ES2281880T3 - Procedimiento de deteccion de acidos nucleicos que usa multiples pares de fluoroforos donadores y moleculas inhibidoras de la fluorescencia en la misma sonda. - Google Patents
Procedimiento de deteccion de acidos nucleicos que usa multiples pares de fluoroforos donadores y moleculas inhibidoras de la fluorescencia en la misma sonda. Download PDFInfo
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Abstract
Un oligonucleótido detector, que comprende muy próximos al menos dos pares de un fluoróforo donador y una molécula inhibidora de la fluorescencia, en el que dicho fluoróforo donador y dichas moléculas inhibidoras de la fluorescencia en cada par dicho están separados por un sitio de escisión que puede escindirse en forma de cadena doble, y en el que la escisión en dicho sitio de escisión puede crear una señal detectable que indica la presencia de un ácido nucleico diana.
Description
Procedimiento de detección de ácidos nucleicos
que usa múltiples pares de fluoróforos donadores y moléculas
inhibidoras de la fluorescencia en la misma sonda.
La presente invención se refiere en general a
procedimientos para detectar secuencias diana de ácidos nucleicos.
En particular, la presente invención se refiere a un oligonucleótido
detector que comprende múltiples fluoróforos que es útil para la
detección altamente sensible de ácidos nucleicos.
La identificación de secuencias únicas de ADN o
ARN o genes específicos dentro de una muestra biológica puede
indicar la presencia de un estado fisiológico o patológico tal como
cáncer o una infección patógena. Por ejemplo, los ensayos de
hibridación de ácidos nucleicos pueden usarse en la industria
agrícola y alimentaria para detectar patógenos vegetales o
bacterias dañinas.
Los marcajes luminiscentes, que emiten luz tras
la excitación por una fuente de energía externa, han resultado ser
útiles para detectar moléculas de ácidos nucleicos y para investigar
la interacción entre estas moléculas. Estos marcajes se clasifican
por la fuente de la energía de excitación, tal como, por ejemplo:
(1) marcajes fotoluminiscentes o fluorescentes, que pueden
excitarse mediante unidades de radiación electromagnética de luz
infrarroja, visible o ultravioleta; (2) marcajes
quimioluminiscentes, que obtienen energía de reacciones químicas;
(3) marcajes radioluminiscentes, que pueden excitarse mediante
energía de partículas de alta energía; y (4) marcajes
bioluminiscentes, que pueden excitarse mediante energía suministrada
en un sistema biológico. El uso de marcajes luminiscentes permite
técnicas de ensayo "homogéneas" en las que una sonda marcada
con un marcaje luminiscente presenta diferentes características
luminescentes cuando se asocia con una diana, obviándose así la
necesidad de eliminar la sonda marcada no asociada. Véase, por
ejemplo, Morrison y col., Anal. Biochem. 183: 231
(1989).
Los marcajes luminiscentes también han resultado
ser útiles en técnicas de amplificación de ácidos nucleicos. Los
cebadores de señal luminiscente (también denominados en lo sucesivo
"sondas detectoras"), que hibridan con una secuencia diana en
dirección 3' desde el sitio de hibridación de los cebadores de
amplificación, se han descrito para uso en la detección de
amplificación de ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, la patente
de los EE.UU. número 5.547.861. Un cebador de señal se alarga
mediante la polimerasa de un modo similar al alargamiento de los
cebadores de amplificación. El alargamiento del cebador de
amplificación desplaza el producto de alargamiento del cebador de
señal de un modo dependiente de la amplificación diana, produciendo
un producto de amplificación secundario detectable de cadena doble
que indica la amplificación de diana. Los productos de
amplificación secundarios generados a partir de cebadores de señal
pueden detectarse por diversos medios, como se ilustra en la
patente de los EE.UU. número 5.550.025 (incorporación de colorantes
lipófilos y sitios de restricción) y la patente de los EE.UU.
número 5.593.867 (detección de la polarización de
fluorescencia).
Se ha usado ventajosamente la transferencia de
energía de fluorescencia para investigar la interacción entre
ácidos nucleicos complementarios en diversos procedimientos de
hibridación. La transferencia de energía fluorescente se produce
entre un fluoróforo donador y una molécula inhibidora de la
fluorescencia (que puede o no ser un fluoróforo) cuando el espectro
de absorción del inhibidor de la fluorescencia se solapa con el
espectro de emisión del donador y los dos están suficientemente
próximos. La energía del estado excitado del donador se transfiere
mediante una interacción dipolo de resonancia-dipolo
inducido al inhibidor de la fluorescencia vecino, dando como
resultado la inhibición de la fluorescencia del donador. En algunos
casos, si el inhibidor de la fluorescencia también es un
fluoróforo, puede mejorarse la intensidad de su fluorescencia. La
eficiencia de la transferencia de energía depende de la distancia
entre el donador y el inhibidor de la fluorescencia de un modo bien
conocido en la técnica.
Recientemente se han empleado sondas o cebadores
que comprenden estructuras secundarias de bases intramolecularmente
apareadas que pueden presentar cambios en la inhibición de la
fluorescencia para detectar secuencias diana de ácidos nucleicos.
En estos sistemas, un donador y un fluoróforo que inhibe la
fluorescencia, que están muy próximos en la estructura secundaria
de bases apareadas de la sonda o cebador, llegan a separarse
espacialmente debido al despliegue de la estructura secundaria
debido al apareamiento de bases con una diana. La separación
dependiente de diana de los dos fluoróforos reduce la inhibición de
la fluorescencia del fluoróforo donador, que aumenta la intensidad
de fluorescencia del donador. Por ejemplo, un oligonucleótido
autocomplementario marcado con fluoróforos en sus extremos 5' y 3'
forma una horquilla que sitúa muy próximos los dos fluoróforos de
tal manera que puede producirse la transferencia de energía y la
inhibición de la fluorescencia. La hibridación del oligonucleótido
autocomplementario con su complemento en un oligonucleótido diana
afecta a la horquilla y aumenta la distancia entre los dos
fluoróforos, reduciéndose así la inhibición de la fluorescencia. Las
estructuras de horquilla marcadas de este modo se describen, por
ejemplo, por Tyagi y col., Nature Biotech. 14:
303-308 (1996).
Una desventaja de la estructura de horquilla es
que es muy estable y la conversión a la forma hibridada no
inhibidora de la fluorescencia es frecuentemente lenta y sólo está
favorecida energéticamente de manera moderada. En el caso de las
estructuras descritas, por ejemplo, en Tyagi y col., como arriba, la
secuencia diana debe competir por la hibridación con la secuencia
complementaria que forma la estructura de horquilla, disminuyendo
así el rendimiento.
También se ha descrito un cebador de señal de
cadena parcialmente sencilla, de cadena parcialmente doble, marcado
con un par donador/inhibidor de la fluorescencia. Por ejemplo, el
documento EP0878554 describe un cebador de señal con un par
donador/inhibidor de la fluorescencia que flanquea un sitio de
reconocimiento de endonucleasa de restricción de cadena sencilla.
En presencia de la diana, el sitio de restricción se vuelve de
cadena doble y puede escindirse mediante una endonucleasa de
restricción. La escisión separa el par donador/inhibidor de la
fluorescencia para disminuir la inhibición de la fluorescencia del
donador.
Otros procedimientos han empleado sitios de
endonucleasa de restricción para separar un par donador/aceptor. La
patente japonesa número 93015439B describe procedimientos para medir
polinucleótidos mediante hibridación de una diana de cadena
sencilla con una sonda de polinucleótido de cadena sencilla marcada
con un par de transferencia de energía. El híbrido de cadena doble
se escinde entonces entre los marcajes por una enzima de restricción
y se mide la fluorescencia de uno de los marcajes. Una desventaja
de este procedimiento es que el sitio de restricción en la sonda
también debe estar presente en la secuencia diana que va a
detectarse. Ghosh y col., Nucl. Acids Res. 22:
3155-3159 (1994) describen la escisión catalizado
por enzimas de restricción de un oligonucleótido marcado con
fluoróforo, que se analiza usando transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia. En este ensayo, un oligonucleótido
marcado se hibrida con una secuencia complementaria que también está
marcada para producir un sitio de restricción de cadena doble que
puede escindirse. Una desventaja de este procedimiento es la
necesidad de modificar cada una de las dos cadenas con un marcaje
fluorescente.
También se ha usado un par donador/aceptor en
procedimientos de amplificación, tal como un procedimiento de
amplificación por desplazamiento de cadenas (SDA) descrito en las
patentes de los EE.UU. números 5.919.630; 5.846.726; y 6.054.729.
Estas patentes describen un cebador de señal de cadena sencilla que
se modifica mediante unión a un par donador/aceptor. El cebador de
señal puede comprender adicionalmente un sitio de reconocimiento de
endonucleasa de restricción entre el donador y el aceptor. Cuando el
cebador de señal forma un dúplex con una secuencia diana
complementaria, el sitio de reconocimiento de endonucleasa de
restricción resulta de cadena doble y puede escindirse o cortarse
por una endonucleasa de restricción. La escisión o corte separa el
donador y aceptor y se detecta un cambio en la fluorescencia debido
a la disminución de la inhibición de la fluorescencia como una
indicación de la amplificación de secuencia diana.
Queda la necesidad de procedimientos mejorados
para detectar secuencias de nucleótidos. Específicamente, existe la
necesidad de mejorar la relación entre una señal de fluorescencia
indicativa de amplificación de diana y una señal de fondo creada
por dispersión de la luz y fluorescencia no inhibida. También existe
la necesidad de medios más eficaces de detección de la
amplificación y mayor sensibilidad de procedimientos de detección
fluorescente.
La presente invención satisface estas
necesidades proporcionando un oligonucleótido detector que comprende
múltiples pares de un fluoróforo donador y una molécula inhibidora
de la fluorescencia, estando separados los pares por un sitio de
escisión que puede escindirse enzimática o químicamente. El
oligonucleótido detector de la presente invención puede usarse con
amplificación en un sistema de ensayo homogéneo para detectar una
secuencia de nucleótidos, o el oligonucleótido detector pueden
usarse en un sistema de ensayo heterólogo sin amplificación. El uso
de múltiples pares donador/inhibidor de la fluorescencia aumenta la
relación entre una señal de fluorescencia indicativa de
amplificación de diana y una señal de fondo, aumentando así tanto la
sensibilidad como la eficiencia de la detección. Mediante el uso de
múltiples fluoróforos en el mismo oligonucleótido detector se
consigue un beneficio adicional. Concretamente, la reacción de
amplificación es más eficaz debido a que sólo se requiere una
molécula adaptadora complementaria para alargar el oligonucleótido
detector. Además, se requiere menos oligonucleótido detector para
generar la misma señal que otros detectores.
Un donador fluoróforo del presente
oligonucleótido detector está suficientemente próximo a una molécula
inhibidora de la fluorescencia para que se produzca la
transferencia de energía entre el donador y el inhibidor de la
fluorescencia. En una realización, el par donador/inhibidor de la
fluorescencia puede separarse mediante tan pocas bases de ácido
nucleico como sean posibles para alojar el sitio de escisión. Son
posibles diversas configuraciones de moléculas donadoras e
inhibidoras de la fluorescencia. Por ejemplo, pero no a modo de
limitación, un fluoróforo donador puede configurarse entre dos o
más moléculas inhibidoras de la fluorescencia, o una molécula
inhibidora de la fluorescencia puede configurarse entre dos o más
fluoróforos donadores.
En una realización, el oligonucleótido detector
es de cadena sencilla y comprende múltiples pares de un fluoróforo
donador y una molécula inhibidora de la fluorescencia, en el que el
fluoróforo donador y la molécula inhibidora de la fluorescencia en
cada par están separados por un sitio que puede escindirse cuando el
oligonucleótido detector forma un dúplex con un segundo
oligonucleótido. El segundo oligonucleótido en esta realización
puede formarse en presencia de un ácido nucleico diana.
El oligonucleótido detector puede comprender
polinucleótidos que tienen una o más modificaciones químicas tales
como un resto de unión para permitir la unión de las moléculas
donadoras e inhibidoras de la fluorescencia. La estructura
principal del oligonucleótido detector puede tener estructuras
ramificadas de tal manera que el oligonucleótido detector puede
alojar adicionalmente pares donador/inhibidor de la
fluorescencia.
\newpage
En otro aspecto de la presente invención se
proporciona un procedimiento para detectar un ácido nucleico diana
en una muestra usando un oligonucleótido detector de la presente
invención. El procedimiento comprende poner en contacto un
oligonucleótido detector (es decir, un "primer
oligonucleótido") con un segundo oligonucleótido para formar un
dúplex entre el primer y el segundo oligonucleótido. El primer
oligonucleótido comprende múltiples pares de fluoróforos donadores
y moléculas inhibidoras de la fluorescencia, en el que los
fluoróforos donadores y las moléculas inhibidoras de la
fluorescencia en cada par están separados por un sitio de escisión.
La presencia del segundo oligonucleótido es indicativa de la
presencia del ácido nucleico diana. Los sitios de escisión son de
cadena doble en el dúplex formado por el primer y el segundo
oligonucleótido, que permite que los sitios de escisión se escindan
para generar una señal. La detección de un cambio en un parámetro de
fluorescencia de los fluoróforos donadores tras la escisión indica
la presencia del ácido nucleico diana. Un experto en la materia
apreciaría fácilmente que el ácido nucleico diana puede necesitar
disociarse de un dúplex antes de la formación del dúplex con el
oligonucleótido detector.
La detección de los fluoróforos donadores puede
comprender controlar el grado y/o la velocidad de cambio de
fluorescencia. En una realización, el cambio de la emisión de
fluorescencia del donador se controla para indicar la presencia o
ausencia, o para proporcionar un número estimado, de los ácidos
nucleicos diana en la muestra. Asimismo, la etapa de control puede
realizarse midiendo, entre otras cosas, un cambio en el grado y/o la
velocidad de cambio de la emisión de fluorescencia de una molécula
inhibidora de la fluorescencia que también es un fluoróforo.
En otro aspecto más de la presente invención se
proporciona un kit que comprende un oligonucleótido detector según
la presente invención. El kit también puede comprender componentes
adicionales tales como patrones internos, controles, enzimas que
pueden amplificar ácidos nucleicos, reactivos químicos, fluoróforos
y/o inhibidores de la fluorescencia que pueden unirse a un
oligonucleótido detector, además de instrucciones para usar el kit
para detectar un ácido nucleico diana. El kit puede comprender
adicionalmente, por ejemplo, pero no a modo de limitación, un
oligonucleótido adaptador que comprende una primera parte, que puede
formar un dúplex con el complemento de un oligonucleótido diana, y
una segunda parte, cuyo complemento puede formar un dúplex con la
primera parte del oligonucleótido detector.
Otras características y ventajas de la presente
invención serán aparentes de los siguientes dibujos y la descripción
de las realizaciones preferidas y también de las reivindicaciones
adjuntas.
La figura 1 ilustra el uso del
oligonucleótido detector de la invención en una reacción de
amplificación para la detección de una secuencia diana.
Las figuras 2A-2F son
gráficas que muestran el resultado de los experimentos realizados en
el ejemplo 2, en el que un oligonucleótido detector de la invención
se compara con sondas detectoras previamente conocidas.
La presente invención emplea un oligonucleótido
detector para detectar un ácido nucleico diana. Un oligonucleótido
detector comprende múltiples pares de fluoróforos donadores y
moléculas inhibidoras de la fluorescencia que proporcionan una
mejora de la relación señal de la fluorescencia respecto a fondo y
detección más eficaz de un ácido nucleico diana. Para el fin de la
invención, "múltiples pares de fluoróforos donadores y una
molécula inhibidora de la fluorescencia" es sinónimo de
"múltiples pares donador/inhibidor de la fluorescencia". Un
fluoróforo donador y una molécula inhibidora de la fluorescencia en
un par donador/inhibidor de la fluorescencia están separados por un
sitio que puede escindirse. En una realización, el sitio puede
escindirse cuando el oligonucleótido detector forma un dúplex con
un segundo oligonucleótido, que se forma en presencia de un ácido
nucleico diana.
Un par donador/inhibidor de la fluorescencia de
la presente invención comprende un "fluoróforo donador" y una
"molécula inhibidora de la fluorescencia". Un fluoróforo
donador en un estado excitado es sensible a la presencia de una
molécula inhibidora de la fluorescencia muy próxima al donador. Es
decir, la molécula inhibidora de la fluorescencia actúa como un
aceptor de energía de resonancia que se transfiere del donador,
siempre que los dos estén muy próximos. Una molécula inhibidora de
la fluorescencia no necesita ser un fluoróforo para ser un aceptor
de energía de resonancia. La transferencia de energía puede
producirse entre un fluoróforo y una molécula inhibidora de la
fluorescencia, siempre que los dos estén separados por un distancia
del orden de decenas de Angstroms (por ejemplo, dentro de
aproximadamente 60 \ring{A}), y siempre que el espectro de emisión
de fluorescencia del donador solape significativamente con el
espectro de absorción de la molécula inhibidora de la
fluorescencia. El término "muy próximo" se define en este
documento como la distancia entre las moléculas donadoras y
aceptoras que es suficiente para un cambio
detectable en un parámetro de fluorescencia una vez que el donador y el inhibidor de la fluorescencia están separados.
detectable en un parámetro de fluorescencia una vez que el donador y el inhibidor de la fluorescencia están separados.
Se controla un cambio detectable en un parámetro
de fluorescencia como una indicación de la presencia de la
secuencia diana. Un "parámetro de fluorescencia" incluye, pero
no se limita a, un aumento en la intensidad de fluorescencia del
donador, una disminución en la intensidad de fluorescencia del
inhibidor de la fluorescencia (cuando la molécula inhibidora de la
fluorescencia es un fluoróforo), una velocidad de cambio de la
intensidad de fluorescencia, una relación de fluorescencia antes y
después de la escisión, o una combinación las mismas. Se prefiere
controlar un cambio en la intensidad de fluorescencia del donador
debido a que este cambio es normalmente mayor que el cambio en la
intensidad de fluorescencia del inhibidor de la fluorescencia. Otros
parámetros de fluorescencia que pueden usarse para detectar un
cambio en una interacción entre el donador y el inhibidor de la
fluorescencia incluyen, pero no se limitan a, un cambio en la
anisotropía de polarización (para medir el cambio relativo en la
movilidad del fluoróforo antes y después de la escisión) o un
desplazamiento de la longitud de onda en un espectro de excitación
o emisión. En una realización pueden usarse un algoritmo para
analizar el cambio en uno o más parámetros de fluorescencia. Véanse
las patentes de los EE.UU. número 6.216.049 y número 5.863.736.
Fluoróforos adecuados para la invención
incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, sulforrodamina 101,
pirenobutanoato, acridina, etenoadenosina, eosina, rodamina y
eritrosina. En la técnica se conocen muchos pares donador/inhibidor
de la fluorescencia y son útiles en la presente invención. Estos
incluyen, pero no se limitan a, isotiocianato de fluoresceína
(FITC)/isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), FITC/Texas
Red^{MR} (sondas moleculares),
FITC/N-hidroxisuccinimidil-1-pirenobutirato
(PYB), FITC/isotiocianato de eosina (EITC),
N-hidroxisuccinimidil-1-pirenosulfonato
(PYS)/FITC, FITC/rodamina X y FITC/tetrametilrodamina (TAMRA),
fluoresceína/rodamina X, rodamina X/Cy5, o fluoresceína/ácido
P-(dimetil-aminofenilazo)benzoico (DABCYL).
Son particularmente útiles moléculas no fluorescentes inhibidoras de
la fluorescencia tales como DABCYL, DAMBI, DABSYL o rojo de metilo.
DABCYL en un colorante no fluorescente inhibidor de la fluorescencia
que inhibe eficazmente la fluorescencia de un fluoróforo adyacente,
por ejemplo fluoresceína o
5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno (EDANS). En
una realización, el donador y el inhibidor de la fluorescencia son
el mismo fluoróforo, en el que el fluoróforo tiene espectros de
adsorción y emisión que se solapan. En la memoria descriptiva y en
los siguientes ejemplos se observan ciertos pares donador/inhibidor
de la fluorescencia; sin embargo, aquellos expertos en la materia
apreciarán que en la presente invención son útiles otros pares. Es
decir, la selección de un par donador/inhibidor de la fluorescencia
particular no es crítica para la presente invención. En un par
donador/inhibidor de la fluorescencia útil para la presente
invención, las longitudes de onda de emisión del fluoróforo donador
solapan suficientemente las longitudes de onda de excitación de la
molécula inhibidora de la fluorescencia para permitir una
transferencia de energía, transferencia de carga o inhibición de la
fluorescencia eficaz. El donador y el inhibidor de la fluorescencia
pueden unirse en sus sitios respectivos en el
oligo-
nucleótido detector usando procedimientos de marcaje terminal e interno rutinarios que son conocidos en la técnica.
nucleótido detector usando procedimientos de marcaje terminal e interno rutinarios que son conocidos en la técnica.
Además del uso de fluoróforos donadores como un
medio para detectar un polinucleótido diana, dentro de la presente
invención también está el uso de otros marcajes luminiscentes,
particularmente agentes quimioluminiscentes.
Los términos "diana" o "ácido nucleico
diana" se refieren a ácidos nucleicos que van a detectarse que
pueden ser ARN o ADN que tiene cualquiera de las configuraciones de
estas moléculas que se encuentran, tales como ARNm y ADN genómico.
Por ejemplo, el ácido nucleico diana puede ser de cadena sencilla o
de cadena doble, o puede tener estructura secundaria. La diana de
un ácido nucleico de cadena doble es la cadena para la que se busca
la detección. El experto apreciará que, cuando la detección requiere
la formación de un dúplex con un ácido nucleico diana de cadena
doble o un ácido nucleico diana con estructura secundaria, la
detección se facilitará haciendo el ácido nucleico diana de cadena
sencilla. Para el fin de la invención, el ácido nucleico diana
puede aislarse o ser de procedencia natural, y puede detectarse
in vitro o in situ. En una realización de la
invención, un procedimiento para detectar un ácido nucleico diana
comprende una reacción de amplificación que está catalizada por una
ADN polimerasa. Los moldes para la amplificación englobada por la
presente invención incluyen el propio ácido nucleico diana, una
cadena complementaria de un ácido nucleico diana y cualquier cadena
de una copia de la secuencia original que se produce por replicación
o amplificación. El ácido nucleico diana también puede ser un molde
para el alargamiento de un molde de un cebador hibridado. En una
realización, el ácido nucleico diana se deriva de un patógeno.
"Escisión" de un oligonucleótido se refiere
a romper los enlaces fosfodiéster de ambas cadenas de un dúplex de
ADN o ARN o romper el enlace fosfodiéster del ADN o ARN de cadena
sencilla. Esto difiere de "cortar," que se refiere a romper el
enlace fosfodiéster de sólo una de las dos cadenas en un dúplex de
ADN o ARN. El sitio de escisión entre el fluoróforo donador y el
inhibidor de la fluorescencia puede escindirse cuando el sitio está
en forma de cadena doble. Un "sitio de escisión" es un
estiramiento de bases de un ácido nucleico de cadena doble que se
escinde específicamente mediante un reactivo de escisión. En una
realización, un sitio de escisión es un sitio de reconocimiento
para una endonucleasa de restricción. En la técnica se conocen bien
diversos sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción.
Reactivos de escisión adecuados también incluyen reactivos de
escisión químico que cortan ambas cadenas de un sitio de escisión.
Podría usarse, por ejemplo, pero no a modo de limitación, un
reactivo de escisión fotoactivado específico para un sitio del tipo
descrito en las patentes de los EE.UU. números 5.798.491 y
5.607.924.
El cambio en la intensidad de fluorescencia con
la escisión del oligonucleótido detector depende de la distancia
que separa el fluoróforo donador y la molécula inhibidora de la
fluorescencia en el oligonucleótido detector no escindido. Véase la
patente de los EE.UU. número 5.919.630. La eficiencia de
transferencia de energía está determinada por la siguiente
ecuación:
E =
\frac{R^{6}_{o}}{R^{6}_{o} +
R^{6}}
en la que r es la distancia entre
el donador y el inhibidor de la fluorescencia y R_{0} es una
constante referida a cada par donador/inhibidor de la fluorescencia
que puede calcularse a partir de ciertos parámetros de los
espectros de adsorción y emisión de cada uno, según procedimientos
bien conocidos. Véase BIOPHYSICAL CHEMISTRY, D. Freifelder, ed.,
W.H. Freeman and Company, San Francisco (1976) en las páginas
426-28.
En general, la magnitud del cambio en la emisión
del donador tras la escisión de cadena doble aumenta con la
disminución de la distancia entre el donador y el inhibidor de la
fluorescencia en el oligonucleótido detector intacto. Sin embargo,
la distancia entre el donador y el inhibidor de la fluorescencia
puede ajustarse para proporcionar una mayor eficiencia de la
escisión. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, si un sitio de
reconocimiento de endonucleasa de restricción se usa como el sitio
de escisión, la separación entre el donador y el inhibidor de la
fluorescencia puede ajustarse para alojar la unión de la
endonucleasa de restricción a su sitio de reconocimiento,
evitándose o limitándose así el impedimento estérico que, de otra
manera, puede interferir con la escisión completo. En una
realización, el fluoróforo donador y la molécula inhibidora de la
fluorescencia están separados por aproximadamente
5-20 nucleótidos, o preferentemente por
aproximadamente 6-8 nucleótidos.
El experto se dará cuenta de que las ventajas
del presente oligonucleótido detector pueden conservarse mientras
se modifican diversos aspectos de su estructura. Por ejemplo, pero
no a modo de limitación, puede modificarse el número de pares
donador/inhibidor de la fluorescencia. Se espera que la adición de
más pares donador/inhibidor de la fluorescencia al oligonucleótido
detector aumente la cantidad de fluorescencia total que puede
observarse después de la escisión del sitio de escisión de cadena
doble. No existe límite superior para el número de pares
donador/inhibidor de la fluorescencia que pueden añadirse al
oligonucleótido detector. En una realización, el número de pares
donador/inhibidor de la fluorescencia es al menos dos. En otras
realizaciones, el oligonucleótido detector contiene al menos tres o
más pares donador/inhibidor de la fluorescencia. En otras
realizaciones, el oligonucleótido detector puede contener al menos
10, 20, 30 ó 50 pares, o puede contener cientos de pares
donador/inhibidor de la fluorescencia, como se necesitan para
producir una relación señal a ruido y sensibilidad del ensayo
óptima.
En algunas realizaciones, la longitud del
oligonucleótido necesaria para alojar los pares donador/inhibidor
de la fluorescencia excederá de 200, o incluso de 500 o más bases.
Además, la estructura principal del oligonucleótido del detector
puede contener ramificaciones para proporcionar secuencias de
oligonucleótidos adicionales que pueden contener pares
donador/inhibidor de la fluorescencia. En la técnica se conocen bien
procedimientos para crear oligonucleótidos ramificados o de
múltiples ramificaciones. Por consiguiente, un
"oligonucleótido" como se usa en este documento no se limita a
un ácido nucleico lineal de aproximadamente 2-20
nucleótidos de longitud.
Además, el modo u orden en el que los pares
donador/inhibidor de la fluorescencia se disponen no es crítico
para la invención. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, el
fluoróforo donador ("D") y la molécula inhibidora de la
fluorescencia ("Q") pueden ordenarse como D/Q, D/Q o pueden
ordenarse como Q/D, D/Q, D/Q/D, Q/D/Q, siempre que el fluoróforo
donador esté muy próximo a la molécula inhibidora de la
fluorescencia. En una realización, los donadores y los inhibidores
de la fluorescencia pueden configurarse en la secuencia D/QQQ/D o
Q/DDD/Q. En estas realizaciones, el sitio de escisión entre el
donador y el inhibidor de la fluorescencia se indica por la marca
cortada. Por consiguiente, para el fin de la invención, un "par
donador/inhibidor de la fluorescencia" comprende un fluoróforo
donador muy próximo a una molécula inhibidora de la fluorescencia,
en el que el donador y el inhibidor de la fluorescencia están
separados por un sitio de escisión, y puede incluir fluoróforos
donadores adicionales o moléculas inhibidoras de la fluorescencia
muy próximas a o el donador o el inhibidor de la fluorescencia que
están adyacentes al sitio de escisión. Una configuración que tiene
tres donadores e inhibidores de la fluorescencia y dos sitios de
escisión, tales como D/Q/D o Q/D/Q, se define como dos "pares
donador/inhibidor de la fluorescencia," aún cuando cada par
comparta o un fluoróforo donador o una molécula inhibidora de la
fluorescencia.
En una realización de la invención, el
oligonucleótido detector se usa en un procedimiento para detectar un
ácido nucleico diana que comprende el uso del oligonucleótido
detector en una reacción de amplificación. En la técnica se conocen
diversos procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos y
pueden aplicarse a la presente invención incluyendo, pero no
limitándose a, amplificación por desplazamiento de cadenas (SDA),
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la
ligasa, replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación
basada en la Q-beta replicasa, amplificación en fase
sólida, amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos
(NASBA), amplificación por círculo rodante y amplificación mediada
por transcripción (TMA).
Un "cebador de amplificación" es un cebador
para la amplificación de una secuencia diana mediante alargamiento
del cebador. Por ejemplo, en SDA, el extremo 3' de un cebador de
amplificación hibrida en el extremo 3' del ácido nucleico diana. El
cebador de amplificación comprende un sitio de reconocimiento
próximo a su extremo 5' para una endonucleasa de restricción que
permitirá que un dúplex de ADN o uno de ARN se corte cuando el
sitio de reconocimiento esté semimodificado, como se describe en la
patente de los EE.UU. número 5.455.166; la patente de los EE.UU.
número 5.270.184; y el documento EP0684315, con respecto al uso de
los sitios de restricción semimodificados en una reacción de SDA.
El cebador de amplificación también puede alargarse desde su
extremo 3' mediante ADN polimerasa cuando la secuencia de unión
diana del cebador de amplificación se hibrida con el ácido nucleico
diana. El cebador de amplificación puede usarse en una reacción que
da como resultado una amplificación exponencial del ácido nucleico
diana.
Los cebadores de amplificación para PCR pueden
estar solamente constituidos por las secuencias de unión diana
debido a que no se requieren secuencias o estructuras especiales
para conducir la reacción de amplificación. En comparación, los
cebadores de amplificación útiles para otros procedimientos de
amplificación, tales como 3SR y NASBA, comprenden un promotor de la
ARN polimerasa próximo al extremo 5'. El promotor se añade al ácido
nucleico diana mediante la formación de dúplex entre el cebador y el
ácido nucleico diana y sirve para conducir la reacción de
amplificación dirigiendo la transcripción de múltiples copias de ARN
de la diana. También pueden ser útiles para la invención otros
cebadores de amplificación conocidos en la técnica.
"Productos de alargamiento" son ácidos
nucleicos que comprenden un cebador, o una parte de un cebador, y
una cadena recién sintetizada que es el complemento del ácido
nucleico diana en dirección 3' desde el sitio de unión del cebador.
Los productos de alargamiento resultan de la hibridación de un
cebador con una secuencia diana y alargamiento del cebador por
polimerasa usando el ácido nucleico diana como molde.
Un experto en la materia entenderá que
"hibridación" y "formación de dúplex" como se usa en este
documento no requiere una complementariedad de bases precisa. Es
decir, puede formarse un dúplex entre dos ácidos nucleicos que
contenían pares de bases desapareadas. Las condiciones en las que
los ácidos nucleicos que son perfectamente complementarios o que
contienen pares de bases desapareadas hibridarán para formar un
dúplex son bien conocidas en la técnica y se describen, por
ejemplo, en MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª edición,
Sambrook y col., eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor
(2001) en el capítulo 10.
La figura 1 ilustra la reacción que implica un
oligonucleótido detector de la invención. Un cebador, P_{1}, se
hibrida con un ácido nucleico diana, T. La ADN polimerasa (presente
en etapa a) alarga una cadena complementaria de P_{1} para formar
la cadena 1. Un oligonucleótido "amortiguador" B_{1} se une
en dirección 5' desde P_{1}. El cebador P_{1} y el amortiguador
B_{1} se añaden normalmente juntos, pero pueden añadirse por
separado. Cuando una polimerasa alarga una cadena complementaria de
B_{1}, la cadena 1 se elimina de la cadena diana, T (etapa b). El
cebador P_{2} se hibrida entonces con la cadena 1, un
oligonucleótido adaptador hibrida en dirección 3' desde P_{2} y
ambos se alargan mediante una polimerasa (etapa c). La cadena
alargada de P_{2}, cadena 2, amortigua la cadena alargada del
oligonucleótido adaptador (etapa d). P_{1} se hibrida ahora con
la cadena 2 y la cadena se alarga de nuevo (etapa e). La cadena
alargada por P_{1} se corta en un sitio de endonucleasa de
restricción localizado en su extremo 5' y la cadena se amplifica
mediante SDA para formar la cadena 3 (etapa f). Las etapas (a) a
(f) dan como resultado múltiples copias de la cadena 3 a partir de
un evento de hibridación específico para una diana sencilla iniciado
por P_{1}.
La hibridación de la cadena 3 con el
oligonucleótido detector múltiple forma un molde de iniciación para
el alargamiento de polimerasa que convierte el oligonucleótido
detector en una forma de cadena doble que puede escindirse.
Específicamente, la cadena 3 forma un dúplex en su extremo 3' con
una secuencia complementaria en el oligonucleótido detector
múltiple (etapa g). Una vez alargado por la polimerasa (etapa h), el
oligonucleótido detector múltiple se escindirá con una endonucleasa
de restricción (etapa i). Los sitios de reconocimiento de
endonucleasa de restricción están localizados entre el fluoróforo
donador y la molécula inhibidora de la fluorescencia en el
oligonucleótido detector, tal que la digestión con una endonucleasa
de restricción da como resultado la separación física del donador y
el inhibidor de la fluorescencia. La separación del donador y el
inhibidor de la fluorescencia da como resultado el aumento de la
fluorescencia del donador, indicando así la presencia de la diana,
T.
La señal puede detectarse en un punto final
seleccionado en la reacción o en tiempo real. Por ejemplo, pero no
a modo de limitación, la señal puede detectarse amplificando la
cadena 3 simultáneamente con una reacción de alargamiento del
híbrido entre la cadena 3 y el oligonucleótido detector múltiple.
Tales ensayos homogéneos en tiempo real pueden usarse para
proporcionar información semicuantitativa o cuantitativa sobre la
cantidad inicial de diana presente. Es decir, cuantas más copias
iniciales estén presentes de la secuencia diana, menos series de
amplificación se requieren para producir una señal de fluorescencia
por encima de un nivel de señal umbral. La cantidad inicial de
ácido nucleico diana en este tipo de ensayo se determina comparando
los resultados experimentales con resultados para una cantidad
conocida de ácido nucleico diana purificado. Los procedimientos
para analizar lecturas de ensayos también se encuentran en las
patentes de los EE.UU. números 6.216.049; 6.066.458; y 5.863.736;
la solicitud de patente de los EE.UU. número de serie 10/626.582; y
la solicitud de patente de los EE.UU. número de serie 09/574.031,
que se corresponde con la solicitud europea número EP1158449,
publicada el 28 de noviembre de 2001.
Como se describe anteriormente, la señal puede
amplificarse generando múltiples copias de cadena 3 mediante una
reacción de amplificación dependiente de la diana usando el cebador
1, el cebador 2 y un cebador adaptador. Los procedimientos de
amplificación alternativos que son conocidos en la técnica, tales
como aquellos expuestos anteriormente, pueden usarse para producir
un equivalente de cadena 3 que puede usarse en la presente
invención.
El oligonucleótido detector puede usarse
alternativamente para detectar un ácido nucleico diana sin una
reacción de amplificación. Por ejemplo, pero no a modo de
limitación, el oligonucleótido detector puede comprender una región
que se hibrida directamente con el ácido nucleico diana. En esta
realización, el oligonucleótido detector puede ser de cadena
parcialmente doble, siempre que comprenda una parte de cadena
sencilla que pueda formar un dúplex con un ácido nucleico diana. En
otra realización, el oligonucleótido detector puede ser completa o
sustancialmente de cadena sencilla, y el oligonucleótido detector se
hace de cadena doble mediante una reacción de alargamiento de la
polimerasa que se inicia en el dúplex formado entre el
oligonucleótido detector y el ácido nucleico diana. Este dúplex
puede formarse, por ejemplo, pero no a modo de limitación, entre una
parte 5' del detector y una parte 3' de un fragmento del ácido
nucleico diana que se ha generado mediante una digestión de la
restricción o similar. En todavía otra realización, el fragmento de
la secuencia diana se amplifica y el oligonucleótido detector se
pone en contacto con o el propio ácido nucleico diana amplificado o
la cadena complementaria amplificada del ácido nucleico diana. En
estas realizaciones, el oligonucleótido detector se usa
preferentemente en un formato heterólogo. Es decir, el
oligonucleótido detector se hace reaccionar con un ácido nucleico
diana y el oligonucleótido detector que no forma un dúplex con el
ácido nucleico diana se lava antes de que los sitios de escisión se
sometan a escisión.
En todavía otra realización, el oligonucleótido
detector interactúa con el ácido nucleico diana mediante un
oligonucleótido adaptador. El oligonucleótido adaptador comprende
una secuencia que se hibrida con el ácido nucleico diana y
comprende una parte separada que se hibrida con el oligonucleótido
detector. El híbrido formado entre el oligonucleótido adaptador y
el oligonucleótido detector crea un molde para el alargamiento de
polimerasa del oligonucleótido detector que hace el oligonucleótido
de cadena doble.
El oligonucleótido detector puede detectarse en
una variedad de formas conocidas en la técnica o directamente o
después de resultar de cadena doble. Por ejemplo, pero no a modo de
limitación, puede detectarse mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida partiendo de una base de peso molecular aparente,
mediante hibridación con una sonda marcada, mediante captura de
fase sólida usando una sonda específica para oligonucleótidos
detectores o mediante escisión con una endonucleasa de
restricción.
Los siguientes ejemplos son representativos de
las realizaciones englobadas por la presente invención y no
pretenden limitar el contenido abarcado por la presente
invención.
Las reacciones de SDA pueden realizarse usando
cebadores de amplificación y el oligonucleótido detector de la
presente invención. En este ejemplo, el detector está diseñado para
detectar una región del gen pol del VIH-1. La SDA
puede llevarse a cabo a aproximadamente 52ºC en presencia de al
menos una, preferentemente 250, copias de un ácido nucleico diana
de ADN de cadena doble clonado usando cebadores de amplificación 500
nM, cebadores amortiguadores 50 nM y oligonucleótido detector 200
nM. Las reacciones de control se llevan a cabo en ausencia del
ácido nucleico diana de cadena doble. Los detectores están marcados
de manera fluorescente con múltiples pares fluoróforo
donador/fluoróforo inhibidor de la fluorescencia (o rodamina/DABCYL
o fluoresceína/DABCYL), que están separados por una secuencia de
reconocimiento BsoBI y están configurados muy próximos. La
fluorescencia del donador se controla durante el transcurso de la
reacción.
La fluorescencia del donador aumenta
significativamente durante el transcurso de la reacción cuando el
ADN diana está presente, que indica que el sitio de la endonucleasa
de restricción BsoBI está escindido. A diferencia, en ausencia de
ADN diana, la fluorescencia permanece constantemente baja durante la
reacción.
Las reacciones de SDA se realizaron usando
cebadores de amplificación y oligonucleótidos detectores de la
presente invención para detectar el transcrito de ARN de VIH. La SDA
se llevó a cabo del siguiente modo: se preparó tampón diana a 50 mM
de KOB, bicina 120 mM y se pinchó con el ácido nucleico diana de ARN
a o 0 copias por reacción o 2000 copias por reacción. Se colocaron
65 \mul de tampón diana preparado con las concentraciones de
reactivo indicadas en pocillos de blanco. Se aplicaron 150 \mul de
muestra tampón en los pocillos de tampón diana, la disolución se
mezcló y los pocillos se colocaron a 50ºC durante 20 minutos. El
reactivo en TR se preparó como se indica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se transfirieron 150 \mul de la disolución en
los pocillos pinchados con calefacción a los pocillos en TR durante
5 minutos. La mezcla de amplificación se preparó como se indica a
continuación:
La mezcla de amplificación se puso en pocillos
de blanco a 100 \mul y los pocillos se colocaron en un bloque
térmico a 60ºC durante 10 minutos antes de completarse la incubación
a 54ºC. En la etapa en TR se transfirieron 62 \mul de la mezcla
de amplificación a los pocillos, los pocillos se cubrieron y la
placa se leyó usando un fluorómetro PROBETEC.
El oligonucleótido detector de la presente
invención se comparó con sondas de horquilla. Los resultados se
muestran a continuación y en las figuras 2A-2F.
CTCGVnv3 es una sonda de horquilla; D = dabaílo; R = rodamina; la
sonda RDRD2.6B tiene 6 bases entre el DABCYL y la rodamina; la sonda
RDRD2.7B tiene 7 bases entre el DABCYL y la rodamina; y la sonda
RDRD2.8B tiene 8 bases entre el DABCYL y la rodamina.
Los resultados demuestran que un oligonucleótido
detector de la presente invención funcionó mejor que otras sondas,
por ejemplo, la sonda CTGCUnv3. Los diversos diseños de sondas de
oligonucleótido detector empleados en el ejemplo 2 varían según el
número bases entre la rodamina y el DABCYL. Los resultados también
demuestran que se observa una mejora cuando se añade una base
adicional base o dos entre la rodamina y los restos de DABCYL
(véase RDRD2.7B y RDRD2.8B).
Claims (10)
1. Un oligonucleótido detector, que
comprende muy próximos al menos dos pares de un fluoróforo donador
y una molécula inhibidora de la fluorescencia, en el que dicho
fluoróforo donador y dichas moléculas inhibidoras de la
fluorescencia en cada par dicho están separados por un sitio de
escisión que puede escindirse en forma de cadena doble, y en el que
la escisión en dicho sitio de escisión puede crear una señal
detectable que indica la presencia de un ácido nucleico diana.
2. El oligonucleótido de la
reivindicación 1, en el que dichos fluoróforos donadores y dichas
moléculas inhibidoras de la fluorescencia están separados por
aproximadamente de 5 a 20 nucleótidos.
3. El oligonucleótido de la
reivindicación 1, en el que dicho sitio de escisión puede escindirse
por una endonucleasa.
4. El oligonucleótido detector de la
reivindicación 2, en el que al menos un fluoróforo donador dicho se
selecciona del grupo constituido por fluoresceína, sulforrodamina
101, pirenobutanoato, acridina, etenoadenosina, eosina, rodamina y
eritrosina.
5. Un procedimiento para detectar un
ácido nucleico diana, que comprende:
a. Poner en contacto (i) un primer
oligonucleótido detector que comprende una parte de cadena sencilla
que comprende muy próximos al menos dos pares de un fluoróforo
donador y una molécula inhibidora de la fluorescencia, en el que
dicho fluoróforo donador y dicha molécula inhibidora de la
fluorescencia en cada par dicho están separados por un sitio de
escisión, con (ii) un segundo oligonucleótido de cadena sencilla,
siendo su presencia indicativa de la presencia del ácido nucleico
diana, para formar un dúplex entre dichos primer y segundo
oligonucleótidos;
b. Alargar el dúplex para hacer de cadena doble
dicha parte de cadena sencilla del primer oligonucleótido
detector;
c. Escindir al menos uno de dichos sitios de
escisión; y
d. Detectar dichos fluoróforos donadores,
en el que un cambio detectable en un parámetro
de fluorescencia de dichos fluoróforos donadores es indicativo de
la presencia de dicho ácido nucleico diana.
6. El procedimiento de la reivindicación
5, que comprende además amplificar el segundo oligonucleótido.
7. El procedimiento de la reivindicación
6, en el que la amplificación es mediante un procedimiento
seleccionado del grupo constituido por amplificación por
desplazamiento de cadenas (SDA), reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa, replicación de
secuencia autosostenida (3SR), amplificación basada en la
Q-beta replicasa, amplificación en fase sólida,
amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA),
amplificación por círculo rodante y amplificación mediada por
transcripción (TMA).
8. El procedimiento de la reivindicación
5, en el que al menos uno de dichos pares se selecciona del grupo
de moléculas donadoras e inhibidoras de la fluorescencia que está
constituido por fluoresceína/rodamina X, rodamina X/Cy5 o
fluoresceína/DABCYL.
9. Un procedimiento para detectar un
ácido nucleico diana, que comprende:
a. (i) Hibridar un cebador P_{1} con dicho
ácido nucleico diana y (ii) alargar P_{1} mediante el uso de una
polimerasa para formar una cadena 1, en el que el cebador P_{1}
comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa en una parte
5' de dicho cebador P_{1} que no se hibrida con el ácido nucleico
diana;
b. (i) hibridar un amortiguador B_{1} con
dicho ácido nucleico diana en dirección 5' desde dicho cebador
P_{1} y (ii) alargar el amortiguador B_{1} y eliminar la cadena
1 de dicho ácido nucleico diana;
c. hibridar un adaptador con la cadena 1 y un
cebador P_{2} con la cadena 1, en el que el cebador P_{2}
hibrida en dirección 5' desde el adaptador;
d. (i) alargar el adaptador para formar una
cadena 2 y (ii) alargar el cebador P_{2} para eliminar la cadena
2 de la cadena 1;
e. (i) hibridar el cebador P_{1} con la cadena
2 y (ii) alargar el cebador P_{1} para formar una cadena alargada
del cebador P_{1};
f. (i) cortar la cadena alargada del cebador
P_{1} en el sitio de reconocimiento de endonucleasa incorporado
en la cadena alargada del cebador P_{1} y (ii) alargar desde el
sitio de corte para formar una cadena 3 y para amortiguar la cadena
alargada del cebador P_{1} que está en dirección 3' desde el sitio
de corte;
g. hibridar la cadena 3 con una parte de un
oligonucleótido, en el que el oligonucleótido comprende múltiples
pares de fluoróforos donadores e inhibidores de la fluorescencia, en
el que el fluoróforo donador y el inhibidor de la fluorescencia en
cada par dicho están separados por un sitio que puede escindirse
cuando dicho sitio de escisión es de cadena doble;
h. (i) alargar la cadena 3 para hacer de cadena
doble los sitios de escisión y (ii) escindir al menos uno de los
sitios de escisión; y
i. detectar dichos fluoróforos donadores,
en el que un cambio detectable en un parámetro
de fluorescencia de dichos fluoróforos es indicativo de la
presencia de dicho ácido nucleico diana.
10. Un kit, que comprende un primer
oligonucleótido detector de cadena sencilla, que comprende muy
próximos al menos dos pares de un fluoróforo donador y una molécula
inhibidora de la fluorescencia, en el que dicho fluoróforo donador
y dicha molécula inhibidora de la fluorescencia en cada par dicho
están separados por un sitio de escisión que puede escindirse en
forma de una cadena doble, y en el que el sitio de escisión es de
cadena doble cuando el primer oligonucleótido detector forma un
dúplex con un segundo oligonucleótido que puede formarse en
presencia de un ácido nucleico diana.
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