BR112012020470B1 - Ensaio multiplex, grupo de sonda e kit para detectar a presença ou ausência de múltiplos sorotipos de um organismo papilomavírus humano (hpv) em uma amostra biológica - Google Patents

Abstract

ENSAIO PARA DETCTAR SOROTIPOS ESTREITAMENTE RELACIONADOS DE PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV). Um ensaio de PCR em tempo real Taq-Man para detectar múltiplos sorotipos de papilomavírus humano (HPV), em que o número de sorotipos detectados excede o número de canais colorimétricos para detecção. Uma amostra biológica é combinada com três grupos de primer/sonda de oligonucleotídeos, tal que as sondas e primers se anelam a uma sequência alvo. Cada grupo de primeir/sonda é pelo menos preferencial para um sorotipo específico de um organismo. O primeiro e segundo grupos de primer/sonda são degenerados entre si. O terceiro grupo de primer/sonda não é degenerado com respeito ao primeiro e segundo grupos de primer/sonda e diferencia de um terceiro sorotipo. O terceiro grupo de primer/sonda tem uma porção de sinal que emite sinal em um comprimento de onda que é o mesmo ou diferente do comprimento de onda emitido pela porção de sinal do grupo de primer/sonda degenerado. As sequências alvo, se presentes, são amplificadas e detectadas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório U.S. No 61/304.941 depositado em 16 de Fevereiro de 2010, as divulgações do qual são por meio deste relatório incorporadas como referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada por intermédio de EFS-Web e é por meio deste relatório integralmente incorporada como referência. A dita cópia ASCII, criada em 31 de Janeiro de 2011, é nomeada Listagem de Sequências para detectar Sorotipos Relacionados de HPV e possui 7,55 kilobytes em tamanho.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Mais do que 80 tipos de papilomavírus humanos (HPVs) foram identificados. Os tipos diferentes de HPV causam uma ampla variedade de fenótipos biológicos, de verrugas proliferativas benignas a carcinomas malignos (para revisão, veja McMurray et al., Int. J. Exp, Pathol. 82(1): 15 - 33 (2001)). O HPV6 e HPV11 são os tipos mais comumente associados com verrugas benignas, ao passo que o HPV16 e HPV18 são os tipos de alto risco mais frequentemente associados com lesões malignas. A determinação do tipo específico de HPV em uma amostra clínica é, portanto, crítico para prognosticar o risco de desenvolvimento de doença associada ao HPV.

[004] Vários métodos com base em ácido nucleicos foram utilizados para identificar e quantificar tipos de HPV específicos em amostras clínicas, tais como detecção de ácido nucleico viral através de hibridização in situ, análise Southern blot, captura híbrida ou reação em cadeia da polimerase (PCR). O ensaio Hybrid Capture® II (Qiagen, Inc., Valencia, CA) utiliza captura de anticorpos e detecção de sinal não radioativo, porém detecta apenas um único alvo de um dado grupo de tipos de HPV (Veja, por exemplo, Clavel et al., British J. Cancer 80(9): 1306 - 11 (1999)). Adicionalmente, pelo fato de que o ensaio Hybrid Capture® II usa um coquetel de sondas de RNA (os coquetéis de sonda são disponíveis para tipos de HPV de alto risco ou baixo risco), ele não fornece informação como para o tipo de HPV específico detectado em uma amostra, porém fornece apenas um positivo ou negativo quanto à presença de HPV de alto risco ou baixo risco. Similarmente, diversos métodos com base em PCR frequentemente envolvem a amplificação de uma sequência do alvo de HPV específica única, seguido por blotting do amplicon resultante a uma membrana e sondagem com uma sonda de oligonucleotídeos radioativamente marcada.

[005] Outros métodos exploram a alta homologia entre genes de HPV específicos de tipos diferentes através do uso de iniciadores consenso comercialmente disponíveis capazes de amplificação por PCR de numerosos tipos de HPV presentes em uma amostra. A presença de um tipo de HPV específico depois é identificada usando uma sonda de oligonucleotídeos específica do tipo. Veja, por exemplo, Kleter et al., Journal of Clinical Microbiology 37(8): 2508 - 2517 (1999); Gravitt et al., Journal of Clinical Microbiology 38(1): 357 - 361 (2000). Similarmente, os ensaios que utilizam iniciadores de PCR degenerados tomam vantagem da homologia entre os tipos de HPV, permitindo a detecção de um número maior de tipos de HPV em relação aos métodos que utilizam grupos de iniciador específicos. Veja, por exemplo, Harwood et al., Journal of Clinical Microbiology 37(11): 3545 - 3555 (1999). Tais ensaios também exigem experimentação adicional para identificar os tipos de HPV específicos.

[006] Os métodos de PCR descritos acima podem estar associados com vários problemas. Por exemplo, as diferenças nas eficácias de reação entre os tipos de HPV podem resultar na amplificação desproporcional de alguns tipos em relação a outros. Adicionalmente, o equilíbrio para amplificação será orientado para aqueles tipos que existem em números de cópias maiores em uma amostra, que consumirão os componentes da reação PCR, tornando menos provável a amplificação dos tipos secundários de HPV.

[007] Também descrito na técnica é um ensaio com base em PCR fluorogênica de exonuclease 5’ (PCR Taq-Man) que permite a detecção de produtos de PCR em tempo real e elimina a necessidade quanto à radioatividade. Veja, por exemplo, Patente U.S. No 5.538.848; Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276 - 7280 (1991). Este método utiliza uma sonda marcada, compreendendo um repórter fluorescente (fluoróforo) e um supressor (quencher) que hibridiza ao DNA do alvo entre os iniciadores de PCR. A excitação do fluoróforo resulta na liberação de um sinal fluorescente pelo fluoróforo que é interrompido pelo supressor (quencher). Os amplicons podem ser detectados pela atividade da exonuclease 5’-3’ da DNA polimerase TAQ, que degrada o DNA de fita dupla encontrado na extensão do iniciador de PCR, liberando assim o fluoróforo da sonda. Em seguida, o sinal fluorescente já não está interrompido e o acúmulo do sinal fluorescente, que está diretamente correlacionado com a quantidade de DNA do alvo, pode ser detectado em tempo real com um fluorômetro automático.

[008] Os ensaios de PCR Taq-Man foram adaptados para a detecção do tipo de HPV. Swan et al. (Journal of Clinical Microbiology 35(4): 886 - 891 (1997)) divulgam um ensaio de sonda fluorogênica que utiliza iniciadores de HPV específicos do tipo que amplificam uma porção do gene L1 em combinação com sondas específicas do tipo. O ensaio de Swan et al. Mensura o sinal fluorescente na extremidade de um número fixo de ciclos de PCR (leitura final) e não em tempo real.

[009] Josefsson et al. (Journal of Clinical Microbiology 37(3): 490 - 96 (1999)) relataram um ensaio Taq-Man que alveja uma porção altamente conservada do gene E1 em combinação com sondas marcadas específicas do tipo com corantes fluorescentes diferentes. Vários tipos de HPV foram amplificados através da utilização de uma mistura de iniciadores específicos e degenerados. Josefsson et al. utilizaram até três sondas específicas do tipo por ensaio, que foram designadas para detectar uma porção do gene E1 a partir de tipos de HPV diferentes. Diferente do ensaio de Swan et al., Josefsson et al. mediram o acúmulo de fluorescência em tempo real.

[010] Tucker et al. (Molecular Diagnosis 6(1): 39 - 47 (2001)) descreveram um ensaio que alveja uma região conservada que abrange a junção E6/E7. Semelhante ao ensaio de Josefsson, Tucker et al. utilizaram a detecção em tempo real e sondas fluorescentes específicas do tipo. Tucker et al. também utilizaram PCR multiplex para detectar simultaneamente sequências do alvo de HPV e no loco celular de actina ou globina no mesmo tubo de reação.

[011] Um dos desafios particulares com a detecção de HPV é o fato de que existem muitos tipos de HPV de interesse clínico. Embora os ensaios multiplex para a detecção de HPV sejam conhecidos, os ensaios multiplex são limitados pelo número de canais colorimétricos para detecção. Estes canais possuem vários comprimentos de onda de luz (ou faixas ou bandas de comprimentos de onda). Cada canal detecta um sinal emitido por uma porção de sinal que emite luz em um comprimento de onda de canal específico. O número de tipos de HPV que são detectados é, portanto, limitado pelo número de porções diferentes, de sinal distintamente detectável no ensaio.

[012] Apesar do desenvolvimento dos ensaios de HPV descritos acima, seria vantajoso desenvolver um ensaio multiplex que é altamente sensível e reproduzível, e que exige horas trabalhadas reduzidas em comparação aos métodos divulgados na técnica. Dados os diversos tipos de HPV, seria útil detectar mais tipos de HPV do que existem canais para detecção do ensaio.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[013] A presente invenção é dirigida a uma amplificação por PCR em tempo real que implanta a química Taq-Man para detectar simultaneamente mais tipos de HPV do que existem canais para detecção. Em outras palavras, em um ensaio com os canais N, o número de tipos de HPV que são detectados é pelo menos N+1.

[014] O ensaio implanta um grupo de iniciador/sonda para detecção de cada tipo de HPV que o ensaio é configurado para detectar. Entre os vários sorotipos suscetíveis à detecção pelo ensaio estão incluídos, por exemplo, os tipos de HPV 33, 39, 51, 56, 58, 59, 66 e 68. A pessoa habilitada avaliará que os grupos de sonda/iniciador descritos neste relatório podem ser combinados com outros grupos de iniciador/sonda para outros tipos de HPV (por exemplo, 16, 18, e 45). Pelo menos um tipo é detectado usando um único grupo de iniciador/sonda. No contexto da amplificação por PCR usando um ensaio Taq-Man, o grupo de iniciador/sonda é pelo menos um iniciador forward, um iniciador reverse e uma sonda. Pelo menos dois tipos são selecionados por um par de grupos de iniciador/sonda com sequências de oligonucleotídeos que são degeneradas entre si. “Sequências degeneradas”, conforme usado neste relatório, são dois iniciadores ou sondas de oligonucleotídeos que são complementares ao mesmo loco do mesmo gene de tipos estreitamente relacionados diferentes e que têm variações de sequência menores entre si para torná-las discriminatórias entre os dois tipos.

[015] Em uma modalidade da presente invenção, os grupos de iniciador/sonda degenerados são para a detecção de tipos de HPV 39 e 68. O grupo de iniciador/sonda alveja o mesmo loco no gene E6 dos dois tipos. O comprimento do alvo é de 91 nucleotídeos e é ilustrado na FIG. 1. O alvo é apenas um segmento do gene E6 total. O alvo para o grupo de iniciador/sonda degenerado para os tipos de HPV 39 e 68 é a SEQ ID NO. 36. Em uma modalidade preferida, as porções de sinal para ambas as sondas é uma marcação de corante cianina comercialmente disponível como CY5.

[016] Nesta modalidade, o grupo de iniciador/sonda que não é degenerado diferencia do Tipo 51 de HPV. O grupo de iniciador/sonda para o tipo 51 também alveja o gene E6, embora em um loco diferente. Em uma modalidade preferida, as porções de sinal para esta sonda neste grupo de iniciador/sonda é FAM, que é especificamente identificada abaixo.

[017] Em uma segunda modalidade da presente invenção, os grupos de iniciador/sondas degenerados são para detecção dos tipos de HPV 33 e 58. O grupo de iniciador/sonda alveja o mesmo loco no gene E6 de ambos os tipos. O comprimento do alvo é de 138 nucleotídeos e é ilustrado na FIG. 2. O alvo é apenas um segmento do gene E6 total. O alvo para o grupo de iniciador/sonda degenerado para os tipos de HPV 33 e 58 é a SEQ ID NO. 37. Em uma modalidade preferida, as porções de sinal para ambas as sondas é FAM.

[018] Nesta modalidade, o grupo de iniciador/sonda que não é degenerado diferencia do Tipo 59 de HPV. O grupo de iniciador/sonda para o tipo 59 também alveja o gene E6, porém não necessariamente o mesmo loco. Em uma modalidade preferida, as porções de sinal para esta sonda neste grupo de iniciador/sonda é CY5, que é especificamente identificado abaixo.

[019] Em uma terceira modalidade da presente invenção, os grupos de iniciador/sonda degenerados são para detecção dos tipos de HPV 56 e 66. O grupo de iniciador/sonda alveja o mesmo loco no gene E6 de ambos os tipos. O comprimento do alvo é de 79 nucleotídeos e é ilustrado na FIG. 3. O alvo é apenas um segmento do gene E6 total. O alvo para o grupo de iniciador/sonda degenerado tipo 56 e 66 de HPV é a SEQ ID NO. 38. Em uma modalidade preferida, as porções de sinal para ambas as sondas é CY5.

[020] Nesta modalidade, o grupo de iniciador/sonda que não é degenerado diferencia do Tipo 59 de HPV. O grupo de iniciador/sonda para o tipo 59 alveja o gene E6. Em uma modalidade preferida, as porções de sinal para esta sonda neste grupo de iniciador/sonda é CY5, que é especificamente identificado abaixo. Nesta modalidade, a mesma porção de sinal que é usada para o Tipo 59 de HPV também é usada para os Tipos 56-66 de HPV. Visto que os mesmos corantes estão no mesmo canal, não existe discriminação óptica entre os tipos de HPV 59 e 56-66 nesta modalidade.

[021] Esta modalidade considera um ensaio multiplex que implanta ainda um outro grupo de iniciador/sonda (degenerado ou discriminatório) para um outro sorotipo de HPV (por exemplo, o grupo de iniciador/sonda degenerado para os sorotipos de HPV 33 e 58). A porção de sinal para este outro sorotipo de HPV não é CY5, e emite em um comprimento de onda que é detectavelmente diferente do comprimento de onda de emissão de Cy5 (por exemplo, FAM).

[022] Em outras modalidades, a porção de sinal para a sonda Tipo 59 de HPV é FAM, que pode ser opticamente distinguida da porção de sinal CY5 para o grupo de iniciador/sonda degenerado para os sorotipos 56 e 66 de HPV.

[023] Modalidades alternadas consideram um ensaio ou um grupo de sonda ou um kit com quaisquer e todas as combinações dos grupos de iniciador/sonda e dos grupos de iniciador/sonda degenerados descritos neste relatório. Especificamente, qualquer um entre os grupos de iniciador/sonda para o sorotipo de HPV 51 ou HPV 59 pode ser combinado com qualquer um entre os grupos de iniciador/sonda degenerados para os sorotipos de HPV 39_68; HPV 33_58; e HPV 56_66. Especificamente considerado é um ensaio ou grupo de sonda ou um kit que combina o grupo de iniciador/sonda para o HPV 51 com o grupo de iniciador/sonda degenerado de um ou mais entre HPV 39_68; HPV 33_58; e HPV 56_66. Um ensaio ou grupo de sonda ou um kit que combina o grupo de iniciador/sonda para o HPV 59 com o grupo de iniciador/sonda degenerado de um ou mais entre HPV 39_68; HPV 33_58; e HPV 56_66. As modalidades onde as porções de sinal para as sondas são os mesmos corantes ou corantes diferentes são consideradas. Visto que um ensaio multiplex é considerado, os grupos de iniciador/sonda podem ser combinados com outros grupos de iniciador/sonda configurados para detectar a presença ou ausência de outros sorotipos de HPV. Em tais modalidades onde a porção de sinal para a sonda detectora nos grupos de iniciador/sonda degenerados é a mesma porção de sinal para o grupo de iniciador/sonda para o sorotipo de HPV 51 ou 59, é considerado que o ensaio multiplex incluiria um quarto grupo de iniciador/sonda para um quarto sorotipo de HPV (por exemplo, HPV 31, HPV 52, HPV 45, etc.) e que o quarto grupo de iniciador/sonda teria uma porção de sinal que é diferente das porções de sinal para as sondas detectoras dos grupos de iniciador/sonda degenerados e dos grupos de iniciador/sonda 51 ou 59 de HPV. Além disso, considerados neste relatório são os ensaios multiplex, em que dois grupos de iniciador/sonda degenerados são combinados em um ensaio. Por exemplo, em um micropoço, um primeiro grupo de iniciador/sonda degenerado para detectar a presença de sorotipos de HPV 33 e 58 pode ser combinado com um segundo grupo de iniciador/sonda degenerado para detectar a presença ou ausência dos sorotipos de HPV 56 e 66. Nestas modalidades, as sondas do primeiro grupo de iniciador/sonda degenerado tem uma porção de sinal que emite em comprimento de onda que é detectavelmente diferente do comprimento de onda de emissão da porção de sinal para o segundo grupo de iniciador/sonda degenerado. Neste exemplo, a porção de sinal para as sondas dos sorotipos de HPV 33 e 58 seria FAM e a porção de sinal para as sondas dos sorotipos de HPV 56 e 66 seria CY5.

[024] Além das porções de sinalização descritas acima, as sondas também têm um supressor (quencher) escuro não fluorescente. Um exemplo de um supressor (quencher) escuro adequado é BHQ™ 1 (Biosearch Technologies), que é apropriado para o uso com o fluoróforo FAM. Um outro exemplo de um supressor (quencher) adequado é BHQ™ 2 (Biosearch Technologies), que é apropriado para o uso com o fluoróforo CY5. Outros exemplos de porções de sinalização são bem conhecidos àqueles habilitados na técnica e não são descritos em detalhes neste relatório.

[025] Conforme usado neste relatório, o termo “iniciador” se refere a um oligonucleotídeo que é capaz de atuar como um ponto de iniciação de síntese ao longo de uma fita complementar quando colocado sob condições, em que a síntese de um produto de extensão do iniciador que é complementar a uma fita de ácido nucleico é catalisada. Tais condições incluem a presença de quatro trifosfatos de desoxirribonucleosídeo diferentes e um agente indutor de polimerização, tal como DNA polimerase ou transcriptase reversa, em um tampão adequado (o “tampão” inclui componentes que são cofatores ou que afetam a concentração iônica, pH, etc.), e em uma temperatura adequada. Conforme utilizado neste relatório, um iniciador de oligonucleotídeo pode ter ocorrência natural, como em um digesto de restrição purificado, ou ser sinteticamente produzido. O iniciador é preferivelmente de fita única para máxima eficácia na amplificação.

[026] Conforme usado neste relatório, “par de iniciador” se refere a dois iniciadores, um iniciador forward e um iniciador reverse, que são capazes de participar na amplificação por PCR de um segmento de ácido nucleico na presença de uma ácido nucleico polimerase para produzir um amplicon de PCR. Os iniciadores que compreendem um par de iniciador pode ser específicos ao mesmo gene de HPV, resultando em um amplicon que consiste em uma sequência de nucleotídeos derivada de um gene de HPV único. Alternativamente, os iniciadores que compreendem um par de iniciador pode ser específicos a genes de HPV diferentes que residem em estreita proximidade uns com os outros dentro do genoma de HPV, desse modo, produzindo amplicons que consistem de uma sequência de nucleotídeos derivados de mais do que um gene.

[027] Conforme usado neste relatório, “espectros de imageamento diferentes”, em referência aos fluoróforos da presente invenção, significa que cada fluoróforo emite energia em uma emissão máxima diferente em relação a todos os outros fluoróforos usados no ensaio particular. O uso de fluoróforos com emissão máxima única permite a detecção simultânea da energia fluorescente emitida por cada fluoróforo usado no ensaio particular.

[028] Conforme usado neste relatório, o termo “discriminatório”, usado em referência aos iniciadores de oligonucleotídeos e sondas da presente invenção, significa que os ditos iniciadores e sondas são específicos a um único tipo de HPV. Ele inclui iniciadores e sondas de HPV específicos a um único tipo de HPV, mas que compartilham alguma homologia com outros tipos de HPV. Iniciadores e sondas “discriminatórios” da presente invenção incluem aqueles oligonucleotídeos que carecem de homologia 3’ com outros tipos de HPV em pelo menos um nucleotídeo ou mais. Um tal resíduo que é único para o tipo de HPV específico na posição específica e atua para diferenciar o tipo de HPV de outros no alinhamento é referido como uma “base discriminatória”. O termo “discriminatório”, em referência aos oligonucleotídeos, não incluem iniciadores e sondas que são específicos a mais do que um tipo de HPV, isto é, aqueles que compartilham homologia total com maios do que um tipo de HPV. Neste respeito, os grupos de iniciador/sonda degenerados divulgados neste relatório não diferenciam do tipo de HPV para o qual eles são configurados. Por exemplo, para o grupo de iniciador/sonda degenerado que alveja os tipos de HPV 39 e 68, o grupo de iniciador/sonda para o tipo de HPV 39 tem uma preferência para tipo de HPV 39 sobre o tipo de HPV 68, porém não diferencia do tipo de HPV 39 sobre o tipo de HPV 68. Pelo fato de que os grupos de iniciador/sonda degenerados não diferenciam entre os tipos de HPV, as sondas preferivelmente têm a mesma porção de sinal. Visto que o ensaio é configurado para determinar a presença ou ausência destes tipos de HPV no agregado, não existe necessidade quanto ao uso de dois canais ópticos para este propósito. Além disso, quando o grupo de iniciador/sonda degenerado é combinado com outros grupos de iniciador/sonda em um micropoço único para um ensaio multiplex, as porções de sinal para os outros grupos de iniciador/sonda (discriminatórios ou não discriminatórios) podem ser as mesmas ou diferentes. As porções de sinal para o ensaio são primariamente uma matéria da escolha do projeto. A pessoa habilitada usará as mesmas porções de sinal para os grupos de iniciador/sonda no mesmo micropoço quando é necessário conhecer se o tipo de HPV particular está presente. A mesma porção de sinal pode ser usada em grupos de iniciador/sonda para os sorotipos de HPV diferentes quando é suficiente conhecer se apenas um de tais tipos está presente.

[029] Conforme usado neste relatório, “amplicon” se refere a um produto específico de uma reação PCR, que é produzido pela amplificação por PCR de uma amostra compreendendo ácido nucleico na presença de uma ácido nucleico polimerase e um par de iniciador específico. Um amplicon pode consistir em uma sequência de nucleotídeos derivada de um gene único de um tipo único de HPV ou um amplicon pode consistir em uma sequência de nucleotídeos derivada de mais do que um gene de um tipo único de HPV.

[030] Conforme usado neste relatório, “grupo de iniciador/sonda” se refere a um agrupamento de um par de iniciadores de oligonucleotídeos e a uma sonda de oligonucleotídeos que hibridiza a uma sequência de nucleotídeos específica de um tipo único de HPV. O dito grupo de oligonucleotídeos consiste de: (a) um iniciador forward discriminatório que hibridiza a uma primeira localização de uma sequência de ácido nucleico de um tipo de HPV; (b) um iniciador reverse discriminatório que hibridiza a uma segunda localização da sequência de ácido nucleico do tipo de HPV a jusante da primeira localização e (c) uma sonda fluorescente marcada com um fluoróforo e um supressor (quencher), que hibridiza a um localização da sequência de ácido nucleico do tipo de HPV entre os iniciadores. Em outras palavras, um grupo de oligonucleotídeos consiste em um conjunto de iniciadores de PCR específicos capazes de iniciar a síntese e um amplicon específico a um tipo único de HPV, e uma sonda fluorescente que hibridiza ao amplicon.

[031] Conforme usado neste relatório, “pluralidade” significa dois ou mais.

[032] Conforme usado neste relatório, “especificamente hibridiza”, em referência aos grupos de oligonucleotídeos, iniciadores de oligonucleotídeos, ou sondas de oligonucleotídeos, significa que os ditos grupos de oligonucleotídeos, iniciadores ou sondas hibridizam a uma sequência de ácido nucleico de um tipo único de HPV.

[033] Conforme usado neste relatório, “gene” significa um segmento de ácido nucleico envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeos. Ele inclui tanto sequências traduzidas (região codificante) quanto sequências não traduzidas 5’ e 3’ (regiões não codificantes), assim como sequências de intervenção (íntrons) entre segmentos codificantes individuais (éxons). Para propósitos da descrição das modalidades da presente invenção, o genoma de HPV tem uma pluralidade de genes: por exemplo, L1, L2, e E1, E2, E4-E7.

[034] Conforme usado neste relatório, “loco” se refere à posição em um cromossomo na qual reside o gene para um traço. O termo loco inclui qualquer um dos alelos de um gene específico. Ele também inclui genes homólogos a partir de tipos de HPV diferentes. Por exemplo, os ensaios de PCR que detectam o gene L1 em HPV16 e HPV6 são ensaios de loco único, apesar da detecção de sequências a partir de tipos de HPV diferentes. Ao contrário, por exemplo, os ensaios que detectam o gene L1 e o gene E1 de um tipo único de HPV são ensaios de múltiplos locos, ainda que um tipo único de HPV seja detectado.

[035] Conforme usado neste relatório, “HPV” significa papilomavírus humano. “HPV” é um termo geral usado para se referir a qualquer tipo de HPV, se correntemente conhecido ou subsequentemente descrito.

[036] Conforme usado neste relatório, “fluoróforo” se refere a uma molécula repórter fluorescente que, sob excitação com um laser, lâmpada de tungstênio, mercúrio ou xenônio, ou um diodo emissor de luz, libera energia na forma de luz com um espectro definido. Através do processo de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), a luz emitida a partir do fluoróforo pode excitar uma segunda molécula, cujo espectro de excitação sobrepõe o espectro de emissão do fluoróforo. A transferência de energia de emissão do fluoróforo para uma outra molécula suprime a emissão do fluoróforo. A segunda molécula é conhecida como uma molécula supressora (quencher). O termo “fluoróforo” é usado permutavelmente neste relatório com o termo “repórter fluorescente”.

[037] Conforme usado neste relatório “supressor (quencher)” ou molécula “supressora (quencher)” se refere a uma molécula que, quando ligada a uma sonda fluorescente compreendendo um fluoróforo, é capaz de aceitar a energia emitida pelo fluoróforo, desse modo, suprimindo a emissão do fluoróforo. Um supressor (quencher) pode ser fluorescente, que libera a energia aceita como luz, ou não fluorescente, que libera a energia aceita como calor, e pode ser ligado em qualquer localização ao longo do comprimento da sonda.

[038] Conforme usado neste relatório “supressor (quencher) escuro” se refere a um supressor (quencher) não fluorescente.

[039] Conforme usado neste relatório, “sonda” se refere a um oligonucleotídeo que é capaz de formar uma estrutura duplex com uma sequência em um ácido nucleico do alvo, devido à complementaridade de pelo menos uma sequência da sonda com uma sequência na região do alvo, ou região a ser detectada. O termo “sonda” inclui um oligonucleotídeo, conforme descrito acima, com ou sem um fluoróforo, e uma molécula supressora (quencher) ligada. O termo “sonda fluorescente” se refere a uma sonda compreendendo um fluoróforo e uma molécula supressora (quencher).

[040] Conforme usado neste relatório, “FAM” se refere ao fluoróforo 6-carbóxi- fluoresceína.

[041] Outras modalidades da invenção usam sequências de oligonucleotídeos diferentes que se ligam à região do gene E6/E7 de HPV. Os oligonucleotídeos descritos neste relatório têm uma sequência que é capaz de se ligar à sequência de ácidos nucleicos alvo (e sua fita complementar). Os oligonucleotídeos descritos neste relatório também podem ser usados, sozinhos ou em combinação, para facilitar a detecção através da amplificação da sequência de ácidos nucleicos do gene E6/E7 de HPV. Em uma modalidade, as sondas são designadas para realizar um ensaio de PCR em tempo real Taq-Man® na porção do alvo do gene. Os exemplos de três grupos de sondas degeneradas usados para os ensaios de PCR em tempo real Taq-Man®, descritos em termos de suas sequências de oligonucleotídeos, são descritos abaixo.

[042] Especificamente, na primeira modalidade onde o primeiro grupo de iniciador/sonda degenerado é para os tipos de HPV 39 e 68, o grupo de iniciador/sonda que prefere o tipo 39 de HPV são SEQ ID NOS: 1, 3 e 5. O grupo de iniciador/sonda que prefere o tipo 68 de HPV são SEQ ID NOS. 2, 4 e 6. SEQ ID NOS 1 e 2 são tanto iniciadores forward Taq-Man quanto são degenerados entre si. SEQ ID NOS 3 e 4 são tanto iniciadores reverse Taq-Man quanto são degenerados entre si. SEQ ID NOS 5 e 6 são tanto sondas Taq-Man quanto são degeneradas entre si. Os grupos de iniciador/sonda degenerados para os tipos de HPV 33 e 58 são SEQ ID NOS. 7 - 16, que incluem duas sequências de iniciador reverse alternativas, SEQ ID NOS. 13 e 14 sendo preferidas. Os grupos de iniciador/sonda degenerados para os tipos de HPV 56 e 66 são SEQ ID NOS. 17 - 23. As sequências de iniciador/sonda que selecionam ou diferenciam para o sorotipo de HPV 51 são SEQ ID NOS. 24 - 29. As sequências de iniciador/sonda que selecionam ou diferenciam para o tipo de HPV 59 são SEQ ID NOS. 30 - 35. Todos as sequências referenciadas acima são enumeradas na Tabela 1 abaixo. Na tabela abaixo, “D” é detector, “FP” é iniciador forward, e “RP” é iniciador reverse. TABELA 1

[043] As localizações das regiões do alvo para o grupos de iniciador/sonda descritos na tabela acima são descritas na Tabela 1A seguinte: Tabela 1A: Localização de Regiões do Alvo

[044] Embora exista homologia de sequência entre as regiões do alvo para os grupos de iniciador/sonda degenerados, as coordenadas destas regiões são dependentes do genótipo.

[045] Em uma modalidade adicional, o método inclui tratar uma amostra usando pelo menos um grupo de iniciador/sondas degenerado para selecionar dois diferentes, mas tipos de HPV estreitamente relacionados, e um grupo de iniciador/sonda que diferencia de um terceiro tipo de HPV, onde a porção de sinal para as sondas degeneradas emite um sinal do mesmo comprimento de onda e é, preferivelmente, a mesma porção de sinalização para as duas sondas degeneradas. A porção de sinalização do grupo de iniciador/sonda que diferencia do terceiro tipo de HPV emite sinal em um comprimento de onda que é diferente, e, portanto, separadamente detectável, a partir do comprimento de onda emitido pelas porções de sinalização para as sondas degeneradas. Estes grupos de iniciador/sonda são usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico para detectar a presença ou ausência do produto de ácido nucleico amplificado.

[046] Em uma outra modalidade, um kit é fornecido para a detecção de HPV. O kit inclui pelo menos um grupo de iniciador/sondas degenerado que seleciona dois tipos de HPV diferentes, mas estreitamente relacionados, e um grupo de iniciador/sonda que diferencia de um terceiro tipo de HPV, onde a porção de sinal para as sondas degeneradas emite um sinal do mesmo comprimento de onda e é, preferivelmente, a mesma porção de sinalização para as duas sondas degeneradas. A porção de sinalização do grupo de iniciador/sonda que diferencia do terceiro tipo de HPV emite sinal em um comprimento de onda que é diferente, e, portanto, separadamente detectável, a partir do comprimento de onda emitido pelas porções de sinalização para as sondas degeneradas. Os grupos de iniciador/sonda capazes de amplificar uma sequência do alvo que pode ser usada para detecção de tal organismo. O kit é fornecido com um ou mais entre os oligonucleotídeos e reagentes tampão para realizar ensaios de amplificação.

[047] Ainda em um outro aspecto do kit, os oligonucleotídeos e reagentes para propósitos de PCR Taq-Man podem ser fornecidos. Neste aspecto, três oligonucleotídeos são fornecidos. Dois dos três são iniciadores de amplificação e o terceiro oligonucleotídeo é configurado como um detector.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[048] A FIG. 1 ilustra a região do alvo do gene E6 para o tipo de HPV 68 e esquematicamente, a degeneração de tal sequência do alvo entre várias mutações do tipo de HPV 68, tipo de HPV 39 e mutações do tipo de HPV 39 juntamente com o grupo de iniciador/sonda degenerado para os tipos de HPV 39 e 68;

[049] As FIGS. 2A-B ilustram a região do alvo do gene E6 para o tipo de HPV 33 e esquematicamente, a degeneração de tal sequência do alvo entre várias mutações do tipo de HPV 33, tipo de HPV 58 e mutações do tipo de HPV 33 junto com o grupo de iniciador/sonda degenerado para os tipos de HPV 33 e 58; e

[050] A FIG. 3 ilustra o gene do alvo E7 para o tipo de HPV 66 e esquematicamente, a degeneração de tal sequência do alvo entre várias mutações do tipo de HPV 66, tipo de HPV 56 e mutações do tipo de HPV 56 junto com o grupo de iniciador/sonda degenerado para os tipos de HPV 56 e 66.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[051] As sondas de oligonucleotídeos e grupos de sondas descritos neste relatório são especificamente designados para selecionar ou diferenciar entre os tipos de HPV. Especificamente, os grupos de iniciador/sonda degenerados que são, de certa forma, seletivos para um entre dois tipos de HPV estreitamente relacionados são combinados com pelo menos um outro grupo de iniciador/sonda que ainda diferencia de um terceiro tipo de HPV que é diferente dos tipos de HPV estreitamente relacionados.

[052] Os grupos de iniciador/sonda fornecem um sinal detectável quando o tipo de HPV específico está presente na amostra.

[053] Nas modalidades preferidas, o método de detecção por PCR (por exemplo, PCR Taq-Man) é usado, embora outros métodos (por exemplo, TMA, e LCR) também sejam considerados. Além disso, um kit para detectar mais tipos de HPV do que existem canais para detecção é divulgado.

[054] Referindo-se à FIG. 1, os grupos de iniciador/sonda degenerados específicos para os tipos de HPV são descritos em termos de seu alinhamento com a região do alvo ilustrada do gene E6. A FIG. 1 ilustra a região do iniciador forward 10, a Região de Detecção Taq-Man 20 e a região de iniciador reverse 30. A FIG. 1 também ilustra os iniciadores forward degenerados 11, 12, iniciadores reverse degenerados 31, 32 e sondas degeneradas 21 e 22 em relação a sua região correspondente na sequência do alvo 40. Apenas as variações na sequência do alvo 40 com respeito à região do iniciador forward, região do iniciador reverse e regiões detectoras são ilustradas nas caixas 60, 70 e 80. A degeneração da sequência entre estas regiões é observada e a partir disso, pode ser observado que estas regiões são menos desejáveis, devido à variação de sequência aumentada nestas regiões.

[055] Por exemplo, na caixa 60, observe que existem polimorfismos de nucleotídeo únicos (T, C) entre a porção da sequência do alvo 40 delimitada pela caixa 60 e a mesma porção E6 de um tipo de HPV 39 do alvo. As caixas 60, 70 e 80 ilustram os polimorfismos de nucleotídeos em relação ao alvo para cepas diferentes dos tipos de HPV 68 e 39. Estas cepas diferentes, e o número e a localização dos polimorfismos de nucleotídeos (em relação ao alvo) são relatados na Tabela 2. Tabela 2: Polimorfismos Ilustrados em FIG. 1 Relação ao Alvo

[056] O iniciador forward 11 para o HPV 39 tem um polimorfismo de nucleotídeo único e é, portanto, degenerado com respeito ao iniciador forward 12 para o HPV 68. O iniciador forward 11 é SEQ ID NO. 1 e o iniciador forward 12 é SEQ ID NO. 2. A degeneração entre as duas sequências é facilmente observada: CCACTAGCTGCATGCCAATC CCATTAGCTGCATGCCAATC

[057] A degeneração respectiva é indicada pelo sublinhado.

[058] A degeneração faz com que o iniciador forward prefira se ligar ao tipo de HPV 39 e o iniciador forward 12 prefira se ligar ao tipo de HPV 68. Os grupos de iniciador/sondas degenerados preferem se ligar ao alvo de um tipo de HPV ao outro tipo, mas não diferenciam. Em termos das Figuras, os grupos de iniciador/sonda são descritos em relação ao alvo. As caixas 60, 70 e 80 contêm informação sobre a degeneração entre os tipos de HPV 39 e 68 com respeito à região do alvo 40 delimitada pelas caixas 60, 70 e 80. Isto é uma referência de localização e não uma referência de hibridização. Especificamente, os iniciadores reverse 31 e 32 (SEQ ID NOs. 3 e 4) têm sequências que são o complemento reverso da sequência em sua localização correspondente no alvo 40. Similarmente, as sondas detectoras 21 e 22 (SEQ ID NOS. 5 e 6) são o complemento reverso da sequência em sua localização correspondente no alvo 40. Os iniciadores forward 11 e 12 (SEQ ID NOS. 1 e 2) são homólogos à sequência em sua localização correspondente no alvo 40.

[059] As FIGS. 2A-B são similares à FIG. 1, porém para os grupos de iniciador/sonda degenerados que selecionam os tipos de HPV 33 e 58. As caixas 160, 170 e 180 ilustram os polimorfismos de nucleotídeos em relação ao alvo para as cepas diferentes dos tipos de HPV 33 e 58. Estas cepas diferentes, e o número e localização dos polimorfismos de nucleotídeos (em relação ao alvo) são relatados na Tabela 3. A localização dos polimorfismos é ilustrada na FIG. 2. Tabela 3: Polimorfismos Ilustrados em FIG. 2A-B Relação ao Alvo

[060] As FIGS. 2A-B ilustram a região do iniciador forward 110, a Região de Detecção Taq-Man 120 e a região do iniciador reverse 130. As FIG. 2A-B também ilustram os iniciadores forward degenerados 111, 112, iniciadores reverse degenerados 131, 132 e as sondas degeneradas 121 e 122 em relação a sua região correspondente na sequência do alvo 140. Apenas as variações na sequência do alvo 140 com respeito à região do iniciador forward, região do iniciador reverse e regiões detectoras são ilustradas nas caixas 160 (FIG. 2A), 170 e 180 (FIG. 2B).

[061] Por exemplo, na caixa 160, observe que existem polimorfismos de nucleotídeos únicos (T, G, G) entre a porção da sequência do alvo 140 delimitada pela caixa 60 e a mesma porção E6 de um tipo de HPV 33 alvo. Entretanto, o iniciador forward 112 para o HPV 58 tem três polimorfismos de nucleotídeos únicos e é, portanto, degenerado com respeito ao iniciador forward 111 para o HPV 33. O iniciador forward 111 é SEQ ID NO. 7 e o iniciador forward 112 é SEQ ID NO. 8. A degeneração entre as duas sequências é facilmente observada: TGTGCCAAGCATTGGAGACA TGTGTCAGGCGTTGGAGACA

[062] A degeneração respectiva é indicada pelo sublinhado.

[063] A degeneração faz com que o iniciador forward 111 prefira se ligar ao tipo de HPV 33 e o iniciador forward 112 prefira se ligar ao tipo de HPV 58. Os grupos de iniciador/sondas degenerados preferem se ligar ao alvo de um tipo de HPV ao outro tipo, porém não diferenciam. Em termos das Figuras, os grupos de iniciador/sonda são descritos em relação ao alvo. As caixas 160, 170 e 180 contêm informação sobre a degeneração entre os tipos de HPV 33 e 58 com respeito à região do alvo 140 delimitada pelas caixas 160, 170 e 180. Isto é uma referência de localização e não uma referência de hibridização. Especificamente, os iniciadores reverse 131 e 132 (por exemplo, SEQ ID NOs. 13 e 14) têm sequências que são o complemento reverso da sequência em sua localização correspondente no alvo 140. Similarmente, as sondas reversas 121 e 122 (SEQ ID NOS. 15 e 16) são o complemento reverso da sequência em sua localização correspondente no alvo 140. Os iniciadores forward 111 e 112 (SEQ ID NOS. 7 e 8) são homólogos à sequência em sua localização correspondente no alvo 140.

[064] A FIG. 3 é similar às FIGS. 1 e 2, porém para os grupos de iniciador/sonda degenerados que selecionam os tipos de HPV 56 e 66. A FIG. 3 ilustra a região do iniciador forward 210, a Região de Detecção Taq-Man 220 e a região de iniciador reverse 230. As caixas 260, 270 e 280 ilustram os polimorfismos de nucleotídeos em relação ao alvo para as cepas diferentes dos tipos de HPV 66 e 56. Estas cepas diferentes, e o número e a localização dos polimorfismos de nucleotídeos (em relação ao alvo) são relatados na Tabela 2. Tabela 4: Polimorfismos Ilustrados em FIG. 3 Relação ao Alvo

[065] A FIG. 3 também ilustra os iniciadores forward degenerados 211, 212, iniciadores reverse degenerados 231, 232 e sondas degeneradas 221 e 222 em relação a sua região correspondente na sequência do alvo 240. Apenas as variações na sequência do alvo 240 com respeito à região do iniciador forward, região do iniciador reverse e regiões detectoras são ilustradas nas caixas 260, 270 e 280.

[066] Por exemplo, na caixa 260, observe que existem dois polimorfismos de nucleotídeos únicos (T, C) entre a porção da sequência do alvo 240 delimitada pela caixa 260 entre e HPV 66 alvo e um HPV 56 alvo. Entretanto, o iniciador forward 212 para o HPV 56 tem um polimorfismo de nucleotídeo único e é, portanto, degenerado com respeito ao iniciador forward 211 para o HPV 66. O iniciador forward 211 é SEQ ID NO. 17 e o iniciador forward 212 é SEQ ID NO. 18. A degeneração entre as duas sequências é facilmente observada: ACCTAATACACGTACCTTGTT ACCTAATTCACGTACCTTGTT

[067] A degeneração respectiva é indicada pelo sublinhado.

[068] A degeneração faz com quer o iniciador forward 211 prefira se ligar ao tipo de HPV 56 e o iniciador forward 212 prefira se ligar ao tipo de HPV 66. Os grupos de iniciador/sondas degenerados preferem se ligar ao alvo de um tipo de HPV ao outro tipo, porém não diferenciam. Em termos das Figuras, os grupos de iniciador/sonda são descritos em relação ao alvo. As caixas 260, 270 e 280 contêm informação sobre a degeneração entre os tipos de HPV 56 e 66 com respeito à região do alvo 240 delimitada pelas caixas 260, 270 e 280. Isto é uma referência de localização e não uma referência de hibridização. Especificamente, os iniciadores reverse 231 e 232 (SEQ ID NOs. 19 e 20) têm sequências que são o complemento reverso da sequência em sua localização correspondente no alvo 240. Similarmente, as sondas 221 e 222 (SEQ ID NOS. 22 e 23) são o complemento reverso da sequência em sua localização correspondente no alvo 240. Os iniciadores forward 211 e 212 (SEQ ID NOS. 17 e 18) são homólogos à sequência em sua localização correspondente no alvo 140. Embora não especificamente debatida, a degeneração entre os iniciadores reverse e as sondas no grupo de iniciador/sonda degenerados é facilmente observada.

[069] Além dos exemplos de grupos de iniciador/sonda degenerados descritos neste relatório, a pessoa habilitada, com base na descrição neste relatório e nas figuras anexas, seria capaz de identificar outras regiões do alvo de sorotipos estreitamente relacionados para que os grupos de iniciador/sonda degenerados possam ser designados. Como é facilmente observado pelas Figuras, as regiões do alvo desejáveis terão pouco polimorfismo entre os sorotipos individuais. Aqueles polimorfismos que estão presentes podem ser dirigidos no projeto do grupo de iniciador/sonda degenerado compatível com a maneira descrita neste relatório.

[070] Conforme descrito abaixo, os iniciadores e as sondas podem se ligar às sequências do alvo, ainda que sejam menos do que 100 % complementares com tais regiões. O grau necessário de complementaridade depende de uma variedade de fatores, incluindo a estringência das condições de ligação. Dependendo das condições de estringência utilizadas, os iniciadores e as sondas podem ser modificados para incluir bases diferentes em sua sequência e ainda podem ser suficientemente complementares para se ligar à região do alvo do ácido nucleico. Suficientemente complementar, conforme usado neste relatório, inclui complementaridade de 70 % ou mais. Em modalidades preferidas, a complementaridade dos iniciadores/sondas a sua sequência do alvo é pelo menos 80 % sobre o comprimento da porção de ligação dos iniciadores/sondas. Mais preferivelmente, a complementaridade dos iniciadores e das sondas a suas sequências do alvo é 90 % ou mais.

[071] Dito de outra forma, a presente invenção considera iniciadores e sondas que têm pelo menos 70 % de homologia com os iniciadores e as sondas especificamente identificados neste relatório pela SEQ ID. Em modalidades preferidas, os iniciadores/sondas que têm pelo menos 80 % de homologia com os iniciadores e sondas especificamente identificados pela SEQ ID neste relatório são considerados. Mais preferivelmente, os iniciadores e as sondas que têm pelo menos 90 % de homologia com os iniciadores e as sondas especificamente identificados pela SEQ ID neste relatório são considerados.

[072] Embora os oligonucleotídeos descritos neste relatório devam ser suficientemente complementares para a ligação às suas porções respectivas do alvo de HPV para que diferenciem, é reconhecido, em algum ponto, que a sequência do oligonucleotídeo se torna menos complementar a seu alvo e possa se ligar a outras sequências de ácido nucleico. Portanto, é desejável que as sondas de oligonucleotídeos permaneçam suficientemente complementares com sua porção respectiva do gene do alvo, e não percam seletividade para seu sítio de ligação do alvo respectivo.

[073] A sequência de ligação do alvo dentro do iniciador de amplificação de oligonucleotídeos pode, em geral, estar localizada em sua extremidade 3’. A sequência de ligação do alvo pode ter cerca de 10 a 25 nucleotídeos em comprimento e pode ter especificidade de hibridização ao iniciador de amplificação. Assim, é entendido que uma pessoa habilitada na técnica possa mudar a sequência de ligação alvo para mudar eficazmente a especificidade de hibridização do iniciador de amplificação e direcionar a hibridização a uma sequência alternativa.

[074] É entendido a uma pessoa habilitada na técnica que os oligonucleotídeos usados em ensaios de amplificação podem ser modificados de alguma forma sem perda de utilidade ou especificidade para uma sequência do alvo. Por exemplo, conforme é conhecido na técnica, a hibridização de sequências de ácido nucleico complementares e parcialmente complementares pode ser obtida ajustando as condições de hibridização para aumentar ou diminuir a estringência (isto é, ajuste da temperatura de hibridização ou teor de sal do tampão). Tais modificações menores das sequências divulgadas e quaisquer ajustes necessários de condições de hibridização para manter a especificidade do alvo exigem apenas experimentação de rotina e estão dentro da habilidade comum na técnica.

[075] Como um guia geral em designar oligonucleotídeos úteis como iniciadores, a Tm diminui aproximadamente 1 °C a 1,5 °C com cada 1 % de diminuição na homologia de sequência. As faixas de temperatura podem variar entre cerca de 60 °C e 70 °C, porém os iniciadores podem ser designados como ideais a 60 °C ± 4 °C e as sondas podem ser designadas como ideais a 70 °C ± 4 °C. Uma consideração adicional quando se designa os iniciadores de amplificação pode ser o teor de guanina e citosina. Geralmente, o teor de GC para um iniciador pode ser cerca de 60 a 70 %, porém também pode ser menor e pode ser apropriadamente ajustado por uma pessoa habilitada na técnica. As sequências de ácidos nucleicos complementares e parcialmente complementares de anelamento podem ser obtidas modificando as condições de anelamento para aumentar ou diminuir a estringência (isto é, temperatura de anelamento de ajuste ou teor de sal do tampão). As modificações, tais como aquelas às sequências divulgadas e quaisquer ajustes necessários de condições de anelamento para manter a especificidade do gene exigem apenas experimentação de rotina e estão dentro da habilidade comum na técnica.

[076] As reações de amplificação utilizando os iniciadores descritos neste relatório podem incorporar timina, conforme mostrado por Walker, et al., supra, ou podem substituir total ou parcialmente 2’-deoxiuridina 5’-trifosfato para TTP na reação para reduzir contaminação cruzada de reações de amplificação subsequentes, por exemplo, conforme mostrado no EP 0 624 643. dU (uridina) é incorporada em produtos de amplificação e pode ser excisada por tratamento com uracil DNA glicosilase (UDG). Estes sítios abásicos tornam o produto de amplificação não amplificável em reações de amplificação subsequentes. UDG pode ser inativada pelo inibidor de uracil DNA glicosilase (Ugi) antes da realização da amplificação subsequente para prevenir excisão de dU em produtos de amplificação recém formados.

[077] A DNA polimerase de PCR considerada para o uso na presente invenção tem atividade da exonuclease 5’-3’ (por exemplo, Sequencing Grade Taq da Promega ou Deep VentR™ (exo-) DNA da New England BioLabs são usados). A sonda hibridiza ao alvo a jusante a partir dos iniciadores de amplificação por PCR. A sonda é deslocada, conforme a síntese de endonuclease a jusante procede a partir dos iniciadores entre os quais a sonda é disposta. Como termociclagem é uma característica de amplificação por PCR, a endonuclease de restrição é preferivelmente adicionada na temperatura baixa depois do ciclo final do anelamento de iniciador e extensão para detecção de amplificação final. Entretanto, uma endonuclease de restrição termofílica que permanece ativa através das fases de temperatura alta da reação de PCR pode estar presente durante a amplificação para fornecer um ensaio em tempo real. A linearização da estrutura secundária e separação do par de corante reduz a supressão de fluorescência, com uma mudança em um parâmetro de fluorescência, tal como intensidade servindo como uma indicação de amplificação do alvo.

[078] A mudança na fluorescência resultante da não dobra ou linearização dos oligonucleotídeos detectores pode ser detectada em um final selecionado na reação. Entretanto, pelo fato de que as estruturas secundárias linearizadas são produzidas concorrentemente com hibridização ou extensão de iniciador, a mudança na fluorescência também pode ser monitorada, conforme a reação ocorre, isto é, em “tempo real”. Este formato de ensaio em tempo real, homogêneo, pode ser usado para fornecer informação semiquantitativa ou quantitativa sobre a quantidade inicial do alvo presente. Quando mais cópias iniciais da sequência do alvo estão presentes, a fluorescência doadora mais rapidamente atinge um valor limiar selecionado (isto é, tempo mais curto para positividade). A diminuição na fluorescência aceitante exibe similarmente um tempo mais curto para positividade, detectado como o tempo necessário para atingir um valor mínimo selecionado. Além disso, a taxa de mudança nos parâmetros de fluorescência durante o curso da reação é mais rápida em amostras que contêm quantidades iniciais maiores de alvo do que em amostras que contém quantidades iniciais menores de alvo (isto é, coeficiente angular aumentado da curva de fluorescência). Estas ou outras medições, conforme é conhecido na técnica, podem ser feitas como uma indicação da presença de alvo ou como uma indicação de amplificação de alvo. A quantidade inicial do alvo é tipicamente determinada pela comparação dos resultados experimentais aos resultados quanto às quantidades conhecidas do alvo.

[079] Os ensaios para a presença de uma sequência do alvo selecionada, de acordo com os métodos da invenção, podem ser realizados em solução ou em uma fase sólida. Os ensaios homogêneos em tempo real ou final, em que o oligonucleotídeo detector funciona como um iniciador, são tipicamente realizados em solução. Os ensaios de hibridização usando os oligonucleotídeos detectores da invenção também podem ser realizados em solução (por exemplo, como ensaios homogêneos em tempo real), porém também são particularmente bem apropriados aos ensaios em fase sólida para a detecção em tempo real ou final do alvo. Em um ensaio em fase sólida, os oligonucleotídeos detectores podem ser imobilizados na fase sólida (por exemplo, pérolas, membranas ou o vaso de reação) por intermédio de marcações internas ou terminais usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um oligonucleotídeo detector marcado com biotina pode ser imobilizado em uma fase sólida modificada por avidina, onde produzirá uma mudança na fluorescência quando exposto ao alvo sob condições de hibridização apropriadas. A captura do alvo desta forma facilita a separação do alvo a partir da amostra e permite a remoção de substâncias na amostra que podem interferir na detecção do sinal ou outros aspectos do ensaio.

[080] Para conveniência comercial, os oligonucleotídeos úteis para a detecção específica e identificação de ácidos nucleicos de HPV podem ser empacotados na forma de um kit. Tipicamente, tal kit contém pelo menos um oligonucleotídeo descrito neste relatório. Os reagentes para a realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico também podem ser incluídos com os oligonucleotídeos específicos de HPV. Por exemplo, tampões, outros oligonucleotídeos, nucleotídeo trifosfatos, enzimas, etc. podem ser incluídos. Os componentes do kit podem ser juntamente empacotados em um recipiente comum. Opcionalmente, as instruções podem ser incluídas, as quais ilustram uma modalidade descrita para a realização de uma modalidade específica dos métodos inventivos. Outros componentes opcionais também podem ser incluídos no kit, por exemplo, um oligonucleotídeo etiquetado com uma marcação adequada para o uso como uma sonda de ensaio, e/ou reagentes ou meios para detectar a marcação.

[081] Além disso, o kit pode incluir oligonucleotídeos e reagentes no formato seco ou líquido. Os componentes do kit podem ser mais estáveis e facilmente manipulados quando no formato seco. Os componentes secos do kit podem ser adicionados ou pré-tratados a uma fase sólida, tal como placa microtituladora, microarranjo, ou outro recipiente apropriado, onde a amostra e o tampão precisam apenas ser adicionados. Este formato facilita a análise de múltiplas amostras simultaneamente e é útil em métodos de rendimento elevado. Os instrumentos BD ProbeTec™ e XTR ViperTM podem ser usados.

[082] Os exemplos seguintes ilustram as modalidades específicas da invenção descritas neste relatório. Como seria evidente aos técnicos habilitados, várias modificações são possíveis, e são consideradas dentro do escopo da invenção descrita.

[083] Um Sistema de PCR Taq-Man para detectar o HPV é adicionalmente descrito abaixo usando os grupos de iniciador/sondas na Tabela 1 como um Exemplo. Os Grupos de Iniciador dos Iniciadores/Sondas descritos na Tabela 1 acima foram designados para realizar a PCR Taq-Man para os tipos de HPV 39 e 68 e 51. Especificamente, na primeira modalidade onde o primeiro grupo de iniciador/sonda degenerado é para os tipos de HPV 39 e 68, o grupo de iniciador/sonda que prefere o tipo de HPV 39 são SEQ ID NOS: 1, 3 e 5. O grupo de iniciador/sonda que prefere o tipo de HPV 68 são SEQ ID NOS. 2, 4 e 6.

[084] A PCR em tempo real Taq-Man é um tipo de PCR quantitativa. Taq-Man usa uma sonda fluorogênica que é um oligonucleotídeo de fita única de 20 a 26 nucleotídeos e é designada para se ligar apenas à sequência de DNA entre os dois iniciadores de PCR. Em Taq-Man, corantes repórteres e corantes supressores (quencher) são ligados à sonda. A sonda é anelada ao DNA alternando a temperatura para desnaturar e reanelar o DNA. A Taq polimerase adiciona nucleotídeos ao DNA do alvo e isto remove a sonda Taq-Man a partir do DNA molde. Quando o corante repórter é separado do corante supressor (quencher), o corante repórter emite energia que é detectável. A energia é quantificada por um computador, que fornece um sinal indicando que o alvo foi detectado. Apenas o produto de PCR específico pode gerar o sinal fluorescente em PCR Taq-Man.

[085] No exemplo neste relatório, a ciclagem térmica é considerada. Depois de uma etapa de desnaturação inicial a 95 °C durante 15 minutos, a mistura de PCR dos grupos de iniciador/sonda e a amostra para a detecção da presença ou ausência do alvo são submetidas ao ciclo térmico de 55 °C durante 1 minuto, seguido por 95 °C durante 30 segundos para quarenta ciclos.

[086] Para praticar PCR Taq-Man, dois iniciadores de PCR com um tamanho de produto preferido de 50 a 150 pares de base e uma sonda com um repórter fluorescente ou fluoróforo (por exemplo, 6-carboxifluoresceína (FAM) e tetraclorofluoresceína (TET)) e um supressor (quencher), tal como tetrametilrodamina (TAMRA), ou um supressor (quencher) escuro, tal como previamente descrito, é covalentemente ligado às suas extremidades 5’ e 3’, são usados. Repórteres fluorescentes e fluoróforos adequados são bem conhecidos e não descritos em detalhes neste relatório. Tabela 5: Exemplos de Grupos de sondas de PCR Taq-Man para o Ensaio Taq-Man de Tipos de HPV 39, 68 e 51

[087] As sondas são designadas para se anelarem à localização ORF no gene E6/E7 de HPV que é observada na Tabela. Neste respeito, as localizações ORF para o grupo de iniciador/sonda/ para HPV 59 para ambos os genes E6 e E7 são listadas na tabela seguinte. Tabela 6: Localizações ORF em E6/E7 para Grupo de iniciador/sonda para o Tipo de HPV 59

[088] Além dos iniciadores e sondas, PCR Taq-Man exige reagentes que são usados para regular a PCR (por exemplo, polimerase, nucleotídeos livres), assim como uma máquina de PCR em tempo real para analisar os dados. Os reagentes e o equipamento são bem conhecidos àqueles habilitados na técnica e não são debatidos em detalhes neste relatório.

[089] Embora a invenção neste relatório tenha sido descrita com referência às modalidades particulares, deve ser entendido que estas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da invenção descrita neste relatório. Portanto, deve ser entendido que diversas modificações podem ser feitas às modalidades ilustrativas e que outros arranjos podem ser projetados sem divergir do espírito e do escopo da invenção descrita neste relatório, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (11)

1. Ensaio multiplex para detectar a presença ou ausência de múltiplos sorotipos de um organismo papilomavírus humano (HPV) em uma amostra biológica CARACTERIZADO pelo fato de que o ensaio detecta mais sorotipos do que existem canais para detecção, compreendendo: fornecer uma amostra biológica; contatar a amostra biológica com três grupos de iniciador/sonda de oligonucleotídeos, cada um dos quais compreende uma sonda de oligonucleotídeos que é detectavelmente marcada e tem um comprimento de sequência de nucleotídeos de 10 a 50 e dois iniciadores de oligonucleotídeos, cada um dos quais tem um comprimento de sequência de nucleotídeos de 10 a 150 sob condições tais que as sondas e iniciadores se anelam a uma sequência alvo e em que cada grupo de iniciador/sonda é preferencial para um sorotipo específico de um organismo, em que os primeiro e segundo grupos de iniciador/sonda são degenerados entre si e em que cada sonda degenerada tem uma porção de sinal que emite sinal que é detectável no mesmo canal e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda não é degenerado com respeito aos outros dois grupos de iniciador/sonda e diferencia-se de um terceiro sorotipo que não é os sorotipos aos quais os grupos de iniciador/sonda degenerados preferencialmente se anelam e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda tem uma porção de sinal que emite sinal em um comprimento de onda que é o mesmo ou diferente do comprimento de onda emitido pela porção de sinal das sondas degeneradas, e em que o alvo dos grupos de iniciadores/sondas degenerados compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 36 a 38; amplificar, se presente, a sequência alvo; e monitorar para detecção da marcação como uma indicação da hibridização do grupo de sonda à sequência alvo, desse modo indicando a presença ou ausência dos sorotipos de HPV.

2. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: a) o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado é SEQ ID NO: 36 e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é configurado para diferenciar-se do sorotipo 51 de HPV e não é degenerado com respeito ao primeiro ou segundo grupo de iniciador/sonda, em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24 a 29; o primeiro grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 39 de HPV e não se diferencia do sorotipo 39 de HPV com respeito ao sorotipo 68 de HPV, em que o primeiro grupo de iniciador/sonda é selecionado de uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, 3 e 5, e o segundo grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 68 de HPV e não se diferencia do sorotipo 68 de HPV com respeito ao sorotipo 39 de HPV, em que o segundo grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4 e 6; ou b) em que o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado é a SEQ ID NO: 37 e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é configurado para diferenciar-se do sorotipo 59 de HPV e não é degenerado com respeito ao primeiro ou segundo grupo de iniciador/sonda, em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 30 a 35; o primeiro grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 33 de HPV e não se diferencia do sorotipo 33 de HPV com respeito ao sorotipo 58 de HPV, em que o primeiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, e 15; e o segundo grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 58 de HPV e não se diferencia do sorotipo 58 de HPV com respeito ao sorotipo 33 de HPV, em que o segundo grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, e 16; ou c) em que o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado é a SEQ ID NO: 38 e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é configurado para diferenciar-se do sorotipo 59 de HPV e não é degenerado com respeito ao primeiro ou segundo grupo de iniciador/sonda, em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 30 a 35; o primeiro grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 56 de HPV e não se diferencia do sorotipo 66 de HPV com respeito ao sorotipo 56 de HPV, em que o primeiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 19 e 21; e o segundo grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 66 de HPV e não se diferencia do sorotipo 66 de HPV com respeito ao sorotipo 56 de HPV, em que o segundo grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 18, 20, 22 e 23.

3. Grupo de sonda para a detecção de múltiplos sorotipos de papilomavírus humano (HPV) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende três grupos de iniciador/sonda de oligonucleotídeos, cada um dos quais compreendendo uma sonda de oligonucleotídeos que é detectavelmente marcada e tem um comprimento de sequência de nucleotídeos de 10 a 50 e dois iniciadores de oligonucleotídeos, cada um dos quais tendo um comprimento de sequência de nucleotídeos de 10 a 150, em que cada grupo de iniciador/sonda é preferencial para um sorotipo específico do organismo de HPV, em que o primeiro e o segundo dos grupos de iniciador/sonda são degenerados entre si e em que cada sonda degenerada tem uma porção de sinal que emite sinal que é detectável no mesmo canal e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda não é degenerado com respeito ao primeiro e segundo grupos de iniciador/sonda e diferencia-se de um terceiro sorotipo que não é os sorotipos aos quais os grupos de iniciador/sonda degenerados preferencialmente se anelam e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda tem uma porção de sinal que emite sinal em um comprimento de onda que é o mesmo ou diferente do comprimento de onda das sondas no primeiro e segundo grupos de iniciador/sonda, e em que o alvo dos grupos de iniciador/sonda degenerados compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 36 a 38.

4. Grupo de sonda, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que: a) o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado é a SEQ ID NO: 36 e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é configurado para diferenciar-se do sorotipo 51 de HPV e não é degenerado com respeito ao primeiro ou segundo grupo de iniciador/sonda, em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24 a 29; o primeiro grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 39 de HPV e não se diferencia do sorotipo 39 de HPV com respeito ao sorotipo 68 de HPV, em que o primeiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, 3 e 5; e o segundo grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 68 de HPV e não se diferencia do sorotipo de HPV 68 com respeito ao sorotipo 39 de HPV, em que o segundo grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4 e 6; ou b) em que o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado é a SEQ ID NO: 37 e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é configurado para diferenciar-se do sorotipo 59 de HPV e não é degenerado com respeito ao primeiro ou segundo grupo de iniciador/sonda, em que o grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 30 a 35; o primeiro grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 33 de HPV e não se diferencia do sorotipo 33 de HPV com respeito ao sorotipo 58 de HPV, em que o primeiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, e 15; e o segundo grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 58 de HPV e não se diferencia do sorotipo 58 de HPV com respeito ao sorotipo 33 de HPV, em que o segundo grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, e 16; ou c) em que o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado é a SEQ ID NO: 38 e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda é configurado para diferenciar-se do sorotipo 59 de HPV e não é degenerado com respeito ao primeiro ou segundo grupo de iniciador/sonda, em que o grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 30 a 35; o primeiro grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 56 de HPV e não se diferencia do sorotipo 66 de HPV com respeito ao sorotipo 56 de HPV, em que o primeiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 19 e 21; e o segundo grupo de iniciador/sonda seleciona para o sorotipo 66 de HPV e não se diferencia do sorotipo 66 de HPV com respeito ao sorotipo 56 de HPV, em que o segundo grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 18, 20, 22 e 23.

5. Kit para a detecção de múltiplos sorotipos de papilomavírus humano (HPV) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende três grupos de iniciador/sonda de oligonucleotídeos, cada um dos quais compreendendo uma sonda de oligonucleotídeos que é detectavelmente marcada e tem um comprimento de sequência de nucleotídeos de 10 a 50 e dois iniciadores de oligonucleotídeos, cada um dos quais tem um comprimento de sequência de nucleotídeos de 10 a 150, em que cada grupo de iniciador/sonda é preferencial para um sorotipo específico do organismo de HPV, em que o primeiro e o segundo grupos de iniciador/sonda são degenerados entre si e em que cada sonda degenerada tem uma porção de sinal que emite sinal que é detectável no mesmo canal e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda não é degenerado com respeito aos outros dois grupos de iniciador/sonda e diferencia-se de um terceiro sorotipo que não é os sorotipos aos quais os grupos de iniciador/sonda degenerados preferencialmente se anelam e em que o terceiro grupo de iniciador/sonda tem uma porção de sinal que emite sinal em um comprimento de onda que é o mesmo ou diferente do comprimento de onda emitido pelas porções de sinal das sondas no grupo de iniciador/sonda degenerado, e em que o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado para o primeiro e segundo grupo de iniciador/sonda degenerado é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 36 a 38.

6. Kit, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que: a) o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado é a SEQ ID NO: 36 e o primeiro grupo de iniciador/sonda degenerado compreende a SEQ ID NO: 1, 3 e 5 e o segundo grupo de iniciador/sonda degenerado compreende a SEQ ID NO: 2, 4, e 6; ou b) em que o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado é a SEQ ID NO: 37 e o primeiro grupo de iniciador/sonda degenerado compreende a SEQ ID NO: 7, a SEQ ID NO: 15 e qualquer uma de SEQ ID NO: 9, 11 e 13 e o segundo grupo de iniciador/sonda degenerado compreende a SEQ ID NO: 8, a SEQ ID NO: 15 e qualquer uma de SEQ ID NO: 10, 12 e 14; ou c) em que o alvo do grupo de iniciador/sonda degenerado é a SEQ ID NO: 38 e o primeiro grupo de iniciador/sonda degenerado compreende a SEQ ID NO: 17, 19, e 21 e o segundo grupo de iniciador/sonda degenerado compreende a SEQ ID NO: 18, a SEQ ID NO: 20 e qualquer uma de SEQ ID NO: 22 e 23.

7. Kit, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o terceiro grupo de iniciador/sonda é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24 a 26, SEQ ID NO: 27 a 29, SEQ ID NO: 30 a 32 e SEQ ID NO: 33 a 35.

8. Kit, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o terceiro grupo de iniciador/sonda diferencia-se do sorotipo 51 de HPV e é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24 a 26 e SEQ ID NO: 27 a 29.

9. Kit, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o terceiro grupo de iniciador/sonda diferencia-se do sorotipo 59 de HPV e é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 30 a 32 e SEQ ID NO: 33 a 35.

10. Kit, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de sinal da sonda detectora do terceiro grupo de iniciador/sonda emite um comprimento de onda que é o mesmo comprimento de onda emitido pela sonda detectora dos primeiro e segundo grupos de iniciador/sonda.

11. Kit, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de sinal da sonda detectora do terceiro grupo de iniciador/sonda emite um comprimento de onda que é diferente do comprimento de onda emitido pela sonda detectora dos primeiro e segundo grupos de iniciador/sonda.