CN1297488A - 用pcr检测目标核酸的方法 - Google Patents

用pcr检测目标核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1297488A
CN1297488A CN99805198A CN99805198A CN1297488A CN 1297488 A CN1297488 A CN 1297488A CN 99805198 A CN99805198 A CN 99805198A CN 99805198 A CN99805198 A CN 99805198A CN 1297488 A CN1297488 A CN 1297488A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
nucleotide
sequence
fluorescence
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN99805198A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1203186C (zh
Inventor
M·A·李
D·L·勒斯利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UK Secretary of State for Defence
Original Assignee
UK Secretary of State for Defence
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UK Secretary of State for Defence filed Critical UK Secretary of State for Defence
Publication of CN1297488A publication Critical patent/CN1297488A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1203186C publication Critical patent/CN1203186C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/80—Elimination or reduction of contamination by undersired ferments, e.g. aseptic cultivation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Geophysics And Detection Of Objects (AREA)
  • Eye Examination Apparatus (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

一种用于检测在某样品中是否存在目标核酸序列的方法,该方法包括:(a)使用一套核苷酸对所说的样品进行扩增反应,其中至少一个核苷酸是被荧光标记的,(b)在探针与目标序列杂交的条件下使扩增产物与探针混合,所说的探针包括一种活性分子,该活性分子能够从荧光标记核苷酸吸收荧光或向其贡献荧光能量,及(c)检测样品的荧光。该方法可以被用于定量样品中目标核酸的数量,也能确定序列特征。实现该方法的试剂盒也是要求专利保护的。

Description

用PCR检测目标核酸的方法
本发明提供一种用于检测在某种样品中一种目标多核苷酸的方法，例如通过监测一个扩增反应，优选地在一种定量方法中，除此之外还有用于这些方法中的探针及试剂盒。该方法也适用于检测序列特性，如多态性或等位基因变异，并也可用于诊断方法中。
已知的荧光多聚酶链式反应(PCR)监测技术包括链特异性及普通的DNA嵌入技术，这些技术能被用在许多第二代PCR热循环装置上。
普通方法利用DNA嵌入染料，当该染料结合于双链DNA时，表现升高的荧光特征。由于在扩增期间DNA堆积浓度升高引起的荧光增强，可以用于测量反应进展及确定目标分子的拷贝数。此外，在一个受控制的温度变化下来检测荧光，可以制作DNA解链曲线，例如，在PCR热循环结束时。
普通DNA方法检测核酸堆积浓度升高没有任何的时间补偿(timepenalty)。单独的荧光读数可以在每一反应的同一点取得。终点解链曲线分析能用来从扩增子中辨别假阳性及识别扩增子。产物峰值可以在不能通过琼脂糖凝胶电泳看见的浓度下观察到。
为得到高清晰度的解链数据。解链实验必须缓慢地在现有的硬件设备上处理5分钟来完成。然而，通过不断地检测荧光扩增，就能产生一个解链和杂交滞后现象的3D图像。该3D图像是扩增子依赖性的，并且可以提供足够的信息用于产物识别。
已发现，总的来说，DNA解链曲线分析在优化PCR热循环中是一种有力的工具。通过确定扩增子的解链温度，就可以在后来的PCR循环中降低变性温度到这一温度。优化用于扩增从第一代反应产物而不是基因组DNA，以减少在后来循环中产生的假阳性。引物寡核苷酸及它们的互补物的解链温度，能够用于确定其退火温度，以减少经验优化的需要。
然而普通的嵌入剂方法仅仅是准-链特异性的(quasi-strand-specific)，因此在需要链特异性检测时并不是非常有用。
链特异性方法利用附加的核酸反应成分来检测扩增反应进展。这些方法可用荧光能量转移(FET)作为检测的基础。一个或多个核酸探针用荧光分子标记，其中一个能够作为能量供体分子而其它的作为能量接受体分子。已知这些分子有时分别称为一种报告分子及一种淬灭分子。供体分子在特定光波长下被激发。并且在该光波长下它将正常地表现一种荧光发射波长。接受体分子在该波长下也被激发，这样，它就可以通过一种距离依赖的能量转移机制接受供体分子的发射能量。一个能够产生的荧光能量转移的特异例子是荧光共振能量转移(FRET)。通常，当非常接近时，接受体分子才可以接受供体分子的发射能量(如在相同的或紧邻位置的分子)。FET或FRET检测的基础是检测供体及接受体发射波长的变化。
有两种普遍运用的FET或FRET探针形式，即：利用加水分解(水解)的核酸探针从接受体中分离供体，以及利用杂交以改变接受体与供体分子空间距离关系。
水解探针可以通过商业途径得到，如TaqManTM探针。这些探针由接受体及供体分子已标记的DNA寡核苷酸组成。探针被设计成可接合于PCR产物的一条链的某一特异区域。随着PCR引物与这条链的退火，Taq酶通过其5’到3’聚合酶活性延长DNA。Taq酶也表现5’到3’外的核酸酶活性。TaqManTM探针的3’末端通过磷酸化方式得以保护，以阻止它们引发Taq延伸。假如TaqManTM探针与产物链杂交，一个延伸的Taq分子也可以水解该探针，从接受体中释放供体作为检测的基础。在这种情况下信号累积，自由供体和接受体分子浓度随着每一个扩增反应循环而升高。
信号产生依赖于探针水解的发生的事实意味着有一个时间限定与该方法相关联。此外，探针的存在可以中断PCR过程的顺序操作过程。
另外，已发现水解可以变成非特异性的，特别是在需要大量的扩增循环过程中，例如，超过50个循环。在这种情况下，探针非特异性水解将导致一种不正当地升高的信号。
这就意味着，这些技术与随着快速热空气循环仪例如Idaho技术公司的RapidcyclerTM及LightcyclerTM的发展而变得比较著名的快速PCR方法并不是非常和谐的。其它快速PCR装置已被描述，例如在共同未决的英国专利申请号9625442.0及9716052.7中。与传统热循环相比，快速循环的优点已被很多地方报道。这些技术是特别有用的，例如在对生物学的竞争检测系统中，在那里，如果想要避免丧失生命或严重伤害，得到结果的速度是非常重要的。
此外，水解探针不提供关于解链滞后现象的明显的信息，因为信号的产生基本上依赖于探针的水解而不是扩增子的解链温度。
杂交探针可以用许多形式获得。分子信号是具有互补的5’及3’序列的寡核苷酸，以致于它们形成发卡环。终端荧光标记是非常紧密相邻的，当形成发卡结构时，以使FRET产生。随着分子信号与一互补序列的杂交，荧光标记被分离，于是FRET不产生，这就是检测的基础。
成对的标记寡核苷酸也可以被应用。这些在一条PCR产物链上最近距离的杂交把供体及接受体分子带到一起，于是FRET能够产生。增强的FRET是检测的基础。这种类型的变异体包括用一种标记的扩增引物与一个单独邻近的探针。
用两种探针或者一种包括两种标记分子的分子信号类型的探针增加了该过程的费用。另外，该方法需要一段合理的长度已知序列的存在，以使两种足够长的已知探针能够在最近距离上互相特异结合。这在一些诊断应用中可能成为一个问题，那里，在一个机体中能够被用于设计一种有效探针的保守序列的长度，例如HIV病毒，可能会相对较短。
而且，应用成对的探针包括更多复杂的实验设计。例如，通过一种探针的解链所提供的信号是双方探针解链的功能。很小错配的研究或其中探针中的一条需要通过与一个剪接区杂交结合(例如，与DNA相比，检测一样品中的RNA，其中在一个内含子任意一侧中的序列都能被用作探针位点)，假如其它探针先解链，会产生不正确的结果。
本申请人已开发了一种用于检测特异核酸序列存在与否的分析方法，该方法也可适应于确定样品中目标序列的数量。
这样，本发明提供一种检测在某样品中一目标核酸序列是否存在的方法，该方法包括(a)使用一组核苷酸对所说的样品进行扩增反应，其中至少一个核苷酸是被荧光标记的，(b)在探针与目标序列杂交的条件下使扩增产物与探针接触混合，所用的探针包括一种活性分子，该活性分子能够从荧光标记核苷酸吸收荧光或向其贡献荧光能量，及(c)监测样品的荧光。
利用该类型的一种分析，一种荧光标记将仅仅掺入扩增产物中。当探针与扩增反应中所产生的任一特异目标序列杂交时，活性分子通过FET或FRET方式从标记的核苷酸吸收能量或供给标记的核苷酸能量。适宜地，活性分子能够从标记的核苷酸吸收荧光，于是荧光就因此减少，该荧光的减少可以被检测到并指示探针的结合。
最优选地，该活性分子是一种在一特征波长下发射荧光的接受体分子。在这种情况下，从接受体分子升高的荧光，该荧光与标记的核苷酸的荧光波长不同，也可以指示探针的结合。
如此标记的扩增产物的存在情况能够通过检测仅仅特异与目标序列结合的探针上的接受体分子的荧光性来探知。在该种情况下，扩增产物的信号能够从荧光标记的背景信号中区分并也能从任何非特异扩增产物中区分出来。
信号是部分地与扩增产物及探针相关联的事实意指就检测含有大量背景DNA的反应混合物中的特异性目标序列来说，该体系是高度特异的。这是因为从非特异扩增产物中形成的信号能够被有效地从测量过的信号中除去。
一种该性质的分析方法能够用便宜的试剂完成。单独标记的探针对那些包括供体和接受体分子的探针来讲是更经济的。
像这里所用的，表述“核苷酸组”(set of nucleotides)指一组足够形成核酸如DNA和RNA的核苷酸。因此包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。这些中的一或多个是用荧光标记的。标记的尿嘧啶可以从Boehringer Mannheim得到。适宜的荧光标记是荧光素。
利用标记的尿嘧啶可能是特别优选的，在于利用它可以形成一种防止污染或从一个扩增反应中贮存到供在该反应管(vessels)中进行的随后扩增反应中使用的策略。消化含有尿嘧啶的核酸的酶，例如尿嘧啶-N-糖苷酶，可以用于预循环孵育步骤，以保证任何残余的扩增子在随后的应用中，于热循环开始之前被消化。
适宜地，不仅一种核苷酸，并且最优选地，所有核苷酸都进行标记，因为这样可以节制从扩增产物中形成的信号水平，并由此影响FET或FRET信号。
扩增可以用已知的扩增反应如聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，链置换分析(SDA)或NASBA来恰当地实现，但优选地为PCR。
优选地，寡核苷酸和接受体分子的荧光都被检测，并计算荧光发射之间的关系。
适宜的活性分子(如接受体分子)是罗丹明染料(rhodaminedyes)或其它染料如Cy5。这些染料可以通过一种常规的方式附着于探针上。活性分子吸附于探针的位置是不重要的，尽管大体上，它们将定位在探针的末端区。
为在活性分子与核苷酸荧光发射间产生FET如FRET，作为供体的荧光发射元素(活性分子或标记的核苷酸)必须比接受体元素波长短。
为此，适宜的化合物在下表中予以陈述：
    供体     接受体
    SYBRGold     罗丹明
    SYBRGreen I     罗丹明
    SYBRGold      Cy5
    SYBRGreen I      Cy5
    荧光素     溴化乙锭
优选地，用作供体和/或接受体的分子产生尖峰，并且在发射波长下少有或没有重叠。在这种情况下，无需从扩增产物产生的信号中分辨“链特异峰”。一种简单的测量该单独的链特异性信号(也就是通过活性分子提供的)将提供关于通过目标反应引起的FET或FRET程度的信息。溴化乙锭(EB)/荧光素联合就可以完成这一要求。在那种情况下，链特异性反应通过在520nm处荧光的减少是可以测量的，适宜地表示为1/荧光。
然而，一旦在从接受体及供体分子得来的荧光信号中有一个光波的重叠，这就能够在结果中捕捉到，例如通过经验地检测光谱间的光波吸收并用这种关系来从两种信号中标准化信号。
本发明方法在其应用领域是相当多用途的。该方法能用于产生样品中关于目标核酸序列的定量及定性数据，像在下文中更详细的讨论。尤其，不仅本发明提供定量扩增，而且它可以被用于，附加地或选择地，获得特征数据如双链体不稳定温度或解链点。
本发明方法中，样品可历经一定条件，在这种条件下探针将在扩增反应完成期间或之后与样品杂交。该过程允许检测在一种同质的方式中实现，在于扩增及检测能够在一个单独的已在开始加入所有试剂的容器中完成，不需要后来的试剂加入步骤，也没有在固相支持物存在下实现该方法的任何需要(尽管这是一种自由选择，像下文中进一步讨论的那样)。
例如，探针在整个扩增反应中存在，荧光信号将允许检测扩增反应进展。这将提供一种对存在于样品中的目标核苷酸定量测定的手段。
在每一个扩增反应循环过程中，扩增子链包括结合于探针的目标序列并由此产生一个接受体信号。因为在样品中的扩增子数量的增加，于是接受体信号也将增加。通过升高率对循环数的坐标作图，可以确定升高的起始点。
探针可以包含一种核酸分子，例如DNA或RNA，当目标核酸序列为单链形式时，探针将与其杂交。在这种情况下，步骤(b)将包括能够使目标核酸形成单链的应用条件。选择地，探针也可以包含一种特异结合于双链形式的目标序列的分子，如一种肽核酸。
尤其，所用的扩增反应将包括把样品放于一定条件下的步骤，在该条件下存在于样品中的任何目标核酸序列都变成单链，例如PCR或LCR。
因此，提供适合的杂交条件，探针在扩增反应过程中发生杂交是可能的。
在一个优选的实施方案中，探针可以被设计以致这些条件在扩增反应的每一个循环中都能遇到。这样，在扩增反应的每一个循环中的一些点，探针将与目标序列杂交，由于FET或FRET而产生一种信号。随着扩增反应的进展，探针将从目标序列上分离或解链，于是由活性分子产生的信号将或者降低或者升高，这依赖于它是否包含供体或接受体分子。例如，如果那是一个接受体，在扩增反应的每一个循环中，就从该活性分子产生一个荧光峰。随着扩增反应进展，峰强度会增加，因为可以有更多的目标序列能够与探针结合。
通过检测在每一循环过程中样品中活性分子的荧光，扩增反应进展能在多种途径下被检测到。例如，由解链峰提供的数据可被分析，如通过计算解链峰下的面积，这个数据与循环数对应在坐标上标出。
荧光通过一种已知的荧光计适宜地加以检测，从这些，例如以光电倍增管电压形式形成的信号，被送入数据信息处理机并能转换成一种与每一样品管相关联的光谱。许多管，例如96管，可以同时进行分析。数据也可以用这种方式在整个反应过程中常有的时间间隔下收集，如每隔10毫秒(ms)。
在这种方式下产生的光谱可以解释，如用预选的荧光半分子的“适合物”(fits)，像染料形成代表每一信号半分子(也就是核苷酸标记和/或活性分子)的峰。峰下面积，它代表每一信号的强度值，可以被确定，并且如果需要，表示为互相的商数。信号强度和/或比率间的差别将允许在通过反应记录的FET或FRET中变化，或在不同的反应条件下变化如温度。该变化，如上所概述的，与探针及目标序列之间结合现象相关。不同峰下的完整面积可以用于计算FET或FRET效果的强度值。
该数据提供一种测量目标核酸在样品中存在数量的方法。
探针可以或自由存在于溶液中或固定于固相支持物上，例如，固定于一种珠子的表面，像磁珠，主要用于分离产物，或一种检测装置表面，如一种胞质团共振检波器的波导管表面(the waveguide of asurface plasmon resonance detector)。选择依赖于特殊分析的性质及运用的特殊检测手段。
探针可以被设计以致于它能通过在扩增反应中所用的DNA聚合酶而杂交，而由此释放接受体分子。随着在每一循环中存在于体系内的自由活性分子数量的增加，它提供一种累积信号。然而，在这种分析中它并不重要，因为以这种方式消耗的探针不依赖于探针的水解作用。
为了得到一个完整不可逆的并直接与存在于反应中每一阶段的扩增产物数量相关的信号，和/或其中反应速度的重要性是最大的，例如在快速PCR中，探针设计为可以从目标序列上完整无损地释放出来是优选的，这样探针可以参与下一个反应。这可能是，例如在扩增反应的延伸阶段。然而，因为信号不依赖于探针的水解，该探针可设计成在扩增循环中的任何阶段与目标序列杂交或从目标序列解链，包括反应的退火或解链阶段。这样的探针将保证扩增反应的干扰被降低到最小程度。
被用于在延伸阶段与目标序列结合的探针，其完整无损地释放可通过运用缺乏5’到3’外切酶活性酶如Taq酶stoffle片段或pwo来实现。当需要快速PCR时，因为避免了水解步骤，这可能是有用的。
当用于这种形式下，保证探针在反应的延伸阶段不被延伸是重要的。因此，探针的3’末端适宜地通过磷酸化作用进行封闭。
在这种方式下产生的数据，可以用许多方法加以解释。在最简单的形式中，在扩增反应中或结束时接受体分子荧光增加指示目标序列存在的数量的增加，该事实提示扩增反应已经进行并且目标序列事实上是存在于样品中的。然而如上所述，通过监测扩增反应全过程，定量也是可能的。最后，获得特征性数据，尤其解链点分析是可能的，或者如一个终点测量或全过程，目的是为获得将在以下被进一步讨论的关于该序列的信息。
这样，本发明的一个优选的实施方案包含一种用于检测核酸扩增的方法，包括完成对一目标多聚核苷酸扩增，在以下事件存在下(a)一种核酸多聚酶(b)至少一个能够与所说的目标多聚核苷酸杂交的引物(c)一套核苷酸，至少其中之一是荧光标记的，以及(d)一种能够与目标多聚核苷酸序列结合的寡核苷酸探针，并且它含有一种能够从该标记核苷酸吸收荧光或供给荧光的活性分子；以及检测扩增反应过程中的荧光变化。适宜地，活性分子是一种能从标记的核苷酸吸收能量的接受体分子。
扩增反应被适宜地用一对设计成为仅仅扩增DNA链内的目标核苷酸序列的引物来完成，就像本领域所熟知的那样。核酸多聚酶适宜地是一种热稳定多聚酶，如Taq多聚酶。
在适当的条件下扩增反应能得以完成是本领域熟知的。最佳的条件在每一种情况是可以变化的，依赖于所包括的特定的扩增子，所用引物的性质以及使用的酶。在每一种情况下的最佳条件可以由技术人员来确定。代表性的变性温度在95℃左右，代表性的退火温度在55℃左右，延长温度在72℃左右。
在本发明的一种特别的实施方案中，探针可以用于定量RNA转录本，例如，在表达实验中，也可用于药物开发中。尤其这种实施方案用作对来源于真核细胞机体的组织进行的表达研究是适宜的。真核细胞中编码蛋白的DNA可含有内含子，DNA序列非翻译区，如编码蛋白序列的外显子。非编码内含子序列在细胞“剪接”过程中从来源于DNA序列的RNA序列中被除去。PCR引物通常结合于编码区，并且当在全部的核酸提取物中用反转录PCR(RT-PCR)时，产物将从DNA依赖的扩增以及RNA依赖的扩增两者中产生。这样当用于表达研究时，单独用PCR，将包括从基因组DNA及表达的RNA两者中都产生的扩增结果。
一种设计成结合横过内含子的探针，在编码外显子的邻近末端区域，因为内含子区域的原因将限制相互作用。剪切的RNA除去了这些区域，因此编码外显子的邻近末端区域形成一个允许探针有效结合的连续的序列。
相反地，一种探针可以仅仅检测一种基因组DNA的扩增产物，如果该探针被设计成结合于内含子区域。从这一探针产生的信号将只与样品中的DNA浓度有关而与样品中RNA浓度无关。
这样，在一种更进一步的实施方案中，探针或者对RNA的剪接区域或DNA的一个内含子是特异的，结果仅仅一种扩增的RNA或扩增的DNA被检测和/或定量。
选择地或附加地，本发明之方法可以用于检测某一序列特征的杂交分析中。这样，更进一步，本发明提供一种用于检测某一序列特征的方法，该方法包括(a)用至少其中一种核苷酸是荧光标记的一套核苷酸扩增所说的序列，(b)在一定条件下，接触扩增产物与一种探针，在这种条件下，探针将与该序列杂交，所说的探针包含一种能够从荧光标记的核苷酸吸收荧光或向其供给荧光能量的活性分子并且(c)监测样品的荧光并测定序列特征性的特定反应条件，在该条件下由于探针与该样品杂交或在探针与目标核酸序列间形成的双链体不稳定而导致荧光变化。
适宜的反应条件包括温度，电化学或对特殊的酶或化学试剂存在的响应。通过检测荧光变化，因为这些特征是变化的，就可以得到该序列精确性质的信息特征。例如，就温度来说，作为一种加热的结果，探针从样品中的序列分离的温度能被确定。这对在遗传诊断中检测，假如乐意的话也可以定量多态性或/和等位基因变异是非常有用的。就“多态性”来说，它包括尤其自然中可能发生在序列上的跃迁，易位，插入，缺失或倒位。
如果目标序列仅仅发生一对碱基变化，解链的滞后作用将会是不同的。这样，例如其中一个样品仅仅含有一种单一等位基因突变体，探针的解链温度将是一个特殊的值，该值与在某一仅仅含有另一种等位基因突变体的样品的值是不同的。一种含有两种等位基因突变体的样品，显示两个解链点，它相对应于每一个等位基因突变体。类似的考虑运用于电化学特性方面或在某种酶或化学试剂存在情况下。探针可以横穿固定于一种固体表面，它可以运用一种电化学势。在特定电化学势下，目标序列将结合于或被排斥出探针，这依赖于该序列的精确性质。
另外，探针杂交的动力学将允许确定，用绝对术语，目标序列浓度。样品的荧光变化允许用于计算探针与样品的杂交率。一个升高的杂交率与存在于样品中的目标序列的浓度相关。由于目标序列的浓度随着扩增反应进展而升高，探针杂交将会更快地发生。这样，该参数也能用作定量的基础。该数据处理模型很有用在于它不依赖于信号强度来提供信息。
本发明的更进一方面包括用于本发明之方法中的试剂盒。这些试剂盒含有一种对目标核苷酸序列特异的探针，其中包括一种活性分子，特别地一种接受体分子。如果希望，探针可以固定在一支持物上，例如一种珠子，如一种磁珠或用在一种检波器中的一支持物，例如一种瞬息波检波器装置的波导管。
附加地，试剂盒可含有一或多种荧光标记的核苷酸，它/它们是与所说的活性分子匹配的。试剂盒其它的潜在成份包括用于扩增反应的试剂，例如DNA多聚酶。
表1用图表形式显示本发明方法中发生的相互作用。
在举例性的扩增反应中，一种DNA分子(1)通过将其与成对的扩增引物(2)，(3)和一组核苷酸(4)混合准备扩增，其中一些核苷酸已用荧光标记(5)进行了标记。DNA分子(1)被变成单链(图1B)，于是引物(2，3)如所熟知的那样，在一个扩增反应中作为上游(正向)及下游(反向)引物与DNA结合。在随之而来的扩增反应过程中，形成一个扩增子产物(6)(图1C)。当该产物形成时，标记与未标记的核苷酸都掺入其中。正常情况下，扩增产物(6)仅仅含有被引物所限定的目标序列。
在随后的扩增阶段，当该产物解链时，含有一个接受体分子(8)的探针(7)结合于目标序列(图1D)。在荧光核苷酸及接受体分子之间的FRET相互作用产生一个在特征性接受体波长下的信号。
然后接受体信号(8)能通过用传统的荧光检测装置监测。

Claims (21)

1．一种用于检测样品中是否存在目标核酸序列的方法，该方法包括(a)使用一套核苷酸对所说的样品进行扩增反应，其中至少一个核苷酸是被荧光标记的，(b)在探针与所说的目标序列杂交的条件下使扩增产物与探针接触混合，所用的探针包括一种活性分子，该活性分子能够从荧光标记核苷酸吸收荧光或向其贡献荧光能量及(c)检测样品的荧光。
2．根据权利要求1的方法，其中活性分子从荧光标记核苷酸上吸收荧光。
3．根据权利要求2的方法，其中活性分子是一种在特征波长下发射能量的接受体分子。
4．根据权利要求3的方法，其中接受体分子是罗丹明染料或其它染料如Cy5。
5．根据前述任何一项权利要求的方法，其中标记的核苷酸是标记的尿嘧啶。
6．根据前述任何一项权利要求的方法，其中所有用于扩增反应中的核苷酸都是标记的。
7．根据前述任何一项权利要求的方法，其中扩增反应包含多聚酶链式反应(PCR)。
8．根据前述任何一项权利要求的方法，其中标记核苷酸与活性分子两者的荧光都被监测并且计算发射光间的关系。
9．根据前述任何一项权利要求的方法，其中探针在整个扩增反应中都存在。
10．根据权利要求9的方法，其中荧光信号被监测，其结果用于定量样品中存在的目标序列的数量。
11．根据前述任何一项权利要求的方法，其中探针设计为可以被在扩增反应中所用的DNA多聚酶水解。
12．根据权利要求1-10中任何一项的方法，其中探针设计为在扩增反应的延伸阶段从目标序列上完整地释放出来。
13．根据权利要求12的方法，其中扩增反应用一种缺乏5’-3’外切酶活性的酶实现。
14．根据权利要求13的方法，其中该酶为Taq酶的stoffle片段或Pwo。
15．根据权利要求12-15的任何一项的方法，其中探针3’末端通过磷酸化封闭。
16．一种用于检测核酸扩增的方法，包括：在下述条件存在下，对目标多核苷酸进行核酸扩增，(a)一种核酸多聚酶，(b)至少一条能够与所说的目标多核苷酸杂交的引物，(c)一套核苷酸，至少其中之一为荧光标记，(d)一种能够与目标多聚核苷酸序列杂交并且含有一种能够从标记的核苷酸吸收荧光能量或供给其荧光能量的活性分子的寡聚核苷酸探针；以及监测扩增反应期间的荧光变化。
17．根据权利要求16的方法，其中扩增通过用一对引物完成，引物被设计为仅仅一条DNA链内的目标核苷酸序列被扩增。
18．根据前述任何一项权利要求的方法，其中探针对或者RNA的一个剪接区域或者在DNA中的一个内含子是特异的，以使扩增的RNA或扩增的DNA中仅有一种被检测和/或定量。
19．用于确定序列的特征的方法，该方法包括(a)用至少其中一种为荧光标记的一套核苷酸扩增所说的序列，(b)在探针与所说靶序列杂交的条件下接触混合扩增产物与探针，所说的探针包含一种能够从荧光标记的核苷酸吸收荧光或向其供给荧光能量的活性分子并且(c)监测所述样品的荧光及测定作为所说序列特征的特定反应条件，在该条件下由于探针与该样品杂交或在探针与目标核酸序列间形成的双链体不稳定而导致荧光变化。
20．用于检测一种多态性和/或等位基因变异的方法，该方法包括用如权利要求1限定的方法扩增怀疑含有所说多态性或变异的序列，用产生的荧光信号测量探针从扩增产物上解链的温度，将这一测量结果与一种多态性或等位基因变异的存在相关联。
21．用于前述权利要求中任一项的方法的试剂盒，它包含一种对含有一种活性分子及一种与该活性分子相匹配的荧光标记核苷酸的目的核苷酸序列特异性的探针。
CNB998051985A 1998-02-19 1999-02-18 用pcr检测目标核酸的方法 Expired - Fee Related CN1203186C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9803382.2A GB9803382D0 (en) 1998-02-19 1998-02-19 Detection system
GB9803382.2 1998-02-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1297488A true CN1297488A (zh) 2001-05-30
CN1203186C CN1203186C (zh) 2005-05-25

Family

ID=10827164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998051985A Expired - Fee Related CN1203186C (zh) 1998-02-19 1999-02-18 用pcr检测目标核酸的方法

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6287781B1 (zh)
EP (1) EP1055002B1 (zh)
JP (1) JP2003512808A (zh)
CN (1) CN1203186C (zh)
AT (1) ATE398187T1 (zh)
AU (1) AU746149B2 (zh)
CA (1) CA2321185C (zh)
CZ (1) CZ20002958A3 (zh)
DE (1) DE69938894D1 (zh)
GB (4) GB9803382D0 (zh)
HU (1) HU226518B1 (zh)
IL (1) IL137909A0 (zh)
NZ (1) NZ506333A (zh)
RU (1) RU2199588C2 (zh)
SK (1) SK12212000A3 (zh)
WO (1) WO1999042611A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101035908B (zh) * 2004-07-29 2011-11-16 路玛拉有限公司 确定样本中模板核酸数量的方法
CN109576350A (zh) * 2019-01-18 2019-04-05 深圳恒特基因有限公司 一种dna与rna同时定量的试剂盒、方法及质控方法

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9725197D0 (en) * 1997-11-29 1998-01-28 Secr Defence Detection system
GB9918237D0 (en) * 1999-08-04 1999-10-06 Secr Defence Detection system
GB0005281D0 (en) * 2000-03-07 2000-04-26 Secr Defence Analytical method
GB2360088A (en) * 2000-03-07 2001-09-12 Secr Defence Method and kit for determining PCR amplification reaction conditions
EP1354064A2 (en) 2000-12-01 2003-10-22 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
GB0110501D0 (en) 2001-04-30 2001-06-20 Secr Defence Brit Amplification process
ATE408710T1 (de) * 2001-05-07 2008-10-15 Mayo Foundation Nachweis von legionella durch ein pcr und fret verwendendes verfahren
GB0111275D0 (en) 2001-05-09 2001-06-27 Secr Defence Analytical method and kit
GB0112868D0 (en) * 2001-05-25 2001-07-18 Secr Defence Detection system
US9261460B2 (en) 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
US6593093B1 (en) * 2002-02-20 2003-07-15 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of group a Streptococcus
US9353405B2 (en) * 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
DE60334132D1 (de) * 2002-05-31 2010-10-21 Nat Inst Of Advanced Ind Scien Neues verfahren zum testen von nukleinsäure unter verwendung von markiertem nukleotid
WO2003102239A2 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Secretary, Department Of Atomic Energy Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands
US7183104B1 (en) 2002-08-23 2007-02-27 Duane Morris Llp Separator and particle detection system
US7074598B2 (en) * 2002-09-25 2006-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of vancomycin-resistant enterococcus spp.
WO2004074447A2 (en) * 2003-02-18 2004-09-02 Applera Corporation Compositions and methods for multiplex analysis of polynucleotides
GB0304832D0 (en) 2003-03-04 2003-04-09 Secr Defence Assay method
EP1641938A2 (en) * 2003-06-30 2006-04-05 AstraZeneca AB Nucleic acid polymerase fluorescence assays
GB0503172D0 (en) 2005-02-16 2005-03-23 Enigma Diagnostics Ltd Detection method
GB0517005D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Enigma Diagnostics Ltd Analytical method and kit
RU2005132940A (ru) * 2006-03-01 2007-11-27 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (RU) Способ детекции специфических фрагментов днк или рнк с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
BRPI0709282B8 (pt) 2006-03-29 2021-05-25 Merial Ltd vacina contra estreptococos
GB0806676D0 (en) 2008-04-12 2008-05-14 Environment Agency The Environmental monitoring
EP2116614A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-11 Qiagen GmbH Simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction
EP2138588A1 (en) * 2008-06-23 2009-12-30 Koninklijke Philips Electronics N.V. Melting curve measurement during amplification
WO2011022589A2 (en) * 2009-08-20 2011-02-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of enterovirus
GB0915664D0 (en) 2009-09-08 2009-10-07 Enigma Diagnostics Ltd Reaction method
RU2585519C2 (ru) * 2012-11-28 2016-05-27 ЗАО "Геноаналитика" Способ селективного отбора целевых участков днк
RU2681822C2 (ru) * 2014-09-26 2019-03-12 Ту Пор Гайс, Инк. Детекция целевой последовательности путем нанопорового сенсорного обнаружения синтетических зондов
US11486873B2 (en) 2016-03-31 2022-11-01 Ontera Inc. Multipore determination of fractional abundance of polynucleotide sequences in a sample
RU2665631C2 (ru) * 2017-01-25 2018-09-03 Общество с ограниченной ответственностью "Секвойя Дженетикс" Способ специфической идентификации последовательностей днк
CN108642150B (zh) * 2018-05-18 2023-12-08 阅尔基因技术（苏州）有限公司 一种基于fret的荧光核酸检测方法和试剂盒
US11604186B2 (en) * 2018-10-17 2023-03-14 Molecular Devices (Austria) GmbH Real time western blot assays utilizing fluorescence resonance energy transfer (FRET)
JP7482795B2 (ja) 2018-12-21 2024-05-14 イルミナ インコーポレイテッド 感知システム

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567583A (en) 1991-12-16 1996-10-22 Biotronics Corporation Methods for reducing non-specific priming in DNA detection
WO1996034983A1 (en) 1995-05-05 1996-11-07 The Perkin-Elmer Corporation Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay
US5716784A (en) * 1996-02-05 1998-02-10 The Perkin-Elmer Corporation Fluorescence detection assay for homogeneous PCR hybridization systems
ATE295427T1 (de) 1996-06-04 2005-05-15 Univ Utah Res Found Überwachung der hybridisierung während pcr
US5866336A (en) * 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US6140054A (en) * 1998-09-30 2000-10-31 University Of Utah Research Foundation Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101035908B (zh) * 2004-07-29 2011-11-16 路玛拉有限公司 确定样本中模板核酸数量的方法
CN109576350A (zh) * 2019-01-18 2019-04-05 深圳恒特基因有限公司 一种dna与rna同时定量的试剂盒、方法及质控方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1055002B1 (en) 2008-06-11
AU2538399A (en) 1999-09-06
DE69938894D1 (de) 2008-07-24
IL137909A0 (en) 2001-10-31
HU226518B1 (en) 2009-03-30
ATE398187T1 (de) 2008-07-15
WO1999042611A1 (en) 1999-08-26
NZ506333A (en) 2002-10-25
GB9902290D0 (en) 1999-03-24
SK12212000A3 (sk) 2002-09-10
AU746149B2 (en) 2002-04-18
GB9803382D0 (en) 1998-04-15
CA2321185C (en) 2009-04-21
GB9903796D0 (en) 1999-04-14
CA2321185A1 (en) 1999-08-26
GB9903578D0 (en) 1999-04-07
HUP0101385A2 (hu) 2001-08-28
US6287781B1 (en) 2001-09-11
EP1055002A1 (en) 2000-11-29
HUP0101385A3 (en) 2003-08-28
CN1203186C (zh) 2005-05-25
JP2003512808A (ja) 2003-04-08
CZ20002958A3 (cs) 2002-02-13
RU2199588C2 (ru) 2003-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1203186C (zh) 用pcr检测目标核酸的方法
US20130178378A1 (en) Multiplex digital pcr
JP4969250B2 (ja) スペーサー領域を使用するプロテウス種の検出、同定、および区別
US9845495B2 (en) Method and kit for detecting target nucleic acid
US20140017689A1 (en) Method for detecting nucleic acids
CA2448211C (en) Nucleic acid detection method
CN104039978A (zh) 水解探针
US20140274779A1 (en) Multiplex allele detection
CA2993517A1 (en) Single nucleotide polymorphism in hla-b*15:02 and use thereof
WO2001004357A9 (en) Generic sbe-fret protocol
WO2006061994A1 (ja) 遺伝子配列検査法
JP2018516594A5 (zh)
AU2002311414A1 (en) Nucleic acid detection method
KR20130029748A (ko) ＩＬ28Ｂ(ｒｓ8099917)와 ＩＴＰＡ(ｒｓ1127354)의 변이를 검출하는 방법
US20050277134A1 (en) Method for amplifying nucleic acid and analysis of single-nucleotide polymorphism using the same
CN102822354A (zh) 用于检测人乳头瘤病毒(hpv)的密切相关的血清型的测定法
Wilhelm et al. Comparison between Taq DNA polymerase and its Stoffel fragment for quantitative real-time PCR with hybridization probes
CN1180091C (zh) 一种复合基因探针的结构和用途
WO2006112939A2 (en) Compositions, methods, and kits for analyzing dna methylation
US20040161763A1 (en) Fluroscence polarisation
US20070122827A1 (en) Target nucleic acid signal detection
US20040121359A1 (en) Fluorescence polarisation
CN104395468A (zh) 检测hla-a*24:02的方法及检测试剂盒
AU2003247603A1 (en) Methods and compositions for monitoring primer extension and polymorphism detection reactions
Dong et al. Polymerization-driven successive collapse of DNA dominoes enabling highly sensitive cancer gene diagnosis

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20050525

Termination date: 20130218