HU226518B1 - Method for detection of target nucleic acids using pcr - Google Patents
Method for detection of target nucleic acids using pcr Download PDFInfo
- Publication number
- HU226518B1 HU226518B1 HU0101385A HUP0101385A HU226518B1 HU 226518 B1 HU226518 B1 HU 226518B1 HU 0101385 A HU0101385 A HU 0101385A HU P0101385 A HUP0101385 A HU P0101385A HU 226518 B1 HU226518 B1 HU 226518B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- probe
- sequence
- fluorescent
- fluorescence
- amplification
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 131
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 76
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 76
- 125000003729 nucleotide group Chemical class 0.000 claims description 57
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 56
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 51
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 27
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 13
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 12
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 claims description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 17
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 17
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 16
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 3
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- -1 uracil-N-glycosylase Chemical class 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000006903 response to temperature Effects 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/80—Elimination or reduction of contamination by undersired ferments, e.g. aseptic cultivation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Geophysics And Detection Of Objects (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
A leírás terjedelme 10 oldal (ezen belül 1 lap ábra)
HU 226 518 Β1
A jelen találmány tárgya eljárás egy polinukleotid-célszekvencia detektálására egy mintában, például amplifikációs reakció nyomon követésével, előnyösen kvantitatív módon, valamint próbák és kitek ezekhez az eljárásokhoz. A találmány szerinti módszer alkalmas szekvenciajellemzők, mint például polimorfizmus vagy allélvariációk kimutatására is, és ezáltal alkalmazható diagnosztikai eljárásokban.
Az ismert fluoreszcens polimeráz-láncreakciót (PCR) alkalmazó monítorozótechnikák magukban foglalják mind a szálspecifikus, mind az általános DNS interkaláló technikákat, amelyek felhasználhatók néhány második generációs PCR hőciklusos készülékben.
Az általános módszerek olyan DNS interkaláló színezékeket hasznosítanak, amelyek megnövelt fluoreszcenciával rendelkeznek, amikor hozzákötődnek a kettős szálú DNS-fajtákhoz. A fluoreszcencia fokozódását, amely a DNS-koncentráció amplifikálás során bekövetkezett növekedésének tulajdonítható, fel lehet használni a reakció előrehaladásának mérésére és a célmolekula kópiaszámának meghatározására. Továbbá a fluoreszcencia nyomon követése által szabályozott hőmérséklet-változásokkal DNS olvadási görbéket lehet létrehozni, például a PCR hőmérsékleti ciklus végén.
Az általános DNS módszerek a nukleinsavak koncentrációjában bekövetkezett növekedést kísérik nyomon bármiféle időeltolódás nélkül. Egyetlen fluoreszcens leolvasást lehet végezni minden egyes reakcióban ugyanazon a ponton. A végpont olvadási görbe analízist fel lehet használni a műtermékek megkülönböztetésére az amplikontól és az amplikonok megkülönböztetésére. A termékek csúcsai azoknál a koncentrációknál láthatók, amelyeket nem lehet agarózgélelektroforézissel láthatóvá tenni.
Ahhoz, hogy nagy felbontású olvadási adatokat kapjunk, az olvadási kísérletet nagyon lassan, működő hardver alatt öt percig kell kivitelezni. Azonban a fluoreszcens amplifikáció folyamatos nyomon követésekor az olvadás hiszterézisének és a hibridizációnak egy 3 dimenziós (3D) képét lehet előállítani. Ez a 3 dimenziós kép amplikonfüggő, és elegendő információt nyújthat a termék megkülönböztetésére.
Azt találták, hogy a DNS olvadási görbe analízis általánosságban egy hathatós eszköz a PCR hőmérsékleti ciklus optimalizálásában. Az amplikonok olvadási hőmérsékletének meghatározásával lehetőség van arra, hogy csökkentsék a denaturálási hőmérsékleteket a késői PCR ciklusban erre a hőmérsékletre. Ha az amplifikációt inkább az első generációs reakciótermékekből, mint a genomiális DNS-ből optimalizálják, csökken a műtermékképződés előfordulása a késői ciklusokban. A primer oligonukleotidok és komplementjeik olvadási hőmérsékletét fel lehet használni arra, hogy anneálási (illesztési) hőmérsékleteiket meghatározzák, és így csökkentsék az empirikus optimalizálás szükségességét.
Az általános interkaláló módszerek azonban csak kvázi-szálspecifikusak, és ezért nem nagyon használhatók fel ott, ahol szálspecifikus detektálásra van szükség.
A szálspecifikus eljárások további nukleinsavkomponenseket alkalmaznak az amplifikációs reakciók előrehaladásának nyomon követésére. Ezek a módszerek felhasználhatják a fluoreszcens energia transzfert (FET) detektálási alapként. Egy vagy több nukleinsavpróbát jeleznek fluoreszcens molekulákkal, melyek közül az egyik képes energiadonorként (átadóként) működni, és egy másik egy energiaakceptor (befogadó) molekula. Ezeket némelykor riportermolekulaként és csillapító- (quencher) molekulaként is említik. A donormolekula egy specifikus hullámhosszú fénnyel gerjesztődik, amely normálesetben egy fluoreszcens emissziós hullámhossz. Az akceptormolekula is gerjesztődik ugyanezen a hullámhosszon úgy, hogy a donormolekula emissziós energiáját be tudja fogadni távolságfüggő energia transzfer mechanizmusok különbözősége által. A fluoreszcens energia transzfer specifikus példája, amely előfordulhat, a Fluoreszcens Rezonancia Energia Transzfer vagy „FRET. Általánosságban az akceptormolekula befogadja a donormolekula emissziós energiáját, amikor azok szoros közelségben vannak (például ugyanazon vagy egy szomszédos molekulán). A FET vagy FRET detektálás alapja az, hogy nyomon követjük a donor és akceptor emissziós hullámhosszoknál bekövetkezett változásokat.
Két szokásosan használatos típusa van a FET vagy FRET próbáknak, az egyik típus esetén a nukleinsavpróbák hidrolízisét alkalmazzák, hogy szétválasszák a donort az akceptortól, és a másik típus esetén hibridizálást használnak, hogy megváltoztassák a térbeli viszonyt a donor- és akceptormolekulák között.
A hidrolízispróbák a kereskedelemben mint TaqMan™ próbák kaphatók. Ezek olyan DNS-oligonukleotidokból állnak, amelyek donor- és akceptormolekulákkal vannak jelezve. A próbák úgy vannak tervezve, hogy hozzákötődjenek egy PCR-termék egyik szálának specifikus régiójához. Miután a PCR-primer anneálódott (odakötődött) ehhez a szálhoz, a Taq enzim 5'—>3' polimeráz aktivitással meghosszabbítja a DNS-t. A Taq enzim 5’-»3’ exonukleáz aktivitással is rendelkezik. A TaqMan™ próbák a 3’-végen foszforilálással védettek, hogy megelőzzék a Taq kiterjesztést a primerből. Ha a TaqMan™ próba hibridizál a termékszálhoz, akkor egy meghosszabbodó Taq molekula szintén hidrolizálhatja a próbát, felszabadítva a donort az akceptorból, amely a detektálás alapját képezi. A jel ebben az esetben összegeződik (kumulatív), a szabad donor- és akceptormolekulák koncentrációja megnövekszik az amplifikációs reakció minden egyes ciklusában.
Az a tény, hogy a szignál keletkezése a próba hidrolízis reakciók előfordulásától függ, azt jelenti, hogy egy időeltolódás kapcsolódik ehhez a módszerhez. Továbbá a próba jelenléte megszakíthatja a PCR-folyamat zavartalan lefolyását.
Ráadásul azt találtuk, hogy a hidrolízis nemspecifikussá válhat, különösen ahol nagyszámú amplifikációs ciklusra, például több mint 50 ciklusra van szükség. Ezekben az esetekben a próba nemspecifikus hidrolízise egy indokolatlanul kifejlesztett szignált eredményez.
HU 226 518 Β1
Ez azt jelenti, hogy az ilyen technikák nem nagyon kompatibilisek a gyors PCR módszerekkel, amelyek még jelentősebbekké váltak a gyors forró levegő termál ciklizátorok kifejlesztésével, mint például a RapidCycler™ és a LightCycIer™, melyek az Idaho Technologies Inc.-től beszerezhetők.
Másféle gyors PCR készülékeket ismertetnek például a WO 98/24548 számon közrebocsátott szabadalmi bejelentésben. A gyors ciklizálás előnyeit a konvencionális hőciklizálással szemben máshol már közölték. Az ilyen technikák előnyösen használhatók például biológiai háborúkat detektáló rendszerekben, ahol a gyors eredmény rendkívül fontos, mivel életveszélyt vagy komoly sérülést kell elhárítani.
Továbbá azt találtuk, hogy a hidrolízispróbák nem nyújtanak szignifikáns információt az olvadás hiszterézisét tekintve, mivel a szignál létrejötte egészében véve inkább a próba hidrolízisétől függ, mint az amplikon olvadási hőmérsékletétől.
A hibridizációs próbák számos megjelenési formában állnak rendelkezésre. A molekuláris jelzők olyan oligonukleotidok, amelyek komplementer 5' és 3' szekvenciákkal rendelkeznek, így hajtű hurkokat képeznek. A terminális fluoreszcens jelzések szoros közelségbe kerülnek, hogy a FRET végbemenjen, amikor a hajtű szerkezet létrejön. A molekuláris jelzőknek a komplementer szekvenciához történő hibridizációját követően a fluoreszcens jelzések elkülönülnek, így FRET nem fordul elő, és ezek a formák képezik a detektálás alapját.
Jelzett oligonukleotidpárok szintén alkalmazhatók. Ezek egy PCR-termékszálon szoros közelségben hibridizálnak, a donor- és akceptormolekulákat együttesen szolgáltatják úgy, hogy a FRET előfordul. A megnövelt FRET a kimutatás alapja. Ennek a típusnak a variánsai közé tartozik a jelzett amplifikációs primer egyetlen szomszédos próbával.
Két próbának vagy egy molekuláris jelző típusú próbának, amely két jelzett molekulát foglal magában, az alkalmazása megnöveli az eljárás költségeit. Ráadásul ez a módszer egy meglehetősen hosszú, ismert szekvencia jelenlétét követeli meg úgy, hogy a két próba, amelyek eléggé hosszúak ahhoz, hogy specifikusan, szoros szomszédságban kötődjenek egymáshoz, ismert. Ez problémát jelenthet néhány diagnosztikai alkalmazásban, ahol egy organizmusban, mint például a HIV-vírus, a konzerválódott szekvenciák, amelyek felhasználhatók egy hatékony próba tervezésére, viszonylag rövidek lehetnek.
Továbbmenve, a próbapárok alkalmazása több komplex kísérleti elgondolást foglal magában. így például egy szignál keletkezik a próba olvadása által mindkét próba felolvadásának függvényeként. A kis hibás illeszkedések („mismatches) vizsgálata, vagy ahol a próbák egyike egy splice régión keresztüli kötést követel meg (például RNS detektálására összehasonlítva a DNS-sel egy mintában, ahol a szekvencia az intron egyik oldalán hasznosítható mint próbahely), téves eredményeket adhat, ha a másik próba olvad először.
A WO 97/46714 számú irat PCR nyomon követésére szolgáló módszert ismertet, amelynek során a PCR eljárás során vagy közvetlenül utána történő hibridizációból származó fluoreszcenciát figyelik meg. A szignál egy fluoreszcencia energia transzfer pártól, például fluoreszcein és Cy5 pártól származik. Egy megvalósítási forma olyan megoldást mutat be, ahol egy amplifikációs prímért jeleznek a pár egyik tagjával, és egy oligonukleotidpróbát a pár másik tagjával. Az amplifikált nukleinsav olvadási és újraanneálási görbéit kapják, ami lehetővé teszi mutációk és allélvariációk azonosítását.
Hiyosi M. és munkatársai [Analytical Biochemistry, 221 (2): 306-311 (1994)] egy DNS-denaturáláson alapuló vizsgálatot ismertetnek, amelyet különösen olyan örökletes betegségek diagnosztizálására szánnak, amelyeket a DNS pontmutációja okoz. A denaturálási hőmérséklet jellemző a szekvenciára, a pontmutáció pedig kis változásokat okoz, ezek detektálhatok a módszerrel.
A feltalálók kifejlesztettek egy assay-t bizonyos nukleinsavszekvenciák jelenlétének a detektálására, amely adaptálható egy mintában a célszekvencia mennyiségének meghatározására.
A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás egy célnukleinsavszekvencia jelenlétének detektálására egy mintában, amely abban áll, hogy (a) a mintát amplifikációs reakciónak vetjük alá egy polímeráz és nukleotidok egy sorozatának felhasználásával, amelyben legalább az egyik nukleotid fluoreszcensen jelzett, (b) az amplifikációs terméket egy próbával érintkeztetjük olyan körülmények között, amelyben a próba hibridizálni fog a célszekvenciához, továbbá az említett próba egy reaktív molekulát tartalmaz, amely képes fluoreszcenciát abszorbeálni az említett fluoreszcensen jelzett nukleotidból vagy fluoreszcens energiát átadni az említett fluoreszcensen jelzett nukleotidnak, és (c) nyomon követjük az említett minta fluoreszcenciáját, és összefüggésbe állítjuk a mintában jelen levő cél-nukleotidszekvencia jelenlétével vagy hiányával. Ilyen típusú assay alkalmazásával a fluoreszcens jelzés csak az amplifikációs termékbe épül be. Amikor a próba hibridizál valamely adott célszekvenciához, amely az amplifikációs reakció eredményeként keletkezett, a reaktív molekula emissziós energiát abszorbeál a jelzett nukleotidokból vagy átad energiát a jelzett nukleotidoknak FET vagy FRET segítségével, így változik a fluoreszcens nukleotidokból származó jel. Célszerűen a reaktív molekula képes fluoreszcenciát abszorbeálni a jelzett nukleotidokból, és ezáltal az ezekből származó fluoreszcencia csökken. Ez a csökkenés detektálható, és ez jelzi a próba kötődését.
Legelőnyösebben a reaktív molekula egy akceptormolekula, amely egy jellemző hullámhosszon bocsát ki fluoreszcenciát. Ebben az esetben az akceptormolekulából származó fluoreszcencia növekedése, amelynek eltérő a hullámhossza a jelzett nukleotidéhoz képest, szintén jelezni fogja a próba kötődését.
Az így jelzett amplifikációs termék jelenlétét detektálni lehet a próbán lévő akceptormolekulából származó fluoreszcencia nyomon követésével (monitorozásá3
HU 226 518 Β1 val), amely próba specifikusan csak a célszekvenciához kötődik. Ebben az esetben az amplifikációs termékből származó szignált meg lehet különböztetni a fluoreszcens jelzés háttérszignáljától, és bármely nemspecifikus amplifikációs termék szignáljától is.
Az a tény, hogy a szignál részben az amplifikációs termékkel és részben a próbával áll összefüggésben, azt jelenti, hogy a rendszer igen specifikus a detektálandó specifikus célszekvenciára nézve olyan reakciókeverékekben, amelyek nagy mennyiségű háttérDNS-t tartalmaznak. Ugyanis a nemspecifikus amplifikációs termékből származó szignált a mért szignálból hatékonyan eliminálhatjuk.
Az ilyen típusú assay-t nem költséges reagensek használatával kivitelezhetjük. Az egyetlen helyen jelzett próbák sokkal gazdaságosabbak, mint az akceptor- és a donormolekulákat egyaránt magukban foglaló próbák.
Amint itt használjuk, a „nukleotidok sorozata” kifejezés a nukleotidok egy olyan csoportjára vonatkozik, amely képes nukleinsavakat, mint például DNS-t és RNS-t képezni. Ezek közé tartozik az adenozin, citozin, guanin és a timin vagy uracil. Közülük egy vagy több fluoreszcensen jelzett. A jelzett uracil beszerezhető a Boehringer Mannheimtől. Megfelelő fluoreszcens jelzések közé tartozik a fluoreszcein.
A jelzett uracil használata különösen előnyös lehet a találmány szerinti eljárásban, mivel használata beilleszthető egy olyan stratégiába, amely annak megelőzésére szolgál, hogy a reakcióedényekben kivitelezett egyik amplifikációs reakcióból szennyezés vagy áthozatal kerüljön a következőbe. Az olyan enzimek, amelyek az uraciltartalmú nukleinsavak emésztésére szolgálnak, ezek közé tartozik például az uracil-N-glikoziláz, felhasználhatók egy ciklizálás előtti inkubációs lépésben, hogy biztosítsuk azt, hogy bármely visszamaradó amplikon emésztődjön, mielőtt a hőciklizálás az ezt követő műveletben elkezdődik.
Előnyösen több mint egy nukleotidot és legelőnyösebben az összes nukleotidot látjuk el jelzéssel, ami mérsékelni fogja az amplifikációs termékből származó szignál szintjét, és így a FET vagy FRET szignált.
Az amplifikációt előnyösen az ismert amplifikációs reakciók alkalmazásával valósítjuk meg, mint például polimeráz-láncreakció (PCR) vagy ligáz-láncreakció (LCR), szálhelyettesítő assay (SDA) vagy NASBA, de előnyösen PCR-rel.
Előnyösen mind a nukleotidnak, mind az akceptormolekulának a fluoreszcenciáját nyomon követjük, és az emissziók közötti összefüggést kiszámítjuk.
Alkalmas reaktív molekulák (mint például akceptormolekulák) a rodaminfestékek vagy más színezékek, mint például a Cy5. Ezeket szokásos módon kapcsolhatjuk a próbához. A reaktív molekula pozíciója a próba mentén kevésbé fontos, bár általában azok a próba terminális régiójánál fognak elhelyezkedni.
Ahhoz, hogy a FET, valamint a FRET megvalósuljon a reaktív molekula és a nukleotidok fluoreszcens emissziója között, a donorként ható alkotóelem (a reaktív molekula vagy a jelzett nukleotid) fluoreszcens emissziójának rövidebb hullámhosszúnak kell lennie, mint az akceptor alkotóelemének.
Ezért a megfelelő kombinációkat az alábbi táblázatban adjuk meg.
| Donor | Akceptor |
| SYBRGold | rodamin |
| SYBRGreen I | rodamin |
| SYBRGold | Cy5 |
| SYBRGreen I | Cy5 |
| Fluoreszcein | etídium-bromid |
Előnyösen a donorként és/vagy akceptorként használt molekulák éles csúcsokat produkálnak, és csak kicsi átfedés van, vagy egyáltalán nincs átfedés az emissziós hullámhosszokban. Ilyen körülmények között nincs szükség arra, hogy a „szálspecifikus csúcsot elkülönítsük attól a szignáltól, amely az amplifikácíós termék által képződött. A szálspecifikus szignál egy egyszerű mérése önmagában (azaz amit a reaktív molekula adott) információt fog nyújtani cél reakció által okozott FET vagy FRET mértékét tekintve. Az etídium-bromid/fluoreszcein kombináció kielégítheti ezt a követelményt. Abban az esetben a szálspecifikus reakció mennyiségileg meghatározható a fluoreszcencia 520 nm-en bekövetkező csökkenésével, előnyösen 1/fluoreszcencia értékben kifejezve.
Azonban ahol a spektrumok átfednek a donor- és az akceptormolekulákból származó fluoreszcens szignálokban, ezt számításba lehet venni az eredményekben, például empirikusan meghatározva az összefüggést a spektrumok között, és felhasználva ezt az összefüggést a két szignálból kapott szignálok normalizálására.
A találmány szerinti eljárás különösen sokoldalúan alkalmazható. Az eljárás felhasználható a mintában lévő cél-nukleinsavszekvenciára vonatkozóan mind kvantitatív, mind kvalitatív adatok létrehozására, amint azt az alábbiakban részletesen ismertetjük. Közelebbről, a találmány nemcsak egy kvantitatív amplifikációt biztosít, hanem azt fel is lehet használni azonfelül vagy alternatív módon arra, hogy jellemző adatokat kapjunk, például a duplex destabilizálási hőmérsékletét vagy olvadáspontokat.
A találmány szerinti eljárásban a mintát olyan körülményeknek vethetjük alá, amelyek alatt a próba a mintákhoz hibridizál, miközben vagy miután az amplifikálási reakció teljessé válik. Az eljárás lehetővé teszi, hogy a detektálást homogén módon végezzük, azaz az amplifikálást és a monitorozást egyetlen konténerben kivitelezzük, az összes reagenst kezdéskor adagoljuk. Nincs szükség ezt követő reagens-hozzáadási lépésekre. Arra sincs szükség, hogy az eljárást szilárd hordozók jelenlétében valósítsuk meg (bár ezt a lehetőséget az alábbiakban tárgyalni fogjuk).
így például ahol a próba jelen van az egész amplifikálási reakción keresztül, a fluoreszcens szignál lehetővé teszi az amplifikációs reakció előrehaladásának nyomon követését. Ez egy eszközt nyújthat a mintában
HU 226 518 Β1 jelen lévő célszekvencia mennyiségének meghatározásához.
Az amplifikációs reakció egyes ciklusai alatt a célszekvenciát tartalmazó amplikonszálak a próbához kötődnek, és ezáltal egy akceptorszignál jön létre. Mivel az amplikon mennyisége a mintában növekszik, így az akceptorszignál is növekedni fog. A növekedés ciklusokon keresztül mért mértékének grafikus ábrázolásával a növekedés kezdőpontját meg lehet határozni.
A próba tartalmazhat egy nukleinsavmolekulát, mint például DNS-t vagy RNS-t, amely a cél-nukleinsavszekvenciához hibridizálni fog, amikor az utóbbi egyszálú formában lesz. Ebben az esetben a (b) lépés magában foglalja olyan körülmények alkalmazását, amelyek a célnukleinsav egyszálúságát biztosítják. Alternatív módon, a próba tartalmazhat egy molekulát, mint például egy peptidnukleinsavat, amely specifikusan kötődik a célszekvencia kettős szálú formájához.
Közelebbről, az alkalmazott amplifikációs reakció magában foglalja azt a lépést, hogy a mintát olyan körülményeknek vetjük alá, amelyek között a mintában lévő bármely cél-nukleínsavszekvencia egyszálúvá válik, mint például a PCR-ben vagy LCR-ben.
Akkor lehetőség lesz arra, hogy a próba hibridizáljon az amplifikációs reakció folyamán, amelyben a megfelelő hibridizációs feltételek együttesen fennállnak.
Egy előnyös megvalósítási módban a próbát úgy tervezhetjük meg, hogy ezek a feltételek teljesülnek az amplifikációs reakció minden egyes ciklusa során. így az amplifikációs reakció egyes ciklusai alatt néhány pontnál a próba hibridizálni fog a célszekvenciához, és egy szignált fog generálni a FET vagy FRET eredményeként. Ahogy az amplifikáció előrehalad, a próba elkülönül vagy leolvad a célszekvenciától, és így a reaktív molekula által létrejött szignál csökkenni vagy növekedni fog attól függően, hogy a donor- vagy akceptormolekulát tartalmazza-e. így például ahol az egy akceptor, az amplifikálás egyes ciklusaiban a reaktív molekuláról fluoreszcenciacsúcs képződik. A csúcs intezitása növekedni fog az amplifikáció előrehaladásával, mert több célszekvencia válik alkalmassá arra, hogy a próbához kötődjön.
Az egyes ciklusok során a mintából a reaktív molekula fluoreszcenciájának nyomon követésével az amplifikációs reakciót különböző módokon lehet nyomon követni. Példaképpen az olvadási csúcsok által nyújtott adatokat lehet analizálni, például úgy, hogy az olvadási csúcsok alatti területeket kiszámítjuk, és ezeket az adatokat a ciklusok számának függvényében ábrázoljuk.
A fluoreszcenciát előnyösen egy ismert fluoriméter alkalmazásával kísérjük nyomon. Az ezekből származó szignálok, például fotosokszorozó feszültségek formájában, eljutnak egy adatprocesszor fedélzetéhez, és ott átalakulnak egy spektrummá, mely kapcsolatban van az egyes mintacsövekkel. Többcsöves rendszert, például 96 csövet lehet egyidejűleg vizsgálni. Ezen a módon az adatokat össze lehet gyűjteni a kívánt intervallumokban, például minden 10 ms-ben, az egész reakció folyamán.
Az ilyen módon előállított spektrumokat felbontjuk, például előre kiválasztott fluoreszcens csoportok, mint például festékek „fit”-jeinek alkalmazásával, hogy az egyes szignált adó csoportokat (azaz nukleotidjelzést és/vagy reaktív molekulát) reprezentáló csúcsokat képezzünk. A csúcsok alatti területeket meghatározhatjuk, amelyek az egyes szignálok intenzitás! értékeit jelentik, és kívánt esetben ezeket egymás hányadosainak formájában fejezhetjük ki. A szignálintenzitások és/vagy arányok különbségei fogják lehetővé tenni a változásokat a FET-ben vagy FRET-ben, melyeket rögzítünk a reakció folyamán vagy a különböző reakciókörülményeknél, mint például különböző hőmérsékleteknél. A változások, amint a fentiekben említettük, összefüggésben vannak a próba és célszekvencia közötti kötési jelenséggel. A különböző csúcsok alatti területek integrálja lehetővé teszi, hogy intenzitás! értékeket kalkuláljunk a FET-re vagy FRET-re.
Ezek az adatok eszközként szolgálnak ahhoz, hogy a mintában jelen lévő célnukleinsav mennyiségét meghatározzuk.
A találmány szerinti eljárásban a próba lehet szabad formában oldatban vagy immobilizált formában egy szilárd hordozón, például gyöngynek, mint például mágneses gyöngynek a felszínéhez kötve, amely felhasználható a termékek elválasztásában, vagy egy detektoreszköz felszínéhez kötve, mint például egy felületi plazma rezonancia detektor hullámvezetője. A szelekció az alkalmazott assay természetétől és az alkalmazott detektálóeszközöktől függ.
A próbát megtervezhetjük úgy, hogy az amplifikációs reakcióban használt DNS-polimeráz elhidrolizálja, miáltal az akceptormolekula felszabadul. Ez egy kumulatív szignált eredményez, a rendszerben jelen lévő szabad reaktív molekulának az egyes ciklusokkal növekvő mennyiségével. Azonban arra nincs szükség ebben az assay-ben, hogy a próba ezen a módon elfogyjon, mivel a szignál nem függ a próba hidrolízisétől.
Abból a célból, hogy egy teljesen reverzibilis szignált érjünk el, amely közvetlenül összefüggésben van a reakció minden egyes lépésénél jelen lévő amplifikációs termék mennyiségével, és/vagy ahol a reakció gyorsasága a legfontosabb, például a gyors PCR-ben, előnyös, ha a próbát úgy tervezzük meg, hogy intakt formában szabaduljon fel a célszekvenciából, és így ismét részt vehessen a reakcióban. Erre lehetőség van például az amplifikációs reakció lánchosszabbító (extenciós) fázisa során. Azonban, mivel a szignál nem függ a próba hidrolízisétől, a próbát meg lehet úgy tervezni, hogy a célszekvenciához hibridizáljon, és elkülönüljön attól az amplifikációs ciklus során bármely lépésnél, beleértve a reakció anneáló vagy olvadó fázisát. Az ilyen próbák biztosítják, hogy az amplifikációs reakcióval való interferenciát minimalizáljuk.
Amikor olyan próbákat alkalmazunk, amelyek az extenciós fázis során kötődnek, azok intakt felszabadulását egy 5-3’ exonukleáz hiányos enzim használatával, mint például a Taq vagy a Pwo Stoffle-fragmense, érhetjük el. Ezt akkor használhatjuk, ha gyors PCR-re van szükség, mivel a hidrolízislépéseket eltávolítottuk.
HU 226 518 Β1
Amikor ezt a módszert alkalmazzuk, különösen fontos annak biztosítása, hogy a próba ne hosszabbodjon meg a reakció extenciós fázisában. Ezért a próba 3’-végét blokkoljuk, előnyösen foszforilálással.
Az ezen a módon előállított adatokat különböző módon interpretálhatjuk. A legegyszerűbb formában, az amplifikációs reakció folyamán vagy végén az akceptormolekula fluoreszcenciájában bekövetkezett növekedés jelzi a jelen lévő célszekvencia mennyiségének növekedését, ami arra utal, hogy a célszekvencia ténylegesen jelen volt a mintában. Azonban, amint a fentiekben kifejtettük, a kvantitatív meghatározás szintén lehetséges, ha az egész amplifikációs reakciót végig nyomon követjük. Végül az is lehetséges, hogy jellemző adatokat kapjunk, és különösen olvadáspontanalízist, vagy végpont-, vagy folyamatos mérésként abból a célból, hogy információt szerezzünk a szekvenciáról, amint az alábbiakban részletesen tárgyaljuk.
A fentiek alapján a találmány egyik előnyös kiviteli módja egy nukleinsavamplifikáció detektálására szolgáló eljárásra vonatkozik, amely abban áll, hogy megvalósítunk egy nukleinsavamplifikációt egy célpolinukleotidon az alábbiak jelenlétében:
(a) egy nukleinsav polimeráz, (b) legalább egy primer, amely képes az említett célpolinukleotidhoz hibridizálni, (c) nukleotidok egy sorozata, amelyben legalább az egyik nukleotid fluoreszcensen jelzett, és (d) egy oligonukleotidpróba, amely képes az említett cél-polinukleotidszekvenciához kötődni, és amely tartalmaz egy reaktív molekulát, amely képes fluoreszcens energiát abszorbeálni az említett jelzett nukleotidból vagy fluoreszcens energiát átadni az említett jelzett nukleotidnak;
és nyomon követjük a fluoreszcenciában bekövetkezett változásokat az amplifikációs reakció folyamán.
Előnyösen a reaktív molekula egy akceptormolekula, amely képes energiát abszorbeálni a jelzett nukleotidből.
Az amplifikációt előnyösen egy primer pár alkalmazásával valósítjuk meg, amelyeket úgy tervezünk meg, hogy egy DNS-szálon belül csak a cél-nukleotidszekvencia amplifikálódjon, amint az jól ismert a technika állásából. A nukleinsav polimeráz előnyösen egy hőstabil polimeráz, mint például a Taq polimeráz.
Alkalmas körülmények, melyek között az amplifikációs reakciót kivitelezhetjük, szintén jól ismertek a technika állásából. Az optimális körülmények az egyes esetekben variálhatók az adott amplikontól, a felhasznált primerektől és az alkalmazott enzimek természetétől függően. Az optimális körülményeket a szakember minden egyes esetben meg tudja határozni. Tipikus denaturálási hőmérsékletek a 95 °C nagyságrendű, tipikus anneálási hőmérsékletek az 55 °C nagyságrendű és tipikus extenciós hőmérsékletek a 72 °C nagyságrendű hőmérsékletek.
A találmány egyik előnyös kiviteli módja szerint a próbát felhasználhatjuk az RNS-transzkriptumok kvantitatív meghatározására, például expressziós kísérletekben, amelyek gyógyszerhatóanyagok kutatásában használhatók. Ez a kiviteli mód különösen eukarióta szervezetekből származó szövetekben végzett expressziós vizsgálatokban alkalmazható. Az eukarióta sejtekben a fehérjéket kódoló DNS-ek tartalmazhatnak intronokat, azaz nem kódoló DNS-szekvencia-régiókat, valamint exonokat, amelyek a fehérjeszekvenciát kódolják. A nem kódoló intronszekvenciák, amelyek a DNS-szekvenciákból származnak, az RNS-ből a celluláris „splicing” eljárások során eltávolítódnak. A PCRprimerek normálesetben a kódolórégiókat célozzák meg, és amikor reverz transzkriptáz PCR-t alkalmazunk teljes nuklelnsavkivonatokban, a kapott termékek mind a DNS-függő amplifikációból, mind az RNS-függő amplifikációból fognak származni. Ezáltal a PCR önmagában, amikor expressziós vizsgálatokra alkalmazzuk, genomiális DNS-ből és expresszált RNS-ből származó amplifikációt fog tartalmazni.
Egy próba, melyet úgy tervezünk, hogy az intronokon keresztül, a kódoló exonok terminális régióinak szomszédságában kötődjön, csökkent kölcsönhatást fog mutatni az intronrégió miatt. Az elhasított RNS-ekben ezek a régiók nincsenek jelen, és ezáltal a kódoló exonok szomszédos terminális régiói egy folytonos szekvenciát képeznek, amely lehetővé teszi a próba hatékony kötődését.
Ezzel szemben a próba detektálhatja csak a genomiális DNS amplifikációs termékét, ha azt úgy tervezzük meg, hogy egy intronrégióhoz kötődjön. Egy ilyen próbából képződött szignál csak a minta DNS-koncentrációjára, és nem az RNS-koncentrációra vonatkozik.
Ezért a találmány egy további előnyös kiviteli módjában a próba specifikus vagy az RNS egy „splice” régiójára, vagy egy intronra a DNS-ben úgy, hogy az amplifikált RNS-nek vagy amplifikált DNS-nek csak az egyikét detektáljuk és/vagy kvantitatív módon meghatározzuk.
Alternatív módon vagy mindezek mellett a találmány szerinti módszert felhasználhatjuk hibridizációs assay-ben egy szekvencia jellemzőinek meghatározására. Ennélfogva a találmány tárgya továbbá eljárás egy szekvencia jellemzőjének a meghatározására, amely abban áll, hogy (a) az említett szekvenciát amplifikáljuk egy polimeráz és nukleotidok egy sorozatának felhasználásával, amelyben legalább az egyik nukleotid fluoreszcensen jelzett, (b) a kettős szálú amplifikációs terméket egy próba jelenlétében denaturáljuk, és a keveréket olyan körülményeknek tesszük ki, ahol a próba hibridizál a célszekvencia egy szálához, vagy pedig a kettős szálú amplifikációs terméket egy olyan próbával érintkeztetjük, amely specifikusan megköti a célszekvenciát kettős szálú formában, ahol a próba egy olyan reaktív molekulát tartalmaz, amely képes fluoreszcenciát abszorbeálni az említett fluoreszcensen jelzett nukleotidból vagy fluoreszcens energiát átadni az említett fluoreszcensen jelzett nukleotidnak, és (c) nyomon követjük az említett minta fluoreszcenciáját, és meghatározunk egy bizonyos reakciókörülményt, az említett szekvencia jellemzőjét, amelynél a
HU 226 518 Β1 fluoreszcens változásokat a próba mintához való hibridizációja vagy a próba és cél-nukleinsavszekvencia között képződött duplex destabilizációja eredményezi.
Megfelelő reakciókörülmények közé tartozik a hőmérséklet, elektrokémiai vagy az adott enzimekre és kemikáliák jelenlétére adott válasz. A fluoreszcenciában bekövetkezett változások nyomon kísérésével, ahogyan ezek a tulajdonságok változnak, megkaphatjuk a szekvencia pontos természetére jellemző információt. így például a hőmérséklet esetében meghatározható az a hőmérséklet, amelynél a próba különválik a szekvenciától a mintában a melegítés eredményeként. Ez különösen felhasználható például arra, hogy kimutassuk és - kívánt esetben - kvantitatív módon is meghatározzuk a polimorfizmust és/vagy allélvariációkat a genetikai diagnózisban. A „polimorfizmusba” beletartoznak az átmenetek, transzverziók, inszerciók, az inverziók deléciói, amelyek előfordulhatnak a szekvenciákban, különösen a természetben.
Az olvadási hiszterézis eltérő lesz, ha a célszekvencia akár csak egy bázispárban is eltér. így például ahol a minta csak egyetlen allélvariánst tartalmaz, a próba olvadási hőmérséklete egy adott érték lesz, amely különbözni fog attól, amelyet akkor találunk, amikor a minta egy másik allélvariánst tartalmaz. Egy minta, amely mindkét allélvariánst tartalmazza, két olvadáspontot mutat az allélvariánsok mindegyikének megfelelően. Hasonló szempontok érvényesek az elektrokémiai tulajdonságokra nézve, vagy bizonyos enzimek vagy kemikáliák jelenlétében. A próbát egy szilárd felszínen immobilizálhatjuk, amelyen keresztül elektrokémiai potenciált alkalmazhatunk. A célszekvencia kötődni fog a próbához vagy repulzál a próbából adott elektrokémiai értékeknél a szekvencia pontos természetétől függően.
Emellett a próba hibridizációs kinetikája lehetővé teszi a célszekvencia koncentrációjának meghatározását abszolút értékben. A mintából eredő fluoreszcenciában bekövetkezett változások lehetővé teszik, hogy a próba mintához történő hibridizációjának mértékét kiszámítsuk. A hibridizáció mértékének növekedése összefüggésben van a mintában jelen lévő célszekvencia mennyiségével. Ahogyan a célszekvencia koncentrációja növekszik az amplifikációs reakció előrehaladásával, a próba hibridizációja még gyorsabban következik be. Ennélfogva ezt a paramétert is fel lehet használni a mennyiségi meghatározás alapjául. Az adatok előállításának ez a módja hasznos, mivel nincs szükség a szignálintenzitásra ahhoz, hogy információt nyújtson.
A találmány további tárgyát képezi olyan kitek alkalmazása a találmány szerinti eljárásban, amelyek tartalmaznak egy fluoreszcensen jelzett nukleotidot és egy, a cél-nukleotidszekvenciára specifikus próbát, amely tartalmaz egy reaktív molekulát, amely képes fluoreszcenciát abszorbeálni a fluoreszcensen jelzett nukleotidról vagy fluoreszcens energiát adni a fluoreszcensen jelzett nukleotidnak. Kívánt esetben a próbát immobilizálhatjuk egy szilárd hordozón, mint például gyöngyön, célszerűen mágneses gyöngyön, vagy egy detektorban alkalmazott hordozón, mint például egy csillapított hullámdetektor készülék hullámirányítója.
Ezen túlmenően a kit egy vagy több fluoreszcensen jelzett nukleotidot is tartalmazhat, amely vagy amelyek kompatibilisek az említett reaktív molekulával. A kit egyéb komponensei közé tartoznak az amplifikációs reakcióban használt reagensek, mint például a DNSpolimeráz.
Az 1. ábrán diagramokon mutatjuk be azokat a kölcsönhatásokat, amelyek a találmány szerinti eljárásban végbemennek.
Az illusztrált amplifikációs reakcióban egy DNS-molekulát (1) készítettünk az amplifikációhoz, melyet érintkezésbe hozunk az amplifikációs primer párral (2), (3) és a nukleotidok sorozatával (4), melyek közül néhány fluoreszcens jelzéssel (5) jelzett. Biztosítjuk a DNS-molekula (1) egyszálúságát (1B. ábra), ekkor a primerek (2, 3) előreirányuló és reverz primerekként kötődnek az amplifikációs reakcióban, mint az jól ismert. Az ezt követő amplifikációs reakció során egy amplikontermék (6) épül fel (1C. ábra). A nukleotidok, mind a jelzettek, mind a jelzetlenek, beépülnek a termékbe, amikor az képződik. Normális esetben az amplikontermék (6) csak a primerek által definiált célszekvenciát tartalmazza.
Amikor ez a termék megolvad (szétválik) az amplifikáció ezt követő fázisában, az akceptormolekulát (8) tartalmazó próba (7) a célszekvenciához kötődik (1D. ábra). A fluoreszcens nukleotidok és az akceptormolekula közötti FRET kölcsönhatás létrehoz egy szignált az akceptor jellemző hullámhosszánál.
Az akceptorszignált (8) ezután nyomon követhetjük szokásos, fluoreszcenciát detektáló készülékek segítségével.
Claims (21)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás cél-nukleinsavszekvencia jelenlétének detektálására egy mintában, azzal jellemezve, hogy (a) a mintát amplifikációs reakciónak vetjük alá egy polimeráz és nukleotidok sorozatának felhasználásával, amelyben legalább az egyik nukleotid fluoreszcens jelzéssel van ellátva, (b) az amplifikációs terméket egy próbával érintkeztetjük olyan körülmények között, amelyben a próba hibridizál a célszekvenciához, továbbá a próba egy reaktív molekulát tartalmaz, amely képes fluoreszcenciát abszorbeálni a fluoreszcens jelzéssel ellátott nukleotidból vagy fluoreszcens energiát átadni a fluoreszcens jelzéssel ellátott nukleotidnak, és (c) nyomon követjük a minta fluoreszcenciáját, amelyet azután összefüggésbe állítunk a mintában levő célnukleinsavszekvencia jelenlétével vagy hiányával.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan reaktív molekulát alkalmazunk, amely fluoreszcenciát abszorbeál a fluoreszcens jelzéssel ellátott nukleotidból.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan reaktív molekulát alkalmazunk, amely egyHU 226 518 Β1 akceptormolekula, és amely energiát bocsát ki egy jellemző hullámhosszon.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy akceptormolekulaként egy rodaminfestéket vagy Cy5-öt alkalmazunk.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelzéssel ellátott nukleotidként jelzett uracilt alkalmazunk.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amplifikációs reakcióban az összes nukleotidot jelzett formában alkalmazzuk.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amplifikációs reakcióban polimeráz-láncreakciót (PCR) végzünk.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind a jelzett nukleotid, mind a reaktív molekula fluoreszcenciáját nyomon követjük, és az emissziók közötti összefüggést kiszámítjuk.
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amplifikációs reakciót a próba jelenlétében végezzük.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fluoreszcens szignált nyomon követjük, és az eredményeket felhasználjuk a mintában jelen lévő célszekvencia mennyiségének meghatározására.
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a próbát úgy tervezzük meg, hogy azt az amplifikációs reakcióban alkalmazott DNS-polimeráz hidrolizálja.
- 12. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a próbát úgy választjuk meg, hogy a próba az amplifikációs reakció meghosszabbító fázisa során a célszekvenciából intakt formában felszabaduljon.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amplifikációs reakciót egy 5-3’ exonukleázhiányos enzim alkalmazásával kivitelezzük.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként a Taq vagy Pwo enzim Stoffle-fragmensét alkalmazzuk.
- 15. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a próba 3’-végét foszforilálással blokkoljuk.
- 16. Eljárás nukleinsavamplifikáciő detektálására, azzal jellemezve, hogy nukleinsavamplifikációt hajtunk végre egy célpolinukleotidon az alábbiak jelenlétében:(a) nukleinsav polimeráz, (b) legalább egy primer, amely képes az említett célpolinukleotidhoz hibridizálni, (c) nukleotidok sorozata, amelyben legalább az egyik nukleotid fluoreszcens jelzéssel van ellátva, és (d) oligonukleotidpróba, amely képes az említett cél-polinukleotidszekvenciához kötődni, és amely tartalmaz egy reaktív molekulát, amely képes fluoreszcens energiát abszorbeálni a jelzett nukleotidból vagy fluoreszcens energiát átadni a jelzett nukleotidnak;és nyomon követjük a fluoreszcenciában bekövetkezett változásokat az amplifikációs reakció folyamán.
- 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amplifikációt egy primer pár felhasználásával kivitelezzük, amelyeket úgy tervezünk meg, hogy csak a cél-nukleotidszekvencia amplifikálódjon a DNSszálon belül.
- 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan próbát alkalmazunk, amely specifikus az RNS egy splice régiójára vagy a DNS-ben egy intronra oly módon, hogy csak az amplifikálódott RNS vagy amplifikálódott DNS egyikét detektáljuk és/vagy mennyiségileg meghatározzuk.
- 19. Eljárás egy szekvencia jellemzőjének a meghatározására, azzal jellemezve, hogy (a) a szekvenciát amplifikáljuk egy polimeráz és nukleotidok egy sorozatának felhasználásával, amelyben legalább az egyik nukleotid fluoreszcens jelzéssel van ellátva, (b) a kettős szálú amplifikációs terméket egy próba jelenlétében denaturáljuk, és a keveréket olyan körülményeknek tesszük ki, ahol a próba hibridizál a célszekvencia egy szálához, vagy pedig a kettős szálú amplifikációs terméket egy olyan próbával érintkeztetjük, amely specifikusan megköti a célszekvenciát kettős szálú formában, ahol a próba egy olyan reaktív molekulát tartalmaz, amely képes fluoreszcenciát abszorbeálni a fluoreszcens jelzéssel ellátott nukleotidból, vagy pedig fluoreszcens energiát átadni a fluoreszcens jelzéssel ellátott nukleotidnak, és (c) nyomon követjük a minta fluoreszcenciáját, és meghatározunk egy bizonyos reakciókörülményt, az említett szekvencia jellemzőjét, amelynél a fluoreszcens változásokat a próba mintához való hibridizációja, vagy pedig a próba és cél-nukleinsavszekvencia között képződött duplex destabilizációja eredményezi.
- 20. Eljárás polimorfizmus és/vagy allélvariációk detektálására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással amplifikálunk egy szekvenciát, amely várhatólag az említett polimorfizmust vagy variációt tartalmazza, mérjük azt a hőmérsékletet a létrehozott fluoreszcens szignál felhasználásával, amelynél a próba kiválik az amplifikációs termékből, és ezt a polimorfizmus vagy allélvariációk jelenlétével hozzuk összefüggésbe.
- 21. Kit alkalmazása az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárásban, ahol a kit tartalmaza) egy fluoreszcens jelzéssel ellátott nukleotidot ésb) egy próbát, amely specifikus egy cél-nukleotidszekvenciára, a próba tartalmaz egy reaktív molekulát, amely képes fluoreszcenciát abszorbeálni a fluoreszcensen jelzett nukleotidból, vagy pedig fluoreszcens energiát adni a fluoreszcensen jelzett nukleotidnak.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9803382.2A GB9803382D0 (en) | 1998-02-19 | 1998-02-19 | Detection system |
| PCT/GB1999/000504 WO1999042611A1 (en) | 1998-02-19 | 1999-02-18 | Method for detection of target nucleic acids using pcr |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0101385A2 HUP0101385A2 (hu) | 2001-08-28 |
| HUP0101385A3 HUP0101385A3 (en) | 2003-08-28 |
| HU226518B1 true HU226518B1 (en) | 2009-03-30 |
Family
ID=10827164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0101385A HU226518B1 (en) | 1998-02-19 | 1999-02-18 | Method for detection of target nucleic acids using pcr |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6287781B1 (hu) |
| EP (1) | EP1055002B1 (hu) |
| JP (1) | JP2003512808A (hu) |
| CN (1) | CN1203186C (hu) |
| AT (1) | ATE398187T1 (hu) |
| AU (1) | AU746149B2 (hu) |
| CA (1) | CA2321185C (hu) |
| CZ (1) | CZ20002958A3 (hu) |
| DE (1) | DE69938894D1 (hu) |
| GB (4) | GB9803382D0 (hu) |
| HU (1) | HU226518B1 (hu) |
| IL (1) | IL137909A0 (hu) |
| NZ (1) | NZ506333A (hu) |
| RU (1) | RU2199588C2 (hu) |
| SK (1) | SK12212000A3 (hu) |
| WO (1) | WO1999042611A1 (hu) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9725197D0 (en) * | 1997-11-29 | 1998-01-28 | Secr Defence | Detection system |
| GB9918237D0 (en) * | 1999-08-04 | 1999-10-06 | Secr Defence | Detection system |
| GB2360088A (en) * | 2000-03-07 | 2001-09-12 | Secr Defence | Method and kit for determining PCR amplification reaction conditions |
| GB0005281D0 (en) * | 2000-03-07 | 2000-04-26 | Secr Defence | Analytical method |
| EP1354064A2 (en) | 2000-12-01 | 2003-10-22 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
| GB0110501D0 (en) | 2001-04-30 | 2001-06-20 | Secr Defence Brit | Amplification process |
| DE60228952D1 (de) * | 2001-05-07 | 2008-10-30 | Mayo Foundation | Nachweis von Legionella durch ein PCR und FRET verwendendes Verfahren |
| GB0111275D0 (en) | 2001-05-09 | 2001-06-27 | Secr Defence | Analytical method and kit |
| GB0112868D0 (en) * | 2001-05-25 | 2001-07-18 | Secr Defence | Detection system |
| US9261460B2 (en) * | 2002-03-12 | 2016-02-16 | Enzo Life Sciences, Inc. | Real-time nucleic acid detection processes and compositions |
| US6593093B1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-07-15 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of group a Streptococcus |
| US9353405B2 (en) * | 2002-03-12 | 2016-05-31 | Enzo Life Sciences, Inc. | Optimized real time nucleic acid detection processes |
| US20060172293A1 (en) * | 2002-05-31 | 2006-08-03 | Kankyo Engineering Co, Ltd. | Novel method of assaying nucleic acid using labeled nucleotide |
| EP1509624A2 (en) * | 2002-05-31 | 2005-03-02 | Secretary, Department Of Atomic Energy | Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands |
| US7183104B1 (en) | 2002-08-23 | 2007-02-27 | Duane Morris Llp | Separator and particle detection system |
| US7074598B2 (en) * | 2002-09-25 | 2006-07-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of vancomycin-resistant enterococcus spp. |
| WO2004074447A2 (en) * | 2003-02-18 | 2004-09-02 | Applera Corporation | Compositions and methods for multiplex analysis of polynucleotides |
| GB0304832D0 (en) | 2003-03-04 | 2003-04-09 | Secr Defence | Assay method |
| WO2005003388A2 (en) * | 2003-06-30 | 2005-01-13 | Astrazeneca Ab | Fluorescence assays for nucleic acid polymerase activity |
| GB0416944D0 (en) | 2004-07-29 | 2004-09-01 | Lumora Ltd | Method for determining the amount of template nucleic acid present in a sample |
| GB0503172D0 (en) | 2005-02-16 | 2005-03-23 | Enigma Diagnostics Ltd | Detection method |
| GB0517005D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Enigma Diagnostics Ltd | Analytical method and kit |
| RU2005132940A (ru) * | 2006-03-01 | 2007-11-27 | Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (RU) | Способ детекции специфических фрагментов днк или рнк с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
| CA2647566C (en) | 2006-03-29 | 2017-01-03 | Merial Limited | Vaccine against streptococci |
| GB0806676D0 (en) | 2008-04-12 | 2008-05-14 | Environment Agency The | Environmental monitoring |
| EP2336358A1 (en) * | 2008-05-06 | 2011-06-22 | QIAGEN GmbH | Simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction |
| EP2138588A1 (en) * | 2008-06-23 | 2009-12-30 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Melting curve measurement during amplification |
| US20110045458A1 (en) * | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of Enterovirus |
| GB0915664D0 (en) | 2009-09-08 | 2009-10-07 | Enigma Diagnostics Ltd | Reaction method |
| RU2585519C2 (ru) * | 2012-11-28 | 2016-05-27 | ЗАО "Геноаналитика" | Способ селективного отбора целевых участков днк |
| CA2962234A1 (en) * | 2014-09-26 | 2016-03-31 | Two Pore Guys, Inc. | Target sequence detection by nanopore sensing of synthetic probes |
| US11486873B2 (en) | 2016-03-31 | 2022-11-01 | Ontera Inc. | Multipore determination of fractional abundance of polynucleotide sequences in a sample |
| RU2665631C2 (ru) * | 2017-01-25 | 2018-09-03 | Общество с ограниченной ответственностью "Секвойя Дженетикс" | Способ специфической идентификации последовательностей днк |
| CN108642150B (zh) * | 2018-05-18 | 2023-12-08 | 阅尔基因技术（苏州）有限公司 | 一种基于fret的荧光核酸检测方法和试剂盒 |
| US11604186B2 (en) * | 2018-10-17 | 2023-03-14 | Molecular Devices (Austria) GmbH | Real time western blot assays utilizing fluorescence resonance energy transfer (FRET) |
| MX2020014061A (es) | 2018-12-21 | 2021-05-27 | Illumina Inc | Sistemas de deteccion. |
| CN109576350B (zh) * | 2019-01-18 | 2021-01-29 | 深圳恒特基因有限公司 | 一种dna与rna同时定量的试剂盒、方法及质控方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5567583A (en) * | 1991-12-16 | 1996-10-22 | Biotronics Corporation | Methods for reducing non-specific priming in DNA detection |
| ATE196322T1 (de) * | 1995-05-05 | 2000-09-15 | Perkin Elmer Corp | Methoden and reagentien fuer die kombination einer pcr-amplifizierung mit einem hybridisierungs-assay |
| US5716784A (en) * | 1996-02-05 | 1998-02-10 | The Perkin-Elmer Corporation | Fluorescence detection assay for homogeneous PCR hybridization systems |
| AU726501B2 (en) | 1996-06-04 | 2000-11-09 | University Of Utah Research Foundation | Monitoring hybridization during PCR |
| US5866336A (en) * | 1996-07-16 | 1999-02-02 | Oncor, Inc. | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US6140054A (en) * | 1998-09-30 | 2000-10-31 | University Of Utah Research Foundation | Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes |
-
1998
- 1998-02-19 GB GBGB9803382.2A patent/GB9803382D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-02-03 GB GBGB9902290.7A patent/GB9902290D0/en not_active Ceased
- 1999-02-18 CA CA002321185A patent/CA2321185C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-02-18 US US09/622,426 patent/US6287781B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-18 DE DE69938894T patent/DE69938894D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-18 GB GBGB9903578.4A patent/GB9903578D0/en not_active Ceased
- 1999-02-18 IL IL13790999A patent/IL137909A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-02-18 SK SK1221-2000A patent/SK12212000A3/sk unknown
- 1999-02-18 JP JP2000532551A patent/JP2003512808A/ja active Pending
- 1999-02-18 NZ NZ506333A patent/NZ506333A/xx unknown
- 1999-02-18 HU HU0101385A patent/HU226518B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-02-18 CZ CZ20002958A patent/CZ20002958A3/cs unknown
- 1999-02-18 RU RU2000124099/13A patent/RU2199588C2/ru active
- 1999-02-18 AT AT99905085T patent/ATE398187T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-02-18 CN CNB998051985A patent/CN1203186C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-02-18 AU AU25383/99A patent/AU746149B2/en not_active Ceased
- 1999-02-18 WO PCT/GB1999/000504 patent/WO1999042611A1/en active IP Right Grant
- 1999-02-18 EP EP99905085A patent/EP1055002B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-19 GB GBGB9903796.2A patent/GB9903796D0/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE398187T1 (de) | 2008-07-15 |
| HUP0101385A2 (hu) | 2001-08-28 |
| AU746149B2 (en) | 2002-04-18 |
| GB9903796D0 (en) | 1999-04-14 |
| CN1297488A (zh) | 2001-05-30 |
| CN1203186C (zh) | 2005-05-25 |
| EP1055002A1 (en) | 2000-11-29 |
| CZ20002958A3 (cs) | 2002-02-13 |
| AU2538399A (en) | 1999-09-06 |
| WO1999042611A1 (en) | 1999-08-26 |
| CA2321185A1 (en) | 1999-08-26 |
| NZ506333A (en) | 2002-10-25 |
| GB9903578D0 (en) | 1999-04-07 |
| CA2321185C (en) | 2009-04-21 |
| IL137909A0 (en) | 2001-10-31 |
| EP1055002B1 (en) | 2008-06-11 |
| JP2003512808A (ja) | 2003-04-08 |
| US6287781B1 (en) | 2001-09-11 |
| GB9902290D0 (en) | 1999-03-24 |
| GB9803382D0 (en) | 1998-04-15 |
| SK12212000A3 (sk) | 2002-09-10 |
| DE69938894D1 (de) | 2008-07-24 |
| HUP0101385A3 (en) | 2003-08-28 |
| RU2199588C2 (ru) | 2003-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU226518B1 (en) | Method for detection of target nucleic acids using pcr | |
| US6833257B2 (en) | Fluorimetric detection system of a nucleic acid | |
| US20100227326A1 (en) | Detection System | |
| KR20070090159A (ko) | 핵산 증폭을 위한 프라이머, 프로브 및 방법 | |
| JP2000509608A (ja) | Ｐｃｒ中のハイブリダイゼーションのモニタリング | |
| KR101038137B1 (ko) | 서열 차이를 감지하는 방법 | |
| WO2001004357A9 (en) | Generic sbe-fret protocol | |
| AU2002311414A1 (en) | Nucleic acid detection method | |
| EP1198593B1 (en) | Amplification method for detection of target nucleic acids involving fluorescence energy transfer | |
| US20030211482A1 (en) | Method for nucleic acid detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |