementárnu sekvenciu sú fluorescenčné farbivá (priestorovo) oddelené, takže nedochádza na FRET a v tom spočíva princíp detekcie.
Môžu sa tiež použiť páry označených oligonukleotidov. Tie hybridizujú v tesnej blízkosti na reťazec PCR produktu, čím sa dostanú donorové a akceptorové molekuly k sebe,takže môže dôjsť k FRET. Princípom detekcie je zvýšenie FRET. Varianty tohto typu používajú označené amplifikačné priméry s jednou priľahlou sondou.
Použitie dvoch sond, alebo sond typu molekulárny maják, ktoré zahŕňajú použitie dvoch označených molekúl,· zvyšuje cenu procesu. Okrem toho táto metóda vyžaduje prítomnosť primerane dlhej známej sekvencie, aby sa dve dostatočne dlhé sondy naviazali v tesnej blízkosti.To môže byť problém v niektorých diagnostických aplikáciách, kde dĺžka konzervovanej sekvencie v organizme, ktorý sa môže použiť na návrh účinnej sondy (ako treba u HIV vírusu) môže byť relatívne krátka.
Okrem toho použitie párov sond zahŕňa komplexnejší experimentálny návrh. Napríklad signál získaný pri analýze rozpúšťania sondy je funkciou uvoľnenia obidvoch sond.Štúdium malých nehomológií, alebo keď sa vyžaduje, aby sa jedna sonda viazala cez oblasť zostrihu (splice región) (napríklad na detekciu RNA v porovnaní s DNA vo vzorke, keď sa môže sekvencia na obidvoch stranách intrónu použiť ako miesto na sondu) môže poskytnúť nepresné výsledky, ak sa druhá sonda uvoľní skôr.
Pc’ác-l-a.-la.
Žiadatel vyvinul test na detekciu prítomnosti určitých sekvencií nukleových kyselín, ktorý sa môže adaptovať na kvantifikáciu množstva cieľovej nukleovej sekvencie vo vzorke.
je schopná fluorescenčnú
Vynález poskytuje metódu na detekciu prítomnosťcieľovej sekvencie nukleovej kyseliny vo vzorke, pričom zmienená metóda zahŕňa (a) amplifikačnú reakciu zmienenej vzorky s využitím nukleotidov, z ktorých je aspoň jeden fluorescenčné označený, (b) kontakt amplifikačného produktu so sondou za podmienok, keď sonda bude hybridizovať k zmenenej cieľovej sekvencii a keď zmienená sonda obsahuje reaktívnu molekulu, ktorá absorbovať fluorescenciu alebo dodať energiu zmienenému fluorescenčné značenému nukleotidu a (c) monitorovať fluoresncencie zmienenej vzorky.
Pri použití analýzy tohto typu sa fluorescenčná značka inkorporuje iba do amplifikačného produktu. Keď sonda hybridizuje s akoukoľvek špecifickou cieľovou sekvenciou, vzniknutou ako výsledok amplifikačnej reakcie, reaktívna molekula absorbuje vyžarovanú energiu z označeného nukleotídu, alebo odovzdá energiu značenému nukleotídu vďaka FET alebo FRET a zmení signál z fluorescenčného nukleotídu. Je vhodné, keď je reaktívna molekula schopná absorbovať fluorescenciu z označeného nukleotídu a tak je jeho fluorescencia redukovaná. Táto redukcia sa môže detekovať a to svedčí o naviazaní sondy.
Ešte výhodnejšie je, keď je reaktívna molekula akceptorovou molekulou, ktorá emituje fluorescenciu s charakteristickou vlnovou dĺžkou. V tomto prípade zvýšenie fluorescencie z akceptorovej molekuly, ktorá má odlišnú vlnovú dĺžku ako z označeného nukleotídu, tiež ukazuje naviazanie sondy.
Prítomnosť takto značeného amplifikačného produktu sa môže detekovať monitorovaním fluorescencie akceptorovej molekuly na sonde, ktorá sa špecificky viaže iba na cieľovú sekvenciu. V tomto prípade sa môže signál z amplifikovaného produktu odlíšiť od signálu pozadia fluorescenčnej značky a tiež od akéhokoľvek nešpecifického amplifikačného produktu.
Fakt, že signál čiastočne spojený s amplifikačným produktorom a čiastočne spojený so sondou znamená, že systém je vysoko špecifický čo sa týka detekcie špecifických cieľových sekvencii v reakčných zmesiach, ktoré obsahujú veľké množstvo vnesenej DNA. Je to tak preto, že signál z nešpecifických amplifikačných produktorv sa môže od nameraného signálu účinne eliminovať.
Test tohto druhu sa môže uskutočňovať s použitím lacných reagencií. Sondy označené jednou značkou sú ekonomickejšie v porovaní s tými, ktoré majú ako akceptorové, tak donorové molekuly.
Tu používaný výraz „sada nukleotidov sa vzťahuje k skupine nukleotidov, ktoré sú postačujúce na tvorbu nukleovej kyseliny, ako DNA alebo RNA. Jedná sa o adenosin, cytosin, quanín a tymín alebo uracil. Jeden z nich (alebo aj viac) je fluorescenčné označený. Označený uracil je dostupný od firmy Boehringer Mannheim. Medzi vhodné fluorescenčné farbivá patrí fluoresceín.
Použitie označeného uracilu môže byť najmä výhodné z hľadiska stratégie prevencie kontaminácie alebo ochrany pred prenosom (amplikónov) z jednej amplifikačnej reakcie na nasledujúce uskutočňované v reakčných skúmavkách. V inkubačnom kroku pred amplifikáciou sa môžu použiť enzýmy, ktoré rozštiepia nukleovú kyselinu obsahujúcu uracil, . ako napríklad uracil-N-glykosyláza; tým sa zaistí, že akékoľvek zbytky amplikónov (z predchádzajúcich amplifikácii) sú pred započatím následného teplotného cyklovania rozložené.
Je vhodné, keď je viac ako jeden nukleotíd, a najlepšie keď sú všetky nukleotídy označené, čím sa zvýši hladina signálu z amplifikovaného produktu a teda PET alebo FRET signál.
Amplifikácia sa uskutoční podľa známych amplifikčných reakcií, ako je polymerázová reťazová reakcia- PCR, lignázová reťazová reakcia -LCR (lignase chain reaction), SDA (strand displaceent assay) alebo NASBA, ale predovšetkým PCR.
Je vhodné, keď sa monitoruje fluorescencia ako nukleotidu, tak akceptorovej molekuly a prepočíta sa vzťah medzi emisiami.
Vhodnými reakčnými molekulami (ako akceptorové molekuly) sú rodamínové farbivá, alebo iné farbivá, ako Cy5. Tie sa môžu pripojiť k sonde obvyklým spôsobom. Pozícia reaktívnej molekuly v sonde nie je dôležitá, aj keď obecne sa umiestňujú v koncovej oblasti sondy.
Aby dochádzalo k FET (napríklad FRET) medzi reaktívnou molekulou a fluorescenčnou emisiou nukleotídov, musí byť fluorescenčná emisia prvku (reaktívnej molekuly alebo značeného nukleotidu), ktorý pôsobí ako donor s kratšou vlnovou dĺžkou, ako akceptového prvku.
Vhodné kombinácie sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.
Donor
SYBRGold
SYBRGreen I SYBERGold
SYBRGreen I
Fluorescein
Akceptor rodamín rodamín
Cy5
Cy5 etidium bromid
Uprednostňuje sa, keď molekuly použité ako donor/alebo akceptor vytvárajú ostré piky, a keď je presah emisných vlnových dĺžok malý alebo žiadny. Za týchto podmienok nemusí byť nutné odlíšiť „pik špecifický pre reťazec od signálu vytvoreného amplifikačným produktom. Jednoduché meranie samotného signálu špecifického pre reťazec (t.j. toho, ktorý je poskytovaný reaktívnou molekulou) poskytne informáciu o rozsahu FET alebo FRET spôsobenej cieľovou reakciou.
môže splniť kombinácia etidium V tomto prípade bude prameňovo špecifická reakcia kvantifikovateľná zmenšením fluorescencie pri 520 nm, najlepšie vyjadrená ako 1/fluorescencia.
Túto požiadavku bromid/fluórescein.
Keď ale dochádza na presah spektier fluorescenčného signálu z donorových a akceptorových molekúl, môže sa táto hodnota vo výsledku vyjadriť, napríklad empirickým určením vzťahu medzi spektrami a použitím tohto vzťahu na rozlíšenie (jednotlivých) signálov z dvoch signálov.
Metóda vynálezu je extrémne verzatllná čo sa týka aplikácií. Metóda sa môže použiť ako na vytváranie kvantitatívnych, tak kvalitatívnych údajov o nukleovej kyseline s cieľovou sekvenciou vo vzorke, ako je rozvedené ďalej. Vynález neposkytuje iba amplifikačná kvantitatívne údaje,ale môže sa tiež použiť (alebo samostatne alebo doplnkovo) na získanie charakteristických údajov, ako napríklad o teplote destabilizácie duplexu alebo bodoch rozpúšťania) .
V metóde vynálezu môže byť vzorka vystavená podmienkam, za ktorých sonda hybridizuje so vzorkami počas, alebo po skončení amplifikačnej reakcie. Proces umožňuje uskutočnenie detekcie rovnakým spôsobom, pretože amplifikácia a monitorovanie sa môže uskutočňovať v jednej reakčnej skúmavke, pričom sa všetky reagenčné činidlá môžu pridať na začiatku. Nie je potrebný žiaden ďalší krok pridania činidiel. Nie je tu tiež žiadna nutnosť uskutočňovať metódu za prítomnosti pevného nosiča (aj keď táto možnosť existuje, ako je diskutované ďalej).
Napríklad keď je sonda prítomná počas amplifikačnej reakcie, môže fluorescenčný signál monitorovať priebeh amplifikačnej reakcie. Týmto spôsobom sa môže kvantifikovať množstvo cieľovej sekvencie prítomnej vo vzorke.
Počas každého cyklu amplifikačnej reakcie sa pramene amplikónu, obsahujúce cieľovú sekvenciu, viažu so sondou a tak sa vytvorí akceptorový signál. Ako sa množstvo amplikónu vo vzorke zvyšuje, tak vzrastá signál akceptora. Vynesením rýchlosti vzrastu oproti cyklom sa môže určiť počiatočný bod tohto vzrastu.
Sonda môže obsahovať molekulu nukleovej kyseliny, ako DNA alebo RNA, ktorá bude hybridizovať s cieľovou sekvenciou nukleovej kyseliny, keď je táto cieľová sekvencia nukleovej kyseliny v jednoraťazcovej forme. V tomto prípade krok b)bude zahŕňať použitie podmienok, ktoré zaistia, aby bola cieľová nukleová kyselina jednoreťazcové. Sonda tiež môže obsahovať molekulu napríklad nukleovej kyseliny peptidu (peptide nucleic acid), ktorá sa viaže špecificky na cieľovú sekvenciu v dvojreťazcovej forme.
Použitá amplifikačná reakcia bude najmä zahŕňať krok vystavenia vzorky podmienkam, keď všetky cieľové sekvencie nukleovej kyseliny vo vzorke budú jednopramenné, ako napríklad pri PCR alebo LCR.
Sonda potom môže hybridizovať amplifikačnej reakcie za predpokladu, vhodné hybridizačné podmienky.
počas priebehu že sa vyskytnú
V preferovanom prípade môže byť sonda navrhnutá tak, že sa tieto podmienky vyskytnú počas každého cyklu amplifikačnej reakcie. V určitý okamih každého cyklu amplikakačnej reakcie tak sonda bude hybridizovať k cieľovej sekvencii a vytvárať signál ako výsledok FET alebo FRET. Ako amplifikácia postupuje, sonda sa uvoľní alebo teplotné uvoľní z cieľovej sekvencie a signál produkovaný reaktívnou molekulou sa alebo zoslabí alebo zvýši v závislosti na tom, ak obsahuje donorovú alebo akcpetorovú molekulu. Keď sa napríklad jedná o akceptor, v každom cykle amplifikačnej reakcie sa tvorí fluorescenčný pik z reatívnej molekuly. Ako amplifikácia pokračuje, intenzita piku sa zvýši, pretože je viac a viac dostupných cieľových sekvencii na naviazanie sondy.
Sledovaním' fluorescencie reaktívnej molekuly vo vzorke počas každého cyklu sa môže rôznymi spôsobmi monitorovať postup amplifikačnej reakcie. Napríklad sa môžu analyzovať údaje poskytnuté pikmi rozpúšťania, napríklad prepočtom plochy pod pikmi rozpúšťania a vynesením týchto dát proti počtu cyklov.
Fluorescencia sa vhodne monitoruje využitím známeho fluorimetra. Ich signál, napríklad vo forme elektrického napätia fotonásobiča, sa posiela do modulu spracovávajúceho dáta a prevádza sa na spektrum spojené s každou vzorkou. Súčasne sa môže hodnotiť viac vzoriek, napríklad 96. Dáta sa týmto spôsobom môžu získavať .v opakovaných intervaloch, napríklad každých 10 ms, počas celej reakcie.
Spektra generované týmto spôsobom sa môžu rozlíšiť napríklad s využitím „shod (fits) napred vybraných fluorescenčných zložiek, ako napríklad farbív, aby sa vytvorili zástupcovia pikov každej signálnej zložky, (t.j. nukleotidovéj značky a/alebo reaktívnej molekuly). Môžu sa určiť plochy pod pikmi, ktoré reprezentujú hodnotu intenzity každého signálu, a ak sa to požaduje, môžu sa vyjadriť ako vzájomný podiel. Rozdiel intenzít signálu a/alebo pomery umožnia zaznamenať zmeny FET alebo FRET počas reakcie alebo za odlišných reakčných podmienok, napríklad teplôt. Ako je naznačené vyššie, zmeny a vzťahujú k vzniku väzby medzi sondou a cieľovou sekvenciou. Integrál plochy pod odlišnými pikmi umožní výpočet hodnoty intenzity FET alebo FRET.
Tieto údaje poskytujú jeden spôsob kvantifikácie množstva cieľovej nukleovej vzorke.
kyseliny prítomnej vo voľne v roztoku alebo Tou môže byť napríklad magnetických gulôčiek
Sonda môže byť alebo imobilizovaná na pevnú fázu. povrch gulôčiek, napríklad používaných v separačných výrobkoch, alebo povrch detektora zariadenia, napríklad vlnovodu plazmonového rezonančného detektora (wavequide of a surface plasmon resonance detector). Výber bude záležať na povahe daného sledovaného testu a na konkrétnych použitých detekčných spôsoboch.
Sonda môže byť navrhnutá tak, že je hydrolyzovaná DNA polymerázou použitou pri amplifikačnej reakcii, čim sa uvoľni akceptorová molekula. Tým vznikne kumulatívny signál, keď sa množstvo reaktívnej molekuly prítomné v systéme každým cyklom zvyšuje. Nie je ale nutné, aby pri tomto teste bola sonda rozložená týmto spôsobom, pretože signál nezávisí, od hydrolýzy sondy.
, Aby sa získal celkom reverzibilný signál, ktorý je priamo úmerný množstvu amplifikovaného produktu prítomného v každej fáze reakcie a/alebo kde je najdôležitejšia rýchlosť reakcie, napríklad v rýchlej PCR, je žiadúce, keď je sonda navrhnutá tak, že sa uvoľní neporušená z cieľovej sekvencia tak sa môže opäť zúčasniť reakcie. Tak to môže byť napríklad počas fázy predlžovania reťazca pri amplifikačnej reakcii. Pretože ale signál nezávisí od hydrolýzy sondy, môže byť sonda navrhnutá tak, že sa hybridizuje a uvoľní z cieľovej sekvencie v akejkoľvek časti amplifikačného cyklu, vrátane nasadania primerov alebo denaturačnej fázy reakcie. Takéto sondy zaistia, že interferencia s amplifikačnou reakciu je minimalizovaná.
Keď sa používajú sondy, ktoré sa viažu počas fázy predlžovania, môže sa ich uvoľnenie v nepoškodenom stave dosiahnuť použitím enzýmu bez 5'3'exonukleázovej aktivity, ako je Stoffelov fragment Taq alebo Pwo. To môže byť užitočné, keď je nevyhnutná rýchla PCR, pretože sa vynechajú hydrolyzačné kroky.
Keď sa používajú týmto spôsobom, je dôležité zaistiť, že sa sonda nebude predlžovať počas predlžovacej fázy reakcie. 3'koniec sondy sa teda vhodne blokuje fosforyláciou.
Dáta získané týmto spôsobom sa môžu interpretovať rôznymi spôsobmi. V najjednoduchšej forme je vzrast fluorescencie akceptorovej molekuly v priebehu, alebo na konci amplifikačnej reakcie ukazovateľom vzrastu množstva prítomnej cieľovej sekvencie. Naznačuje fakt, že prebehla amplifikačná reakcia a že teda bola cieľová sekvencia prítomná vo vzorke.Ako je ale naznačené vyššie, kvantifikácia je tiež možná monitorovaním amplifikačnej reakcie v jej priebehu. Nakoniec je tiež možné získať charakteristické dáta a najmä analýzu teplôt rozpúšťania alebo na konci amplifikácie alebo v jej priebehu s cielom získať informácie o sekvencii, ako to bude diskutované ďalej.
Preferovaná forma vynálezu zahŕňa metódu na detekciu amplifikácie nukleovej kyseliny, ktorá zahŕňa:
amolifikáciu nukleovej kvseiiny ní lovom polynukleotíde za prítomnosti a) polymerázy nukleovej kyseliny b) aspoň jedného primeru schopného hybridizovať s daným cieľovým polynukleotídom c) sadou z ktorých je aspoň jeden fluorescenčné oligonukleotidovou sondou, ktorá je k danej cieľovej polynukleotídovej sekvencii a ktorá obsahuje reaktívnu molekulu, ktorá je schopná absorbovať fluorescenciu z daného označeného nukleotídu alebo odovzdanie fluorescencie danému označenému nukleotídu, a sledovanie zmien vo nukleotidov, označený a d) schopná väzby fluorescencii počas amplifikačnej reakcie. Je vhodné, keď je reaktívna molekula akceptorovou molekulou, ktorá môže absorbovať energiu z označeného nukleotídu.
Amplifikácia se výhodne uskutočňuje pomocou páru primérov, ktoré sú navrhnuté tak, že je amplifikovaná iba cieľová nukleotidová sekvencia na DNA prameni. To je odborníkom bežne známe.Polymerázou nukleovej kyseliny je najlepšie termostabilná polymeráza ako napríklad Taq polymeráza.
Odborníkom sú dobre známe vhodné podmienky, pri ktorých sa môže uskutočňovat amplifikácia. Optimálne podmienky môžu byť rôzne, vždy závislé na danom amplikóne, povahe použitých primérov a použitom enzýme. Optimálne podmienky môže určiť pre každý prípad skúsený pracovník. Typická denaturačná teplota je zhruba 95° C, typická teplota na nasadanie primérov je okolo 55° C a teplota predlžovania reťazca je okolo 72° C.
V určitej forme vynálezu sa môže sonda použiť na kvantifikáciu RNA transkriptov, napríklad v expresných experimentoch, ktoré sa môžu využívať pri liľadanx liekov. Zvlášť je tento prípad vhodný na expresné štúdie v pletivoch eukaryontných orgánov. DNA kódujúce proteíny v eukaryontných bunkách môže obsahovať intróny, nekódujúce oblasti DNA sekvencie, a exóny, ktoré kódujú proteínové sekvencie. Nekódujúce intrónové sekvencie sa z RNA sekvencie (ktorá je odvodená od DNA sekvencie) odstránia počas bunečného procesu „zostrihu. PCR primery sú normálne navrhnuté na kódujúcu oblasť a keď sa uskutočňuje PCR reverznou transkripciou s celkovým extraktom nuleových kyselín, výsledné produkty budú odvodené ako od amplifikácie DNA, tak od amplifikácie RNA. Preto keď sa použije na expresné štúdie samotná PCR, dostaneme výsledky z genómovej DNA a exprimovanej RNA.
Sonda, ktorá je navrhnutá tak, aby sa viazala cez intróny na odlehlej koncovej oblasti kódujúcich exónov, bude mať obmedzenú interakciu vďaka oblasti intrónu. Zostrihnutá RNA bude mať tieto oblasti odstránené a preto odľahlé koncové oblasti kódujúcich exónov tvoria jednu súvislú sekvenciu umožňujúcu účinné naviazanie sondy.
Naopak sonda môže detekovať iba amplifikačný produkt genómovej DNA keď je navrhnutá tak, že sa viaže na intrónovú oblasť. Signál vytvorený takouto sondou by sa vzťahoval iba na DNA koncentráciu a nie RNA koncentráciu vo vzorke.
V ďalšej forme vynálezu, je teda sonda špecifická alebo pre oblasť zostrihu RNA alebo intrón v DNA, takže je detekovaná a/alebo kvantifikovaná alebo iba amplifikovaná RNA alebo amplifikovaná DNA.
Pripadne (alebo naviac) sa môže metóda vynálezu použiť v hybridizačných testoch na určenie charakteristík sekvencie. Vynález teda v ďalšom aspekte poskytuje metódu na určenie charakteristiky sekvencie, pričom daná metóda zahŕňa a) amplifikáciu danej sekvencie s využitím sady nukleotidov, z ktorých je aspoň jeden fluorescenčné označený b) reakciu amplifikačného produktu so sondou za podmienok, keď sa bude sonda hybridizovať k danej cieľovej sekvencií, pričom daná sonda obsahuje reaktívnu molekulu, ktorá je schopná alebo absorbovať z, alebo odovzdať fluorescenčnú energiu danému fluorescenčné označenému nukleotidu a c) monitorovaním fluorescencie danej vzory a určením konkrétnej reakčnej podmienky, charakteristickej pre danú sekvenciu, keď sa mení fluorescencia, ako výsledok hybridizácie sondy k vzorke alebo destabilizácia duplexu tvoreného medzi sondou a sekvenciou cieľovej nukleovej kyseliny.
Vhodné reakčné podmienky zahŕňajú teplotu, elektrochémiu, alebo odpoveď na prítomnosť určitých zmien týchto enzýmov alebo chemikálií, fluorescencie v závislosti na vlastností sa môžu získať informácie charakterizujúce presne vlastnosti sekvencie. Napríklad v prípade teploty - môže sa určiť napríklad teplota, pri ktorej sa sonda uvoľní od sekvencii vo vzorke ako reakcia na zohrievanie. To môže byť mimoriadne užitočné napríklad na detekciu (a keď je to potrebné aj pre kvantifikáciu) polymorfizmov a/alebo alelického variantu pri Pod „polymorfizmy' inzercia, delécia genetických diagnózach, tranzica, transverzia, inverzia, dochádzať
Sledovaním variabilite patrí alebo ku ktorým môže prirodzene v sekvenciách
Oneskorenie rozpúšťania bude odlišné, ak sa bude cieľová sekvencia odlišovať napríklad iba jedným nukleotídom. Ak teda bude vzorka obsahovať iba jeden alelický variant, teplota rozpúšťania sondy bude mať určitú hodnotu, ktorá bude odlišná od tej, ktorú bude mať vzorka, ktorý obsahuje iba iný alelický variant. Vzorka, obsahujúca obidva alelické varianty bude vykazovať dva body rozpúšťania, zodpovedajúce každému alelickému variantu. Podobné úvahy platia čo sa týka elektrochemických vlastností alebo v prítomnosti určitých enzýmov alebo chemikálií. Sonda môže byť imobilizovaná na pevnom povrchu, na ktorý sa môže aplikovať elektrochemický potenciál. Sonda sa bude viazať alebo bude odpudzovaná od cieľovej sekvencie pri určitých elektrochemických hodnotách závisiacich na presnej povahe sekvencie.
Naviac umožní kynetika hybridizáciu sondy určenia koncentrácie cieľovej sekvencie (v absolútnom označení) . Zmeny vo fluorescencii vzorky umožňujú výpočet rýchlosti hybridizácie sondy k vzorke,
Zvýšenie množstvo koncentrácia amplifikáciou hybridizáciu rýchlosti cieľovej cieľovej zvyšuj e, hybridizácie sa bude vzťahovať sekvencie vo vzorke. Ako sa sekvencií s pokračujúcou bude dochádzať na rýchlejšiu sondy. Tento parameter teda môže byť tiež použitý ako základ pre kvantifikáciu. Tento spôsob spracovania dát je užitočný preto, že informácie nezávisia na intenzite signálu.
Ďalšie aspekty vynálezu zahŕňajú kity na použitie metódou vynálezu. Tieto kity budú obsahovať sondu špecifickú pre cieľovú nukleotídcvú reaktívnu molekulu, najmä Ak je to žiaduce, sonda sekvenciu, ktorú akceptorovú môže byť na guľôčky alebo nosič použitý vlnovod detektora obsahuje molekulu.
imobilizovaná na nosič, ako (napríkad magnetické guľôčky) v detektore, ako napríklad zanikajúcich vín (wavequide of an evanescent wave detector device).
napríklad
Naviac môžu kity obsahovať jeden alebo viac fluorescenčné označených nukleotidov, ktorý je/ktoré sú kompatibilné so zmienenou reaktívnou molekulou. Medzi ďalšie potencionálne komponetny kitov patria reagencie použité pri amplifikačnej reakcii, ako napríklad DNA polymeráza.
Ί-VííJacly usLu£t?cíT<.nxťa t/yníle-ža>
Vynález bude ďalej opísaný najmä na príkladoch s odkazom na sprevádzajúce schematické nákresy, kde značí:
Obr.1 ukazuje schematicky interakcie uplatňujúce sa v metóde vynálezu.
V ilustrácii amplikačnej reakcie je DNA molekula (1) pripravená na amplifikáciu vďaka prítomnosti páru primerov (2, 3) a sady nukleotidov (4), z ktorých sú niektoré označené fluorescenčnou značkou (5) . DNA molekula (1) sa uvedie do jednoraťazcového stavu (obr.lB), keď sa priméry (2,3) naviažu známym spôsobom ako spätný (reverse) a dopredný (forward) primer v amplifikačnéj reakcii.
Počas priebehu nasledujúcej amplifikačnéj reakcie vzniká produkt-amplikon (6) (obr.lC). Do vznikajúceho produktu sa inkorporujú ako označené, tak neoznačené Pri normálnej amplifikácii obsahuje produkt (6) iba cieľovú sekvenciu nukleotidy.
amplikonový definovanú primerami.
Keď sa amplifikácie akceptorovú sekvenciu tento produkt denaturuje, molekulu (8) (obr.ID). Pri počas nasledujúcej fázy sonda (7) obsahujúca sa naviaže na cieľovú
FRET interakcii medzi fluorescenčným nukleotídom a akceptorovou molekulou (8) vznikne signál s vlnovou dĺžkou charakteristickou pre akceptor.
Signál akceptora (8) sa môže monitorovať konvenčnými fluorescenčnými detekčnými zariadeniami.
Claims (18)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Metóda na detekciu prítomnosti sekvencie cieľovej nukleovej kyseliny vo vzorke, pričom zmienená metóda zahŕňa a) vystavenie zmienenej vzorky amplifikačnej reakcii s využitím sady nukleotidov, z ktorých je aspoň jeden fluorescenčné označený b) kontakt amplifikačného produktu so sondou za podmienok, keď bude sonda hybridizovať so zmienenou cieľovou sekvenciou, pričom zmienená sonda obsahuje reaktívnu molekulu, ktorá je schopná absorbovať fluorescenciu zo zmieneného fluorescenčné označeného nukleotídu, alebo odovzdať fluorescenčnú energiu zmienenému fluorescenčné označenému nukleotídu a c) sledovanie fluorescencie zmienenej vzorky.
- 2. Metóda podľa nároku 1, kde reaktívna molekula absorbuje fluorescenciu zo zmieneného fluorescenčné označeného nukleotídu.
- 3. Metóda podľa nároku 2, kde je reaktívna molekula akceptorovou molekulou, ktorá emituje energiu s charakteristickou vlnovou dĺžkou.
- 4. Metóda podľa nároku 3, kde je akceptorová molekula rodamínové farbivo alebo iné farbivá, ako Cy5.
- 5. Metóda podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde je označeným nukleotídom označený uracil.
- 6. Metóda podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sú všetky nukleotídy použité pri amplifikácii označené.
- 7. Metóda podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde amplifikačná reakcia zahŕňa polymerázovú reťazcovú reakciu (PCR).
- 8. Metóda podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sa sleduje fluorescencia ako označeného nukleotídu, tak reaktívnej molekuly a vypočíta vzťah ich vyžarovania.
- 9. Metóda podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde je sonda prítomná pri amplifikačnej reakcii.
- 10. Metóda podľa nároku 9, kde sa sleduje fluorescenčný signál a výsledky sa použijú na kvantifikáciu množstva cieľovej sekvencie prítomnej vo vzorke.
- 11. Metóda podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde je sonda navrhnutá tak, že je pri amplifikačnej reakcii hydrolyzovaná DNA polymerázou, použitou pri amplifikácii.
- 12. Metóda podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, kde je sonda navrhnutá tak, že je vo fáze predlžovania reťazca pri amplifikačnej reakcii uvoľnená od cieľovej sekvencie neporušená.Metóda podľa nároku 12, reakcia uskutočňuje s využitím 3 ' exonukleázovej aktivity.kde sa amplifikačná enzýmu bez 5'MetódaStofflov fragment podľa nároku 13, kde je enzýmom (Stoffle fragment) Taq alebo Pwo.
- 15. Metóda podlá ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 15, kde je 3' koniec sondy blokovaný fosforyláciou.
- 16. Metóda detekcie amplifikácie nukleovej kyseliny zahŕňajúca: amplifikáciu nukleovej kyseliny na cieľovom polynukleotíde za prítomnosti a) polymerázy nukleovej kyseliny b) aspoň jedného primeru schopného hybridizovať so zmieneným cieľovým polynukleotídom c) sady nukleotidov, z ktorých je aspoň jeden fluorescenčné označený a d) oligonukleotídovej sondy, ktorá je schopná väzby k danej cieľovej polynukleotídovej sekvencii a ktorá obsahuje reaktívnu molekulu, ktorá je schopná absorbovať fluorescenciu zo zmieneného označeného nukleotidu alebo odovzdať fluorescenčnú energiu zmieneému označenému nukleotidu; a sledovanie zmien vo fluorescencii počas amplifikačnej reakcie.
- 17. Metóda podľa nároku 16, kde sa amplifikácie.uskutočňuje s využitím páru primerov, ktoré sú navrhnuté tak, že je amplifikovaná iba cieľová nukleotídová sekvencia na DNA reťazci.
- 18. Metóda podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde je sonda špecifická alebo pre oblasť zostrihu RNA alebo intrón v DNA, takže sú detekované a/alebo kvánti fi kované alebo iba amplifi kovaná RNA alebo amplifikovaná DNA.
- 19. Metóda na určenie charakteristiky sekvencie, pričom zmienená metóda zahŕňa a) amplifikáciu zmienenej sekvencie s využitím sady nukleotidov, z ktorých je aspoň jeden fluorescenčné označený, b) reakciu amplifikačného produktu so sondou, za podmienok, keď dôjde na hybridizáciu sondy k zmienenej cieľovej sekvencii, pričom zmienená sonda obsahuje reaktívnu molekulu, ktorá je schopná absorbovať fluorescenčnú energiu zo zmieneného fluorescenčné označeného nukleotídu alebo odovzdať energiu fluorescenčné označenému nukleotídu a c) fluorescencie zmienenej vzorky a určením konkrétnej reakčnej podmienky, vlastnosti zmienenej sekvencie, keď sa mení fluorescencia ako výsledok hybridizácie sondy k vzorke alebo destabilizácia duplexu tvoreného medzi sondou a cieľovou sekvenciou nukleovej kyseliny.zmienenému sledovanie
- 20. Metóda na detekciu polymorfizmov a/alebo alelických variant, pričom zmienená metóda zahŕňa amplifikáciu sekvencie s predpokladaným zmieneným polymorfizmom alebo variantom s využitím metódy definovanej v nároku 1, meranie teploty, keď sa sonda uvoľní od amplifikovaného produktu s využitím produkovaného fluorescenčného signálu a vztiahnutím tohto signálu k prítomnosti polymorfizmu alebo alelického variantu.Súprava na použitie v metóde ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorá obsahuje sondu špecifickú s reaktívnou nukleotíd, na cieľovú molekulou a nukleotidovú fluorescenčné ktorý je kompatibilný so sekvenciu označený zmienenou reaktívnou molekulou.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9803382.2A GB9803382D0 (en) | 1998-02-19 | 1998-02-19 | Detection system |
| PCT/GB1999/000504 WO1999042611A1 (en) | 1998-02-19 | 1999-02-18 | Method for detection of target nucleic acids using pcr |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK12212000A3 true SK12212000A3 (sk) | 2002-09-10 |
Family
ID=10827164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1221-2000A SK12212000A3 (sk) | 1998-02-19 | 1999-02-18 | Metóda na detekciu cieľovej nukleovej kyseliny pomocou PCR |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6287781B1 (sk) |
| EP (1) | EP1055002B1 (sk) |
| JP (1) | JP2003512808A (sk) |
| CN (1) | CN1203186C (sk) |
| AT (1) | ATE398187T1 (sk) |
| AU (1) | AU746149B2 (sk) |
| CA (1) | CA2321185C (sk) |
| CZ (1) | CZ20002958A3 (sk) |
| DE (1) | DE69938894D1 (sk) |
| GB (4) | GB9803382D0 (sk) |
| HU (1) | HU226518B1 (sk) |
| IL (1) | IL137909A0 (sk) |
| NZ (1) | NZ506333A (sk) |
| RU (1) | RU2199588C2 (sk) |
| SK (1) | SK12212000A3 (sk) |
| WO (1) | WO1999042611A1 (sk) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9725197D0 (en) * | 1997-11-29 | 1998-01-28 | Secr Defence | Detection system |
| GB9918237D0 (en) * | 1999-08-04 | 1999-10-06 | Secr Defence | Detection system |
| GB0005281D0 (en) * | 2000-03-07 | 2000-04-26 | Secr Defence | Analytical method |
| GB2360088A (en) * | 2000-03-07 | 2001-09-12 | Secr Defence | Method and kit for determining PCR amplification reaction conditions |
| EP1354064A2 (en) | 2000-12-01 | 2003-10-22 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
| GB0110501D0 (en) | 2001-04-30 | 2001-06-20 | Secr Defence Brit | Amplification process |
| ATE408710T1 (de) * | 2001-05-07 | 2008-10-15 | Mayo Foundation | Nachweis von legionella durch ein pcr und fret verwendendes verfahren |
| GB0111275D0 (en) | 2001-05-09 | 2001-06-27 | Secr Defence | Analytical method and kit |
| GB0112868D0 (en) * | 2001-05-25 | 2001-07-18 | Secr Defence | Detection system |
| US9261460B2 (en) | 2002-03-12 | 2016-02-16 | Enzo Life Sciences, Inc. | Real-time nucleic acid detection processes and compositions |
| US6593093B1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-07-15 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of group a Streptococcus |
| US9353405B2 (en) * | 2002-03-12 | 2016-05-31 | Enzo Life Sciences, Inc. | Optimized real time nucleic acid detection processes |
| DE60334132D1 (de) * | 2002-05-31 | 2010-10-21 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | Neues verfahren zum testen von nukleinsäure unter verwendung von markiertem nukleotid |
| WO2003102239A2 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Secretary, Department Of Atomic Energy | Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands |
| US7183104B1 (en) | 2002-08-23 | 2007-02-27 | Duane Morris Llp | Separator and particle detection system |
| US7074598B2 (en) * | 2002-09-25 | 2006-07-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of vancomycin-resistant enterococcus spp. |
| WO2004074447A2 (en) * | 2003-02-18 | 2004-09-02 | Applera Corporation | Compositions and methods for multiplex analysis of polynucleotides |
| GB0304832D0 (en) | 2003-03-04 | 2003-04-09 | Secr Defence | Assay method |
| EP1641938A2 (en) * | 2003-06-30 | 2006-04-05 | AstraZeneca AB | Nucleic acid polymerase fluorescence assays |
| GB0416944D0 (en) | 2004-07-29 | 2004-09-01 | Lumora Ltd | Method for determining the amount of template nucleic acid present in a sample |
| GB0503172D0 (en) | 2005-02-16 | 2005-03-23 | Enigma Diagnostics Ltd | Detection method |
| GB0517005D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Enigma Diagnostics Ltd | Analytical method and kit |
| RU2005132940A (ru) * | 2006-03-01 | 2007-11-27 | Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (RU) | Способ детекции специфических фрагментов днк или рнк с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
| BRPI0709282B8 (pt) | 2006-03-29 | 2021-05-25 | Merial Ltd | vacina contra estreptococos |
| GB0806676D0 (en) | 2008-04-12 | 2008-05-14 | Environment Agency The | Environmental monitoring |
| EP2116614A1 (en) * | 2008-05-06 | 2009-11-11 | Qiagen GmbH | Simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction |
| EP2138588A1 (en) * | 2008-06-23 | 2009-12-30 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Melting curve measurement during amplification |
| WO2011022589A2 (en) * | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of enterovirus |
| GB0915664D0 (en) | 2009-09-08 | 2009-10-07 | Enigma Diagnostics Ltd | Reaction method |
| RU2585519C2 (ru) * | 2012-11-28 | 2016-05-27 | ЗАО "Геноаналитика" | Способ селективного отбора целевых участков днк |
| RU2681822C2 (ru) * | 2014-09-26 | 2019-03-12 | Ту Пор Гайс, Инк. | Детекция целевой последовательности путем нанопорового сенсорного обнаружения синтетических зондов |
| US11486873B2 (en) | 2016-03-31 | 2022-11-01 | Ontera Inc. | Multipore determination of fractional abundance of polynucleotide sequences in a sample |
| RU2665631C2 (ru) * | 2017-01-25 | 2018-09-03 | Общество с ограниченной ответственностью "Секвойя Дженетикс" | Способ специфической идентификации последовательностей днк |
| CN108642150B (zh) * | 2018-05-18 | 2023-12-08 | 阅尔基因技术（苏州）有限公司 | 一种基于fret的荧光核酸检测方法和试剂盒 |
| US11604186B2 (en) * | 2018-10-17 | 2023-03-14 | Molecular Devices (Austria) GmbH | Real time western blot assays utilizing fluorescence resonance energy transfer (FRET) |
| JP7482795B2 (ja) | 2018-12-21 | 2024-05-14 | イルミナ インコーポレイテッド | 感知システム |
| CN109576350B (zh) * | 2019-01-18 | 2021-01-29 | 深圳恒特基因有限公司 | 一种dna与rna同时定量的试剂盒、方法及质控方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5567583A (en) | 1991-12-16 | 1996-10-22 | Biotronics Corporation | Methods for reducing non-specific priming in DNA detection |
| WO1996034983A1 (en) | 1995-05-05 | 1996-11-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay |
| US5716784A (en) * | 1996-02-05 | 1998-02-10 | The Perkin-Elmer Corporation | Fluorescence detection assay for homogeneous PCR hybridization systems |
| ATE295427T1 (de) | 1996-06-04 | 2005-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
| US5866336A (en) * | 1996-07-16 | 1999-02-02 | Oncor, Inc. | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US6140054A (en) * | 1998-09-30 | 2000-10-31 | University Of Utah Research Foundation | Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes |
-
1998
- 1998-02-19 GB GBGB9803382.2A patent/GB9803382D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-02-03 GB GBGB9902290.7A patent/GB9902290D0/en not_active Ceased
- 1999-02-18 CN CNB998051985A patent/CN1203186C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-02-18 WO PCT/GB1999/000504 patent/WO1999042611A1/en active IP Right Grant
- 1999-02-18 IL IL13790999A patent/IL137909A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-02-18 SK SK1221-2000A patent/SK12212000A3/sk unknown
- 1999-02-18 DE DE69938894T patent/DE69938894D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-18 GB GBGB9903578.4A patent/GB9903578D0/en not_active Ceased
- 1999-02-18 CZ CZ20002958A patent/CZ20002958A3/cs unknown
- 1999-02-18 CA CA002321185A patent/CA2321185C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-02-18 US US09/622,426 patent/US6287781B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-18 AU AU25383/99A patent/AU746149B2/en not_active Ceased
- 1999-02-18 HU HU0101385A patent/HU226518B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-02-18 RU RU2000124099/13A patent/RU2199588C2/ru active
- 1999-02-18 AT AT99905085T patent/ATE398187T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-02-18 JP JP2000532551A patent/JP2003512808A/ja active Pending
- 1999-02-18 NZ NZ506333A patent/NZ506333A/xx unknown
- 1999-02-18 EP EP99905085A patent/EP1055002B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-19 GB GBGB9903796.2A patent/GB9903796D0/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1055002B1 (en) | 2008-06-11 |
| AU2538399A (en) | 1999-09-06 |
| DE69938894D1 (de) | 2008-07-24 |
| IL137909A0 (en) | 2001-10-31 |
| HU226518B1 (en) | 2009-03-30 |
| ATE398187T1 (de) | 2008-07-15 |
| WO1999042611A1 (en) | 1999-08-26 |
| NZ506333A (en) | 2002-10-25 |
| GB9902290D0 (en) | 1999-03-24 |
| AU746149B2 (en) | 2002-04-18 |
| GB9803382D0 (en) | 1998-04-15 |
| CA2321185C (en) | 2009-04-21 |
| GB9903796D0 (en) | 1999-04-14 |
| CA2321185A1 (en) | 1999-08-26 |
| GB9903578D0 (en) | 1999-04-07 |
| HUP0101385A2 (hu) | 2001-08-28 |
| US6287781B1 (en) | 2001-09-11 |
| EP1055002A1 (en) | 2000-11-29 |
| HUP0101385A3 (en) | 2003-08-28 |
| CN1203186C (zh) | 2005-05-25 |
| JP2003512808A (ja) | 2003-04-08 |
| CZ20002958A3 (cs) | 2002-02-13 |
| CN1297488A (zh) | 2001-05-30 |
| RU2199588C2 (ru) | 2003-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK12212000A3 (sk) | Metóda na detekciu cieľovej nukleovej kyseliny pomocou PCR | |
| US6833257B2 (en) | Fluorimetric detection system of a nucleic acid | |
| JP4457001B2 (ja) | ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法 | |
| JP6265905B2 (ja) | 普遍的リアルタイム多分析物検出用の二官能性オリゴヌクレオチドプローブ | |
| JP6096672B2 (ja) | 検出体、プローブ、および阻害剤を用いた核酸標的検出 | |
| US20100227326A1 (en) | Detection System | |
| US20210310056A1 (en) | Real-time multiplexed hydrolysis probe assay using spectrally identifiable microspheres | |
| JP2004532044A5 (sk) | ||
| Wilhelm et al. | Comparison between Taq DNA polymerase and its Stoffel fragment for quantitative real-time PCR with hybridization probes | |
| US20130210001A1 (en) | Sequence detection assay | |
| JP4628625B2 (ja) | 蛍光エネルギー移動を含む標的核酸を検出するための増幅方法 | |
| Kota | Non-gel based techniques for plant genotyping. |