JP5330250B2 - 核酸の蛍光検出のための二本鎖プローブ - Google Patents
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Description
− 式T’1−T1の配列を含む標的核酸の第一の鎖の検出を目的とする、式X1−(L1)a−S1−S’1−(L’1)b−Y1の第一の鎖;
− 標的核酸の第二の鎖が存在するならば、式T’2−T2の配列を含む標的核酸の第二の鎖の検出を目的とする、式X2−(L2)c−S2−S’2−(L’2)d−Y2の第二の鎖;
を含む、一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出を目的とする二本鎖プローブに関し、ここで、
− X1、X2、Y1およびY2のうち二つは蛍光供与体であり、一方で、他の二つは蛍光受容体であり、また、X1およびY2が共に蛍光供与体であることはできず;
− a、b、cおよびdは0または1であり、ただし、X1、X2、Y1またはY2が蛍光供与体である場合、それぞれ、a、b、cまたはdは1であり;
− T1およびT2は、10ないし35ヌクレオチド、より好ましくは、12ないし20ヌクレオチドを有する、互いに相補的なオリゴヌクレオチド配列であり;
− 互いに独立して、T’1およびT’2は、2ないし8ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり;
− S1およびS2は、10ないし35ヌクレオチド、より好ましくは、12ないし20ヌクレオチドを有する、互いに相補的なオリゴヌクレオチド配列であり、S1はT1に対して少なくとも85%相補的であり、S2はT2に対して少なくとも85%相補的であり;
− 互いに独立して、S’1およびS’2は、2ないし8ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、S’1はT’1に対して少なくとも65%相補的であり、S’2はT’2に対して少なくとも65%相補的であり;
− L1およびL2は、L1に対するS1の連結部位およびL2に対するS2の連結部位に対するX1およびX2の各回転半径が少なくとも3.4Åとなるようなスペーサー部分であり;
− L’1およびL’2は、L’1に対するS’1の連結部位およびL’2に対するS’2の連結部位に対するY1およびY2の各回転半径が少なくとも3.4Åとなるようなスペーサー部分であり;
− 二本鎖プローブの融解温度は、二本鎖プローブの第一の鎖と標的核酸の第一の鎖の間で形成される複合体の融解温度よりも低く;標的核酸の第二の鎖が存在する場合には、二本鎖プローブの第二の鎖と該標的核酸の第二の鎖の間で成される複合体の融解温度よりも低い。
−式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖、および
−式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成される。
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は3ないし6ヌクレオチドを有するポリTポリヌクレオチドであり;
− S1およびS2は14ないし18ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり;
− S’1およびS’2は4ないし6ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列である。
・5’−CACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGT−3’(配列番号:31);
この場合、S2−S’2は5’−GGAGTCCGCGTAAAGAGAGGTGCGCCCCGT−3’(配列番号:32)のフラグメントである(かかる二本鎖プローブはHBV Aゾーンの検出を特に目的とする);
・5’−CGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCG−3’(配列番号:33);
この場合、S2−S’2は5’−GTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAG−3’(配列番号:34)のフラグメントである(かかる二本鎖プローブはHBV Bゾーンの検出を特に目的とする);
・5’−CCAAGCGGTGGCGGCGGAGGACGGCACTGC−3’(配列番号:35);
この場合、S2−S’2は5’−GTCCTCCGCCGCCACCGCTTGGCGATTGTC−3’(配列番号:36)のフラグメントである(かかる二本鎖プローブは内部対照の検出を特に目的とする);
・5’−ATAGTGGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAA−3’(配列番号:37);
この場合、S2−S’2は5’−GACATTTATCACAGCTGGCTACTATTTCTTTTT−3’(配列番号:38)のフラグメントである(かかる二本鎖プローブはHIV−1Mの検出を特に目的とする);
・5’−AGTCTACCTGACCATGAATTGCTTCCCCTTTTATATGGCAT−3’(配列番号:39);
この場合、S2−S’2は5’−TAAAAGGGGAAGCAATTCATGGTCAGGTAGACTACAGTCCA−3’(配列番号:40)のフラグメントである(かかる二本鎖プローブはHIV−1Oの検出を特に目的とする);
・5’−CTGAATATTGTCAGAATAGTGAGCGTGCCTTACCGACGATA−3’(配列番号:84);
この場合、S2−S’2は5’−TATCGTCGGTAAGGCACGCTCACTATTCTGACAATATTCAG−3’(配列番号:85)のフラグメントである(かかる二本鎖プローブはサルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)の検出を特に目的とする);
からなる群より選択される配列のフラグメントである。
− 5’から3’への方向に式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖
および
− 5’から3’への方向に式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成され、ここで、
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は5’−TTTT−3’(配列番号:41)であり;
− S1は5’−GGAGTTCTTCTTCTAGGG−3’(配列番号:42)であり;
− S’1は5’−GACC−3’(配列番号:43)であり;
− S2は5’−CCCTAGAAGAAGAACTCC−3’(配列番号:44)であり;
− S’2は5’−CTCG−3’(配列番号:45)であり;
かかる二本鎖プローブはHBV Bゾーンの検出を特に目的としており;
または:
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は5’−TTTTTT−3’(配列番号:46)であり;
− S1は5’−GGGAGTTCTTCTTC−3’(配列番号:47)であり;
− S’1は5’−TAGGGG−3’(配列番号:48)であり;
− S2は5’−GAAGAAGAACTCCC−3’(配列番号:49)であり;
− S’2は5’−TCGCCT−3’(配列番号:50)であり;
かかる二本鎖プローブはHBV Bゾーンの検出を特に目的としており;
または:
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は5’−TTTTTT−3’(配列番号:46)であり;
− S1は5’−CTCTTTACGCGGAC−3’(配列番号:51)であり;
− S’1は5’−TCCCCG−3’(配列番号:52)であり;
− S2は5’−GTCCGCGTAAAGAG−3’(配列番号:53)であり;
− S’2は5’−AGGTGC−3’(配列番号:54)であり;
かかる二本鎖プローブはHBV Aゾーンの検出を特に目的としており;
または:
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は5’−TTTT−3’(配列番号:41)であり;
− S1は5’−CTCTCTTTACGCGGACTC−3’(配列番号:76)であり;
− S’1は5’−CCCG−3’(配列番号:77)であり;
− S2は5’−GAGTCCGCGTAAAGAGAG−3’(配列番号:78)であり;
− S’2は5’−GTGC−3’(配列番号:79)であり;
かかる二本鎖プローブはHBV Aゾーンの検出を特に目的としている。
− 5’から3’への方向に式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖
および
− 5’から3’への方向に式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成され、ここで、
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は5’−TTTT−3’(配列番号:41)であり;
− S1は5’−CCAGCTGTGATAAATG−3’(配列番号:55)であり;
− S’1は5’−TCAG−3’(配列番号:56)であり;
− S2は5’−CATTTATCACAGCTGG−3’(配列番号:57)であり;
− S’2は5’−CTAC−3’(配列番号:58)であり;
かかる二本鎖プローブはHIV−1Mの検出を特に目的としており;
または:
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は5’−TTTT−3’(配列番号:41)であり;
− S1は5’−CTGACCATGAATTGCTTC−3’(配列番号:59)であり;
− S’1は5’−CCCT−3’(配列番号:60)であり;
− S2は5’−GAAGCAATTCATGGTCAG−3’(配列番号:61)であり;
− S’2は5’−GTAG−3’(配列番号:62)であり;
かかる二本鎖プローブはHIV−1Oの検出を特に目的としている。
− 5’から3’への方向に式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖
および
− 5’から3’への方向に式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成され、ここで、
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は5’−TTTTTT−3’(配列番号:46)であり;
− S1は5’−AAGCGGTGGCGGCG−3’(配列番号:63)であり;
− S’1は5’−GAGGAC−3’(配列番号:64)であり;
− S2は5’−CGCCGCCACCGCTT−3’(配列番号:65)’であり;
− S’2は5’−GGCGAT−3’(配列番号:66)であるか;
または:
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は5’−TTTT−3’(配列番号:41)であり;
− S1は5’−AAGCGGTGGCGGCGGA−3’(配列番号:80)であり;
− S’1は5’−GGAC−3’(配列番号:81)であり;
− S2は5’−TCCGCCGCCACCGCTT−3’(配列番号:82)であり;
− S’2は5’−GGCG−3’(配列番号:83)である。
− 5’から3’への方向に式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖
および
− 5’から3’への方向に式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成され、ここで、
− X1およびX2はFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2はDabcylであり;
− L1およびL2は5’−TTT−3’(配列番号:86)であり;
− S1は5’−GAATAGTGAGCGTGCCT−3’(配列番号:87)であり;
− S’1は5’−TACCG−3’(配列番号:88)であり;
− S2は5’−AGGCACGCTCACTATTC−3’(配列番号:89)であり;
− S’2は5’−TGACA−3’(配列番号:90)である。
− 少なくとも一つの上記定義の二本鎖プローブ;
− 酵素ベース核酸増幅のための酵素;
− 酵素ベース核酸増幅に適した試薬混合物;
を含むキットにも関する。
a)少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を、
該標的核酸の検出を目的とする少なくとも一つの上記定義の二本鎖プローブ、または上記キットにて定義した二つの核酸鎖の少なくとも一対、
酵素ベース核酸増幅のための酵素、
標的核酸の酵素ベース増幅に適したヌクレオチドプライマー、
酵素ベース核酸増幅に適した試薬混合物
と混合して、反応混合物を得る工程;
b)該反応混合物を加熱することにより、反応混合物中に存在する核酸を融解する工程;
c)反応混合物を冷却することにより、二本鎖プローブおよびヌクレオチドプライマーを標的核酸にハイブリダイズさせる工程;
d)酵素に核酸合成を触媒させる工程;
e)工程b)ないしd)を繰り返す工程;
を含む方法にも関し、ここで、
反応混合物からの蛍光発光の強度は、工程b)ないしd)の少なくとも一つにて測定され、また、少なくとも蛍光発光の強度がバックグラウンドレベルを上回って測定されるまで、工程b)ないしd)は繰り返される。
オリゴヌクレオチド合成
用いたオリゴヌクレオチドはEurogentecから購入したものか、または製造元推奨の条件ならびにApplied BiosystemsおよびGlen Researchから購入した試薬を用いて、Expedite 8909 DNA/RNA合成機(Perkin Elmer)にて合成した。
温度の関数として蛍光をモニターすることにより、融解温度を測定した。
HBV C遺伝子(Bゾーン)の3’末端部分およびHBV DNAポリメラーゼコード化領域の開始部分を標的化することによるHBVゲノムの検出
初めに、HBVゲノムのBゾーン(参照株 adw n° M98077のヌクレオチド(nt)2300−2435)の検出のために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイにて本発明による二本鎖プローブを試験し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
QIAamp(登録商標) DSPウイルスキット(Qiagen,品番60704)を製造元の指示に従って用いて、BBI Diagnosticから入手したHBV DNA陽性対照Accurun325(品番A325−5723)から、HBVゲノムDNAを抽出した。使用前にHBVゲノムDNAを水で希釈した。
本発明による二本鎖プローブおよび参照モレキュラー・ビーコン・プローブを比較するために、幾つかのパラメーターを研究した:
− 混合物中の様々な開始量のDNAについて閾値サイクル(Ct)を評価した;Ctは、バックグラウンドの蛍光より高い蛍光シグナルを生じるのに必要なサイクル数である;Ct値はDNAの開始量のlog10に比例する;
− 検出限界は検出されるDNAの最低量に対応する;
− PCR混合物中の初期DNA量に対するCtの曲線の直線性(少なくとも0.95の相関係数を対象とする);
− 蛍光強度レベル、およびバックグラウンドの蛍光とプローブによる蛍光発光との差異(差異が重きいほど、少数のDNAコピーの区別がより簡単かつ有意となる)。
HBVゲノムのBゾーンの検出
本発明による別の二本鎖プローブを設計して、アニーリング温度を50℃に設定したこと以外は実施例2に示したものと同じ条件で用い、モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
HBVゲノムのオーバーラップ領域(Aゾーン)を標的化することによるHBVゲノムの検出
次に、二本鎖プローブ濃度を0.2μMに設定したこと以外は実施例2に示したものと同じ条件を用いて、HBVゲノムのAゾーン(HBV DNAポリメラーゼコード化の末端およびHBV X蛋白質コード化配列の開始部分 − 参照株 adw n° M98077のヌクレオチド(nt)1440−1602)の検出のために、本発明による二本鎖プローブをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイにて試験し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
内部対照(IC)の検出
また、本発明による二本鎖プローブを内部対照(IC)の検出のためにリアルタイムPCRアッセイにて試験し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
ADH5Fc:5’−TGC CAT CGC TGT GCT ACA AC−3’(配列番号18)
ADH5Rc:5’−AAC GAC GGG AAG GAG GGT GC−3’(配列番号19)
を用いてADHトウモロコシ遺伝子(トウモロコシGMOスタンダード ERM−BF411a,品番91528 Fluka)からPCRにより生成された408ヌクレオチドのフラグメントである。
HBVゲノムのAゾーンおよび内部対照の検出を組み合わせたマルチプレックスアッセイ(PCRの間の抽出量および阻害量の測定が可能となる)は実施例4および実施例5のプローブおよびプライマーを用いて設定された。
−IC DNA 1PCRあたり300コピー;ICプライマー 0.3μM;
−HBV DNA 1PCRあたり0〜50,000コピー;HBVプライマー 0.6μM;
−モレキュラー・ビーコン ICプローブ 0.2μM または二本鎖ICプローブ 各鎖0.1μM;
−モレキュラー・ビーコン HBVプローブ 0.6μM または二本鎖HBVプローブ 各鎖0.2μM。
予想通り、この検出は両プローブ系について本質的に一定の結果をもたらした。FAMとAtto532色素との間の干渉に起因して、Ctの若干の低下のみが、高濃度のHBV DNA(50,000コピー/PCR)にて観察された。
単位複製配列の検証
上記PCR反応を用いて得られたPCR産物の性質をアガロースゲル電気泳動により検証した。結果を図3に示す。
HIV1−Mゲノムの検出
本発明による二本鎖プローブを、HIV−1Mの様々な遺伝子型(A、B、C、D、E、F、GおよびH)のリアルタイムPCR検出に適用し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
アッセイされる試料は、1mlあたり7.75 108個のHIV−1MサブタイプBのウイルス粒子のウイルス力価を有するリンパ芽球様CEM細胞の培養液の上清であるか、または1mlあたり50,000個のウイルス粒子にて8遺伝子型(A、B、C、D、E、F、GおよびH)のHIV1−Mを含むPRD201パネル(BBIダイアグノスティック)のいずれかであった。
HIV RNA 表に示される通り、SH1BM14 0.4μM、SH1BM17 0.2μM、SH1BM18 0.2μM、HIV1−Mプライマー 0.6μM、4U HotStarTaq(登録商標) Polymerase(Qiagen,品番203207)、100μM MgCl2、d(ACGU)TP 400μM、Quantitect(登録商標) RT Mix 0.5×(Qiagen)、2.5% DMSO。
HIV RNA 表に示される通り、二本鎖プローブ 0.1μM、HIV1−Mプライマー 0.15μM、4U HotStarTaq(登録商標) Polymerase(Qiagen,品番203207)、100μM MgCl2、d(ACGU)TP 400μM、Quantitect(登録商標) RT Mix 0.5×(Qiagen)、2.5% DMSO。
A.リンパ芽球様CEM細胞の培養液の上清由来の試料(HIV1−M Bサブタイプ)
二本鎖プローブHIV1−M 0.1μM、二本鎖プローブHIV1−O 0.1μM、HIV1−M/Oプライマー 配列番号25 0.15μM、HIV1−Mプライマー 配列番号26 0.075μM、HIV1−Oプライマー 配列番号30 0.15μM、4U HotStarTaq(登録商標) Polymerase(Qiagen,品番203207)、100μM MgCl2、d(ACGU)TP 400μM、Quantitect(登録商標) RT Mix 1×(Qiagen)、2.5% DMSO。
マルチプレックスアッセイHBV Aゾーン(FAM/Atto647N)−定量
IC検出のためにAtto532色素の代わりにAtto647N色素を用い、実施例4および5のプローブおよびプライマー(以後、「系1」と称する)、ならびに本発明による別の二本鎖プローブ(以後、「系2」と称する)を用いて、(i)HBVゲノムのAゾーンおよび内部対照(IC)の検出ならびに(ii)HBVの定量を組み合わせたマルチプレックスアッセイを設計した。
− IC DNA 1PCRあたり300コピー、
− HBV DNA 1PCRあたり100〜106コピー、
− HBVプライマー 0.6μM、
− ICプライマー 0.3μM;
− モレキュラー・ビーコン ICプローブ(0.2μM)、系1 二本鎖ICプローブ(各鎖0.1μM)、または系2 二本鎖ICプローブ(各鎖0.05μM);
− モレキュラー・ビーコン HBVプローブ(0.6μM)、系1 二本鎖HBVプローブ(各鎖0.2μM)、または系2 二本鎖HBVプローブ(各鎖0.05μM);
− HotStarTaq(登録商標) Polymerase(Qiagen,品番203205) 2.5U、MgCl2 6mM、d(ACGU)TP 200μM、dTTP 100μM、0.25U UDG、PVP 0.3%、グリセロール 5%。
シンプレックスアッセイHIV(FAM)−代替的配置5’FAM/3’FAMおよび5’Dabcyl/3’Dabcyl
HIV−1Mの様々な遺伝子型の検出のために、2つの代替的配置の本発明による二本鎖プローブを用い(同じ鎖上に2つのフルオロフォア、および他の同じ鎖上に2つのクエンチャー、および逆もまた同様:系Aおよび系B)、実施例7のプローブおよびプライマーを用いて、シンプレックスアッセイを設計した。
− HIV RNA 表に示される通り;
− プライマー 0.15μM;
− 二本鎖HIVプローブ各鎖0.1μM;
− HotStarTaq(登録商標) Polymerase(Qiagen,品番203207) 4U、MgCl2 0.1mM、d(ACGU)TP 100mM、2.5% DMSO;
− Quantitect(登録商標) RT Mix 1×(Qiagen)。
サルモネラ・ティフィの検出
本発明による二本鎖プローブを、サルモネラ・ティフィ(iagA遺伝子のヌクレオチド1501ないし1655に及ぶ155ヌクレオチドのフラグメント、NCBI CoreNucleotide 参照X80892)の検出のために設計されたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)シンプレックスアッセイにてさらに試験し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
古典的なプラスミド調製キットを製造元の指示に従って用いて、サルモネラ・ティフィ標的化配列を含むDNAプラスミド(iagA遺伝子由来の619塩基対(X80892由来の1114ないし1732の位置)のHindIII−BamHIフラグメントを含むpUC18プラスミド)を抽出した。使用前にDNAプラスミドを水で希釈した。
− プラスミドDNA:0〜20,000コピー/PCR;
− サルモネラプライマー 0.5μM;
− モレキュラー・ビーコンサルモネラプローブ 0.2μM または二本鎖サルモネラプローブ 各鎖0.1μM;
− ポリメラーゼ(Fast Start Taq DNAポリメラーゼ(Roche) 3U/反応、HotStarTaq(登録商標) Plus(Qiagen) 2.5U/反応、NovaTaqTM Hot Start(Novagen) 2U/反応、DynazymeTM II DNAポリメラーゼ(Finnzymes) 3U/反応、Taq DNAポリメラーゼ(Roche) 3U/反応);
− MgCl2 4mM;d(ACGT)TP 100μM。
Claims (29)
- − 式T’1−T1の配列を含む標的核酸の第一の鎖の検出を目的とする、式X1−(L1)a−S1−S’1−(L’1)b−Y1の第一の鎖;
− 標的核酸の第二の鎖が存在するならば、式T’2−T2の配列を含む標的核酸の第二の鎖の検出を目的とする、式X2−(L2)c−S2−S’2−(L’2)d−Y2の第二の鎖;
を含む、一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出を目的とする二本鎖プローブであって、ここで、
− X1、X2、Y1およびY2のうち二つは蛍光供与体であり、一方で、他の二つは蛍光受容体であり、また、X1およびY2が共に蛍光供与体であることはできず;
− a、b、cおよびdは0または1であり、ただし、X1、X2、Y1またはY2が蛍光供与体である場合、それぞれ、a、b、cまたはdは1であり;
− T1およびT2は、互いに相補的な10ないし35ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり;
− T’1およびT’2は互いに独立して、2ないし8ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり;
− S1およびS2は、互いに相補的な10ないし35ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、S1はT1に対して少なくとも85%相補的であり、S2はT2に対して少なくとも85%相補的であり;
− S’1およびS’2は互いに独立して、2ないし8ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、S’1はT’1に対して少なくとも65%相補的であり、S’2はT’2に対して少なくとも65%相補的であり;
− L1およびL2は、L1に対するS1 の連結部位およびL2に対するS2の連結部位に対するX1およびX2の各回転半径が少なくとも3.4Åとなるようなスペーサー部分であり;
− L’1およびL’2は、L’1に対するS’1の連結部位およびL’2に対するS’2の連結部位に対するY1およびY2の各回転半径が少なくとも3.4Åとなるようなスペーサー部分であり;
− 二本鎖プローブの融解温度は、二本鎖プローブの第一の鎖と標的核酸の第一の鎖との間で形成された複合体の融解温度より低く;標的核酸の第二の鎖が存在するならば、二本鎖プローブの第二の鎖と該標的核酸の第二の鎖との間で形成された複合体の融解温度より低いものである、
二本鎖プローブ。 - b=d=0であり、X1およびX2が蛍光供与体である請求項1記載の二本鎖プローブであって、故に、
−式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖、および
−式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成される二本鎖プローブ。 - 蛍光供与体がキサンテン色素、ローダミン色素、カルボピロニン色素およびカルボキサミド色素からなる群より選択される、請求項1または2記載の二本鎖プローブ。
- 蛍光受容体がDabcyl(4−(4−ジメチルアミノフェニル)ジアゼニル安息香酸)、Dabsyl(4−N,N−ジメチルアミノアゾベンゼン−4’スルホン酸)、ブラックホールクエンチャー1(登録商標)(BHQ(登録商標)−1)、ブラックホールクエンチャー2(登録商標)(BHQ(登録商標)−2)、ブラックホールクエンチャー3(登録商標)(BHQ(登録商標)−3)、Iowa Black(登録商標)、Eclipse(登録商標)、QSY(登録商標)7、QSY(登録商標)9、QSY(登録商標)21、DABMI(4−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−4’−マレイミド)、マラカイトグリーン(4−[(4−ジメチルアミノフェニル)フェニル−メチル]−N,N−ジメチルアニリン)、クマリン(2H−クロメン−2−オン)およびダーククエンチャーからなる群より選択される、請求項1ないし3いずれかに記載の二本鎖プローブ。
- X1およびX2が蛍光部分である場合、L1およびL2それぞれX1およびX2の蛍光の25%未満を消失させ、Y1およびY2が蛍光部分である場合、L’1およびL’2がそれぞれY1およびY2の蛍光の25%未満を消失させる、請求項1ないし4いずれかに記載の二本鎖プローブ。
- L1、L2、L’1および/またはL’2が少なくとも一つの正電荷を含む、請求項1ないし5いずれかに記載の二本鎖プローブ。
- L1、L2、L’1およびL’2が、同一または異なって、2ないし10ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド、3ないし12個の炭素原子を有するアルキルまたはアミノアルキル基、および2ないし6の重合度を有するポリエチレングリコール基からなる群より選択される、請求項1ないし5いずれかに記載の二本鎖プローブ。
- L1、L2、L’1およびL’2が、同一または異なって、ポリTポリヌクレオチドである、請求項7記載の二本鎖プローブ。
- L1および/またはL2がポリヌクレオチドである場合に、L1および/またはL2の長さがそれぞれS’2および/またはS’1の長さよりも短い、請求項7または8記載の二本鎖プローブ。
- L1および/またはL2がポリヌクレオチドである場合に、L1および/またはL2がそれぞれS’2および/またはS’1に対して35%未満の相補性を示す、請求項7ないし9いずれかに記載の二本鎖プローブ。
- プローブの第二の鎖に対するプローブの第一の鎖の融解温度が、各標的核酸鎖に対するプローブのいずれかの鎖の融解温度よりも少なくとも10%低い、請求項1ないし10いずれかに記載の二本鎖プローブ。
- − 式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖、および
− 式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成される請求項1ないし11いずれかに記載の二本鎖プローブであって、ここで、
− X1およびX2が、FAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が3ないし6ヌクレオチドを有するポリTポリヌクレオチドであり;
− S1およびS2が14ないし18ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり;
− S’1およびS’2が4ないし6ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列である、
二本鎖プローブ。 - S1−S’1が以下のものからなる群より選択される配列のフラグメントである、請求項12記載の二本鎖プローブ:
・5’−CACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGT−3’(配列番号31);
この場合、S2−S’2は5’−GGAGTCCGCGTAAAGAGAGGTGCGCCCCGT−3’(配列番号32)のフラグメントである;
・5’−CGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCG−3’(配列番号33);
この場合、S2−S’2は5’−GTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAG−3’(配列番号34)のフラグメントである;
・5’−CCAAGCGGTGGCGGCGGAGGACGGCACTGC−3’(配列番号35);
この場合、S2−S’2は5’−GTCCTCCGCCGCCACCGCTTGGCGATTGTC−3’(配列番号36)のフラグメントである;
・5’−ATAGTGGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAA−3’(配列番号37);
この場合、S2−S’2は5’−GACATTTATCACAGCTGGCTACTATTTCTTTTT−3’(配列番号38)のフラグメントである;
・5’−AGTCTACCTGACCATGAATTGCTTCCCCTTTTATATGGCAT−3’(配列番号39);
この場合、S2−S’2は5’−TAAAAGGGGAAGCAATTCATGGTCAGGTAGACTACAGTCCA−3’(配列番号40)のフラグメントである;
・5’−CTGAATATTGTCAGAATAGTGAGCGTGCCTTACCGACGATA−3’(配列番号84);
この場合、S2−S’2は5’−TATCGTCGGTAAGGCACGCTCACTATTCTGACAATATTCAG−3’(配列番号85)のフラグメントである。 - − 5’から3’への方向に式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖、および
− 5’から3’への方向に式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成される、HBV検出を目的とする請求項12または13記載の二本鎖プローブであって、ここで、
− X1およびX2がFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が5’−TTTT−3’(配列番号41)であり;
− S1が5’−GGAGTTCTTCTTCTAGGG−3’(配列番号42)であり;
− S’1が5’−GACC−3’(配列番号43)であり;
− S2が5’−CCCTAGAAGAAGAACTCC−3’(配列番号44)であり;
− S’2が5’−CTCG−3’(配列番号45)であるか;
または
− X1およびX2がFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が5’−TTTTTT−3’(配列番号46)であり;
− S1が5’−GGGAGTTCTTCTTC−3’(配列番号47)であり;
− S’1が5’−TAGGGG−3’(配列番号48)であり;
− S2が5’−GAAGAAGAACTCCC−3’(配列番号49)であり;
− S’2が5’−TCGCCT−3’(配列番号50)であるか;
または
− X1およびX2がFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が5’−TTTTTT−3’(配列番号46)であり;
− S1が5’−CTCTTTACGCGGAC−3’(配列番号51)であり;
− S’1が5’−TCCCCG−3’(配列番号52)であり;
− S2が5’−GTCCGCGTAAAGAG−3’(配列番号53)であり;
− S’2が5’−AGGTGC−3’(配列番号54)であるか;
または
− X1およびX2がFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が5’−TTTT−3’(配列番号41)であり;
− S1が5’−CTCTCTTTACGCGGACTC−3’(配列番号76)であり;
− S’1が5’−CCCG−3’(配列番号77)であり;
− S2が5’−GAGTCCGCGTAAAGAGAG−3’(配列番号78)であり;
− S’2が5’−GTGC−3’(配列番号79)である、
二本鎖プローブ。 - − 5’から3’への方向に式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖、および
− 5’から3’への方向に式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成される、HIV−1検出を目的とする請求項12または13記載の二本鎖プローブであって、ここで、
− X1およびX2がFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が5’−TTTT−3’(配列番号41)であり;
− S1が5’−CCAGCTGTGATAAATG−3’(配列番号55)であり;
− S’1が5’−TCAG−3’(配列番号56)であり;
− S2が5’−CATTTATCACAGCTGG−3’(配列番号57)であり;
− S’2が5’−CTAC−3’(配列番号58)であるか;
または
− X1およびX2がFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が5’−TTTT−3’(配列番号41)であり;
− S1が5’−CTGACCATGAATTGCTTC−3’(配列番号59)であり;
− S’1が5’−CCCT−3’(配列番号60)であり;
− S2が5’−GAAGCAATTCATGGTCAG−3’(配列番号61)であり;
− S’2が5’−GTAG−3’(配列番号62)である、
二本鎖プローブ。 - − 5’から3’への方向に式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖、および
− 5’から3’への方向に式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成される、内部対照の検出を目的とする請求項12または13記載の二本鎖プローブであって、ここで、
− X1およびX2がFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が5’−TTTTTT−3’(配列番号46)であり;
− S1が5’−AAGCGGTGGCGGCG−3’(配列番号63)であり;
− S’1が5’−GAGGAC−3’(配列番号64)であり;
− S2が5’−CGCCGCCACCGCTT−3’(配列番号65)であり;
− S’2が5’−GGCGAT−3’(配列番号66)であるか;
または
− X1およびX2がFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が5’−TTTT−3’(配列番号41)であり;
− S1が5’−AAGCGGTGGCGGCGGA−3’(配列番号80)であり;
− S’1が5’−GGAC−3’(配列番号81)であり;
− S2が5’−TCCGCCGCCACCGCTT−3’(配列番号82)であり;
− S’2が5’−GGCG−3’(配列番号83)である、
二本鎖プローブ。 - − 5’から3’への方向に式X1−L1−S1−S’1−Y1の第一の核酸鎖、および
− 5’から3’への方向に式X2−L2−S2−S’2−Y2の第二の核酸鎖
から構成される、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)の検出を目的とする請求項12または13記載の二本鎖プローブであって、ここで、
− X1およびX2がFAM、Atto532、NK141、NK230およびAtto647Nからなる群より選択され;
− Y1およびY2がDabcylであり;
− L1およびL2が5’−TTT−3’(配列番号86)であり;
− S1が5’−GAATAGTGAGCGTGCCT−3’(配列番号87)であり;
− S’1が5’−TACCG−3’(配列番号88)であり;
− S2が5’−AGGCACGCTCACTATTC−3’(配列番号89)であり;
− S’2が5’−TGACA−3’(配列番号90)である、
二本鎖プローブ。 - − 請求項1ないし17いずれかに記載の式X1−(L1)a−S1−S’1−(L’1)b−Y1の第一の核酸鎖、および
− 請求項1ないし17いずれかに記載の式X2−(L2)c−S2−S’2−(L’2)d−Y2の第二の核酸鎖
を含む、一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出を目的とするキット。 - 少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を蛍光検出するための、請求項1ないし17いずれかに記載の二本鎖プローブまたは請求項18記載のキットの使用。
- 標的核酸が生物試料中に存在する、請求項19記載の使用。
- 少なくとも一つの一本鎖または二本鎖核酸の検出が、酵素ベース核酸増幅法にて実施される、請求項19または20記載の使用。
- 酵素ベース核酸増幅法がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写PCR(RT−PCR)、マルチプレックスPCRまたはRT−PCR、およびリアルタイムPCRまたはRT−PCRからなる群より選択される、請求項21記載の使用。
- 少なくとも一つの一本鎖または二本鎖核酸を蛍光定量するための、請求項19ないし22いずれかに記載の使用。
- − 請求項1ないし17いずれかに記載の少なくとも一つの二本鎖プローブ;
− 酵素ベース核酸増幅のための酵素;
− 酵素ベース核酸増幅に適した試薬混合物;
を含む、酵素ベース核酸増幅法にて少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を蛍光検出するためのキット。 - 標的核酸の酵素ベース増幅に適したヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項24記載のキット。
- マルチプレックス酵素ベース核酸増幅法にていくつかの一本鎖または二本鎖標的核酸を検出するための請求項24または25記載のキットであって、該キットが請求項1ないし17いずれかに記載のいくつかの二本鎖プローブを含んでおり該標的核酸の各々が該二本鎖プローブの少なくとも一つにより検出される傾向がある、キット。
- 以下の工程:
a)少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸と、
− 該標的核酸の検出を目的とする請求項1ないし17いずれかに記載の少なくとも一つの二本鎖プローブ、または請求項18記載の二つの核酸鎖の少なくとも一対、
− 酵素ベース核酸増幅のための酵素、
− 標的核酸の酵素ベース増幅に適したヌクレオチドプライマー、
− 酵素ベース核酸増幅に適した試薬混合物、
とを混合して反応混合物を得る工程;
b)該反応混合物を加熱することにより、反応混合物中に存在する核酸を融解させる工程;
c)該反応混合物を冷却することにより、二本鎖プローブおよびヌクレオチドプライマーを標的核酸にハイブリダイズさせる工程;
d)酵素に核酸合成を触媒させる工程;
e)工程b)ないしd)を繰り返す工程;
を含む、酵素ベース核酸増幅法にて少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を検出するための方法であって、ここで、反応混合物からの蛍光発光の強度が工程b)ないしd)の少なくとも一つにて測定され、また、少なくとも蛍光発光の強度がバックグラウンドレベルを上回って測定されるまで工程b)ないしd)が繰り返される、方法。 - 少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸がリアルタイムで検出される、請求項27記載の方法。
- 少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸が定量される、請求項27または28記載の方法。
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