ES2327956T3

ES2327956T3 - Sondas de doble hebra para la deteccion de acidos nucleicos, mediante fluorescencia.

Info

Publication number: ES2327956T3
Application number: ES06291594T
Authority: ES
Inventors: Typhaine Dagland; Francois Rieunier
Original assignee: Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2009-11-05
Anticipated expiration: 2026-10-12
Also published as: WO2008044129A3; JP5330250B2; US9194007B2; CA2666388A1; AU2007306019A1; EP1911852B1; WO2008044129A2; ATE437965T1; CA2666388C; DE602006008150D1; EP1911852A1; US20110129824A1; EP2076610A2; JP2010505440A; AU2007306019B2; PT1911852E

Abstract

Una sonda de doble hebra, pretendida para la detección de un ácido nucleico diana, de hebra individual, o de hebra doble, mediante fluorescencia, el cual comprende: - una primera hebra de la fórmula X1-(L1)a-S1-S''1-(L''1)b-Y1, pretendida para una primera hebra del ácido nucleico diana, la cual comprende una secuencia de la fórmula T'' 1-T 1; - una segunda hebra de la fórmula X2-(L2)c-S2-S''2-(L''2)dY2, pretendida para una segunda hebra del ácido nucleico diana, la cual comprende una secuencia de la fórmula T''2-T2; en donde, - dos de las X1, X2, Y1, e Y2, representan un donante fluorescente, mientras que, las otros dos, representan un aceptor fluorescente, y X 1 y X 2, no pueden representar, ambas, un donante fluorescente; - a, b, c y d, representan 0 ó 1, con la condición de que, a, b, c ó d, representen 1, cuando, respectivamente, X1, X2, Y1, ó Y2, representen un donante fluorescente; - T 1 y T 2, representan secuencias de oligonucleótidos, que tienen de 10 a 35 nucleótidos, de una forma más preferible, de 12 a 20 nucleótidos, las cuales son complementarias la una con respecto a la otra; - de una forma independiente la una con respecto a la otra, T''1 y T''2, representan secuencias de oligonucleótidos, que tienen de 2 a 8 nucleótidos; - S1 y S2, representan secuencias de oligonucleótidos, que tienen de 10 a 35 nucleótidos, las cuales son complementarias la una con respecto a la otra, siendo S1, por lo menos un 85% complementaria a T1, y siendo, S2, por lo menos un 85% complementaria a T2; - de una forma independiente la una con respecto a la otra, S''1 y S''2, representan secuencias de oligonucleótidos, que tienen de 2 a 8 nucleótidos, siendo S''1, por lo menos un 65% complementaria a T''1, y siendo, S''2, por lo menos un 65% complementaria a T''2; - L 1 y L 2, son porciones espaciadoras, de tal forma que, el respectivo radio de giro de X 1 y X 2, con respecto a los sitios de unión de S 1 a L 1 y de S 2 a L 2, sea de por lo menos 3,4 ''A; - L''1 y L''2, son porciones espaciadoras, de tal forma que, el respectivo radio de giro de Y1 y Y2, con respecto a los sitios de unión de S''1 a L''1 y de S''2 a L''2, sea de por lo menos 3,4 ''A; - siendo la temperatura de fusión de la sonda de doble hebra, inferior a la temperatura de fusión del complejo formado entre la primera hebra y la segunda hebra de la sonda de doble hebra del ácido nucleico diana; e inferior a la temperatura de fusión del complejo formado entre la segunda hebra de la sonda de doble hebra y la segunda hebra del ácido nucleico diana, en caso de encontrarse presente.

Description

Sondas de doble hebra para la detección de ácidos nucleicos, mediante fluorescencia.

La presente invención, se refiere a una sonda nucleotídica de doble hebra, pretendida para la detección de ácidos nucleicos, mediante fluorescencia.

La cuantificación de ácidos nucléicos es, corrientemente, de un extenso uso médico, de una forma particular, en el sector de la virología. De hecho, la determinación de la carga vírica, en individuos que sufren de enfermedades víricas crónicas, tales como la hepatitis B o el SIDA, es ahora indisociable del control de estas patologías, notablemente, para controlar la eficacia de los regímenes de fármacos.

Entre los varios procedimientos conocidos para la cuantificación de ácidos nucleicos, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), a tiempo real, es usualmente el procedimiento de mayor valor, dadas ambas circunstancias, su sensibilidad y su especificidad.

La PCR a tiempo real, asocia la amplificación del ácido nucleico y la detección mediante fluorescencia de los ácidos nucleicos amplificados. En resumen, una PCR del tipo standard, pretendida para la amplificación de un ácido nucleico diana, se lleva a cabo en presencia de sondas, las cuales de una forma específica, producen una señal de fluorescencia cuando unen al ácido nucleico diana y, la emisión de la fluorescencia, se controla, mientras acontecen los ciclos de la PCR. El ciclo para el cual se mide la fluorescencia emitida a partir de la PCR, por encima de un nivel correspondiente a un determinado umbral (es decir, por encima de un umbral de fluorescencia de fondo), se denomina el ciclo umbral (Ct). Se mostrado el hecho de que, el Ct, es proporcional al logaritmo decimal de la cantidad de ácido nucleico que se encuentra inicialmente presente en la PCR (véase "Real-time PCR", -PCR a tiempo real-, en Avanced Methods S., Dorak MT. ed., Taylor y Francis, Oxford, 2006). Así, de este modo, la determinación del Ct, facilita la determinación de la concentración inicial de un ácido nucleico diana en una muestra.

El éxito de este procedimiento, ha conducido al desarrollo de varias sondas fluorescentes pretendidas para producir una cantidad mínima de fluorescencia, cuando se encuentran no unidas al ácido nucleico diana, y una cantidad máxima de fluorescencia, cuando se encuentran unidas al ácido nucleico diana. Una vía para lograr este objetivo, es la consistente en proporcionar sondas marcadas con porciones fluorescentes y de extinción, de tal forma que, las últimas porciones, se encuentren una íntima proximidad cuando las sondas no se encuentran unidas al ácido nucleido diana - para evitar la emisión de fluorescencia - y lo suficientemente apartadas las unas con respecto a las otras, cuando la sonda se encuentra unida al ácido nucleico diana - para facilitar la emisión de fluorescencia.

Así, de este modo, Morisson (patente estadounidense US 5.928.862), proporciona un sonda nucleotídica de doble hebra, en donde, las hebras, son totalmente complementarias la una con respecto a la otra, y a las hebras del ácido nucleico diana, portando, cada hebra de la sonda, un donante fluorescente, por ejemplo, en el extremo 5', y un fluorescente aceptor, por ejemplo, en el extremo 3'. Cuando la sonda se encuentra no unida al ácido nucleico diana, la emisión de fluorescencia, se extingue, debido al hecho de que, las porciones fluorescente y de extinción, se encuentran encaradas, la una con respecto a la otra, en la sonda de doble hebra. Como contraste de ello, cuando la sonda se encuentra unida al ácido nucleico diana, las porciones fluorescente y de extinción, se encuentran separadas, la una con respecto a la otra, permitiendo, con ello, el que se emita la fluorescencia.

No obstante, estas sondas, sufren de un inconveniente mayor. Realmente, de hecho, no existe una diferencia significante en las temperaturas de fusión de la sonda de doble hebra, en sí mima, y de los dúplex entre las hebras de la sonda y las hebras del ácido nucleico diana. Así, por lo tanto, durante la fase de reasociación de un ciclo de PCR a tiempo real, existe una competición ente las hebras de la sonda, enlazándose a ellas mismas, por un lado, y las hebras de la sonda que se enlazan al ácido nucleico diana, por otro lado, lo cual tiene como resultado una emisión de fluorescencia disminuida y, como consecuencia de ello, una sensibilidad disminuida de la PCR a tiempo real. Adicionalmente, además, la emisión de fluorescencia del donante fluorescente, se extingue parcialmente, mediante las nucleobases, en los extremos de la doble hélice de DNA, formada por la unión de la sonda al ácido nucleico diana.

Estos problemas, se solucionan parcialmente, en vistas a las denominadas sondas moleculares Beacon, las cuales se dan a conocer, de una forma notable, en el documento de solicitud de patente internacional WO 98/10 096.

Las sondas moleculares Beacon, toman usualmente la forma de una sonda de ácido nucleico, doblada en una estructura del tipo tallo-bucle, en donde, un extremo del tallo, se encuentra unido a un donante fluorescente, mientras que, el otro extremo, se encuentra unido a un aceptor fluorescente. Como tal, no se emite una fluorescencia a partir de la sonda, mientras que, el otro extremo, se encuentra unido al aceptor de fluorescencia. Adicionalmente, además, estas sondas, están diseñadas de tal forma que, la temperatura de fusión del tallo, es inferior a la temperatura de fusión de las secuencia del bucle, con respecto a su secuencia complementaria, en el ácido nucleico diana. Como tal, existe únicamente una competencia muy limitada entre la sonda que se une a sí misma, y la sonda que se une al ácido nucleico diana, durante la fase de reasociación de la PCR.

Las sondas moleculares Beacon, son oligonucleótidos relativamente largos (entre 35 y 45 nucleótidos de longitud). Tales tipos de tamaños grandes, pueden mostrarse como problemáticos, cuando se diseñan estas sondas, especialmente, cuando las dianas a detectarse, están constituidas a partir de partes variables de una secuencia de ácido nucleico. Adicionalmente, además, la síntesis química de tales tipos de oligonucleótidos largos doblemente arcados, es laboriosa y costosa.

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Adicionalmente, además, el diseño de tales tipos de sondas, demuestra, usualmente, el ser una tarea pesada, puesto que, el equilibrio as ser encontrado, entre las temperaturas de fusión del tallo y del bucle, es a menudo delicado de obtener. De hecho, este equilibrio, depende notablemente de la pareja donante fluorescente - aceptor fluorescente utilizados, de la longitud y la secuencia del tallo, así como también de la longitud de las secuencia del bucle. Este problema, viene reforzado en el caso de ensayos múltiplex, en donde, todas las sondas, deben ser funcionales dentro de unos estrechos márgenes de las temperaturas de reasociación de la PCR.

Otro inconveniente digno de anotar, concerniente a estas sondas, consiste en la formación de las estructuras internas secundarias durante las etapas de hibridación, la cuales limitan la hibridación específica de la sonda a su diana. Tal tipo de limitación, puede ser crítica en ensayos múltiplex de amplificación a tiempo real.

Otras sondas, utilizadas en el denominado ensayo de hibridación "Taíman" (Gelfand et al., patentes estadounidenses US 4.210.015, US 5.487.972; y Livak et al., patentes estadounidenses US 5.538.848, US 5.723.591, US 6.258.569), hacen también uso de un sistema del tipo donante fluorescente - aceptor fluorescente. Estas sondas, se encuentran constituidas, por un oliognucleótido de hebra individual, marcado con un donante fluorescente y un aceptor fluorescente, localizados en ambos lados de las sondas, formando así, de este modo, un par FRET (FRET, del inglés, Fluorescence Resonance Energy Tranfer - [Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia] -). En el ensayo, se utiliza una polimerasa de ácido nucleico que tiene una actividad exonucleasa 5' a 3', que libera nucleótidos individuales o múltiples, mediante la segmentación de la sonda nucleotídica, cuando ésta se hibrida a la hebra diana. Esta segmentación, separa el donante fluorescente y el aceptor fluorescente, interrumpiendo, de este modo, el par FRET, y facilitando la emisión de fluorescencia.

Estas sondas, sufren de dos inconvenientes mayores. En primer lugar, el procedimiento Taíman, requiere el uso específico de enzimas de polimerasa Taq, que tengan actividad exonucleasa 5' a 3'. En segundo lugar, la síntesis de los oligonucleótidos que portan dos marcadores diferentes, en localizaciones específicas y un grupo de bloqueo en el nucléotido del terminal 3', para evitar la extensión mediante la polimerasa de ácido nucleico, tiene como resultado un gran número de subproductos. La presencia de estos subproductos, requiere una purificación laboriosamente intensiva, lo cual tiene como resultado unos costos más altos.

Como tal, es un objeto de la presente invención, el proporcionar sondas fluorescentes que combinan el uso de donantes y aceptores fluorescentes, desprovistas de los inconvenientes asociados con las sondas que son ya conocidas en el arte especializado de la técnica.

Los presentes inventores, han solucionado los problemas expuestos anteriormente, arriba, procediendo a proporcionar las siguientes sondas de doble hebra, las cuales se ejemplifican en las Figuras 1 y 2.

Las sondas en concordancia con la presente invención, están constituidas por dos hebras, parcialmente complementarias, la una con respecto a la otra. El enlace de estas hebras, a las respectivas hebras de ácido nucleico diana, se ve favorecida, a raíz de su enlace mutuo, lográndose ello, procediendo a proporcionar, en cada hebra de la sonda de doble hebra, una secuencia nucleotídica diseñada para unirse al ácido nucleico diana, pero no a la otra hebra de la sonda. La temperatura de fusión de tal tipo de sonda de doble hebra, es inferior que la temperatura de fusión del complejo formado a partir de la primera y segunda hebra de la sonda de doble hebra, con respectivamente la primera y segunda hebras del ácido nucleico diana.

Tales tipos de sondas de doble hebra, puede fácilmente adaptarse, para emparejar para cualquier ácido nucleico diana particular.

Adicionalmente, además, las sondas en concordancia con la presente invención, proporcionan en general, una fluorescencia incrementada, con respecto a las otras sondas fluorescentes conocidas en el arte especializado de la técnica, cuando se someten a test de ensayo, en condiciones óptimas de PCR, procediendo a proporcionar una porción espaciadora, entre el donante fluorescente y el resto de la sonda, evitando, con ello, una extinción que pudiera resultar a raíz de la proximidad de las nucleobases en los extremos de la doble hélice, la cual se forma entre las hebras de las sonda y el ácido nucleico diana.

Los inventores, han evidenciado, así mismo, el hecho de que, de una forma inesperada, las sondas de doble hebra en concordancia con la invención, no son estrictamente dependientes de una temperatura específica de reasociación, proporcionando, de este modo, un ventaja real, en los ensayos múltiplex.

Así, de este modo, la presente invención, se refiere a una sonda de doble hebra, pretendida para la detección de un ácido nucleico diana, de hebra individual, o de hebra doble, mediante fluorescencia, el cual comprende:

- una primera hebra de la fórmula X_{1}-(L_{1})_{a}-S_{1}-S'_{1}-(L'_{1})_{b}-Y_{1}, pretendida para una primera hebra del ácido nucleico diana, la cual comprende una secuencia de la fórmula T'_{1}-T_{1};

- una segunda hebra de la fórmula X_{2}-(L_{2})_{c}-S_{2}-S'_{2}-(L'_{2})_{d}Y_{2}, pretendida para una segunda hebra del ácido nucleico diana, la cual comprende una secuencia de la fórmula T'_{2}-T_{2};

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en donde,

- dos de las X_{1}, X_{2}, Y_{1}, e Y_{2}, representan un donante fluorescente, mientras que, las otros dos, representan un aceptor fluorescente, y X_{1} y X_{2}, no pueden representar, ambas, un donante fluorescente;

- a, b, c y d, representan 0 ó 1, con la condición de que, a, b, c ó d, representen 1, cuando, respectivamente, X_{1}, X_{2}, Y_{1}, ó Y_{2}, representen un donante fluorescente;

- T_{1} y T_{2}, representan secuencias de oligonucleótidos, que tienen de 10 a 35 nucleótidos, de una forma más preferible, de 12 a 20 nucleótidos, las cuales son complementarias la una con respecto a la otra;

- de una forma independiente la una con respecto a la otra, T'_{1} y T'_{2}, representan secuencias de oligonucleótidos, que tienen de 2 a 8 nucleótidos;

- S_{1} y S_{2}, representan secuencias de oligonucleótidos, que tienen de 10 a 35 nucleótidos, de una forma más preferible, de 12 a 20 nucleótidos, las cuales son complementarias la una con respecto a la otra, siendo S_{1}, por lo menos un 85% complementaria a T_{1}, y siendo, S_{2}, por lo menos un 85% complementaria a T_{2};

- de una forma independiente la una con respecto a la otra, S'_{1} y S'_{2}, representan secuencias de oligonucleótidos, que tienen de 2 a 8 nucleótidos, siendo S'_{1}, por lo menos un 65% complementaria a T'_{1}, y siendo, S'_{2}, por lo menos un 65% complementaria a T'_{2};

- L_{1} y L_{2}, son porciones espaciadoras, de tal forma que, el respectivo radio de giro de X_{1} y X_{2}, con respecto a los sitios de unión de S_{1} a L_{1} y de S_{2} a L_{2}, sea de por lo menos 3,4 \ring{A};

- L'_{1} y L'_{2}, son porciones espaciadoras, de tal forma que, el respectivo radio de giro de Y_{1} y Y_{2}, con respecto a los sitios de unión de S'_{1} a L'_{1} y de S'_{2} a L'_{2}, sea de por lo menos 3,4 \ring{A};

- siendo la temperatura de fusión de la sonda de doble hebra, inferior a la temperatura de fusión del complejo formado entre la primera hebra y la segunda hebra de la sonda de doble hebra del ácido nucleico diana; e inferior a la temperatura de fusión del complejo formado entre la segunda hebra de la sonda de doble hebra y la segunda hebra del ácido nucleico diana, en caso de encontrarse presente.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, a menos que se indique de otra forma, los polinucleótidos que se encuentran comprendidos en las hebras, las secuencias o las porciones, representados por las siguientes fórmulas: X_{1}-(L_{1})_{a}-S_{1}-S'_{1}-(L'_{1})_{b}-Y_{1}, X_{2}-(L_{2})_{c}-S_{2}-S'_{2}-(L'_{2})_{d}Y_{2}, T'_{1}-T_{1}, T'_{2}-T_{2}, S_{1}-S'_{1}, S_{2}-S'_{2}, S_{1}, S'_{1}, S_{2}, S'_{2}, L_{1}, L'_{1}, L_{2}, L'_{2}, pueden encontrarse en la orientación 5' a 3' ó 3' a 5'. No obstante, tal y como resultará evidente para aquélla persona experta en el arte especializado de la técnica, dentro de una misma fórmula, todos los polinucleótidos, tienen la misma orientación. A parte de ello, para una hebra de doble hebra dada, se interpretará que, todas las fórmulas, se van leer en la misma orientación, por ejemplo, los polinucleótidos que se encuentran comprendidos en las hebras representadas por X_{1}-(L_{1})_{a}-S_{1}-S'_{1}-(L'_{1})_{b}-Y_{1} y X_{2}-(L_{2})_{c}-S_{2}-S'_{2}-(L'_{2})_{d}Y_{2}, se encuentran todas, bien ya sea en la orientación 5' a 3', o bien ya sea en la orientación 3' a 5'.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, "nucleótido", abarca todos los nucleótidos conocidos, naturales y no naturales, particularmente, ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos naturales y no naturales.

Los nucleótidos no naturales a ser utilizados en el ámbito de la presente invención, pueden seleccionarse de entre el grupo constituido por nucleótidos sintéticos que tienen porciones de bases modificadas y/o porciones de azúcares modificadas, que son capaces de una hibridación específica (diseñada para mejorar la propiedad de enlace o unión, reducir la degeneración, incrementar la especificidad, y por el estilo), por ejemplo: nucleósidos de C-5-metilpirimidina, 2,6-diaminopurina, 2'-desoxirribosa, G-Clamp (análogo de la fenoxazina), N-4-etil-2'-desoxicitidina, 2'-desoxiinosina, 2'-desoxinetularina y 2-nitropirrol-2'dexoxinucleósido.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, la expresión "oligonucleótido", se refiere a polinucleótidos que tienen de 2 a 100 nucleótidos, con una estructura de cadena modificada o no modificada y/o un ligamiento modificado entre nucleótidos. Los polinucleótidos que tienen una estructura de cadena modificada o no modificada y/o un ligamiento modificado entre nucleótidos, de una forma notable, abarcan LNA (Locked Nucleic Acids - [ácidos nucleicos bloqueados]-), PNA (peptide Nucleic Acids - [ácidos nucleicos peptídicos] -) y por el estilo. Análogos de ligamientos de fosfodiésteres, incluyen, de una forma notable, fosforotiato, fosforodiotiato, fosforamidato y por el estilo.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, "ácido nucleico diana", se refiere a cualquier polímero de nucleótidos, de origen natural o sintéticos, tal y como se definen anteriormente, arriba, tal como un ácido desoxirribonucleico de hebra individual o de doble hebra (al cual se le hará referencia, en lo sucesivo, como "DNA"), un ácido ribonucleico (al cual se le hará referencia, en lo sucesivo, como "RNA"). De una forma particular, los ácidos nucleicos diana, se originan o se derivan de los rRNA, mRNA, DNA plasmídico, DNA bacteriano, DNA vírico, RNA vírico, y DNA cromosómico.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, "donante fluorescente", se refiere a un fluoróforo, es decir, una molécula, la cual, al absorber energía de un longitud de onda específica (longitud de onda de excitación), reemite energía a través de una señal de fluorescencia, a una longitud de onda más larga específica (longitud de onda de emisión). Los fluoróforos, son bien conocidos par parte de aquellas personas expertas en el arte especializado de la técnica, y éstas se encuentran descritas, de una forma notable, en la solicitud de patente europea EP 1 173 519; en la publicación prioritaria de patente PCT de la patente internacional WO 2004/055 1117; por parte de Drexhage K.H. "Structure and properties of laser dyes", -Estructura y propiedades de los láser colorantes-, en Dye lasers, tercera edición, F. P. Schäfer, Ed., Springer-Verlag, (1990), páginas 155-200; por parte de Valeur B. "Molecular fluorescence: Principles and Applications", -Fluorescencia molecular: Principios y aplicaciones-, Ed. WILEY-VCH Verlag GmbH, 2001; Berlman, I.B., Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, -Manual de los espectros de fluorescencia de la moléculas aromáticas-, segunda edición, Academia Press (1971); Griffihs J. "Colour and constitution of Organic Molecules", Academia Press (1976).

Tal y como se pretende aquí, en este documento, "aceptor fluorescente", se refiere a una molécula que absorbe la energía emitida a partir de un fluoróforo, con la emisión subsiguiente de un fotón de fluorescencia, a otra longitud de onda, o sin dicha emisión. En el caso en que acontezca emisión de energía subsiguiente, el aceptor fluorescente es en sí mismo un fluoróforo. Si no acontece emisión subsiguiente de energía, el aceptor fluorescente, es un extintor o inhibidor. Los aceptores fluorescentes, son bien conocidos por parte de aquellas personas expertas en el arte especializado de la técnica, y éstos se describen, de una forma notable, en Chen et al., (1998) Science 279 : 851-3; por parte de Haugland RP., en "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", 1992-1994; en la publicación de prioridad de patente de la patente internacional WO 01/86 001; por parte de Lukhtanov et al. (2001) Amarican Biotechnology Laboratory 19: 68-69; y por parte de Clegg et al., (1992) Methods in Enzymology 211: 353-289.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, cuando las dos hebras de las sonda de doble hebra se hibridan la una con la otra, los donantes fluorescentes, se posicionan en una íntima proximidad con respecto a los aceptores de fluorescencia. Esto tiene como resultado una mínima emisión de fluorescencia a la longitud de onda de emisión del donante fluorescente a ser emitido por la sonda de doble hebra. En el caso en el que el aceptor sea un extintor (inhibidor), la fluorescencia mínima, se emite, sea cual fuere la longitud de onda. Este efecto, se elimina cuando, ambas hebras de la sonda de doble hebra se encuentran unidas a sus respectivas dianas afines, debido a la distancia que separa al donante de fluorescencia con respecto al aceptor de fluorescencia.

Existe un gran desafío en cuanto a la guía médica, en la bibliografía especializada, en cuanto a lo referente a la selección de apropiados pares donante/aceptor, por ejemplo, Wu et al. (1994) Anal. Biochem. 218: 1-13; White et al. "Fluorescence Analysis: A Practical Approach "Marcel Dekker, New York, 1970.

Se encuentran comercialmente a disposición, en el mercado, muchas formas apropiadas de donantes y aceptores fluorescentes, con sustituyentes, como la funcionalidad de unión, para el enlace a un oligonucleótido.

De una forma preferible, se emplean los donantes y aceptores de fluorescencia derivatizados con una porción de fosforamidita, debido al hecho de que, éstos, se encuentran directamente unidos al 5'OH del oligonucleótido, en la conclusión de las síntesis en fase sólida. Así, de este modo, la síntesis, puede automatizarse en su totalidad, tal y como se describe, por ejemplo, por parte de Mullah et al. (1999) Nucleosides & Nucleotides 18:1311-1312. Como tales, los colorantes de fluoresceína y derivados, pueden introducirse, de una forma conveniente, en el extremo 5' de un oligonucleótido, procediendo a utilizar esta química de la fosforamidita, según se describe por ejemplo, en las patentes estadounidenses US 5.583.236, US 5.721.355, y EP 0 652.167. puede también utilizarse un nucleótido marcado con un donante o aceptor fluorescente, e incorporarse en cualquier parte de una secuencia oligonucleótida, durante su síntesis, tal y como se describe por parte de Yang et al. (1997) Methods in Ezymology. 28:417-441.

Procedimientos alternativos para la unión de donantes o aceptores fluorescentes, que tienen la denominación de acoplamiento post-sintético o manual, se encuentran también bien descritos, por ejemplo, en las siguientes referencias: Sproat et al. (1987) Nucleic Acids Research 15: 4837-4848; Sproat et al. (1987) Nucleic Acids Research 15: 6181-6196; Markiewick et al. (1989) Nucleic Acids Research 17: 7149-7158; Agrawal "Protocols in Oligonucleotide Conjugates", Protocolos en Conjugados de Oligonucleótidos -, en Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1994.

Los oligonucleótidos modificados en el extremo 5', pueden sintetizarse mediante la incorporación directa de un grupo amino 5', ó de un grupo sulfhidrilo 5', como por ejemplo, procediendo a utilizar un 5'-tiol modificador C6 ó un 5'-amino modificador C6 (por ejemplo, de Glen Research). Un derivado de alogenoacetamida ó maleimina del aceptor o donante fluorescente, se acopla al grupo sulfhidrilo ó un derivado de succimidilo del aceptor o donante de fluorescencia, se acopla al grupo amino. Esta química, es muy útil para los donantes o aceptores fluorescentes sensibles, los cuales no son estables durante la síntesis automatizada y/que se dañan mediante el tratamiento necesario para la desprotección y segmentación a partir del soporte (generalmente, amoníaco concentrado), como la tratametilrodamina (TAMRA), los colorantes de cianina u otros.

Con objeto de introducir un marcador en el extremo 3' de un oligonucleótido, pueden utilizarse columnas modificadas (a saber, vidrio o poliestireno poroso, controlados), de una forma preferible, directamente, en el sintetizador automatizado. El grupo amino del soporte, se encuentra covalentemente enlazado al marcador. De una forma particular, de este modo, pueden introducirse extintores.

Otra conocida bien conocida para introducir un marcador en el extremo 3' de un oligonucleótido, es consistente en funcionalizar el extremo 3' del oligonucleótido, con un grupo amino, u utilizar un derivado de succinimida del donante o aceptor fluorescente, tal y como se describe, por ejemplo, por parte de Nelson et al. (1989) Nucleic Acids Research 17: 7187-7194.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, la expresión "porción espaciadora", se refiere a cualquier grupo químico que tenga tendencia a enlazarse a un ácido nucleico. Esta porción espaciadora, es de utilidad para evitar la extinción de la fluorescencia emitida a partir de un donante fluorescente, el cual podría resultar a raíz de la proximidad de las nucleobases en los extremos de la doble hélice que se forma entre las hebras de la sonda y el ácido nucleico diana.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, la expresión "radio de giro", se refiere a la distancia existente entre el sitio de unión de S_{1} ó S_{2}, en las porciones espaciadoras L_{1} y L_{2}, y respectivamente, el sitio de unión X_{1} ó X_{2}, en las mismas porciones, en la conformación más extendida de las porciones espaciadoras, o a la distancia existente entre el sitio de unión de S'_{1} ó S'_{2}, en las porciones espaciadoras L'_{1} y L'_{2}, y respectivamente, el sitio de unión Y_{1} ó Y_{2}, en las mismas porciones, en la conformación más extendida de las porciones espaciadoras. Debería también tomarse debida nota en cuanto al hecho de que, según se pretende en la invención, X_{1} y X_{2}, pueden encontrarse respectivamente unidad a cualquier parte de L_{1} y L_{2}, y que Y_{1} e y_{2}, pueden encontrarse respectivamente unidas a cualquier parte de L'_{1} y L'_{2}, por
ejemplo, costado con costado, o en las extremidades, siempre y cuando se observe la condición en el radio de giro.

Se considera como necesaria una distancia de por lo menos 3,4 \ring{A}, con objeto de asegurare el hecho de que acontezca una mínima extinción del donante fluorescente, debido a la proximidad de las nucleobases que constituyen S_{1} ó S_{2}. De hecho, los nucleótidos, de una forma particular, los nucleótidos G, se conocen bien como teniendo propiedades de extinción.

A título de ejemplo, las eficacias de extinción (%) de los nucleótidos naturales, con respecto a fluoróforos particulares, se exponen en la tabla que se facilita a continuación:

1

La porción espaciadora (L_{1}, L_{2}, L_{1}' ó L_{2}'), puede comprender una porción de engarce para el acoplamiento con un donante o aceptor fluorescente. Ésta puede ser, por ejemplo, una función hidroxilo, protegida mediante un grupo dimetoxitritilo o cualquier otro grupo protector lábil, de una forma preferible, compatible con la química de sintetizadores automáticos.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, la expresión "complementaria", significa dos secuencias nucleotídicas de la misma longitud, cuyas bases se emparejan completamente.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, la expresión "X%" complementaria, significa el hecho de que, dos secuencias de la misma longitud, las cuales se encuentran alineadas a base de pares, en su entera longitud, comprende un X% de bases que se encuentran emparejadas.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, la expresión ``temperatura de fusión (Tm - [del inglés melting temperatura] -), se refiere al punto de temperatura, en una reacción de hibridación, a la cual, la mitad de los nucleótidos, se desnaturalizan (hebras individuales) y la mitad, se reasocian o hibridan (hebras dobles). La temperatura de fusión, depende de un juego de condiciones, referido a la restricción, como por ejemplo, el tampón de hibridación utilizado. Ésta puede determinarse en concordancia con métodos que son bien conocidos por parte de las personas expertas en el arte especializado de la técnica, tales como aquéllos que se describen por parte de Wallace et al., (1979) Nucleic Acid Res. 6: 3543-3558; Breslauer et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 376-3750; y Xia et al, (1998) Biochemistry 37: 14719-14735.

Los valores de la Tm (temperatura de fusión), pueden predecirse utilizando parámetros termodinámicos del vecino más cercano y correcciones específicas con sales, tal y como se describe por parte de Breslauer et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 376-3750 y Owczarzy et al., (2004), Biochemistry 43: 3537-3554. Tales tipos de predicciones, se consideran como precisas, para oligonucleótidos de 8 a 60 bases en longitud, en soluciones tampón neutras (valor pH 7-8), con concentraciones de cationes monovalentes de 10 mM a 1,2 M. La concentración de oligonucleótidos, se asume que es significativamente más grande que la concentración de la diana complementaria. Los efectos de las modificaciones químicas, no se tienen en consideración. Los efectos de los cationes divalentes, no se cuentan. El error medio de la Tm de esta forma determinada es, usualmente, de +/- 2ºC.

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De una forma ventajosa, gracias a la porción espaciadora, las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, proporcionan, en general, una fluorescencia incrementada con respecto a otras sondas fluorescentes conocidas en el arte especializado de la técnica, cuando se someten a test de ensayo, en condiciones óptimas de PCR. Adicionalmente, además, pueden utilizarse cantidades menores de las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, en comparación con las sondas fluorescentes pertenecientes al arte especializado correspondiente a la técnica anterior, reduciéndose, con ello, el coste de los ensayos de los cuales se hace uso, y los problemas vinculados a la hidrancia o resistencia estérica en los ensayos, de una forma particular, en los ensayos múltiplex. Adicionalmente, además, las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, proporcionan un sistema vigoroso y sensible, el cual, de una forma notable, facilita la detección de cantidades muy pequeñas de ácidos nucleicos (por ejemplo, 5-10 copias por ensayo de PCR).

De una forma igualmente ventajosa, e inesperada, las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, no son estrictamente dependientes de una temperatura específica de reasociación. Esto es particularmente ventajoso, cuando se implementan ensayos múltiplex, en donde, las varias sondas que se utilizan, tienen que ser funcionales, a la misma temperatura de reasociación, facilitando un diseño más sencillo de las sondas, y una selección más importante en las secuencias que se tienden a utilizar para enlazarse a los ácidos nucleicos diana.

Las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, son de utilidad para detectar un ácido nucleico diana, en una muestra. Tal tipo de ácido nucleico diana, puede derivarse de una microorganismo, tal como un virus (como por ejemplo, el virus de la hepatitis C (HCV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), el virus del papiloma humano (HPV), o una bacteria (como por ejemplo, la Listeria, la Salmonella, o una Micobacteria). Las sondas de doble hebra de la invención, son también de utilidad para la detección de polimorfismo nucleotídico individual, o inserciones, deleciones y mutaciones múltiples en ácidos nucleicos, como por ejemplo, en el marco de la diagnosis o la prognosis de enfermedades genéticas o cáncer.

En una forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, b = d = 0 (a y c representando entonces 1), y X_{1} y X_{2}, representan donantes fluorescentes, encontrándose entonces constituida, la citada sonda de doble hebra, por:

- una primera hebra de ácido nucleico de la fórmula X_{1}-L_{1}-S_{1}-S'_{1}-Y_{1}, y

- una segunda hebra de ácido nucleico de la fórmula X_{2}-L_{2}-S_{2}-S'_{2}-Y_{2}.

En otra forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, el donante fluorescente se selecciona de entre el grupo consistente en colorantes de santeño, colorantes de rodamina, colorantes de carbopironina y colorantes de carboxamida.

En otra forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, el aceptor fluorescente, se selecciona de entre el grupo consistente en Dabcilo, Dabsilo, BHQ1, BHQ2, BHQ3, Iowa black, Eclipse, QSY-7/9, QSY-21, DABMI, verde de malaquita, cumarina, y extintores (inhibidores) oscuros.

Las características de los donantes y aceptores fluorescentes que se tiende a utilizar en el ámbito de la presente invención, se representan en la tabla que se facilita a continuación.

2

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(Continuación)

3

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La absorbancia características de (Abs) de algunos aceptores fluorescentes, se presentan en la tabla que se facilita a continuación:

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Ejemplos de pares de donantes/aceptores fluorescentes apropiados, incluyendo la excitación máxima (Exc) y la emisión máxima (Em), los cuales pueden utilizarse en el contexto de la presente invención, se reportan en la tabla que se facilita a continuación.

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5

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(Continuación)

6

En otra forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, L_{1} y L_{2}, inhiben, respectivamente, menos de un porcentaje del 25% de la fluorescencia de X_{1} y X_{2}, cuando X_{1} y X_{2}, representan porciones fluorescentes y, L'_{1} y L'_{2,} respectivamente, inhiben menos de un porcentaje del 25% de la fluorescencia de Y_{1} e Y_{2}, cuando Y_{1} e Y_{2}, representan porciones fluorescentes.

En otra forma preferida de presentación de las sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, L_{1}, L_{2}, L'_{1} y/o L'_{2}, comprenden por lo menos una carga negativa. La presencia de por lo menos una carga negativa, en la porción espaciadora, asegura el hecho que, cuando ambas hebras de la sonda de doble hebra, se encuentran asociadas conjuntamente, las porciones fluorescente e inhibidora (extintora),, se encuentran en estrecha proximidad la una con respecto a la otra, gracias a las interacciones electrostáticas, las cuales acontecen entre la carga positiva y las estructuras de cadena de fosfato de las hebras de DNA, negativamente cargadas.

En otra forma preferida de presentación de las sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, L_{1}, L_{2}, L'_{1} y L'_{2}, idénticas o diferentes, se seleccionan de entre el grupo consistente en un polinucleótido que tiene de 2 a 10 nucleótidos, un grupo alquilo ó aminoalquilo que tiene de 3 a 12 átomos de carbono, y un grupo polietilenglicol que tiene un grado de polimerización de 2 a 6.

En otra forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, L_{1}, L_{2}, L'_{1} y L'_{2}, idénticas o diferentes, representan un polinucleótido poli T. de una forma ventajosa, los polinucleótidos poli T, proporcionan un mínimo de extinción o inhibición, con respecto a otros polinucleótidos.

En otra forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, cuando L_{1} y/o L_{2}, representan un polinucleótido, entonces, la longitud de L_{1} y/o L_{2}, es más corta que la de S'_{2} y/o S'_{1}, respectivamente. De una forma ventajosa, en tal tipo de configuración, un donante fluorescente enlazado a la unidad espaciadora, estaría en una estrecha proximidad con respecto a los nucleótidos de S'_{2} y/o S'_{1}, cuando las hebras de las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, se encuentran enlazadas conjuntamente, inhibiéndose con ello, de una forma posible, de una forma particular, si S'_{2} y/o S'_{1}, comprenden nucleótidos G.

En otra forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, cuando L_{1} y/o L_{2}, representan un polinucleótido, entonces, L_{1} y/o L_{2}, presentan menos de un porcentaje del 35% de complementariedad con S'_{2} y/o S'_{1}, respectivamente. Tal tipo de bajo porcentaje de complementariedad, es ventajoso, debido al hecho de que, éste, permite a las hebras de la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, el enlazarse particularmente y preferencialmente, a su respectiva hebra de ácido nucleico diana, al compararse con su unión o enlace mutuos.

En otra forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, la temperatura de fusión de la primera hebra, en la sonda, con respecto a la segunda hebra de la sonda, es por lo menos un 10% inferior que la temperatura de fusión de cada una de las sondas, con respecto a sus respectivas hebras de ácido nucleico diana. Tal tipo de temperatura de fusión, es la que se prefiere, debido al hecho de que, ésta, permite un enlace o unión particularmente preferencial de las hebras de la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, a su respectiva hebra de ácido nucleico, al compararse con un enlace o unión mutua.

En una forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba:

- X_{1} y X_{2}, se seleccionan de entre el grupo constituido por FAM, Att532, NK141, NK230 y ATTO647N;

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo

- L_{1} y L_{2}, representan un polinucleótido poli T, que tiene de 4 a 6 nucleótidos;

- S_{1} y S_{2}, representan una secuencia de oligonucléotido que tiene de 14 a 18 nucleótidos;

- S'_{1} y S'_{2}, representan una secuencia de oligo-nucléotido que tiene de 4 a 6 nucleótidos;

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En otra forma preferida de presentación de la sonda de doble hebra anteriormente definida, arriba, S_{1}-S'_{1}, representan un fragmento de una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por:

\bullet 5'-CACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGT-3' (SEQ ID NO: 31);

S_{2}-S'_{2} representando entonces un fragmento de

5'-GGAGTCCGCGTAAAGAGAGGTGCGCCCCGT-3' (SEQ ID NO: 32) (tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección de la Zona A del HBV);

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\bullet 5'-CGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCG-3'(SEQ ID NO: 33);

S_{2}-S'_{2} representando entonces un fragmento de

5'-GTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAG-3' (SEQ ID NO: 34) (tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección de la Zona B del HBV);

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\bullet 5'-CCAAGCGGTGGCGGCGGAGGACGGCACTGC-3' (SEQ lD NO: 35);

S_{2}-S'_{2} representando, entonces, un fragmento de 5'-GTCCTCCGCCGCCACCGCTTGGCGATTGTC-3' (SEQ ID NO: 36) (tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección de un control interno);

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\bullet 5'-ATAGTGGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAA-3' (SEQ ID NO: 37);

S_{2}-S'_{2} representando, entonces, un fragmento de

5'-GACATTTATCACAGCTGGCTACTATTTCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 38) (tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección del HIV-1M);

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\bullet 5'-AGTCTACCTGACCATGAATTGCTTCCCCTTTTATATGGCAT-3' (SEQ ID NO: 39);

S_{2}-S'_{2} representando, entonces, un fragmento de

5'-TAAAAGGGGAAGCAATTCATGGTCAGGTAGACTACAGTCCA-3' (SEQ ID NO: 40) (tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección del HIV-10).

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La presente invención, se refiere, también, a la siguiente sonda de doble hebra como se ha definido anteriormente, arriba, la cual puede utilizarse para la detección del HBV, estando constituida, la citada sonda de doble hebra, por:

- una primera hebra de ácido nucleico, de la fórmula X_{1}-S_{1}-S'_{1}-Y_{1}, en la orientación 5' a 3', y

- una segunda hebra de ácido nucleico, de la fórmula X_{2}-L_{2}-S_{2}-S'_{2}-Y_{2}, en la orientación 5' a 3'; y en donde,

- X_{1} y X_{2}, se seleccionan de entre el grupo constituido por FAM, Atto532, NK141, NK230 y ATTO647N;

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2}, representan 5'-TTTT-3' (SEQ ID NO: 41);

- S_{1} representa 5'-GGAGTTCTTCTTCTAGGG-3' (SEQ ID NO: 42);

- S'_{2} representa 5'-GACC-3'(SEQ ID NO: 43);

- S_{2} representa 5'-CCCTAGAAGAAGAACTCC-3' (SEQ ID NO: 44);

- S'_{2} representa 5'-CTCG-3' (SEQ ID NO: 45); tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección de la Zona B del HBV;

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o en donde:

- Y_{1} e Y_{2} representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTTTT-3' (SEQ ID NO: 46);

- S_{1} representa 5'-GGGAGTTCTTCTTC-3' (SEQ ID NO: 47);

- S'_{1} representa 5'-TAGGGG-3' (SEQ ID NO: 48);

- S_{2} representa 5'-GAAGAAGAACTCCC-3' (SEQ ID NO: 49);

- S'_{2} representa 5'-TCGCCT-3' (SEQ ID NO: 50); (tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección de la Zona B del HBV);

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o en donde,

- X_{1} y X_{2} se seleccionan de entre el grupo constituido por FAM, Atto532, NK141, NK230 y ATTO647N;

- Y_{1} e Y_{2} representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTTTT-3' (SEQ ID NO: 46);

- S_{1} representa 5'-CTCTTTACGCGGAC-3' (SEQ ID NO: 51);

- S'_{1} representa 5'-TCCCCG-3' (SEQ ID NO: 52);

- S_{2} representa 5'-GTCCGCGTAAAGAG-3' (SEQ ID NO: 53);

- S'_{2} representa 5'-AGGTGC-3' (SEQ ID NO: 54); tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección de la Zona A del HBV.

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La presente invención, se refiere, también, a la siguiente sonda de doble hebra como se ha definido anteriormente, arriba, la cual puede utilizarse para la detección del HIV, estando constituida, la citada sonda de doble hebra, por:

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTT-3' (SEQ ID NO: 41);

- S_{1} representa 5'-CCAGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO: 55);

- S'_{1} representa 5'-TCAG-3' (SEQ ID NO: 56);

- S_{2} representa 5'-CATTTATCACAGCTGG-3' (SEQ ID NO: 57);

- S'_{2} representa 5'-CTAC-3' (SEQ ID NO: 58);); tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección del HIV-1M;

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o en donde,

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTT-3' (SEQ ID NO: 41);

- S_{1} representa 5'-CTGACCATGAATTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 59);

- S'_{1} representa 5'-CCCT-3' (SEQ ID NO: 60);

- S_{2} representa 5'-GAAGCAATTCATGGTCAG-3' (SEQ ID NO: 61);

- S'_{2} representa 5'-GTAG-3' (SEQ ID NO: 62); tal como una sonda de doble hebra, particularmente pretendida para la detección del HIV-10.

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La presente invención, se refiere, también, a la siguiente sonda de doble hebra como se ha definido anteriormente, arriba, la cual puede utilizarse para la detección de un control interno, en la citada la citada sonda de doble hebra, está constituida por:

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTTTT-3' (SEQ ID NO: 46);

- S_{1} representa 5'-AAGCGGTGGCGGCG-3' (SEQ ID NO: 63);

- S'_{1} representa 5'-GAGGAC-3' (SEQ ID NO: 64);

- S_{2} representa 5'-CGCCGCCACCGCTT-3 (SEQ ID NO: 65)';

- S'_{2} representa 5'-GGCGAT-3' (SEQ ID NO: 66).

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La invención, se refiere adicionalmente a un equipo, a modo de kit, para la detección fluorescente de por lo menos un ácido nucleico de hebra individual o de doble hebra, que comprende una primera hebra de ácido nucleico de la fórmula X_{1}-(L_{1})_{a}-S_{1}-S'_{1}-(L'_{1})_{b}-Y_{1}, tal y como se define anteriormente, arriba, y una segunda hebra de ácido nucleico de la fórmula X_{2}-(L_{2})_{c}-S_{2}-S'_{2}-(L'_{2})_{d}Y_{2}, tal y como se define anteriormente, arriba.

La invención, se refiere, también, al uso de una sonda en concordancia con la presente invención, para detectar, mediante fluorescencia, ácidos nucleicos diana de hebra individual o de doble hebra, de una forma particular, en procedimientos que comprenden por lo menos una etapa de hibridación de ácido nucleico.

En una forma preferida de presentación del uso anteriormente definido, arriba, el ácido nucleico diana, se encuentra presente en una muestra biológica.

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En otra forma preferida de presentación del uso anteriormente definido, arriba, la detección de por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, se lleva a cabo en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico basado en enzimas.

La expresión "procedimiento de amplificación de ácido nucleico basado en enzimas", se refiere a cualquier procedimiento, en donde acontece una síntesis de ácido nucleico catalizado por enzimas.

Tal tipo de procedimiento de amplificación de ácido nucleido basado en enzimas, puede seleccionarse, de una forma preferible, de entre el grupo constituido por LCR, replicación Q-beta, NASBA, LLA (del inglés Linked Linear Amplification - [Amplificación lineal enlazada] -), TMA, 3SR, Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), notablemente, abarcando a todos los sistemas de PCR basados en procedimientos conocidos en el arte especializado de la técnica, tal como la PCR de transcriptasa inversa (RT-CR), PCR simplex y múltiplex, PCR a tiempo real, PCR de punto final, PCR cuantitativa o cualitativa, y combinaciones de éstas. Estos procedimientos de amplificación de ácido nucleico basados en enzimas, son bien conocidos por parte de aquéllas personas expertas en el arte especializado de la técnica, y éstos se describen, de una forma notable, en Saiki et al. (1988) Science 239: 487, en las solicitudes de patente europeas EP 200 362 y EP 201 184 (PCR), Fahy et al. (1991) PCR Meth. Appl. 1: 25-33 (3SR, Self-sustained Sequence Replication - [Replicación de secuencia autosostenida (3SR)]-); patente estadounidense US 5.399.491 (TMA, Transcription Mediated Amplification - [Amplificación mediatizada por Transcripción (TMA)] -), Walker et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (SDA, Strand Displacement Amplification - [Amplificación mediante desplazamiento de hebra (SDA)] -); patente europea EP 0 320 308 (LCR, Ligase Chain Reaction - [Reacción en cadena de la ligasa](LCR) -); Bustin & Mueller (2005), Clin. Sci. (Londres) 109: 365-379 (real time Reverse-Transcription PCR - [PCR de transcripción inversa a tiempo real] -).

De una forma preferible, el procedimiento de ácido nucleico basado en enzimas, se selecciona de entre el grupo consistente en la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR ó RT-PCR múltiplex, y PCR ó RT-PCR a tiempo real. De una forma mayormente preferible, el procedimiento de amplificación de ácido nucleico basado en enzimas, es el procedimiento de PCR ó RT-PCR, a tiempo real, opcionalmente, múltiplex.

Tal y como se pretende aquí, en este documento, "múltiplex", se refiere a la detección de por lo menos dos ácidos nucleicos diana diferentes, mediante la utilización de por lo menos dos sondas de doble hebra en concordancia con la invención, en donde, cada uno de los citados ácidos nucleicos diana, es susceptible de detectarse, mediante por lo menos una de las citadas sondas de doble hebra. De una forma preferible, el marcaje de cada sonda con un donante fluorescente diferente, hace posible detectar separadamente la señal emitida por las distintas sondas enlazadas a su ácido nucleico diana.

En otra forma de presentación, el uso anteriormente definido, arriba, se aplica a la cuantificación fluorescente de por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra. Esto puede realizarse fácilmente por parte de una persona experta en el arte especializado de la técnica, mediante la implementación de un control de cuantificación interno, o mediante la utilización de curvas standard.

La presente invención, se refiere, también, a un equipo, a modo de "kit", para la detección fluorescente de por lo menos un ácido nucleido diana, de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de de amplificación de ácido nucleico, a base de enzimas, el cual comprende:

- por lo menos una sonda de ácido nucleico como se ha definido anteriormente, arriba,

- una enzima para la amplificación de ácido nucleico, basada en enzimas,

- una mezcla de reactivos, adaptada para la amplificación de ácido nucleico a base de enzimas.

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En una forma preferida de presentación, el equipo a modo de "kit" anteriormente definido, arriba, para la detección por fluorescencia de por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico a base de enzimas, comprende adicionalmente cebadores adaptados para la amplificación a base de enzimas, del ácido nucleico diana.

En otra forma preferida de presentación, el equipo a modo de "kit" anteriormente definido, arriba, para la detección por fluorescencia de por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico a base de enzimas, está más particularmente adaptado para la detección de varios ácidos nucleicos diana de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de amplificación múltiplex de ácidos nucleicos, a base de enzimas, comprendiendo, el citado equipo a modo de "kit", varias sondas de doble hebra según se han definido anteriormente, arriba, en donde, cada uno de los citados ácidos nucleicos diana, es susceptible de detectarse mediante por lo menos una de las citadas sondas de doble hebra.

La presente invención, se refiere, también, a un procedimiento para la detección de por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, a base de enzimas, que comprende las siguientes etapas:

a) mezclar por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, con:

- por lo menos una sonda de doble hebra tal y como se ha definido anteriormente, arriba, pretendida para la detección del citado ácido nucleico diana, o por lo menos un par de las dos hebras de ácido nucleico diana tal y como se ha definido en el equipo, a modo de "kit", anteriormente descrito, arriba,

- una enzima, para la amplificación de ácido nucleico a base de enzimas,

- cebadores de nucleótidos, adaptados para la amplificación, a base de enzimas, del ácido nucleico diana,

- una mezcla reactiva, adaptada para la amplificación de ácido núcleico a base de enzimas, para obtener la mezcla de reacción;

b) fundir los ácidos nucleicos presentes en la mezcla de reacción, mediante el calentamiento de la citada mezcla de reacción;

c) dejar que la sonda de doble hebra y los cebadores de nucleótidos, hibriden a los ácidos nucleicos diana, mediante el enfriado de la mezcla de reacción;

d) dejar que la enzima catalice la síntesis de ácido nucleico;

e) repetir las etapas b) a d);

en donde, la intensidad de la reacción de fluorescencia, procedente de la mezcla de reacción, se mide en por lo menos una de las etapas b) a d) y las etapas b) a d), se repiten, por lo menos hasta que, la intensidad de la emisión de fluorescencia, se mida por encima de un nivel de fondo.

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Tal y como se pretende aquí, en este documento, las etapas c) y d), pueden realizarse de una forma concomitante.

En una forma de presentación del procedimiento anteriormente definido, arriba, para la detección de por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico a base de enzimas, el por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, se detecta a tiempo real.

En otra forma de presentación del procedimiento anteriormente definido, arriba, para la detección de por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico a base de enzimas, se procede a cuantificar el por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra.

La invención, se ilustra adicionalmente en los ejemplos que se facilitan a continuación.

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Descripción resumida de las figuras

La figura 1, representa un esquema general de una sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, y su enlace a un ácido nucleico diana. X_{1} y X_{2}, son fluoróforos, Y_{1} e Y_{2}, son inhibidores (extintores).

La figura 2, representa un ejemplo de una sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, y su enlace a un ácido nucleico diana. F, representa un fluoróforo, Q, es un inhibidor (extintor).

La figura 3, representa una migración de gel electrofóretica (desde la parte superior hasta el fondo) de PCRs, realizadas en sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención (panel superior), con sondas moleculares Beacon (panel inferior). Desde la izquierda hasta la derecha, las bandas, corresponden a:

Marcador de peso EZ - banda no cargada - control de agua x 3 bandas - 5 copias HBV/PCR x 3 bandas - 10 copias HBV/PCR x 3 bandas - 50 copias HBV/PCR x 3 bandas, 500 copias HBV/PCR x 2 bandas - 5000 copias HBV/PCR x 2 bandas - banda no cargada - marcador de peso EZ.

La figuras 4A y la figura 4B, respectivamente, representan curvas de ensayos normalizados de florescencia versus número de ciclos, en RT-PCR a tiempo real, para la detección de HIC-1M (según se describe en el ejemplo 7), en presencia de una sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención (Figura 4B) o sondas moleculares Beacon de referencia (Figura 4A).

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos utilizados, se compraron de procedencia de la firma Eurogentec, o se sintetizaron en un sintetizador de DNA/RNA del tipo ``Expedite 8909 DNA/RNA synthesizer (Perkin-Elmer), utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante, y reactivos comprados de procedencia de la firma Applied Biosystems y de la firma Glen Research.

Las sondas de oligonucleótidos, contenían un aceptor fluorescente de Dabcilo (Dabcyl) en el extremo 3', y una fluoresceína (FAM) ó porción de fluoróforo Atto532, en el extremo 5'.

La porción de Dabcilo, se introdujo durante la sítensis de oligonucleótidos automatizadas, utilizando una columna controlada de vidrio poroso (3'Dabcyl-CPF, procedente de la firma Glen Research).

El extremo 5' del oligonucleótido, se funcionalizó, utilizando un engarce específico modificador de tiol, para el extremo 5', del tipo "5'-Thiol Modifier linker" de procedencia de la firma Glen Research.

El oligonucleótido, se purificó, a continuación, utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Después de la purificación, el grupo protector, se retiró del grupo sulfhidrilo, al extremo 50, y el oligonucleótido 5'SH, se acopló a una fluoresceína (FAM) derivada de la yodoacetamida (6-IAF, de procedencia de la firma Molecular Probes, ref. I-20452) ó un derivado de la maleimina Atto 532 (ATTO-TEC, ref. AD532-4).

Los colorantes no reaccionados, se retiraron por cromatografía de exclusión, con columna NAP-5 (Pharmacia, Suecia).

Finalmente, el oligonucleótido con doble marcaje, se purificó mediante HPLC, se desaló y se liofilizó, en concordancia con procedimientos que son bien conocidos por parte de aquéllas personas expertas en el arte especializado de la técnica.

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Determinación experimental de las temperaturas de fusión (m) de las sondas de doble hebra

Las temperaturas de fusión, se midieron mediante el control de la fluorescencia, como una función de la temperatura.

En resumen, los perfiles térmicos de desnaturalización para los híbridos marcados con un fluoróforo FAM (excitación a 490 nm, emisión a 530 nm), se obtuvieron utilizando espectrofluorímetro Varian (ref. 85-102023-00, Cary Eclipse Bio). Todas las mediciones, se realizaron en el siguiente tampón de hibridación: 2,5 mM MgCl_{2} (ref. 11558147, Qiagen), tampón de PCR 1X (Tampón PCR 10X, ref. 12182201, Qiagen). La concentración de los oligonucleótidos, era de 0,1 \muM y, la concentración de los oligonucleótidos diana, era de 0,2 \muM, en un volumen final de 50 \mul. La temperatura, se incrementó en etapas o pasos de 0,5ºC, desde una temperatura de 25ºC a una temperatura de 95ºC, durando, cada paso o etapa, 60 segundos. Se procedió a medir la fluorescencia, durante los 30 segundos finales. Las longitudes de excitación y de emisión, eran de 10 nm y el voltaje del PMT (fotomultiplicador), se ajustó a un valor de 600 V.

Todas las soluciones de dúplexes, se trataron, antes de los experimentos de desnaturalización, para favorecer la hibridación con el siguiente procedimiento: calentamiento a una temperatura de 95ºC, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, enfriado a la temperatura ambiente, durante un transcurso de tiempo de 180 minutos, y almacenaje a una temperatura de 4ºC, durante el transcurso de toda la noche.

La Tm (temperatura de fusión), se calculó utilizando el primer procedimiento derivado, con el "software" informático, para cálculos térmicos, del tipo "Eclipse Thermal software" (Varian).

A la temperatura ambiente, se reasocian las dos hebras de las sondas de doble hebra. Se observa una baja fluorescencia (Dabcilo y FAM, se encuentran en cercana proximidad). A medida que aumentan las temperaturas, los híbridos funden a parte, el Dabcilo se desplaza desde la FAM, y disminuye la extinción o inhibición, dando como resultado un incremento de la intensidad de la emisión de la fluorescencia a partir de la FAM. Por el contrario, cuando la hebra de una sonda de doble hebra se reasocia con su diana, a la temperatura ambiente, la FAM, se separa del Dabcilo, lo cual tiene como resultado una alta señal de fluorescencia. A medida que la temperatura incrementa, los híbridos se funden a parte, y la señal de fluorescencia decrece.

Los valores de la Tm (temperatura de fusión) (Tm exp.), se indican en la tabla que se facilita abajo, a continuación.

7

Las temperaturas de fusión teóricas (Tm teór.), se calcularon utilizando el analizador de cálculo de temperaturas del tipo "Tm calculador" de Oligoanalizer 3,0 en SciTools (Integrated DNA Technologies).

Los valores experimentales de la temperatura de fusión (Tm exp.), son ligeramente superiores que los valores teóricos de la temperatura de fusión (Tm teór.). La diferencia entre la TM de la sonda de doble hebra y la Tm para el híbrido de cada hebra, de la sonda de doble hebra, con su diana cognada o afín, es similar en la práctica (\Delta Tm exp.) y en la teoría (\Delta Tm teór.). Los valores de la temperatura de fusión (Tm), se utilizaron para determinar la mejor temperatura de reasociación (Mejor Ta - [Ta, del inglés, annealing temperature] -), en los siguientes experimentos de PCE. La temperatura de reasociación, se eligió, usualmente, en un valor mayor que la Tm, para la sonda de doble hebra, y en un valor menor que la Tm, para el híbrido de cada hebra de las sondas de doble hebra con sus respectivas dianas.

NB: sólo se determinaron valores teóricos para las siguientes sondas:

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Ejemplo 2

Detección del genoma del HBV, procediendo a objetivizar, como diana, la parte del extremo 3' del gen HBV C (zona B) en el principio de la región codificadora de la DNA polimerasa del HBV.

Se procedió, en primer lugar, a someter a test de ensayo, a un test de ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a tiempo real, para la detección de la zona B (nucleótidos (nt) 2300-2435 de la hebra de referencia adw Nº M98077) del genoma del HBV, y se comparó con una sonda molecular Beacon de referencia.

Materiales y métodos

Se procedió a extraer DNA del HBV, a partir de un control positivo de DNA de HBV, Accurun 325, obtenido de procedencia de la firma BBI Diagnostic (ref. A325-5723), utilizando el equipo a modo de kit, "QIAamp DSP Virus kit" (Qiagen, ref. 60704), en concordancia con las instrucciones del fabricante. El DNA genómico del HBV, se diluyó con agua, antes de su uso.

Las sondas y cebadores de nucleótidos, se obtuvieron de procedencia de la firma Eurogentec. Se utilizaron las sondas y cebadores que se citan a continuación:

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F = FAM; Q' = Dabcilo; las secuencias que enlazan para el ácido nucleico diana, se encuentran representadas en negrita.

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Las mezclas de PCR, eran como sigue: HBV DNA 0-50,000 copias por PCR, sonda Molecular Beacon 0,6 \muM por PCR, ó sonda de doble hebra, 0,3 \muM para cada hebra, cebadores de HBV 0,6 \muM, Polimerasa del tipo "HotStarTaq Polymerase" (QIAGEN ref. 203205) 2,5U, MgCl_{2} 6 mM, d(ACGU)TP 200 \muM, dTTP 100 \muM, 0,25U UDG, PVP 0,3%, glicerol 5%.

Se procedió a realizar PCR a tiempo real, en un termociclador fluorescente del tipo "BioRad Chromo4 fluorescent thermocycler", con el siguiente perfil térmico.

200

Resultados

Se procedió a estudiar varios parámetros, con objeto de comparar las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención y las sondas moleculares Beacon de referencia:

- se procedió a avaluar el ciclo umbral (Ct), para varias cantidades de partida de DNA, en las mezclas; Ct, representa el número de ciclos que son necesarios para conseguir una señal de fluorescencia mayor que la fluorescencia de fondo; los valores de Ct, son proporcionales al log_{10} de las cantidades iniciales o de partida de DNA;

- el límite de detección, corresponde a la menor cantidad de DNA detectada

- la linealidad de la curva del Ct versus cantidad de DNA inicial, en las mezclas de PCR (se objetiviza, como diana, un coeficiente de correlación de por lo menos 0,95);

- los niveles de la intensidad de fluorescencia y la diferencia entre la fluorescencia de fondo y la emisión de fluorescencia, mediante las sondas (cuanto más importante es la diferencia, más simple y sencilla es la discriminación de los pequeños números de copias de DNA).

El Ct medio, se calcula a partir de los diferentes valores de CT medidos para un número inicial dado de copias de DNA diana; SD, representa la desviación standard y, CV, el coeficiente de variación.

Los resultados obtenidos para la sonda molecular Beacon de referencia y la sonda de doble hebra en concordancia con la invención, se presentan en las tablas que se facilitan a continuación.

\bulletSonda molecular Beacon (MB) de referencia (Ta = 55ºC):

10

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\bulletSonda de doble hebra (DS) (Ta = 55ºC):

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La ganancia de fluorescencia obtenida mediante la utilización de la sonda de doble hebra de la invención, se resume en la tabla que se facilita a continuación:

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12

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Los valores de Ct medidos utilizando la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, son similares a aquéllos medidos con la sonda Molecular Beacon de referencia.

La sensibilidad, es similar, utilizando ambas sondas, pero se obtiene un 35% de incremento en la fluorescencia máxima, de media, cuando se utiliza la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención.

En cuanto a lo referente a la sonda Molecular Beacon de referencia, la regresión lineal del Ct, con respecto al número inicial de copias de DNA diana, para la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, presenta un alto coeficiente de correlación (R^{2} = 0,9788).

Las PCRs a tiempo real, utilizando sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, permanecen funcionales, dentro de unos amplios márgenes de temperatura de reasociación (de 51ºC a 60ºC). De hecho, se obtuvieron valores similares, cuando se procedió a someter a test de ensayo las sondas de doble hebra, con una temperatura de reasociación situada entre 51ºC y 60ºC (véase la tabla que se facilita abajo, a continuación).

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Sonda de doble hebra (Ta = 51ºC):

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Sonda de doble hebra (Ta = 60ºC):

14

Además, una PCR a tiempo real, realizada con la misma sonda de doble hebra, a una concentración inferior, de 0,2 \muM de cada hebra, proporcionó unos resultados productivos similares (si se compara a una concentración de 0,6 \muM de la sonda Molecular Beacon de referencia).

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Ejemplo 3 Detección de la zona B del genoma del HBV

Se procedió a diseñar una sonda alternativa en concordancia con la presente invención, y ésta se utilizó en las mismas condiciones como las que se han expuesto en el Ejemplo 2, excepto en cuanto a lo referente a la temperatura de reasociación, la cual se ajustó a un temperatura de 50ºC, y ésta se comparó con la sonda Molecular Beacon.

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\bulletSonda de doble hebra (DS) (Ta = 50ºC):

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En cuanto a lo referente a la sonda de doble hebra expuesta en el Ejemplo 1, los Ct, medidos utilizando la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, son similares a aquéllos medidos con la sonda Molecular Beacon de referencia.

De nuevo, la sensibilidad, es similar, utilizando ambas sondas.

En cuanto a la sonda Molecular Beacon de referencia, la regresión lineal del Ct, con respecto al número inicial de copias de DNA diana, presentan también un alto coeficiente de correlación (R^{2} = 0,9746), para las sonda de doble hebra en concordancia con la invención.

Las PCRs a tiempo real, utilizando esta sonda de doble hebra, permanece funcional dentro de unos amplios márgenes de temperatura de reasociación (de 46ºC a 55ºC). Se obtuvieron unos resultados similares, cuando las sondas de doble hebra, se sometieron a test de ensayo con una temperatura de reasociación de 55ºC (véase la tabla que se facilita abajo, a continuación).

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Sonda de doble hebra (Ta =55ºC):

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Ejemplo 4 Detección de un genoma de HBV, procediendo a objetivizar, como diana, una región de solapado del genoma del HBV (zona A)

Se procedió a someter a tests de ensayo, sondas de doble hebra en concordancia con la invención, en un ensayo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), para la detección de la zona A del genoma del HBV (final de la DNA-polimerasa del HVB, codificante, y el inicio de las secuencias que codifican a los nucleótidos de las proteínas HVB X (nt), 1440-1602 de la cepa de referencia adw nº M98077) y comparadas con una sonda Molecular Beacon de referencia, utilizando las misma condiciones que las expuestas en el Ejemplo 2, excepto en cuanto o lo referente a la concentración de la sonda de doble hebra, la cual se ajustó a un valor de 0,2 \muM.

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Se utilizaron las sondas y cebadores que se citan a continuación:

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Los resultados obtenidos para la sonda molecular Beacon y la sonda de doble hebra en concordancia con la invención, se presentan en las tablas que se facilitan a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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\bulletSonda molecular Beacon (MB) de referencia (Ta = 55ºC):

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\bulletSonda de doble hebra (DS) (Ta = 55ºC):

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Los resultados obtenidos, se resumen en la tabla que se facilita a continuación:

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La sensibilidad, es similar, utilizando ambas sondas, pero se obtiene un 49,1% de incremento en la fluorescencia máxima, de media, cuando se utiliza la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención.

En cuanto a lo referente a la sonda Molecular Beacon de referencia, la regresión lineal del Ct, con respecto al número inicial de copias de DNA diana, para la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, presenta un alto coeficiente de correlación (R^{2} = 0,9826).

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Sonda de doble hebra (Ta = 51ºC):

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Sonda de doble hebra (Ta = 60ºC):

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Además, una PCR a tiempo real, realizada con la misma sonda de doble hebra, a ambas, una concentración inferior, de 0,1 \muM, y a una concentración superior, de 0,3 \muM, de cada hebra, proporcionó unos resultados productivos similares (si se compara a una concentración de 0,6 \muM de la sonda Molecular Beacon de referencia).

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Ejemplo 5 Detección de un control interno (IC)

Se procedió a someter a tests de ensayo, una sonda de doble hebra en concordancia con la invención, en un ensayo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) a tiempo real, para la detección de un control interno (IC), y se comparó con una sonda Molecular Beacon de referencia.

Los ICs, se utilizan en ensayos múltiplex, con objeto de validar los resultados de la PCR, gracias a su Ct diana, y a su intervalo confidencial. A parte de esto, éstos facilitan la detección de inhibidores en las muestras y, así de este modo, ayudan a validar su cuantificación. Se designa, usualmente, un IC, para tener la misma eficiencia de PCR, y la misma longitud de amplicones que la del ácido nucleico diana.

El IC utilizado en el presente caso, es un fragmento de 408 nucleótidos, generados mediante PCR, a partir del gen ADH del maíz (GMO-Standard del maíz ERM-BF4111, referencia 91528 Fluka) con los siguientes cebadores específicos:

5'- TGC CAT CGC TGT GCT ACA AC- 3'	(SEQ ID NO: 18)

5'- AAC GAC GGG AAG GAG GGT GC-3'	(SEQ ID NO: 19)

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El fragmento de DNA del IC, se extrajo, a continuación, utilizando el equipo, a modo de "kit" de purificación por PCR, del tipo "QiaQuick PCR Purification Kit" (Qiagen, referencia 28104), en concordancia con las instrucciones del fabricante. El fragmento de DNA del IC, se diluyó en agua, después de la dosificación UV y antes de su uso.

Las mezclas de PCR utilizadas, eran tal y como se describen en el Ejemplo 2, excepto en cuanto a lo referente al DNA a ser amplificado, 0-10.000 copias de DNA del IC, por PCR; la concentración de las sondas: sonda Molecular Beacon 0,2 \muM, sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención 0,1 \muM de cada hebra; y la concentración de los cebadores de 0,3 \muM.

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Las secuencias de las sondas y cebadores, se exponen a continuación:

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\bulletSonda molecular Beacon (MB) de referencia (Ta = 55ºC):

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\bulletSonda de doble hebra (DS) (Ta = 55ºC):

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La ganancia de fluorescencia, se calcula con la siguiente fórmula: [(DS de la fluorescencia máxima - MB de la fluorescencia máxima/MB de la fluorescencia máxima] x 100.

La sensibilidad y la fluorescencia máxima, es similar, utilizando ambas sondas.

En cuanto a lo referente a la sonda Molecular Beacon de referencia, la regresión lineal del Ct, con respecto al número inicial de copias de DNA diana, presenta un alto coeficiente de correlación (R^{2} = 0,9767), para la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención.

Las PCRs a tiempo real, utilizando sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, permanecen funcionales, dentro de unos amplios márgenes de temperatura de reasociación (de 51ºC a 60ºC).

De hecho, se obtuvieron valores similares, cuando se procedió a someter a test de ensayo las sondas de doble hebra, con una temperatura de reasociación situada entre 51ºC y 60ºC (véase la tabla que se facilita abajo, a continuación).

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\bulletSonda de doble hebra (DS) (Ta = 51ºC):

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\bulletSonda de doble hebra (DS) (Ta = 60ºC):

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Además, una PCR a tiempo real, realizada con la misma sonda de doble hebra, a una concentración inferior, de 0,1 \muM, de cada hebra, proporcionó unos resultados productivos similares (si se compara a una concentración de 0,2 \muM de la sonda Molecular Beacon de referencia).

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Ensayos múltiples

Se procedió a disponer un ensayo múltiplex, combinando la detección en la zona A, del genoma del HBV, y de un control interno (facilitando la determinación del rendimiento productivo de extracción y el rendimiento productivo de la inhibición, durante la PCR), utilizando las sondas y los cebadores de los Ejemplos 4 y 5.

En resumen, las concentraciones de sondas y cebadores de DNA moldes, se utilizaron en las mezclas, de otro modo similares, del Ejemplo 2:

- 300 copias de IC-DNA, por PCR; cebadores IC 0,3 \muM;

- HBV DNA 0-50-50.000 copias por PCR; cebadores HBV 0,6 \muM;

- Sonda molecular Beacon de IC 0,2 \muM, ó sonda de doble hebra IC 0,1 \muM por cada hebra;

- Sonda molecular HBV 0,2 \muM, ó sonda de doble hebra HBV 0,2 \muM por cada hebra.

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Las condiciones de PCR a tiempo real, no cambiaron, al compararse con las expuestas anteriormente, arriba.

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Sonda molecular Beacon (MB) de referencia (Ta = 55ºC):

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\bulletSonda de doble hebra (DS) (Ta = 55ºC):

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NB: control IC, representa mezclas, en las cuales, se añadieron solamente 300 copias de IC, sin ningún HBV-DNA.

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Detección de la fluorescencia de Atto 532 (detección del IC-DNA)

Tal y como se esperaba, esta detección, proporcionó esencialmente unos resultados constantes para ambos sistemas de sondas. Únicamente se observó un ligero descenso en el Ct, a altas temperaturas de HBV-DNA (50.000 copias/PCR), debido a la interferencia entre los colorantes FAM y Atto 532.

En conjunto, los resultados obtenidos utilizando la sonda de doble hebra de la invención, son similares a aquéllos obtenidos utilizando las sondas Moleculares Beacon de referencia. Adicionalmente, además, estos resultados, pudieron lograrse con más bajas concentraciones de las sondas de doble hebra, si se compara con las sondas Moleculares Beacon.

Es también digno de notar, el hecho de que, las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, son funcionales, dentro de un amplio margen de temperaturas de reasociación. Esto es particularmente ventajoso, cuando se procede a implementar ensayos múltiplex, en donde, las diversas sondas que se estén utilizando, deben ser funcionales, a las misma temperaturas de reasociación.

Finalmente, las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, mostraron también ser funcionales, dentro de unos amplios márgenes de concentraciones de MgCl_{2} (4-7 mM) (véase la tabla que se facilita abajo, a continuación).

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Ejemplo 6 Control de los amplicones

La calidad de los productos de PCR obtenidas con las reacciones de PCR anteriormente reseñadas, arriba, se controló mediante electroforesis en gel de azarosa. Los resultados obtenidos, se presentan en la Figura 3.

Solamente se amplifica un ácido nucleico, mediante PCR, con el tamaño esperado de 163 pares de bases, en presencia de la sonda Molecular Beacon, o en presencia de la sonda de doble hebra. Se observa una especificación no específica. A parte de ello, el uso de las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, no proporciona más dímeros de cebadores (MW \leq50 pb) que cuando se utilizan las sondas Moleculares Beacon.

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Ejemplo 7 Detección del genoma del HV1-M

Se procedió a aplicar las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, a la detección por PCR, a tiempo real, de varios genotipos (A, B, C, D, E, F, G y H) de HIV-1M, y se compararon con las sondas Moleculares Beacon de referencia.

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Materiales y métodos

Las muestras ensayadas eran, o bien la el sobrenadante de cultivo de las células linfoblásticas CEM, que tienen un título vírico de 7,75\cdot10^{8} partículas virales del subtipo B del HIV-1M/ml, o bien el panel PRD201 (BBI Diagnostic), que contenía 8 genotipos ((A, B, C, D, E, F, G y H) del HIV1-M, a 50.000 partículas víricas/ml.

Se procede a extraer HIV-RNA, de las muestras, utilizando el equipo a modo de kit, "QIAamp DSP Virus kit" (Qiagen, ref. 60704), en concordancia con las instrucciones del fabricante. El RNA extraído, se diluyó con agua, con RNA vehículo (1 ng/ml, QIAGEN, ref. 1009615).

Las secuencias de sondas y cebadores utilizadas, se exponen abajo, a continuación:

34

La sonda SH1BN14, está pensada para la detección del genotipo B del HIV-1M para los genotipos C y D, y la SH1BN18, para el genotipo E.

La sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, enlaza al mismo ácido nucleico diana que la SH1BM14. Ésta abarca, también, tres mmm, con el ácido nucleico diana correspondiente del genotipo C y dos mmm con el correspondiente ácido nucleico diana del genotipo D.

Las características de la sonda de doble hebra, se proporcionan en la tabla que se facilita abajo, a continuación:

35

Las mezclas de PCR, eran como sigue, cuando se utilizaron con las sondas Moleculares Beacon:

HIV-RNA, según se indica en la tablas, SHIBM14 0,4 \muM, SHIBM17 0,2 \muM, SHIBM18 0,2 \muM, cebadores de HIV1-M 0,6 \muM, 4U polimerasa Taq del tipo "HotStarTaq Polymerase" (QIAGEN ref. 203207), 100 \muM MgCl_{2}, d(ACGU)TP 200 \muM, Quantitec RT mix 0,5x (QIAGEN), 2,5% DMSO.

Las mezclas de PCR, eran como sigue, cuando se utilizaron con la sonda de doble hebra de la presente invención:

HIV-RNA, según se indica en la tablas, sonda de doble hebra 0,1 \muM, cebadores de HIV1-M 0,15 \muM, 4U polimerasa Taq del tipo "HotStarTaq Polymerase" (QIAGEN ref. 203207), 400 \muM MgCl_{2}, Quantitec RT 0,5x (QIAGEN), 2,5% DMSO.

Se procedió a realizar una PCR a tiempo real, en un termociclador fluorescente del tipo "BioRad Chromo4 fluorescent thermocycler", con el siguiente perfil térmico.

100

Resultados

\bulletSonda molecular Beacon (MB) de referencia SH1BM14 (Ta = 55ºC):

36

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(Continuación)

37

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(Continuación)

38

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\cdotSondas moleculares Beacon (MB) de referencia SH1BM 14/17/18 (Ta = 55ºC):

39

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(Continuación)

40

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(Continuación)

41

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Se utiliza el mismo perfil térmico para sonda de doble hebra, comparado con las sondas Moleculares Beacon, excepto en cuanto a lo referente a la temperatura de reasociación, la cual se ajustó a un valor de 50ºC.

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\bulletSonda de doble hebra en concordancia con la invención (Ta = 50ºC):

42

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(Continuación)

43

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(Continuación)

44

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Los resultados obtenidos, se resumen en las tablas que se facilitan a continuación:

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\bulletSonda Molecular Beacon (MB) SH1BM14 versus sonda de doble hebra

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\bulletSondas Moleculares Beacon (MB) de referencia SH1BM14/17/19 versus sonda de doble hebra

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Tal y como puede verse a raíz de las tablas anteriormente, arriba, la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, proporciona unos resultados similares que las sondas Moleculares Beacon de referencia, en cuanto a lo concerniente al umbral de detección (2 copias por PCR), valores Ct, linealidad (coeficientes de correlación) y reproducibilidad (SD).

Aparte de ello, debería tomarse debida nota en cuanto al hecho de que se obtiene una ganancia de fluorescencia de un 194,6%, de media, si se compara con las sondas Moleculares Beacon de referencia.

Adicionalmente, además, la comparación de la fluorescencia versus número de curvas de ciclos para las sondas de doble hebra (Figura 4A) y las sondas Moleculares Beacon SH14/17/18 (Figura 4B), muestra claramente el hecho de que, las curvas obtenidas con la sonda de doble hebra, tienen una sigmoidalidad más pronunciada y que, las curvas, se encuentran más reagrupadas, lo cual facilita una mejor discriminación entre los controles negativos (agua) y los ensayos, con una reducida cantidad de ácido nucleico diana.

Adicionalmente, además, se necesita una cantidad de sondas y de cebadores, 4 veces menor, cuando se utiliza la sonda de doble hebra de la presente invención, que cuanto se utilizan las sondas Moleculares Beacon SH1BM14/17/18.

Al variar la temperatura de reasociación de la RT-PCR a tiempo real, entre unas temperaturas de 48 y 55ºC, los inventores, mostraron el hecho de que, las sondas de doble hebra de la invención, permanecen completamente funcionales.

Panel B.PRD201 (HIV1-M, subtipos A, B, C, D, E, F, G y H)

\bulletSonda molecular Beacon (MB) de referencia SH1BM14 (Ta = 55ºC):

47

\newpage

(Continuación)

48

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\bulletSonda molecular Beacon (MB) de referencia SH1BM14/17/18 (Ta = 55ºC):

49

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(Continuación)

50

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\bulletSonda de doble hebra en concordancia con la invención (Ta = 50ºC):

51

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(Continuación)

52

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Debería tomarse debida nota en cuanto al hecho de que, la sonda de doble hebra en concordancia con la presente invención, facilita la detección de todos los genotipos A a H, de una forma particular, los subtipos C, D y E, de doble hebra, los cuales, o bien no se detectan con la sonda Molecular Beacon SH1BM14 (subtipo C), o bien se detectan con una alto valor de Ct (subtipo E), o incluso se detectan con una intensidad de fluorescencia muy baja, ligeramente por encima de la de fondo (subtipo D).

Se observa una ganancia de un 74,4%, para la mayoría de los genotipos, mediante la utilización de la sonda de doble hebra, con respecto a las tres sondas Moleculares Beacon.

Adicionalmente, además, se necesitan 4 veces menos de sondas y cebadores, con la sonda de doble hebra en concordancia con la invención, mediante comparación con las tres sondas moleculares Beacon.

\newpage

Ejemplo 8 Detección múltiplex de los genomas H1V -M y HIV1-O

Se utilizaron las siguientes sondas adicionales:

53

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

Sonda de doble hebra HIV1-M 0,1 \muM, sonda de doble hebra HIB1-O 0,1 \muM, cebador HIV1-M/O SEQ ID NO: 25 0,15 \muM, cebador HIV1-M SEQ ID NO: 26 0,075 \muM, cebador HIV1-M/O SEQ ID NO: 30 0,15 \muM, 4U polimerasa Taq del tipo "HotStarTaq Polymerase" (QIAGEN ref. 203207), 100 \muM MgCl_{2}, d(ACGU)TP 200 \muM, Quantitec RT mix 1 x (QIAGEN), 2,5% DMSO.

Los resultados obtenidos con las sondas, para la detección de las sondas HIV1-M mezcladas a las sondas HIV1-O, descritas anteriormente, arriba, utilizando las muestras que se originan a partir del sobrenadante de un cultivo de células de linfoblastoides CEM, se presentan en la tabla que se facilita abajo, a continuación (Ta = 55ºC):

55

Buen umbral de detección, Cts, linealidad y reproductividad, pudieron así, de este modo, evidenciarse.

La fluorescencia, se encuentra bien dentro de los patrones standard de trabajo.

La fluorescencia normalizada, versus número de curvas de ciclos, son semejantes a sigmoides y se encuentran reagrupadas dentro de la totalidad de los márgenes de concentraciones iniciales de DNA, permitiendo así, de este modo, una buena discriminación entre los controles negativos de agua y muestras con reducidas copias de DNA, tal y como se evidencia para la detección simplex de HIV1-M.

Como tales, los inventores, mostraron el hecho de que, reducidas cantidades (0,1 \muM) de sonda de doble hebra en concordancia con la invención, fueron también efectivas en ensayos dúplex.

Adicionalmente, además, los resultados obtenidos con las sondas, para la detección de HIV1-O, mezcladas con aquéllas que se describen en el Ejemplo 7, en el panel PRD201 (HIV-1MI) y en el panel BBI 301 (HIV-O), se presentan en las dos tablas que se facilitan abajo, a continuación: (Ta = 50ºC).

56

\newpage

(Continuación)

57

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\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

Las sondas de doble hebra en concordancia con la presente invención, pueden detectar de genotipos HIV-1-M (de A a H, de una forma particular, los subtipos C, D y E, los cuales no se detectan mediante la sonda Molecular Beacon SH1BM14 sola) y todos los genotipos del panel de HIV1-O, en un ensayo dúplex.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Bio-Rad Pasteur

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> SONDA DE DOBLE HEBRA PARA LA DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BET06P0859

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección de ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcgccgagg gagttcttct tctaggggac gcgca

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttggagtt cttcttctag gggacc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctccctcaa gaagaagatc cctttt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaccaaatg cccctatctt atc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagattgaga tcttctgcga cg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttttggga gttcttcttc tagggg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccgctccct caagaagaag tttttt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggcaggagt ccgcgtaaag agaggtgtgc cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttttctct ttacgcggac tccccg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtggagaga aatgcgcctg tttttt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgaatccc gcggacga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcagaggt gaagcgaagt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección de un control interno I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctgcgtcc tccgccgcca ccgcttgggc agca

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección de un control interno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttttaagc ggtggcggcg gaggac

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección de un control interno I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagcggttcg ccaccgccgc tttttt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagccgcaga tccgagcta

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagtggaac atagccgtgg tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgccatcgct gtgctacaac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacgacggga aggagggtgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgcatagt ggccagctgt gataaatgtc gcgcg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgcatagt agcttgctgt gataaatgtc gcgcg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgcatagt agccaactgt gataaatgtc gcgcg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttccagct gtgataaatg tcag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcggtcga cactatttac tttt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattggagag caatggctag tga

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgtacaat ctaattgcca ta

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgcaagtc tacctgacca tgaattgctt ccccttttat gcgcg

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttctgacc atgaattgct tcccct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para la detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatggactgg tacttaacga agtttt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgtacaat ctatttgcca ta

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacctctctt tacgcggact ccccgtctgt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagtccgcg taaagagagg tgcgccccgt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgagggagtt cttcttctag gggacctgcc tcg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del genoma del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcccctaga agaagaactc cctcgcctcg cag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del gen ADH del maíz

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagcggtg gcggcggagg acggcactgc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del gen ADH del maíz

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctccgcc gccaccgctt ggcgattgtc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del genoma del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagtggcca gctgtgataa atgtcagcta aaa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del genoma del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacatttatc acagctggct actatttctt ttt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del genoma del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtctacctg accatgaatt gcttcccctt ttatatggca t

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento del genoma del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaaagggga agcaattcat ggtcaggtag actacagtcc a

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttt

\hfill

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagttcttc ttctaggg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacc

\hfill

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctagaaga agaactcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcg

\hfill

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HBV detection probe fragment

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Tttttt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggagttctt cttc

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagggg

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagaagaac tccc

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgcct

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctctttacgc ggac

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccccg

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccgcgtaa agag

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HBV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtgc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagctgtga taaatg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcag

\hfill

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catttatcac agctgg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctac

\hfill

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaccatga attgcttc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccct

\hfill

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagcaattc atggtcag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección del HIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtag

\hfill

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección de control interno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcggtggc ggcg

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección de control interno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggac

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección de control interno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgccgccacc gctt

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de sonda de detección de control interno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgat

\hfill

6

Claims

1. Una sonda de doble hebra, pretendida para la detección de un ácido nucleico diana, de hebra individual, o de hebra doble, mediante fluorescencia, el cual comprende:

\vskip1.000000\baselineskip

en donde,

- S_{1} y S_{2}, representan secuencias de oligonucleótidos, que tienen de 10 a 35 nucleótidos, las cuales son complementarias la una con respecto a la otra, siendo S_{1}, por lo menos un 85% complementaria a T_{1}, y siendo, S_{2}, por lo menos un 85% complementaria a T_{2};

\vskip1.000000\baselineskip

2. Una sonda de doble hebra, según la reivindicación 1, en donde, b = d = 0, y X_{1} y X_{2}, representan donantes de fluorescencia, encontrándose constituida, la citada sonda de doble hebra, por:

- una primera sonda de ácido nucleico de la fórmula X_{1-}L_{1}-S_{1}-S'_{1}-Y_{1}, y

\vskip1.000000\baselineskip

3. Una sonda de doble hebra, según la reivindicación 1 ó 2, en donde, el donante fluorescente, se selecciona de entre el grupo consistente en colorantes de xantano, colorantes de rodamina, colorantes de carbopironina y colorantes de carboxamida.

4. Una sonda de doble hebra, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde, el aceptor fluorescente, se selecciona de entre el grupo consistente en Dabcilo, Dabsilo, BHQ1, HHQ2, BHQ3, Iowa Black, Eclipse, QSY-7/9, QSY-21, DABMI, verde de malaquita, cumarina, e inhibidores oscuros.

5. Una sonda de doble hebra, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde, L_{1} y L_{2}, respectivamente, inhiben menos de un 25% de la fluorescencia de X_{1} y X_{2}, cuando X_{1} y X_{2}, representan porciones fluorescentes, y L'_{1} y L'_{2}, respectivamente, inhiben menos de un 25% de la fluorescencia de Y_{1}, cuando Y_{1} e Y_{2}, representan porciones fluorescentes.

6. Una sonda de doble hebra, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde, L_{1}, L_{2}, L'_{1} y L'_{2}, iguales o diferentes, comprenden por lo menos una carga positiva.

7. Una sonda de doble hebra, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde, L_{1}, L_{2}, L'_{1} y L'_{2}, iguales o diferentes, se seleccionan de entre el grupo consistente en un polinucleótido que tenga de 2 a 10 nucleótidos, un grupo alquilo ó aminoalquilo que tenga de 3 a 12 átomos de carbono, y un grupo polietilenglicol que tenga un grado de polimerización de 2 a 6.

8. Una sonda de doble hebra, según la reivindicación 7, en donde, L_{1}, L_{2}, L'_{1} y L'_{2}, iguales o diferentes, representan un polinucleótido poli-T.

9. Una sonda de doble hebra, según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde, cuando L_{1} y/o L_{2}, representan un polinucleótido, entonces, la longitud de L'_{1} y/o L'_{2}, es más corta que la de S'_{2} y/o S'_{1}, respectivamente.

10. Una sonda de doble hebra, según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde, cuando L_{1} y/o L_{2}, representan un polinucleótido, entonces, L'_{1} y/o L'_{2}, representan una complementariedad de menos del 35%, con S'_{2} y/o S'_{1}, respectivamente.

11. Una sonda de doble hebra, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde, la temperatura de fusión de la primera hebra de la sonda, con respecto a la segunda hebra de la sonda, es por lo menos un 10% inferior, que la temperatura de fusión de cualquiera de las dos sondas con respecto a sus respectivas hebras de ácido nucleico diana.

12. Una sonda de doble hebra, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde, la citada sonda de doble hebra, se encuentra constituida por:

- un primera hebra de ácido nucleico de la fórmula X_{1-}L_{1}-S_{1}-S'_{1}-Y_{1}, y

- un segunda hebra de ácido nucleico de la fórmula X_{2}-L_{2}-S_{2}-S'_{2}-Y_{2};

\vskip1.000000\baselineskip

y en donde,

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo;

- S'_{1} y S'_{2}, representan una secuencia de oligo-nucléotido que tiene de 4 a 6 nucleótidos.

\vskip1.000000\baselineskip

13. Una sonda de doble hebra, según la reivindicación 12, en donde, S_{1}-S'_{1}, representan un fragmento de una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por:

\bullet 5'-CACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGT-3' (SEQ ID NO: 31);

S_{2}-S'_{2} representando entonces un fragmento de

5'-GGAGTCCGCGTAAAGAGAGGTGCGCCCCGT-3' (SEQ ID NO: 32);

\vskip1.000000\baselineskip

\bullet 5'-CGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCG-3'(SEQ ID NO: 33);

S_{2}-S'_{2} representando entonces un fragmento de

5'-GTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAG-3' (SEQ ID NO: 34);

\vskip1.000000\baselineskip

\bullet 5'-CCAAGCGGTGGCGGCGGAGGACGGCACTGC-3' (SEQ lD NO: 35);

S_{2}-S'_{2} representando, entonces, un fragmento de 5'-GTCCTCCGCCGCCACCGCTTGGCGATTGTC-3' (SEQ ID NO: 36);

\newpage

\bullet 5'-ATAGTGGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAA-3' (SEQ ID NO: 37);

S_{2}-S'_{2} representando, entonces, un fragmento de

5'-GACATTTATCACAGCTGGCTACTATTTCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 38);

\vskip1.000000\baselineskip

\bullet 5'-AGTCTACCTGACCATGAATTGCTTCCCCTTTTATATGGCAT-3' (SEQ ID NO: 39);

S_{2}-S'_{2} representando, entonces, un fragmento de

5'-TAAAAGGGGAAGCAATTCATGGTCAGGTAGACTACAGTCCA-3' (SEQ ID NO: 40).

\vskip1.000000\baselineskip

14. Una sonda de doble hebra, según las reivindicaciones 12 ó 13, pretendida para la detección del HBV, en donde, la citada sonda de doble hebra, se encuentra constituida por:

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2}, representan 5'-TTTT-3' (SEQ ID NO: 41);

- S_{1} representa 5'-GGAGTTCTTCTTCTAGGG-3' (SEQ ID NO: 42);

- S'_{2} representa 5'-GACC-3'(SEQ ID NO: 43);

- S_{2} representa 5'-CCCTAGAAGAAGAACTCC-3' (SEQ ID NO: 44);

- S'_{2} representa 5'-CTCG-3' (SEQ ID NO: 45);

\vskip1.000000\baselineskip

o en donde:

- Y_{1} e Y_{2} representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTTTT-3' (SEQ ID NO: 46);

- S_{1} representa 5'-GGGAGTTCTTCTTC-3' (SEQ ID NO: 47);

- S'_{1} representa 5'-TAGGGG-3' (SEQ ID NO: 48);

- S_{2} representa 5'-GAAGAAGAACTCCC-3' (SEQ ID NO: 49);

- S'_{2} representa 5'-TCGCCT-3' (SEQ ID NO: 50);

\vskip1.000000\baselineskip

o en donde,

- Y_{1} e Y_{2} representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTTTT-3' (SEQ ID NO: 46);

- S_{1} representa 5'-CTCTTTACGCGGAC-3' (SEQ ID NO: 51);

- S'_{1} representa 5'-TCCCCG-3' (SEQ ID NO: 52);

- S_{2} representa 5'-GTCCGCGTAAAGAG-3' (SEQ ID NO: 53);

- S'_{2} representa 5'-AGGTGC-3' (SEQ ID NO: 54).

\vskip1.000000\baselineskip

15. Una sonda de doble hebra, según la reivindicación 12 ó 13, pretendida para la detección del HIV, en donde, la citada sonda de doble hebra, se encuentra constituida por:

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTT-3' (SEQ ID NO: 41);

- S_{1} representa 5'-CCAGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO: 55);

- S'_{1} representa 5'-TCAG-3' (SEQ ID NO: 56);

- S_{2} representa 5'-CATTTATCACAGCTGG-3' (SEQ ID NO: 57);

- S'_{2} representa 5'-CTAC-3' (SEQ ID NO: 58);

\vskip1.000000\baselineskip

o en donde,

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTT-3' (SEQ ID NO: 41);

- S_{1} representa 5'-CTGACCATGAATTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 59);

- S'_{1} representa 5'-CCCT-3' (SEQ ID NO: 60);

- S_{2} representa 5'-GAAGCAATTCATGGTCAG-3' (SEQ ID NO: 61);

- S'_{2} representa 5'-GTAG-3' (SEQ ID NO: 62).

\vskip1.000000\baselineskip

16. Una sonda de doble hebra, según la reivindicación 12 ó 13, pretendida para la detección del HIV, en donde, la citada sonda de doble hebra, se encuentra constituida por:

- Y_{1} e Y_{2}, representan Dabcilo;

- L_{1} y L_{2} representan 5'-TTTTTT-3' (SEQ ID NO: 46);

- S_{1} representa 5'-AAGCGGTGGCGGCG-3' (SEQ ID NO: 63);

- S'_{1} representa 5'-GAGGAC-3' (SEQ ID NO: 64);

- S_{2} representa 5'-CGCCGCCACCGCTT-3 (SEQ ID NO: 65)';

- S'_{2} representa 5'-GGCGAT-3' (SEQ ID NO: 66).

\vskip1.000000\baselineskip

17. Un equipo, a modo de "kit", para la detección fluorescente de un ácido nucleico de hebra individual o de doble hebra, el cual comprende:

- una primera hebra de ácido nucleico de la fórmula X_{1}-(L_{1})_{a}-S_{1}-S'_{1}-(L'_{1})_{b}-Y_{1}, tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, y

\newpage

- una segunda hebra de ácido nucleico de la fórmula X_{2}-(L_{2})_{c}-S_{2}-S'_{2}-(L'_{2})_{d}Y_{2}, tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

\vskip1.000000\baselineskip

18. El uso de una sonda de doble hebra, según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, de un kit según se define en la reivindicación 17, para la detección fluorescente de por lo menos un ácido nucleico de hebra individual o de doble hebra.

19. El uso según la reivindicación 18, en donde, el ácido nucleico diana, se encuentra presente en una muestra biológica.

20. El uso, según la reivindicación 18 ó 19, en donde, la detección de por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, se lleva a cabo en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico basado en enzimas.

21. El uso, según la reivindicación 20, en donde, el procedimiento de amplificación de ácido nucleico basado en enzimas, se selecciona de entre el grupo consistente en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la PCR de Transcripción Inversa (RT-PCR), las PCR ó RT-PCR múltiplex, y las PCR ó RT-PCR a tiempo real.

22. El uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21, para cuantificar por fluorescencia el por lo menos un ácido nucleico de hebra individual o de doble hebra.

23. Un equipo, a modo de "kit", para la detección por fluorescencia de por lo menos un ácido nucleido diana de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de ácido nucleico a base de enzimas, el cual comprende:

- por lo menos un sonda de doble hebra según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16;

- una enzima para la amplificación de ácido nucleico, a base de enzimas;

- mezcla de reactivos, adaptada para la amplificación de ácidos nucleicos a base enzimas.

\vskip1.000000\baselineskip

24. Un equipo a modo de "kit", según la reivindicación 23, el cual comprende adicionalmente cebadores de nucleótidos, adaptados para la amplificación a base de enzimas, del ácido nucleico diana.

25. Un equipo, a modo de "kit", según la reivindicación 23 ó 24, para la detección de variaos ácidos nucleicos diana de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de amplificación múltiplex de ácidos nucleicos, a base de enzimas, comprendiendo, el citado equipo a modo de "kit", varias sondas de doble hebra, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde, cada uno de los citados ácidos nucleicos diana, es susceptible de detectarse mediante por lo menos una de las citadas sondas de doble hebra.

26. Un procedimiento para la detección de por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, a base de enzimas, que comprende las siguientes etapas:

- por lo menos una sonda de doble hebra tal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, pretendida para la detección del citado ácido nucleico diana, o por lo menos un par de las dos hebras de ácido nucleico diana tal y como se define en la reivindicación 17,

- una enzima, para la amplificación de ácido nucleico a base de enzimas,

- una mezcla reactiva, adaptada para la amplificación de ácido nucleico a base de enzimas, para obtener la mezcla de reacción;

d) dejar que la enzima catalice la síntesis de ácido nucleico;

e) repetir las etapas b) a d);

\vskip1.000000\baselineskip

27. El procedimiento según la reivindicación 26, en donde, el por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, se detecta a tiempo real.

28. El procedimiento según la reivindicación 26 ó 27, en donde, el por lo menos un ácido nucleico diana de hebra individual o de doble hebra, se cuantifica.