BRPI0620507A2 - método de detectar patógenos - Google Patents

Abstract

MéTODO DE DETECTAR PATóGENOS. E descrito um método de detecção de genótipos patógenos, especialmente organismos associados com doenças sexualmente transmissíveis, especialmente papiloma virus humano. O método envolve o uso de PCR em tempo real, utilizando sondas especialmente concebidas. Também são descritas as sondas, os kits para a realização do método, para a concepção de iniciadores e de métodos adequados para utilização no método da invenção.

Description

Método de detectar patógenos.

Esta invenção se refere ao diagnóstico específico para organismos associados com doenças sexualmente transmissíveis, e mais particularmente a detecção do genótipo humano papiloma vírus (HPV), especialmente o genótipos do HPV genital.

O Papiloma vírus humano e o seu significado

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), o cancro do colo do útero é a segunda causa mais comum de morte por cancro em mulheres. A presença de infecção pelo HPV tem sido implicada em mais de 99% dos cancros cervicais em todo o mundo. Conforme estimativa, mais de 500.000 mulheres desenvolvem cancro do colo do útero no mundo todo a cada ano, e mais de 273000 dos casos são fatais. Mesmo com programa de rastreio, um número significativo de mulheres morrem de câncer cervical todos os anos.

A Infecção pelo HPV é uma doença sexualmente transmissível mais freqüente (DST) no mundo todo, e até 60% das mulheres sexualmente ativas serão infectadas pelo HPV no trato genital uma vez na vida. Independentemente do estado da infecção pelo HPV, menos de 1 em 10.000 mulheres irá desenvolver cancro invasivo do colo do útero. O fato de a maior parte das mulheres infectadas por HPV não desenvolverem cancro ou anomalias citológicas subestima a importância de fatores modulando a progressão da doença para o cancro cervical-HPV em mulheres infectadas. Esses fatores podem incluir o HPV e genótipo molecular variante, o HPV carga viral, a persistência de infecção pelo HPV, a co-infecção com outros agentes DST, o estado imune do hospedeiro e fatores ambientais tais como o tabagismo.

Os papiloma vírus são Vírus de pequeno DNA que infectam as células epiteliais de mamilos, provocando lesão epitelial proliferativa que podem ser benignos, como por exemplo, fibropapillomas (verrugas), ou que podem ser maligno. Todos os papiloma vírus são semelhantes em genoma pela dimensão, organização, forma de penetração nas células e a leitura de DNA, proteínas e funções compartilhadas. Muitos, mas não todas, as regiões do genoma são conservadas entre as várias papilomiroses.

Devido à estreita associação entre o papiloma vírus do ciclo de vida e do estado de diferenciação da célula hospedeira, os detalhes do ciclo de vida do papiloma vírus não foram completamente elucidados. Sabe-se que o papiloma vírus infecta células basais epiteliais, em que o genoma viral se estabelece e se mantém a um nível tão baixo de atividade (Eclipse), que o número de cópias replicadas estão em coordenação com a célula hospedeira. Como as células infectadas em queratinócitos, o DNA viral é amplificado, os genes são induzidos, e segue a reprodução vegetativa do papiloma vírus. O Papiloma vírus infecta uma grande variedade de animais, incluindo os seres humanos. O papiloma vírus humano (HPV) (incluindo a família Papillomaviridae, Alfa-, Beta-de-Gama, Delta-, Mupapillomavirus e os gêneros não classificados Papillomaviridae ) são causas comuns de doenças sexualmente transmissíveis. Vários tipos de HPV foram identificados pela seqüência dedados do DNA1 HPV e 96 genótipos foram totalmente seqüenciados até à data. Genotipagem de HPV é baseada nas seqüências de ADN a L1, E6, E7 e de genes. Uma diferença de 10% com relação à seqüência previamente conhecida é suficiente para definir um novo tipo de vírus.

A heterogeneidade do grupo HPV é geralmente descrita em deVilliers, 1989, J. 63:4898-4903 Virologia, que está incorporada neste documento por referência. Os genomas de numerosos tipos de HPV foram seqüenciados e / ou caracterizados.

HPVs são vírus com DNA tumorais cujo genoma está organizado em três regiões: o início da seqüência genética (E1 a E7), o ultimo gene (L1 e L2) e as regiões regulamentares superior (URR) ou região de controle longa (LCR). A URR possui caráter vinculativo para muitos locais repressores e ativadores de transcrição, sugerindo que ele pode desempenhar um papel na determinação da gama de hospedeiros específicos para tipos de HPV. E1 e E2, entretanto, codificam proteínas que são vitais para a duplicação de ADN extracromossómico e a conclusão do ciclo de vida viral. O E2 codifica duas proteínas: uma que inibe a transcrição da região anterior, e os outros, o que aumenta a transcrição da região anterior. Uma característica marcante do carcinoma cervical HPV-associados é a perda da expressão da proteína viral E2. Recentemente foi descrito uma nova proteína E2, composto pelo produto da pequena E8 ORF com a parte da proteína E2. Esta proteína capaz de reprimir as duas formas de duplicação viral e transcrição, e é por isso que se supõe ter um papel importante de latência viral.

A proteína E4 aparece em fases posteriores da infecção quando estão sendo montados vírus completos, e não é se reconhecem transformações das propriedades; no entanto, considera-se a desempenhar um papel importante para a maturação e de duplicação do vírus. A proteína O E4 também induz o colapso da rede citoplasmática citoqueratina em queratinócitos humanos, uma situação que poderá ajudar a libertação dos viriões da célula infectada.

A abertura e leitura E5 (ORF), entretanto, é muitas vezes excluído nas células de carcinoma cervical, indicando que poderia não ser essencial na manutenção da transformação maligna da célula hospedeira. Quando presentes, E5 interage com várias proteínas transmembranas como os receptores do fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento derivado de plaquetas-β, e estimulador da colônia. Um estudo utilizando células infectadas HPV 16 foi encontrada a proteína E5 que possui fraca atividade de transformação.

Na carcinogênese, as unidades ORF E6 e E7 são consideradas as mais importantes para o desempenho da codificação. Estas duas unidades codificam oncoproteinas que permitem a duplicação do vírus e da sobrevivência e da transformação da célula que hospeda o DNA do HPV.

A regiões unidades L1 e L2, as mais distantes na unidades, codificam capsides de proteínas virais durante a fase de montagem do virião. As proteínas codificadas por L1 são altamente preservantes entre as diferentes espécies do vírus papiloma. O menor cápside de seqüência de proteínas codificadas por L2 tem mais variações do que a proteína da L1.

O HPV pode infectar as células basais epiteliais da pele ou tecido dos revestimentos interiores, e são, portanto, classificados como tipo cutânea ou mucosa (anogenital).

Normalmente o DNA do HPV é extracromossómico ou episomal, nos casos precursores benignos em lesões cervicais. No entanto, em muitas células de cancro cervical como nas linhas de câncer cervical do colo do útero, e no HPV transformados queratinócitos humanos in vitro, o DNA do HPV esta integrado no genoma hospedeiro.

O câncer em tecidos pode conter tanto DNA episomal como HPV integrado, ao mesmo tempo, mas apesar de integração, parece ocorrer com maior freqüência em HPV-18 associados ao cancro do colo do útero que em HPV-16 associados ao cancro do colo do útero. O HPV 16 Integrado está presente em algumas pré lesões, mas nem sempre está presente em carcinomas. Durante a integração do DNA HPV, o genoma viral normalmente estão na região E1/E2. A ruptura geralmente leva à perda das regiões do E1 e E2. A perda de E2, que codifica proteínas, incluindo uma região que inibe a transcrição da E6 e E7, entretanto, tem-se observado aumento descontrolado com expressão das proteínas oncogências E6 e E7. O aumento expressivo de E6 e E7, entretanto, verificou-se aumento da transformação das células malignas hospedeiras e a decorrente formação tumoral. A integração viral do genoma do HPV genômico de acolhimento está associada com a progressão de estado policlonal para monoclonal em neoplasias intra Cervical (CIN), e esses eventos desempenham um papel fundamental na progressão de neoplasia cervical a partir de baixo grau para de alto grau.

O desequilíbrio entre números padrões de DNA (CNI) são característicos de lesões intra cervical escamosa (SIL)1 papiloma vírus humano (HPV) e estado de reincidência. Enquanto alguns CNIs semelhantes foram observados em freqüências em HG-SIL (alto grau SIL) e LG-SIL (baixo grau SIL), outros, incluindo a 1T 16q e 3q, foram encontrados com freqüência em HG-SIL, mas não em LG - SIL. Houve um número significativamente superior no caso CNIs por HG-SILs mostrando a perda de HPV16 gene E2 e, em seguida HG-SILs. Os dados são coerentes com a seqüencial incremento de CNIs SIL em progressão na cervical. CNI de maior freqüência do gene E2 em associação com a perda confirmada in vitro prova que o HPV é de alto risco e está associado à instabilidade de integração genomica.

Com base na disposição molecular, os dados clínicos e epidemiológicos, um subconjunto de HPVs são inequivocamente os agentes etiológicos de cancro cervical e seus precursores. HPVs foram detectados em cerca de 90% de células escamosas cervical adenocarcinomas e carcinomas. A maioria das infecções por HPV surgem espontaneamente, mas com a persistente infecção com HPV1 foi encontrado DNA em metástases cervicais decorrentes de tumores. Inegavelmente HPV são reconhecidos pelo alto risco (ou oncogênico) por representarem um importante fator de risco de cancro do colo do útero e são cada vez mais reconhecido por seu papel em outros cancros. Praticamente todos os cancros cervicais (99%) contém os genes de HPVs de alto risco, mais comumente tipos 16, 18, 31, e 45. Outros tipos de alto risco incluem tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, e 73. HPVs 31, 33, 35, 51 e 52 são por vezes consideradas como "risco intermediário ", porque eles são mais comuns em displasia leve ou grave lesão do que em carcinomas. Entre as espécies de alto risco, o HPV 16 e 18 são os mais associados com carcinoma cervical. O DNA HPV16 tem sido encontrado em mais de 50% de células escamosas de carcinomas, enquanto o HPV18 DNA tem sido encontrado em mais de 50% dos adenocarcinomas. No entanto, a grande maioria dos HPVs anogenital têm potencial oncogênico.

A integração do HPV com células hospedeiras tem duas conseqüências biológicas principais:

a) Todos os HPVs anogenital induzem baixo grau de lesões escamosas, que são o correlato morfológico de uma infecção produtiva e as expressões fenótipicas de latência pelos E6, E7. Latência é inerente a uma estratégia de papiloma vírus para mobilizar recursos para a duplicação do DNA e produzir novos descendentes. b) Raramente, HPVs induzem um fenótipo epitelial proliferativo reconhecido como uma lesão de grau elevado, e que similaridade citohistologica do precursor do carcinoma cervical invasivo, o que poderia envolver os E6, E7.

Coincidem com doenças clínicas, que estão associadas com infecções por HPV e o potencial campo de aplicações de HPV detecção e tipagem métodos incluem Condilomas acuminados, líquen escleroso, hiperplasia de célula escamosa, neoplasia intra vulvar, células escamoas de carcinoma, neoplasia intra cervical, carcinoma cervical, adenocarcinoma de colo do útero, neoplasia intra anal, penile intra neoplasia, adenocarcinoma da laringe, recorrentes papilomatose respiratória, e epidermodisplasias verruciformes. Dados recentes também sugerem que o HPV pode desempenhar um papel no desenvolvimento do câncer de próstata em homens.

As lesões precursoras do Cancro do colo do útero (lesões intra) ou anomalias citológicas são detectadas usando o exame Papanicolaou, do inventor George Papanicilau, conhecido como a citologia oncológica. A técnica envolve analise do esfregaço raspado cervical em uma lâmina de vidro, coloração de células obtidas a partir do trato ano-genital, da mancha nucelar com hematoxilina. A citologia oncológica, no entanto, tem uma falta de repetibilidade e não é suficientemente preditiva de iminente neoplasia induzida por HPV. Foi demonstrado que em 25% dos doentes com carcinoma avançado de alguns anos, apresentaram esfregaços Papanicolau normal com citologia negativa, antes do diagnóstico positivo em cancro do colo do útero em casos re- exame. Uma vez mais prevalente problema é a ocorrência de cancro invasivo dentro de 3 anos diante de uma citologia negativa oncológica.

A atual taxa de falsos negativos aceitável (ou seja, mulheres que têm displasia de acordo com um resultado de avaliações por patologistas especialistas avaliando biopsias de tecidos em vez de amostras de baciloscopia, mas não diagnosticados dessa forma durante a rotina por esfregaço) é de aproximadamente 5- 10%, mas estudos recentes sugerem que a taxa real pode ser muito superior. Além disso, em cerca de 7-8% dos casos, a citologia oncológica demonstra células escamosas atípicas de significado indeterminado (Ascus). Em um adicional 20-30% dos casos, a citologia oncológica pode ser insuficiente para a interpretação devido à presença de células inflamatórias. No caso do colo do útero, verrugas planas (visualizadas por coloscopia ) são lesões pré-malignas suspeitas. Foi também descrita a progressão Histopatológica das verrugas planas para carcinoma in situ e de cancro do colo do útero.

São comuns a observação de Lesões internas incidentes entre as mulheres no início com infecção pelo HPV, e o intervalo incidente entre HPV-16 ou pela infecção pelo HPV-18 e a confirmação por biópsia CIN grau 2-3 parece ser relativamente curto. No entanto estudos têm demonstrado que a infecção com tipos de HPV de alto risco é geralmente transitórios. Persistência da infecção pelo HPV aumenta substancialmente o risco de progressão para alto grau lesões intra e a doença invasiva.

A progressão da doença é variável e está associada com a perda ou a persistência de HPV. Um número significativo de regiões com displasia regridem espontaneamente, outros não, embora alguns progressos progridam rapidamente.

Como conseqüência do papel preferencial de genótipos de alto risco no cancro do colo do útero, e em virtude da diferente, e conseqüente tipo característico dos padrões para as outras condições patológicas, é extremamente importante tanto a identificação como a tipagem de HPV. Adicionalmente diferentes tipos de HPV de alto risco colocam riscos diferentes para os indivíduos afetados. Por exemplo, HPV16 e HPV18 tem sido mais consistente identificada em graus mais elevados de displasia cervical e carcinoma do que outros tipos de HPV. HPV16 também é mais prevalente em casos de carcinoma escamoso, e HPV18 é mais prevalente nos casos de adenocarcinoma.

Diagnósticos de HPV

A partir de 1980, vários genomas virais, foram clonados e utilizados como sondas de tipo específico no diagnóstico de HPVs. Técnicas de Filtro hibridização têm sido utilizadas para detecção de DNA HPV em raspado cervical, em paralelo com as amostras recolhidas para a rotina citologia. Sondas de DNA HPV têm sido utilizadas em diferentes hibridizações com base em testes e ensaios como Sul e do híbrido Dot / Soutern para detectar DNA HPV em amostras clínicas derivadas de tecido. Adicionalmente com biopsia purificada de DNA hibridizada em tecido preservado, ou seja, com localização direta dentro da célula, sondas demonstraram estar intactas quanto a seqüências complementares dos ácidos nucléicos.

Um método de detecção dos tipos de DNA HPV que utiliza um processo inverso tem sido relatada. O procedimento envolveu a formação de uma membrana que DNA genômico de quatro diferentes tipos de HPV e, em seguida, foi identificados e rotulados os DNA a partir de uma amostra biológica para cada DNA vinculado à membrana.

Inúmeros métodos sido desenvolvidos a todo momento para detectar os tipos específicos de HPV. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido utilizado para amplificar e detectar a presença de HPV16 e HPV18 DNA, em especial, para detectar HPV16 oral e cervical em biópsias. Uma mistura de iniciadores dores foi descrito em específico para a amplificação por PCR de seqüências de HPV tipos 1a, 5, 6, 8, 11, 16, 18, e 33. U. S. Pat. N 0 s 4683195 e 4683202 PCR e para divulgar o uso de PCR para detectar a presença ou ausência de ácidos nucléicos na seqüência de uma amostra.

A U. S. Pat. No. 5447839, que está incorporada neste documento por referência, divulga um método de detecção e tipagem de HPV. Neste método, seqüências de DNA de HPV em uma amostra são amplificados por PCR usando iniciadores que amplificam tanto o consenso oncogênico e não-oncogênico dos tipos de HPV. Assim, a presença de HPV na amostra é indicada pela formação de amplificação dos produtos. HPV é, então, datilografado em tipo específico de sondas de ADN, que originarão híbridos com a região de DNA amplificados. O tipo específico de sondas híbridas divulgada nesta patente são capazes de identificar e distinguir entre os cinco tipos de HPV oncogênico conhecidas, ou seja, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18 e o HPV-33. Uma variedade de métodos de detecção de alto risco tipos de HPV foram concebidas. Muitos destes, dependem da detecção das seqüências únicas no genoma HPV. Por exemplo, sondas de DNA ou RNA complementar a uma porção de genes de uma determinada espécie de HPV de alto risco têm sido relatados na arte, como útil na triagem para detecção da presença de uma determinada estirpe de HPV de alto risco em pacientes amostras (E.U. Pat. N 0 4849332, incorporados neste documento por referência). U. S. Pat. No. 5705627., Incorporados por referência neste documento, os relatórios da utilização de PCR para amplificar e detectar HPV DNA utilizando iniciantes ou mistos, seguido de digitação utilizando uma mistura de genótipo específicos de sondas de DNA. Outros exemplos de utilização de princípios que podem ser encontrado na E.U. Pat. No. 5.364.758, e Kleter, B. et al., Am. J. de Patologia, vol. 153, η 0 6, 1731-39 (1998). Essas referências estão também incorporados neste documento por referência.

Não existe um método comercial disponível, que se baseia na hibridação e amplificação de sinal. (Hibrid Capture Il1 Digene Corp) No entanto, este método tem notória especificidade com problemas devido à alta homologia seqüência de alguma parte do genoma do HPV.

Os métodos baseados na amplificação são constituídos por uma parte responsáveis pela sensibilidade (amplificação), que está separado das partes responsáveis pela especificidade (detecção por hibridação). Estas técnicas diferem na secção ampliada o genoma, o número de iniciantes e as técnicas de detecção. A maior parte das vezes são utilizados métodos de amplificação GP5-GP6 + + (geral primer - GP), MI9-MI11, PGMI, SPF, L1C e ao tipo específico PCR por reações. A maior parte das vezes são utilizadas técnicas de detecção da seqüência específica de hibridação, polimorfismo comprimento fragmento restrição (RFLP) e linha sonda de doseamento (LiPA). Às vezes, mas raramente, sequenciação ou outros métodos são aplicados. A análise das propriedades do amplificações pode variar dentro de uma grande variedade e são caracterizadas pelo número de genótipos, o que pode ser ampliado, a sensibilidade analítica, especificidade da amplificação / detecção dos genótipos e também pelas diferenças entre as sensibilidades dos genótipos. PCR de HPV em tempo real

A carga viral HPV-16 (HPV-16) pode ser um biomarcador preditivo da presença de lesões cervicais de alto grau. Vários testes PCR em tempo real têm sido desenvolvidos para medir com precisão HPV-16 carga viral (HPV-16 L1, HPV-16 E6, e HPV-16 E6 PG). Os métodos pedagógicos executam a detecção em tempo real de HPV, mas apenas detectam um genótipo de cada vez.

A identificação de HPV DNA em pacientes juvenis com reações recorrentes de papilomatose respiratória foi realizado utilizando SIBR ® Verde a PCR em tempo real. O método é utilizado para detectar vários HPV genótipos em uma reação PCR em tempo real., No entanto, a amplificação do método é diferente da descrita na presente invenção. O amplificado já é produzido (aprox. 450 pb), que não é aceite por uma sonda em tempo real, baseado na amplificação método preferido art.O comprimento igual ou inferior a 150 pb. O método de detecção é aspecífico e incapaz de diferenciar os genótipos com confiabilidade, o que exige posterior digitação viral utilizando a PCR em tempo real com o tipo de iniciadores específicos para HPV tipos 6, 11, 16, 18, 31, e 33. Isto detecta novamente os tipos de HPV isolados, mas apenas um genótipo de cada vez.

Do mesmo modo outro método utilizado consiste em um único tubo de reação. Neste foi utilizado para detectar HPV genótipos de uma forma geral. No entanto, detecção de grupos específicos, não foram descritas.

Outro método foi utilizado para a detecção de DNA HPV em parceiros sexuais novamente usando uma abordagem em duas fases a fim de avaliar os dados tanto o genótipo e carga viral. O método utiliza GP5 + / 6 + reação em cadeia da polimerase (PCR), seguido por inverter-line blot análise. Foi utilizado para a detecção de 45 tipos de HPV em amostras cervicais de raspagem de pênis. Cargas virais positivas foram posteriormente determinadas em amostras de raspagem para HPV tipos 16, 18, 31, e 33 por um LightCicIer à base de PCR em tempo real de ensaios. O GP5 + / GP6 + PCR amplificado gera um comprimento de 150 pb, possibilitando o método baseado na aplicação da sonda em tempo real no entanto o método não pode detectar vários genótipos ou grupos em uma reação.

Um método para a homogeneidade em tempo real de detecção e quantificação dos ácidos nucléicos amplificados foi concebido utilizando uma enzima da digestão. Neste sistema de detecção homogêneo é mediado por um primer contendo um repórter e quencher em agrupamento no 5o 'terminal, separadas por uma pequena secção de ADN que codifica uma enzima de restrição de reconhecimento na seqüência. Na forma de ociosos, o sinal do repórter fluorescente é quenched devido a Transferência de Energia Fluorescente por Ressonância (FRET). No entanto, como o primer torna-se incorporado numa dupla ocioso-amplificado, uma enzima de restrição presente no DNA da reação cleaves que liga o repórter a quencher, permitindo irrestrita fluorescência do repórter. Este sistema foi testado usando um primer específico para o gene E6 do papiloma vírus humano (HPV) 16 combinado com o rótulo e transferência cleavable energia utilizada para amplificar HPV16 positivo DNA. O método não pode ser utilizado para a detecção de vários genótipos ou grupos. PCR em tempo real

Um sistema baseado em simultâneo para a quantificação dos tipos de HPV associados com um risco elevado de cancro do colo do útero também tem sido descrita. A PCR em tempo real de ensaio para a detecção e quantificação de HPV16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -52, -58, -67 e foi desenvolvido. O teste é baseado em três amostras paralelas em tempo real a partir de cada paciente PCRs : (i) 1 reação detecta e quantifica HPV16, -31, -18, -45 e (HPV18 e -45 foram detectados e quantificados em conjunto, utilizando uma sonda) com três diferentes fluorescentes, (ii) reação 2 detecta e quantifica HPV33, -35, -39, -52, -58, -67 e (HPV33, -52, -58, -67 e foram detectados e quantificados em conjunto), novamente com três diferentes fluorescentes e apenas três foram utilizadas diferentes sondas, e (iii) reação 3 detecta e quantifica o montante de uma única cópia genética humana (HMBS, Homo sapiens hidroximetilbilane sintase; GenBank não-adesão. M95623.1). Reação 1 inclui um total de sete PCR primers e três sondas, reação 2 inclui um total de sete PCR primers e três sondas, e de reação 3 inclui dois primers PCR e uma única sonda. O método aplica TaqMan hidrolisável PCR em tempo real de sondas. O uso de apenas três sondas em uma reação detecta um máximo de 6 genótipos na mesma reação. O método não pode ser utilizado como um projeto pedagógico para detectar várias reações HPV genótipos, porque a seqüência de identidades entre genótipos são limitadas. A prorrogação da reação é restrita por seqüência usando identidades entre os genótipos.

Um método de detecção e quantificação de papiloma vírus oncogênico humano (HPV) foi desenvolvido anteriormente, utilizando o fluorescente 5 'exonuclease no ensaio. O método baseia-se na amplificação de um fragmento de 180 pb-3 a "parte da leitura da moldura aberta do E1 em um único tipo de PCR com sondas específicas para os tipos de HPV 16, 18, 31, 33, e 35. As sondas podem ser utilizadas separadamente ou em combinações de até três sondas por teste. O método foi limitada a três sondas por teste.

Uma estratégia para a detecção e genotipagem de HPV com SibrGreen e PCR molecular PCR também tem sido descrita. O ensaio, realiza a detecção geral HPV SibrGreen com comunicação de HPV-DNA amplificados, e de genotipagem de sete tipos de HPV prevalente (HPV-6, -11, -16, -18, -31, -33, -45) em tempo real molecular PCR Beacon. Os dois passos do método utilizam três balizas moleculares rotulados de maneira diferente em uma reação da PCR.

Outro método também tem sido descrita: a degenerar HPV auto-verificando fluorescente primer conhecido como Escorpião, uma mistura de Escorpiões foi usada em conjunção com uma linha primer geral. Utilizando uma seleção de primers, foi possível introduzir um consenso que permite que um único site Escorpião de reconhecer diferentes HPV amplificados. Este é um processo em duas fases que podem detectar teoricamente mais de 40 diferentes tipos de HPV. 10 Escorpiões primers foram utilizados neste estudo (HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 56). A seqüência primer de Escorpião é cada tipo específico e localiza-se na mesma seqüência que a da posição GP6 + primer de Jacobs et al. O método ensina um procedimento de detecção geral para detectar a presença de HPV e de um tipo específico método utilizado para detectar o tipo de amostras positivas. Ela não resolve o problema de rastreio com sondas multiplexadas, o que leva a sonda de reatividade cruzada. Na realidade, o método evita usar sondas múltiplas em uma reação.

O PCR HPV baseado em tempo real utilizando os métodos de detecção em tempo-real LightCicIerTM e TaqManTM foram comparados aos convencionais GP5 + / 6 + PCR / ensaio imunoenzimático (EIA) para avaliar a carga de HPV cervical em raspagem de espécimes. Ambos os testes PCR em tempo real, determinou a carga HPV16 em raspagem de espécimes da mesma forma, mas não houve compatibilidade entre os resultados e os ensaios GP5 + / 6 + PCR / EIA, sugerindo que este método não é adequado para quantificar HPV DNA. Também pelo HPV6/11 e HPV16/18 DNA que tenham sido determinadas pelo tempo real fluorogenico e quantitativos PCR detectados os dois tipos de HPV gene, de cada vez.

Métodos de desenho para primers

Iniciadores de sondas são utilizadas para detectar apenas uma molécula de ácidos nucléicos HPV, por exemplo, uma molécula de ácidos nucléicos codifica uma porção de L1, pode ser concebido utilizando, por exemplo, um programa de computador como oligo (Biologia Molecular Insights Inc., Cascade, Colo.) ou Primer3. Adequadas características destes oligonucleotídeos são bem conhecidos por aqueles competente na tecnologia.

Há uma extensa bibliografia sobre os princípios gerais da PCR primer design, que têm conduzido a um certo número de aplicações de software, mais notavelmente Primer3 e várias extensões. Um rápido teste para a formulação da programação dinâmica de iniciadores para par-wise e compatibilidade também foi desenvolvida. A aplicação de PCR multiplex tem vindo a aumentar ao longo da última década, exigindo mais seleções sofisticados de primer. Diferentes algoritmos pode favorecer certos objetivos, ou pode ser concebido especialmente para as plataformas tecnológicas. Em geral, o problema da identificação de bases pares para maximizar a um único nível doses de multiplexagem tem mostrado ser incompletos. Uma aproximação do algoritmo que elimina a 3 'base em complementaridade, abordando simultaneamente o tamanho e constrastando com que tenha sido apresentado.

O método da invenção está relacionada com o problema da concepção multiplex de ensaios PCR, nomeadamente a concepção de consenso de iniciadores. A abordagem geral do problema é a concepção do consenso primers para amplificar inúmeras meta pares com menos do que o número de metas. Além disso, o design, leva em conta as regras de concepção multiplex PCR ensaios, exemplificada por um consenso do herpes vírus Uma particular avanço foi desenvolvido para identificar as distancias entre as seqüências genéticas baseadas no híbrido oligonucleótidos (CODEHOPs). Regiões Curtas com elevado teor de proteínas de conservação pode ser representada como seqüência de blocos alinhados sem espaços. CODEHOPs são obtidas a partir desses blocos seqüência conservada e são usados na PCR para amplificar a região entre elas. Um CODEHOP PCR primer consiste de um pool de cartilhas contendo cada uma seqüência diferente no 3 "degenerar núcleo região onde cada primer fornece uma das possíveis combinações códon, uma codificação orientada 3-4 conservados os aminoácido, motivos de seqüência dentro do bloco. Além disso, cada primer no conjunto tem um idêntico 5 'consenso grampo obtidas a partir da região mais provável dos nucleotídeo em cada posição da codificação dos aminoácidos conservados de acompanhamento do orientado motivo. A amplificação por fusão inicia e a extensão dos iniciadores no conjunto com o maior semelhança, no 3 "degeneram core meta para o modelo. A fusão é estabilizado pela 5" consenso grampo que corresponde parcialmente a meta do modelo. Uma vez que o primer é incorporado, torna-se o modelo para posterior amplificação ciclos. Porque todos os iniciadores são idênticos no 5 "consenso grampo região, todos eles vão Anneal em alta severidade durante rondas subseqüentes de amplificação. Este método foi utilizado no domínio da virologia também. A abordagem é diferente do método da invenção, se for caso específico seqüência blocos são utilizados para a realização eficiente amplificação de seqüências relacionadas. O programa CODEHOPs encontra primers para a amplificação de metas desconhecido, mas trabalha com seqüências de alinhadas em vez de seqüências de DNA.

Existem numerosos métodos de lidar com a concepção de consenso / degenerados, mas eles geralmente usam diferentes algoritmos para resolver basicamente o mesmo problema, para melhor identificar se encaixam os conjuntos primer de forma eficiente para a amplificação de seqüências -alvo relacionadas. A cooperação entre os iniciadores não é levada em conta:

Outra abordagem é o programa PriFi (http://cgi- www.daimi.au.dk/cgi-chili/PriFi/main). Estes desenhos pares de primers é útil para PCR de DNA genômico em espécies onde antes a seqüência da informação não estava disponível. O programa trabalha com um alinhamento de seqüências de DNA a partir de espécies afins fitogeneticamente e uma lista de realizações possivelmente degeneram primers pares cumprimento de uma série de critérios, de tal forma que os primers têm uma elevada probabilidade de amplificação ortologa de seqüências fitogeneticamente em outras espécies afins. No entanto o programa não utiliza o conceito de cooperação entre os iniciadores.

O programa para a concepção de amplificado por PCR primers alinhados grupos de seqüências de DNA é um método semelhante. O mais importante é amplificado para a aplicação da concepção de "grupo-específicos" PCR primer estabelece que amplificar uma região de DNA a partir de um determinado grupo taxonômico, mas não amplificar regiões ortologas de outros grupos taxonômicos. Novamente, a cooperação entre os iniciadores não foi levada em conta.

A concepção de amplificação para detecção da desegmentação por numerosos iniciadores, relacionados com metas de amplificação não tem regras claras na literatura. No entanto, é geralmente aceito que as interações entre os iniciadores são imprevisíveis da concorrência para a ampliação dos recursos inferior a sensibilidade da reação e mais primers significa uma maior probabilidade de mispriming produzindo aspecífico para os produtos concorrentes mais recursos.

O papel potencial dos testes de rasteio de carcinoma cervical HPV é altamente dependente da infra-estrutura existente. Para serem eficazes, as clinicas devem estar bem organizadas, com um bom programa de citologia instalado, com controle de qualidade e com eficácia para os custos. A questão é saber se acrescentam-se testes HPV existentes para o programa e as questões da eficácia dos custos. Em contraste, para configurações em que rastreio é inexistente, ou seja ineficaz por causa da má-qualidade citológica ou inerentes limitações devido a uma elevada quantidade de esfregaços inflamatórios, as mais básicas questões de sensibilidade, especificidade, e a simplicidade dos processos de teste torna-se primordial.

O PCR em tempo real possui tecnologia que oferece funcionalidades que preencham os requisitos e até mesmo ultrapassam ambos os cenários acima descritos. Um estudo recente determinou o montante de HPV DNA para alguns dos mais freqüentes tipos de HPV de alto risco como determinantes da progressão de neoplasias cervicais (SIA). A série de números cópia por célula não difere entre os tipos de HPV, mas a razão de chances para a SIC, no percentil com a mais alta carga viral é substancialmente mais elevado para HPV 16 (OR = 36,9 IC 95% = 8,9- 153,2) do que para HPV 31 ( OR = 3,2; IC 95% = 1,1-9,1) ou HPV 18/45 (OR = 2,6; IC 95% = 1,0-6,4). Por isso, a carga viral dp HPV pode ser preditiva de risco futuro de CEI cervical numa fase em que as lâminas são negativas para anormalidades escamosas. Tecnologias em tempo real oferecem as premissas para determinar a carga viral mais exata do que os métodos de detecção de HPV existentes. A tecnologia em Tempo real oferece várias vantagens sobre os métodos existentes. No entanto, não têm sido desenvolvidos métodos em tempo real de amplificação e detecção que podem detectar mais de três tipos de HPV em uma mesma reação. Além disso, nenhum método foi desenvolvido para detectar clinicamente em uma reação importantes grupos do vírus, por exemplo, de baixo risco ou de alto risco de papiloma vírus humano em grupos.

Uma coleta exata de amostras para auto-teste HPV poderia ter enormes implicações. Este tipo de teste abre a possibilidade de avaliar as mulheres que de outra forma não queiram se submeter a exames pélvicos. Em regiões subdesenvolvidas isso iria oferecer uma vantagem em relação à prática atual. Ocorrem situações onde a dificuldade, em substituição, a auto-amostragem oferecem dificuldades adicionais de abordagem para chegar às mulheres que se recusam a realizar os convencionais testes e sal rastreabilidade, vigilância e controle, após o tratamento do HPV-positivos citologia-negativa nas mulheres, no qual necessários testes freqüentes devem ser realizados em intervalos curtos. A auto-amostragem com abordagem às capacidades do paciente podem melhorar a qualidade e a acessibilidade dos programas de rastreio.

Um teste HPV deverá satisfazer todas estas necessidades, tanto os alvos primários convencionais como o rastreio. A tecnologia PCR em tempo real é especialmente adequada para atender à estas exigências tecnologicamente. A inerente simplicidade da tecnologia ajuda a reduzir os entraves e as infra-estruturas necessárias, de forma igualmente eficaz em termos de custos em relação a outras tecnologias. De outra forma também as tecnologias PCR em tempo real podem contribuir para melhorar a sensibilidade analítica e sobretudo a detecção da especificidade de HPV, fornecendo uma base mais sólida do aperfeiçoamento aos parâmetros clínico- homólogos. O controle interno acrescenta capacidades de controle de qualidade ao sistema.

Para o paciente a aplicação de tecnologias de detecção do HPV em tempo real são as opções mais viáveis. A próxima fronteira no ensino primário e de rastreio em tempo real de tecnologias em casos de outros agentes patogênicos já atraiu grandes atenções nesta área, e poderia na pratica deste, acrescentar valores.

O aumento da sensibilidade da PCR em tempo real, comparativamente a outros métodos, bem como o recurso de melhorias fornecidas por PCR em tempo real, incluindo a amostra por confinamento e em tempo real de detecção do produto amplificado indicam a viabilidade da implementação desta tecnologia para o diagnóstico de rotina humana papiloma vírus infecções no laboratório clínico.

No primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método de detecção da presença de pelo menos um contato com um agente patogênico composto de ácidos nucléicos obtidos a partir de uma amostra com um conjunto composto de pelo menos quatro sondas onde cada uma das sondas dita compreende uma seqüência complementar a uma seqüência de patógeno ladeado por quatro ou cinco pares de bases complementares, onde ditas bases formam uma estrutura caule, na ausência de uma hibridização de ácidos nucléicos a partir de um agente patogênico, onde dita sonda é marcada com um primeiro e um segundo marcador interagindo por hibridação marcada de tal forma que dita sonda de ácidos nucléicos de um agente patogênico provoca uma alteração no sinal detectado.

Tal como aqui utilizadas, "ácidos nucléicos" refere-se à DNA e RNA, nas suas diversas formas, tais como mRNA, e hnRNA. Os ácidos nucléicos pode ser única ou duplamente ociosos.

Tal como aqui utilizadas como um "agente patogênico", é um agente biológico que perturba a fisiologia normal de um animal, ou que provoca a doença e está associada a doença. O patógeno pode ser um agente causai, isto é, infecção de um paciente com o patógeno produz a doença, quer isoladamente, quer na presença de uma outra mais co-fatores.

De preferência o patógeno é um organismo associado a uma doença sexualmente transmissível. Tal como aqui utilizadas, o termo "organismo associado a uma doença sexualmente transmissível" refere-se a um organismo que está presente em doentes que sofrem de doenças sexualmente transmissíveis. Exemplos de organismos associados a uma doença sexualmente transmissível podemos incluir Chlamidia trachomatis, que é associado com a clamídia, Neisseria gonorrhoeae que está associada a gonorreia, herpes simplex virus (HSV), que está associado a herpes genital, pappillomavirus Humanos, que está associado com verrugas genitais e Treponema pallidum que está associada a sífilis. O organismo é um vírus de preferência, mais de preferência um pappillomavirus humano (HPV). O método é preferencialmente usado para detectar a presença de um ou mais genótipos HPV.

Apesar do método apresentar a invenção que diz respeito à detecção de um agente patogênico, este método pode ser usado para detectar a presença ou ausência de qualquer organismo, especialmente os que contêm mais de uma sub-espécies, ou organismos afins. Tal como aqui utilizadas, "organismos afins" remetem para os que estejam a partir da mesma classe, gênero ou espécie, e ter um alto nível de similaridade genética, de preferência, pelo menos, 80% identidade, de preferência mais 90%. Os organismos estão relacionados com preferência a vírus, de preferência mais à papiloma vírus humano.

Cada uma das sondas de preferência tem a seguinte estrutura geral:

3 caule-F-HPV seqüência complementares F'-tronco' - 5 '

F e F 'são opcionais ligando as seqüências que ligar para o acompanhamento complementar das Seqüências base dos pares e suporte. Suporte e suporte' as seqüências complementares a base formada por pares que formam um estrutura da dupla-hélice na solução. Estas seqüências são preferencialmente palindromicas. Não há preferência nas 4 bases em cada extremidade da sonda. As bases que compõem o suporte de preferência composta CG pares, de preferência 1, 2, 3, 4 ou 5 pares CG. O caule tem preferência a seqüência CGCG.

Determinou-se nos nossos experimentos que as quatro base pares-tronco molecular beacons não interagem uns com os outros causando imprevisíveis amplificação falsas ao longo do tempo, na ausência de DNA alvo detectável, o que parece depender da taxa em final da estrutura. Ocasionalmente cinco pares de bases de caule molecular beacons precisam ser utilizados para otimizar a reação. Beacons com caules mais longos, tanto em singleplex e detecção multiplex exercida em incontrolável amplificação oferece falsos sinais. Balizas mais curtas surgiram, normalmente têm temperaturas muito baixas para o derretimento, e tendem a ser úteis na ampliação da reação em tempo real.

O termo "interagindo rótulo", como aqui utilizados refere-se a uma de um par de etiquetas que coopera com o outro do par das etiquetas. Esta cooperação ocorre quando os marcadores estão nas proximidades, tais como quando as sondas tem um tronco loop estrutura. Quando a sonda hibridiza um complemento de ácidos nucléicos, a cooperação entre os rótulos é diminuída, ou completamente removido como a distância entre eles é aumentada. Os rótulos são anexados às sondas em cada extremidade da sonda, de preferência, quer sobre ou adjacente a bases complementares que formam a estrutura tronco loop. Se não é importante que os rótulos são anexados desde que uma mudança de sinal pode ser detectado quando a sonda mudanças conformação de um para o outro ou seja, caule loop para abrir. A mudança de sinal pode ser um aumento no sinal quando a sonda se encontra em posição aberta, ou seja, quando é hibridizada a uma seqüência complementar de ácidos nucléicos, por exemplo, quando um rótulo interagindo quenches o sinal a partir do segundo interagindo com outro rótulo. Em alternativa, a mudança de sinal pode ser uma diminuição no sinal quando a sonda estiver na posição aberta quando é hibridizado a uma seqüência complementar de ácidos nucléicos, por exemplo, quando o primeiro provoca um sinal do rotulo interagindo e ser detectável a partir do segundo sinal.

Na preterida incorporação interagem rótulos FRET doador e uma correspondente FRET aceitante.

FRET tecnologia (ver, por exemplo, E.U. Pat. N°S 4996143, 5565322, 5849489, 6162603) é baseado no fato de que, quando um doador e de uma fração correspondente aceitante fluorescentes são posicionados dentro de uma certa distância uns dos outros, leva energia por transferência destes fluorescentes no lugar entre as duas moléculas que podem ser visualizados ou não detectados e/ou quantificados. Tal como aqui utilizadas, o FRET formato utiliza tecnologia molecular baliza tecnologia para detectar a presença ou ausência de uma HPV. Molecular beacon tecnologia utiliza uma hibridização com uma sonda rotulados doador fluorescente e um agrupamento aceitante fluorescente agrupamento. As etiquetas fluorescentes são normalmente localizadas em cada extremidade da sonda. Molecular beacon tecnologia utiliza uma sonda oligonucleótido ter seqüências que permitam estrutura secundária formação (por exemplo, um hairpin). Como resultado da estrutura secundária é a formação no âmbito da sonda, ambas as moléculas fluorescentes estão em proximidade espacial quando a sonda se encontra em solução. Depois de hibridização para o alvo ácidos nucléicos (ou seja, o genótipo de ácidos nucléicos HPV), a estrutura secundária da sonda é perturbada e as moléculas fluorescentes tornar-se separados uns dos outros tais que, após excitação com luz de um comprimento de onda adequado, a emissão da primeira fluorescente agrupamento é diferente do que detectado, na ausência de uma ácidos nucléicos a partir de um genótipo HPV.

Tal como aqui usados, no que diz respeito ao doador e aceitador correspondente moléculas fluorescentes, "correspondentes" se refere a um agrupamento aceitante fluorescente ter um espectro de emissão que se sobrepõe ao espectro de excitação do agrupamento doador fluorescente. O comprimento de onda máximo do espectro de emissão do aceitante fluorescente, agrupamento de preferência deve ser pelo menos de 100 nm maior que o comprimento de onda máximo do espectro de excitação do agrupamento doador fluorescente. Por conseguinte, transferência não- eficiente da energia radiante pode ser realizado entre eles.

Doador Fluorescente e aceitador das moléculas são geralmente escolhidos para (a) uma elevada eficiência energética Forster de transferência; (b) uma grande mudança final Stokes (> 100 nm); (c) mudança da emissão, tanto quanto possível, a porção em vermelho do espectro visível (> 600 nm) e (d) a mudança de emissão para uma mais elevada do que o comprimento de onda de emissão fluorescente Raman da água produzida por excitação do doador, em excitação por comprimento de onda. Por exemplo, um agrupamento doador fluorescente pode ser que tenha escolhido a sua excitação máxima perto de uma linha laser (por exemplo, Hélio- Cádmio 442 nm ou Argônio 488 nm), um alto coeficiente de extinção, um alto rendimento quântico, e uma boa sobreposição das suas emissão fluorescente com o espectro de excitação do correspondente aceitante agrupamento fluorescente. Um correspondente aceitante fluorescente agrupamento pode ser escolhida que tem um elevado coeficiente de extinção, um alto rendimento quântico, uma boa sobreposição da sua excitação com a emissão do doador fluorescente agrupamento, e a emissão na parte vermelha do espectro visível (> 600 nm).

O Representante doador fluorescente de moléculas que podem ser utilizados com vários aceitantes moléculas fluorescentes em tecnologia FRET incluem fluoresceína, Amarelo Lúcifer, B-ficoeritrina, 9-acridineisotiocianato, Amarelo VS Lúcifer, 4-acetamido-4'-isotio-cianatostilbeno-2, 2'- Acido Dissulfonico, 7-dietil-amino-3- (4'-isotiocianatopfenil)-4-Metilcumarina, succiriimdil 1-pirenobutirato, 4-acetamido-4'- isotiociinatostilbena-2, 2'-disulfoníco ácido derivados, opcionalmente substituídos pirenas, antracenas, naftalenos, Acridinas, estilbenos, índoles, benzindolas, oxazoles, benzoxazoles, Tiazóis, benzotiazoles, 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazoles, cianinas, carbocianinas, carbostirils, porfirinas, salicilatos, antranilatos, azulenos, perilenes, piridinas, quinolinas, cumarínicos, poliazaindacenos, xantenos, oxazinas, benzoxazinas, carbazinas, fenalenonas, benzfenalenonas, carbazinas, oxazinas, 4-bora-3a, 4a-diaza-s- indacenos, fluoroforesceinas, rodaminas, rodols, 5-carboxifluoroflorescentes (FAM ), 5- (2'-aminoetil) aminonaptaleno-1-acidos sulfónicos (EDANS)1 antranilamides, térbio quelatos, reativo Vermelho 4, Texas tintos, ATTO corantes, EVO Tintas, Tintas DIO, Alexa BODIPI corantes e tintas.

O Representante aceitante de moléculas fluorescentes, dependendo do agrupamento doador fluorescente utilizados, incluem-LC.TM. RED 640 (Red LightCicler.TM.-640-N-hidroxisuccinimide éster), LC.TM.-RED 705 (LightCicler.TM.- Vermelha 705-Fosforamidite), tingimentos cianina como CI5 e CI5.5, Lissamine rodamina B sulfonil cloreto de tetrametil rodamina isotiocianato, rodamina x isotiocianato, eritrosine isotiocianato de fluoresceína, dietilenetriamina pentaacetato quelato ou outros íons de lantanídeos (por exemplo, Europium, ou térbio). Dador e aceitador moléculas fluorescentes pode ser obtido, por exemplo, Molecular de sondas (Junction Citi, Oreg.) Ou Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).

Preferencialmente, o aceitante fluorescente é um agrupamento extintor. Tal como aqui utilizadas, um agrupamento extintor quencher é um agrupamento que diminui a fluorescência emitida pelo marcador fluorescente. Isso inclui completa e parcial inibição da emissão da fluorescência. O grau de inibição não é importante, desde que uma mudança de fluorescência pode ser detectado depois de o quencher for removido.

O agrupamento é quenching preferencialmente selecionado a partir do grupo, constituído por opcionalmente substituídos fenís naftils, antracenis, benzotiazois, benzoxazoles, ou benzimidazóis, pirenos, antracenos, naftalenos, acridinas, estilbenos, índoles, benzindoles, oxazoles, benzoxazoles, Tiazóis, benzotiazoles, 4 -- amino-7-nitrobenzo-2-oxa-1 ,3-diazoles, cianinas, carbocianines, carbostirils, porfirinas, salicilatos, antranilates, azulenos, perilenes, piridinas, quinolines, cumarínicos, poliazaindacenes, xantenes, oxazines, benzoxazines, carbazines, fenalenones, benzfenalenones, carbazines, oxazines, 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacenes, fluoroforesceins, rhodamines, rhodols, 5-carboxifluoroforesceinas (FAM), 5 - (2'-aminoetil) aminonaptalene-1-sulfónico ácidos (EDANS)1 Antranilamides, térbio quelatos, Reactive Red 4, dabcils, nitrotirosines, malaquite greens, Texas tintos, dinitrobenzenes, ATTO corantes, EVO Tintas, Tintas DIO, Alexa BODIPI corantes e tintas.

A seleção adequada de pares de FRET doadores e aceitantes ou quenchers está dentro do conhecimento da pessoa qualificada.

Geralmente, quando o FRET é detectado em um montante, que é estatisticamente diferente a partir da quantidade de FRET em uma amostra que não possua o papiloma vírus humano de ácidos nucléicos molécula a presença de uma infecção pelo papiloma vírus humano no indivíduo é indicado. Hibridização da sonda para os ácidos nucléicos aumenta a distância entre o doador e o agrupamento aceitador e, portanto, a interação do FRET é reduzida. A mudança de comprimento de onda de emissão pode ser detectado e um aumento da emissão ou emissões a um comprimento de onda diferentes, tal como quando é utilizado um quencher. Alternativamente pode haver uma diminuição da emissão ou emissões a um comprimento de onda diferente quando um não-quenching doador aceitador é usado.

A analise Fluorescente pode ser efetuada utilizando, por exemplo, através de um sistema microscópico de uma fóton contagem epifluorescente (contendo o espelho dicroico e filtros apropriados para o acompanhamento da emissão fluorescente em particular intervalo), um sistema fóton contador fotomultiplicador, ou um fluorímetro. A Excitação da transferência de energia pode ser efetuada com um íon laser de argônio, uma lâmpada de alta intensidade a mercúrio (Hg), uma fibra óptica e fonte de luz, ou outra fonte de luz alta com intensidade e devidamente filtrada para excitação na faixa desejada.

O doador e aceitador fluorescentes são moléculas de preferência associadas a sonda sobre a ligação entre as seqüências. O doador e aceitador de moléculas fluorescentes pode ser anexado adequando um braço através de uma sonda oligonucleótida. A duração de cada ligação também é importante, como o braço irá afetar a distância entre o doador e o agrupamento fluorescente e o agrupamento aceitante fluorescente. O comprimento de um braço de ligação para os efeitos da presente invenção é a distância em Angstroms (ANG) a partir da base para o agrupamento nucleotídeo fluorescente. Em geral, um braço mede cerca de 10 a cerca de 25 ANG. O braço de ligação pode ser do tipo descrito no WO 84/03285. WO 84/03285 que também divulga os métodos de formas a anexar particularmente bases de nucleotídeos, e também para prender moléculas fluorescentes para um braço.

A sonda deve ter um nível suficiente de identidade com o ácido nucléico do patógeno ou organismo associado a uma doença sexualmente transmissível, para que possa originar híbridos com ácidos nucléicos a partir de um ou mais organismos patogênicos ou associada a uma doença sexualmente transmissível em condições adequadas. Basta um único ocioso ácido nucléico para originar híbridos para o outro fazendo um duplex entre eles. Isso ocorre quando um ácido nucléico contém uma seqüência que é o inverso ou complemento da outra (o mesmo arranjo dá lugar à interação natural entre o lógico e não-logico vertentes de DNA no genoma e está subjacente a configuração da dupla hélice). Para completar as regiões de hibridação, é exigida para que um duplex se forme, é necessário apenas que o número de bases emparelhadas seja suficiente para manter o duplex no âmbito da hibridação em condições utilizadas. Muitas vezes, é desejável dispor de uma ou mais desajustes entre a seqüência da sonda, e que do genoma do patógeno. Isto é necessário para evitar a formação de estruturas secundárias indesejadas no âmbito da sonda. Assim, em uma única seqüência proferiu a encarnação do agente patogênico dentro da sonda que contém pelo menos um desencontro com a seqüência do genoma do patógeno.

As condições de hibridação na tecnologia devem ser bem conhecidos da pessoa competente. Por exemplo SSC/0.1 χ 0,2% SDS a 42 ° C. (para condições de severidade moderada); e 0,1 χ CCD a 68 ° C. (para condições de alta severidade). Lavagens, podes ser realizadas utilizando apenas uma das condições oferecidas, ou cada uma das condições pode ser utilizada (por exemplo, lavagem de 10- 15 minutos cada um, na ordem listada acima). Qualquer ou todos os tipos de lavagens pode ser repetido. Condições ótimas irão variar e pode ser determinada empiricamente pela pessoa qualificada.

O grau de identidade entre a sonda e do agente patogênico da ácidos nucléicos irá variar dependendo da função da sonda. Por exemplo, a sonda pode ser usado para identificar a presença de todos as sub-espécies do agente patogênico, por exemplo, todos os genótipos HPV, caso em que a sonda terá uma seqüência que originarão híbridos a partir de uma seqüência de uma região que é o ácido nucléico altamente conservadas entre todas as sub-espécies, tais como HPV genótipos.

A sonda pode ser usada para detectar a presença de agentes patogênicos, por exemplo, HPV genótipos, a partir de um certo risco grupo, e.g. alto risco ou de baixo risco ou de outros genótipos. A seqüência da sonda será concebida em conformidade. Por exemplo, uma sonda pode ser projetada para detectar genótipos de alto risco que pode vincular a tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, e 73, mas não ácidos nucléicos de outros genótipos. Estas são referidas como "risco grupo sondas".

Alternativamente cada sonda pode ter uma seqüência que tem um elevado grau de semelhança com uma variável de uma região específica um genótipo, de modo que ela só realize hibridação a partir de ácidos nucléicos daquele genótipo. Tais sondas são chamados de "genótipo específico". Os membros do papiloma vírus humano do tipo específico de sondas podem originar híbridos no âmbito definido em genótipo-regiões específicas, de preferência aqueles que inclua SEQ ID. NOS: 53 a 103 sobre o DNA. O genótipo HPV específicos de preferência sondas compreende uma seqüência de selecionados SEQ ID. NOS: 33 a 52 ou SEQ ID. N 0 s 105 a 117. Estas seqüências forma parcial ou total da seqüência única para o patógeno.

O conjunto de sondas inclui pelo menos quatro sondas, de preferência 5, 10, 15 ou 20 diferentes sondas. As sondas são cuidadosamente concebidas de modo a que a seqüência contida com o conjunto da estrutura, não só hibridar com o desejado na seqüência de ácidos nucléicos de ser detectada, mas para que eles não o façam com estruturas secundárias nas seqüências de Ioops outras sondas. Assim, as seqüências para o loop parte da sondas não são geralmente apenas uma seqüência que seja 100% complementares à seqüência do genoma de ser detectado. Preferencialmente, o papiloma vírus humano tipo específico de sondas poderão originar híbridos-tipo definida dentro de regiões específicas, de preferência aqueles que inclua SEQ ID. NOS: 53 a 103 ou SEQ ID. N º s 105 a 117. Em cada uma encarnação preferidas sondas compreendem uma seqüência de selecionados SEQ ID. NOS: 33 a 52 ou SEQ ID. N0S 105 a 117. Em particular preferência em uma incorporação do conjunto de sondas compreende:

5'TET-CGGCGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAGCCG-Dabcil-3' 5'TET-CGGCGGGACATCCATATTACTCTATCAAAGCCG-Dabcil-3' 5'TET-CGCGGGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAACGCG-Dabcil-3' 5TET-CCGGCACCCATATTTCCCCCTTAAACCGG-Dabcil-3' 5'TET-CCGGACGACCAGCAAACAAGACACCCGG-Dabcil-3' 5'FAM-CGGCCAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGCCG-Dabcil-3' 5'FAM-CCGGTATCCTGCTTATTGCCACCCCGG-Dabcil-3' 5'FAM-CGGCCATACCTAAATCTGACAATCCGCCG-Dabcil-3' 5'FAM-GCCGTTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTTCGGC-Dabcil-3' 5'FAM-CGGCAAAACAAGATTCTAATAAAATAGCAGCCG-Dabcil-3' 5'FAM-CGGCTTAAAGTGGGTATGAATGGTTGGCCG-Dabcil-3' 5'FAM-CCGGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCCGG-Dabcil-3' 5'FAM-CGGCAGCACGCGTTGAGGTTTTAGCCG-Dabcil-3' 5'FAM-CCGGAGTTTTAGTTCCCAAGGTGTCCCGG-Dabcil-3' 5'FAM-CCCGCTGTGACTAAGGACAATACCAAACGGG-Dabcil-3' 5'FAM-CGGCTTCCATCAAAAGTCCCAATAACGCCG-Dabcil-3' 5'FAM-CGGCAAAGGTGGTAATGGTAGACAGGGCCG-Dabcil-3' 5'FAM-CGGCAATCTGGTACCAAAACAAACATCGCCG-Dabcil-3' 5'FAM-CGGCTTAAGGTTCCTATGTCTGGGGGCCG-Dabcil-3' and 5'(Texas Red)-TTTTTT-(fluorescein)-CGGCTGACATAGATCCCCATAGACAGTTGCCG- Dabcil-3'

A presença de agentes patogênicos de um grupo particular de risco podem ser detectados de duas maneiras. Em primeiro lugar sondas "grupo de risco" podem ser utilizadas. De preferência o conjunto de sondas contém mais de um tipo de risco sonda grupo, onde cada modelo diferencialmente é rotulado. Por exemplo, um grupo de alto risco sonda pode ser distinguido de uma sonda de baixo risco. Por isso, a presença de um agente patogênico, como o HPV, tanto grupo de risco podem ser detectados. Alternativamente, o conjunto de sondas podem compreender sondas de genótipo específico, onde todas as sondas para a genótipos a partir de um certo risco grupo, por exemplo, genótipos de alto risco são todos rotulados com o mesmo rótulos interagindo. Assim, a identidade do genótipos específicas presentes não pode ser determinado, mas a presença de um genótipo de um determinado grupo pode ser confirmada.

Em uma incorporação o método preferido inclui ainda a determinação da temperatura de fusão da dupla ociosos ácidos nucléicos formado por uma molécula de sondas e ditos complementares obtidos a partir de ácidos nucléicos de dita amostra. Como cada uma das sondas tem uma certa seqüência de ácidos nucléicos, a temperatura de fusão da dupla ociosa da molécula de ácidos nucléicos formada pela união e as sondas complementares obtidas a partir de ácidos nucléicos de dita amostra é único para cada sonda. Assim, o agente patogênico específico ou genótipo presentes podem ser detectados. Por exemplo, um conjunto de sondas genótipo específicas para um determinado grupo risco pode ser usado para verificar se algum de genótipos desse grupo estão presentes. A fusão temperatura pode então ser determinada a fim de identificar quais são específicas genótipos presentes.

O método de detecção de tipos de HPV pode ser realizada individualmente após o método ter sido realizado para detectar HPV família, gêneros ou grupos, concomitante com o método para detectar HPV.

Se mais de uma sonda é utilizada, preferencialmente eles podem ser distinguidos uns dos outros, ou seja, cada sonda emite um sinal diferente quando houver variação detectável a um determinado comprimento de onda. Assim, duas sondas são utilizadas, emitem cada uma comprimentos de onda, quando ocorre a hibridação a partir de ácidos nucléicos que o patógeno pode ser distinguido de ambas as sondas em solução (ou seja, não hibridisadas para os ácidos nucléicos a partir do agente patogênico, como o genótipo HPV) e a outra sonda quando é hibridizada para os ácidos nucléicos a partir do patógeno. Isso permite a presença das duas sondas hibridisadas para os ácidos nucléicos a ser visualizados ao mesmo tempo. Alternativamente as duas sondas estão marcadas como interagir com diferentes rótulos, por exemplo FRET doadores, que estão emitindo diferentes comprimentos de onda. Isto pode ser conseguido através da utilização de diferentes combinações de rótulos interagindo, tais como FRET doadores e aceitantes. A seleção das combinações adequadas de interagir rótulos é rotina para a pessoa competente e conhecedora da tecnologia.

O método preferencialmente detecta a presença de agentes patogênicos com quatro ou mais genótipos, utilizando quatro sondas ou mais. De preferência a sondas estão vinculados a uma fase sólida de tal ordem que cada tipo de sonda está em um local geograficamente definida a partir da qual se distingue sonda outros locais. Isto permite sondas marcadas com os mesmos ou semelhantes rótulos interagindo que produzem um sinal no mesmo ou similar comprimento de onda a ser utilizado, enquanto continua a fornecer um meio para distinguir o sinal produzido por cada sonda. Alternativamente, o sondas podem ser rotulados de modo a que os sinais sejam diferentes produzidos por cada tipo de sonda. A pessoa qualificada irá entender que um leque de possíveis apoios sólidos estão em uso comum na área de arranjos e de qualquer um destes "substratos" pode ser utilizado na produção de matrizes de sondas para comprovar a presente invenção.

Em uma preterida incorporação existe um método para a construção de uma reação para a detecção de segmentação, relacionados com metas de detecção, com pelo menos quatro sondas balizas molecular em tempo real. O método inclui a seleção de lugares vinculativos para a sonda, a determinação da seqüência de sondas que satisfazem os critérios normalmente aplicados em sondas (por exemplo, o controle da sonda conforme um programa de computador em total complementaridade como Primer3) e adicionando bases, de preferência quatro ou cinco bases, para a seqüência da sonda, em ambas as extremidades, tornando-se a complementar e capazes de formar duplos ociosos suportes envolvendo exatamente as duas extremidades do mesmo oligonucleotideos. Essas estruturas são geralmente chamadas balizas quatro-tronco molecular. Adicionalmente o ponto de fusão da sonda seqüência deverá ser mais elevado do que o ponto de fusão do caule estrutura, quando medido no próximo equilíbrio taxas de aquecimento e refrigeração. Os quatro bases-caule de balizas moleculares geralmente são mais vantajosas que outra haste de mais curta duração tendo em taxas de descolagem mais longo do que os caules, e de ter maior temperatura de fusão, mais curto do que o caule das balizas moleculares.

Geralmente, as misturas dos membros da sonda originarão híbridos e a amplificação do produto dentro de um certo tipo definido específico de cada região. As sondas são normalmente rotuladas com um agrupamento doador fluorescente em uma final e em outra final, eles normalmente são rotulados com um correspondente aceitante quencher fluorescentes ou fração. Em algumas incorporações a fração do doador fluorescente pode conter um complexo de corantes fluorescentes específicos, incluindo o chamado coletor corante, a mudança do comprimento de onda da emissão da sonda para fornecer um único sinal de detecção fluorescente. O método inclui ainda detectar da presença, a ausência ou mudança de ressonância fluorescente energia transferência (traste) entre o doador e o agrupamento fluorescente aceitante quencher fluorescentes ou fração. A presença de ou alteração de FRET é indicativo da presença de HPV na amostra biológica, enquanto que a ausência de traste é revelador da falta de HPV na amostra biológica.

Geralmente, os ácidos nucléicos são hibridizados com a sonda e variam em comprimentos de onda absorvidos pelo agrupamento doador fluorescente. A presença ou ausência de vinculados à sonda é detectada por visualização e / ou medição do comprimento de onda emitido pelo aceitante aceitante fluorescentes ou fração. Em alternativa, pode ser detectado por quantificação do FRET.

Em uma incorporação preferiu-se a que de ácidos nucléicos obtidos a partir de uma amostra é amplificada antes de ser contactada a dizer conjunto de sondas. De preferência a amplificação é realizada utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR). A reação pode ser amplificação PCR (ver, por exemplo E.U. Patentes n. 0 s 4683195 e 4683202, e Innis et al, editores, PCR protocolos, (Academic Press, New lork, 1989; Sambrook et al, Clonagem Molecular, Second Edition, (Cold Spring Harbour Laboratori, New lork, 1989)). PCR irá também pode ser usado quando RNA foi isolado e convertido, de preferência por transcrição reversa, de cDNA. Preferencialmente, o PCR é realizada utilizando Taq DNA polimerase, por exemplo, AmpIiTaq ™ (Perkin-Elmer, Norwalk, Ligar). Taq polimerase também pode ser obtido a partir de MBI Fermentas, Perkin Elmer, Boehringer Mannheim e Beckman Instruments. Um equivalente, de preferência termoestável, DNA polimerase também pode ser utilizado no método de apresentar a invenção, como TfL (Termus flavus) polimerase (Gut et al, Virol. Métodos 77

(1): 37-46 (1999)).

Alternativamente, a amplificação reação pode ser RT-PCR (lajima et al, Clin. Chem, 44 (12): 2441-2445 (1998); Martell et al, J. Clin. Microbiol., 37

(2): 327-332 (1999); Gut et al, Virol. Métodos 77 (1): 37-46 (1999); Predhomme et al, Leucemia, 13 (6): 957-964 (1999)), na qual RNA é transcrita para inverter cDNA que é então submetido a PCR.

Como é sabido, PCR envolve a extração e a desnaturação (de preferência pelo calor) de uma amostra de DNA (ou RNA). Um molar de oligonucleótidos é acrescentado, juntamente com uma polimerase, que pode ser de calor estável, e dNTPs para formar a seqüência amplificada. Os oligonucleótidos são concebidos para hibridar a extremos opostos da seqüência desejada para a amplificação. Na primeira ronda de amplificação, as réplicas da DNA polimerase para produzir dois "produtos longos", que começam com as respectivas iniciadores. O total de DNA1 o que inclui os dois produtos longos original e as duas vertentes, então é desnaturado e uma segunda rodada de polimerização é realizado (por exemplo, através da diminuição da temperatura). O resultado da segunda volta é o original duas vertentes, os dois produtos longos a partir da primeira rodada, dois novos produtos longos (produzido a partir do original vertentes), e duas "curto produtos" produzidos a partir dos produtos longos. Estes pequenos produtos têm a seqüência da seqüência alvo (ou senso antisense) com um primer em cada extremidade. Para cada rodada amplificação adicional, o número de curto produtos cresce exponencialmente, cada rodada produzindo dois novos produtos e uma longa série de curtas produtos iguais à soma dos produtos longos e curtos remanescentes no fim da rodada anterior. Oligonucleótidos podem ser sintetizados por uma série de abordagens, por exemplo, Ozaki et al, Nuc. Acids Res. 20: 5205-5214 (1992); Agrawal et al, Nuc. Acids Res. 18: 5419-5423 (1990) ou similares. Convenientemente, o oligonucleótido sondas são sintetizadas em um sintetizador automático de DNA, por exemplo, Aplicado um biossistemas, Inc1 Foster Citi, Califórnia, modelo 392 ou 394 DNA / RNA sintetizador usando o padrão bioquímicas como fosforamidite química (Beaucage e lier, tetraedro 48: 2223-2311 (1992), E.U. Patente n. 0 s 4980460, 4725677, 4415732, 4458066 e 4973679). Alternativa bioquímicas, incluindo os não-naturais, como a espinha dorsal grupos fosforotioate e fosforamidate, também podem ser empregadas, desde que a hibridização eficiências resultantes da oligonucleotídeos não sejam prejudicados. O comprimento e precisa seqüência do DNA primers dependerá da meta polinucleotídicas de ser ampliado. Preferencialmente, o comprimento do DNA primers está na faixa de 10 a 60 nucleotídeos e mais de preferência na faixa de 15 a 30 ou 25 nucleotídeos.

De preferência, a produção dos ácidos nucléicos amplificado deve ser monitorada permanentemente. Tal como aqui usados "monitorado continuamente" significa que a quantidade de produto amplificado é medida em uma base regular. Por exemplo, uma leitura pode ser tomada após o primeiro ciclo de amplificação, e, posteriormente, após cada um, dois, cinco ou ciclos. Em alternativa à medição da quantidade de produto amplificado presentes podem ser tomadas após um certo período de tempo, por exemplo, cada um, dois, cinco ou dez segundos. Isto permite que o processo deve ser monitorizada em "tempo real". A pessoa competente na tecnologia ia entender que o nível do sinal produzido pelo vinculados sondas venha a flutuar como os ciclos de passar através das diversas fases de anelmento, amplificação, e desnaturação.

para a prática dos métodos da invenção podem ser utilizados métodos convencionais PCR, em conjugação com a tecnologia FRET. Em uma incorporação é utilizado, um instrumento termociclador denominado LIGHTCICLERTM. Uma descrição detalhada do Sistema LIGHTCICLERTM é um monitoramento em tempo real on-line de PCR que pode ser encontrada no site da Roche. Os seguintes patentes descrevem a PCR em tempo real como utilizado nos LIGHTCICLER.TM. tecnologia: WO 97/46707, WO 97/46714 e WO 97/46712. O LIGHTCICLERTM é um instrumento de ciclagem térmica rápida combinada com um fluorimetro de micro volume utilizando alta qualidade óptica. Esta técnica de termociclagem utiliza cubas de vidro de paredes finas como elementos aonde acontece a ação. O Aquecimento e resfriamento da câmara de reação são controladas pela alternância de ar aquecido e ar ambiente. Devido à baixa massa de ar e do elevado diferencial de massa de ar de superfície no volume da cuba, ocorre transferência de temperatura para dentro da câmara térmica. O instrumento permite que a PCR seja acompanhado em tempo real. Além disso, as cuba servindo de elemento óptico para a coleta da luz (similar ao vidro fibra óptica), concentrando o feixe na ponta da cuba. O efeito é eficiente e a variação da iluminação fluorescente torna a amostra monitorável. O suporte que abriga a Cuba pode ser removido do instrumento. Por conseguinte, as amostras podem ser carregados fora do instrumento (PCR em uma sala limpa, por exemplo). Além disso, esse recurso permite o coletor de amostra e o suporte podem ser facilmente limpos e esterilizados. O fluorimetro, possui uma parte do aparelho que é a fonte de luz. A luz emitida é filtrada e orientada por uma lente de epi- iluminação direcionada para o centro da cuba. A luz Fluorescente emitida a partir da amostra é então focada pela mesma lente, passaram por um espelho dicroico, é novamente e devidamente filtrada, e centrada no sensor ótico que recolhe os dados fotohibridos. A unidade óptica no instrumento de preferência inclui três faixas de filtros (530 nm, 640 nm e 710 nm), deve distinguir seis cores e detectar variações opções de fluorescências. A presente invenção, no entanto, não é limitada pela configuração de um instrumento disponível comercialmente. A opção de coleta de dados incluem monitorarização por fase de ciclos, coleta continua de amostras para a identificação de curva para analises, amostragem contínua (em que a freqüência de amostragem é dependente da amostra) e / ou subdividida para medição de todas as amostras após o intervalo definido temperatura. O termociclador é operado de preferência utilizando uma estação PC de trabalho e pode utilizar um sistema operacional Windows NT. As amostras são obtidas por capilares em sispostos em posições seqüenciais ao longo do bloco ótico da máquina. O software pode exibir os índices de fluorescência, em tempo real imediatamente após cada medição. O tempo de resposta é de 10-100 mseg. Após cada etapa do ciclo, uma amostragem quantitativa de fluorescência vs o numero de ciclo pode ser atualizado continuamente para todas as amostras. Os dados gerados podem ser armazenados para posterior análise.

A preterida incorporação é a amplificação de ácidos nucléicos utilizando pelo menos um primer selecionado a partir de Seq Id η 0 s 1 a 32, mais de preferência utilizando uma mistura de primer Seq Id η 0 s 1 a 32.

A preterida incorporação utiliza um método artificial ou natural de controle interno de DNA, de preferência por detectar sinais ou FRET a uma emissão diferente, distinguíveis de comprimento de onda ou independentemente da emissão de comprimento de onda utilizados na detecção de mudanças de sondas em um local geograficamente distinguível em fase sólidas.

Os métodos descritos acima pode ainda incluir amplificação de ácidos nucléicos contaminante de reações anteriores de amplificação. Prevenir tais amplificações indesejáveis podem incluir um primeiro passo de tratar a amostra biológica com uracilo-DNA glicosilase antes de amplificação. Além disso, o ciclo pode ser realizado em uma amostra de controle distintos, para confirmar a boa condição de amplificação. Uma amostra de controle pode incluir uma molécula de ácidos nucléicos do papiloma vírus humano. Alternativamente, essa amostra de controle pode ser amplificada usando um par de iniciadores e de controle hibridizados usando um par de sondas controle. Um produto de controle amplificação é produzido quando o controle modelo está presente na amostra, bem como as sondas controles originarão híbridos para o controle de amplificação.

Os métodos para apresentar a invenção são realizadas em ácidos nucléicos obtidos a partir de uma amostra biológica. Representantes amostras biológicas incluem raspagem cervical, biópsias, tecido seções difamatória ou em parafina, raspado de outros locais anatômicos onde ocorreu a infecção pelo papiloma vírus humano e também de urina. De preferência a amostra é selecionada a partir de amostras citológicas de tecidos esfregaços, ou biopsia de brônquicos, urina, massa da próstata, ejaculação, sangue cervical, vulvar, anal, genital, pele ou laringe.

Em um segundo aspecto a presente invenção fornece um conjunto de pelo menos quatro sondas compreendendo em cada uma das sondas uma seqüência complementar a uma seqüência de um agente patogênico ladeado por quatro pares de bases complementares, onde ditas bases formam um arvore, na falta de estrutura hibridização de ácidos nucléicos para um a partir de um agente patogênico, onde dita sonda é marcado com um primeiro e um segundo marcador interagindo por hibridização de tal forma que dita sonda de ácidos nucléicos de dito patógeno provoca uma alteração no sinal detectado.

A preterida incorporação de sondas aplicáveis do primeiro aspecto e ao segundo aspecto.

Como descrito acima, as seqüências que formam o "laço" parte da sonda são selecionados para que eles não só originarão híbridos com a seqüência desejada no organismo-alvo, mas também para que eles não façam com as estruturas secundárias regiões Ioop de outras sondas. Assim, no terceiro aspecto a presente invenção proporciona uma seqüência de ácidos nucléicos que inclua qualquer uma das SEQ ID N°s 33 a 52 ou SEQ ID N°s 105-117. Estas seqüências de ácidos nucléicos podem ser utilizados em outros métodos para detectar a presença de um ou mais genótipos HPV. Assim, a presente invenção prevê também a utilização de alguns ácidos nucléicos da invenção para a detecção da presença ou ausência de pelo menos um genótipo HPV. De preferência utilizar os ácidos nucléicos usados em um método que acompanha continuamente a amplificação dos ácidos nucléicos obtidos a partir de uma amostra.

Tais métodos incluem a tecnologia TAQMANTM, ou o uso das seqüências, como parte de um escorpião molecular, e de outros métodos baseados na PCR.

A tecnologia TAQMANTM detecta a presença ou ausência de um produto de amplificação e, consequentemente, a presença ou ausência de HPV. TAQMANTM utiliza uma tecnologia única de sondas rotuladas ociosas hibridizadas com duas moléculas fluorescentes. Quando uma primeira fração fluorescente é excitada com luz de um adequado comprimento de onda, a energia absorvida é transferida para uma segunda fração fluorescente de acordo com os princípios de FRET. O segundo agrupamento fluorescente é geralmente uma molécula quencher. Durante a etapa de ligação a reação de PCR, a hibridização da sonda rotulada liga-se ao DNA alvo e é degradada pela 5 'para 3' exonuclease atividade da Taq Polimerase durante a fase posterior alongamento. Como resultado, o agrupamento excitado fluorescentes e a segunda fração fluorescentes tornou-os espacialmente diferentes um do outro. Como conseqüência, a excitação da primeira fração fluorescente, na ausência do segundo fluorescentes, a fluorescência de emissão a partir da primeira fração é detectável pela alteração fluorescente. Por exemplo, se a segunda fração é um quencher fluorescente, a emissão de fluorescência a partir do primeiro agrupamento fluorescente aumenta e, portanto, pode ser detectado. A título de exemplo, um ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Sistem (Applied biossistemas, Foster Citi, Califórnia) utiliza tecnologia TAQMANTM, e é adequada para o desempenho de métodos de detecção de HPV. Informações sobre PCR e detecção utilizando um sistema ABI PRISMTM 7700 podem ser encontradas em sites de biossistemas Aplicada.

Em sexto aspecto, a presente invenção fornece um método de identificação de um mínimo conjunto de primers que amplificam seqüências de ácidos nucléicos a partir de dois ou mais organismos relacionados compreendendo:

(a) Identificação de um primeiro local de ligação que tenha, pelo menos, 30% de identidade entre ditos organismos;

(b) Desenhar um conjunto de iniciadores capaz de iniciar a amplificação do primeiro local identificados em (a), onde cada um dos ditos iniciadores não tenha mais de 3 inadequações de uma primária ligação no ultimo dito organismo, e, pelo menos em um site de dizer onde cada um dos ditos primeiros difere de cada um dos ditos primeiros por 4 ou menos nucleótidos;

c) Determinar o menor número de primers necessários para detectar o maior número possível de ditos organismos ;

(d) Determinar a quantia relativa de cada primer exigidos nos ditos conjuntos de primer a fim de garantir a igualdade de amplificação da seqüência dos ácidos nucléicos a partir de todos os organismos ditos.

Tal como aqui utilizadas, "relatados organismos" referem-se a organismos advindos de mesma classe, gênero ou espécie, e ter um alto nível de similaridade genética, de preferência, pelo menos, 80% identidade, de preferência, pelo menos, mais 90% de identidade. Os organismos relatados são preferivelmente vírus, mais preferivelmente papiloma vírus humano. Os iniciadores preferivelmente ampliam a região L1 do papiloma vírus humano.

O percentual de identificação de duas seqüências de ácidos nucléicos é determinado pela seqüência do alinhamento ideal para efeitos comparativos (por exemplo, as lacunas podem ser introduzidas na seqüência da primeira para a melhor alinhamento com a seqüência) e da comparação dos nucleótidos em posições correspondentes. O "melhor alinhamento" é um alinhamento de duas seqüências que resulta na mais alta porcentagem de identidade. A identidade é determinada pelo numero de nucleotídeos idênticos nas seqüências na comparação (ou seja, identidade =% do número de cargos idênticos / número total de posições χ 100).

A determinação da percentagem de identidade entre as duas seqüências pode ser conseguida através de um algoritmo matemático conhecido. Um exemplo de um algoritmo matemático para comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 87:2264 2268, tal como modificado em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 90:5873 5877. O NBLAST e XBLAST programas de Altschul1 et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410 tem incorporado um tal algoritmo. BLAST nucleotídeo pesquisas podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, wordlengt = 12 para obter seqüências de nucleótidos homólogo de moléculas de ácidos nucléicos da invenção. Para obter alinhamentos para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizada como descrito em Altschul et al. (1997) Ácidos Nucléicos Res. 25:3389 3402. Alternativamente, PSI Blast podem ser utilizados para a realização de uma pesquisa que detecta iterada relação de distancias entre moléculas (Id.). Quando se utiliza BLAST, Gapped BLAST1 PSI Blast e programas, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) pode ser usado. Outro exemplo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das seqüências é o algoritmo de Miers e Miller1 CABIOS (1989). ALINHAR o programa (versão 2.0) que faz parte do pacote de software CGC seqüência alinhamento tem incorporado o dito algoritmo. Outros algoritmos para análise de seqüência conhecida no estado da arte incluem antecedência e ADAM, tal como descrito no Torellis e Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10: 3 5; e FASTA descrito em Lipman e Pearson (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444 8. Dentro FASTA, ktup é uma opção que ajusta o controle de sensibilidade e velocidade da pesquisa.

Um conjunto mínimo de primers ou primeiros é um conjunto de seqüências contendo o menor número de primers necessários para amplificar seqüências de ácidos nucléicos com os organismos afins que forem necessários. O conjunto de iniciadores opcionais pode incluir uma correção primer que é utilizado para controlar as diferenças entre os iniciadores em um local especial, primer vinculativo. A correção de primers não deve ter mais de três inadequações ao primer de ligação, local onde são designados para agir. A adição de primers correções ajuda a produzir um nível de sensibilidade na detecção, que é, pelo menos, duas ordens de grandeza ou maior de todos os organismos destinados a ser detectados por exemplo, todos os papiloma vírus humano.

Tal como aqui usados "desencontro" se refere quando se refere a uma base de um primer não forma uma base-par, de acordo com a Watson-Crick emparelhamento base realizado em correspondência com a ligação base. Um desencontro é formado onde duas bases correspondentes não estão em conformidade com os critérios por exemplo, Watson-Crick C-T, G-A. As inadequações são de preferência dentro da metade do primer mais próximo a 5 'efeito, mais de preferência, formando a 3 nucleotídeos antes do 5'final de primer

Cada um dos iniciadores, no conjunto primer só difere da cada um dos outros primers em conjunto, pelos quatro ou menos nucleótidos. Assim, se os iniciadores são ao todo 15 nucleotídeos, ao longo dos 11 nucleótidos em um primer, são idênticos para 11 nucleotídeos em cada um dos outros primers. Os nucleótidos idênticos são preferivelmente não-continuos.

Em uma incorporação na qual se prevê um método para a construção de uma reação extremamente complexa e de múltiplas reações para a amplificação de HPV. O método inclui a seleção de conservação do local de vinculo do primer (menos de 70% variabilidade) em uma adequada proximidade. O local do primer vinculativo deve ser colocado a uma distância uns dos outros para assegurar que o tamanho do amplificado seja adequado. De preferência seja produzido um amplificado com 30-160 de nucleotídeos de comprimento, mais de preferência 40-120, 50-100, 60-90 e 70-80 nucleotídeos de comprimento. Ampliações entre 130 e 160 nucleotídeos de comprimento são particularmente preferidas. Os iniciadores fazem parte de amplificados gerados. Os iniciadores são preferencialmente 10-30 nucleotídeos de comprimento, mais de preferência 12-25, 15-22 ou 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos de comprimento. A seqüência de um conjunto completo de primers iniciadores onde estão satisfazendo os critérios normalmente aplicados para os iniciadores (por exemplo, o controle dos iniciadores contra um programa de computador em total complementaridade como Primer3) é então determinado, e o menor número possível de primers concebidos tenham apenas três inadequações de preferência em uma das extremidades do primer, de preferência o mais 5 'fim, a todos os organismos afins, tais como o HPV tipos, que se destinam a ser ampliado. Adicionalmente os iniciadores deve ligar para um quase igual número de tipos com não mais de três inadequações..Outras diferenças de amplificações são controladas pela troca da concentração relativa à concentração dos iniciadores. A sensibilidade de detecção é resultante de preferência dentro de duas grandezas, pelo menos, para todos os organismos afins, tais como o HPV tipos, que se destinam a ser detectado.

Esta é uma realização significativa sobre as técnicas na arte recente, onde a adição seqüencial dos primers, e os métodos da experimentação e do erro são seguidos. O método planejado mantém a competição em um mínimo. Há umas eficiências aprontando corrigidas de encontro a todos os alvos, tendo por resultado sensibilidades altamente iguais da amplificação. A probabilidade de erro é reduzida adicionalmente mantendo os primers preferivelmente variáveis' a extremidade no 5o finalizante.

A mistura de iniciadores é capaz de complementar uma região pelo menos com um tipo de HPV L1 região, de preferência composto Seq ID N 0 s 53 a 103. Ela inclui, no mínimo, de preferência um primer de transmitir o grupo Seq Id n.0 s 1 a 16 e, pelo menos, uma versão primer a partir do grupo Seq ID η 0 s 17 a 32.

Em um aspecto do sétimo aspecto atual prevê um conjunto de primers obtida pelo método do sexto aspecto incluindo pelo menos um primer selecionados a partir de Seq.lD. N 0 s 1 a 32. De preferência que inclui pelo menos um primer para transmitir o grupo Seq Id n. 0 s 1 a 16 e, pelo menos, um versão primer a partir do grupo Seq ID η 0 s 17 a 32. Mais de preferência que compreenda Seq.lD. N 0 s 1 a 32.

Em um outro aspecto da presente invenção fornece um kit de detecção de um ou mais um ou mais patógenos que compreende uma série de sondas na acepção do segundo aspecto. O kit inclui um conjunto de preferência mais de iniciadores identificados de acordo com o método do sexto aspecto.

Além disso, a invenção fornece um kit para detecção de um ou mais agentes patogênicos compreendendo um conjunto de primers identificados de acordo com o método do sexto aspecto.

De preferência os kits podem ser usados para detectar um ou mais organismos associados com uma doença sexualmente transmissível, de preferência HPV genótipos. De preferência a sondas compreende uma seqüência de selecionados da Seq ID nós. 17 a 33. O conjunto de iniciadores de preferência, pelo menos uma seqüência selecionados a partir de Seq Id n 0 s 1 a 32, mais de preferência, pelo menos, um selecionado de Seq ID η 0 1 para 16 e, pelo menos, um selecionado de Seq Id 17-32. Preferivelmente a mistura de primer compreende a seqüência de primers Id 1-32.

De preferência os kits devem incluir um controle interno.

O kit também pode incluir uma etiqueta ou folheto com instruções para utilizar a mistura de pares de sondas iniciadoras para a detecção da presença ou ausência de HPV em uma amostra biológica.

Os kits podem ainda compreenderem outros componentes, tais como os reagentes necessários para a PCR. Estas incluem reagentes buffers, uma adequada DNA polimerase, dNTPs e como dATP1 dCTP, dGTP e dTTP. O kit dos componentes podem ser apresentados em ampolas ou em outras embalagens. Os reagentes podem ser Iiofilizados para reconstituição mais tarde antes dos usos.

Alternativamente os componentes podem ser fornecidos em soluções tampão adequadas pronto para utilização. Essas soluções devem conter conservantes adequados.

Salvo definição, todas as técnicas e científicas termos aqui usadas têm o mesmo significado que comumente entendida por uma das ordinárias habilidade na arte a que pertence esta invenção. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes às descritas neste documento podem ser usados em testes da prática ou da presente invenção, os métodos e osrnateriais são descritos a seguir. Além disso, os materiais, métodos, e os exemplos são apenas ilustrativos e não destinados a ser uma limitação. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências aqui mencionados são incorporados por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, as presentes especificações, incluindo definições, serão revisadas.

A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos não- limitantes. Outras características, objetos, e os benefícios das invenções serão visíveis a partir de desenhos e descrição pormenorizada, e entre as reivindicações.

Exemplo 1

Detecção de DNA HPV por PCR em tempo real de alto risco e baixo risco

O volume total de reação foi de 20μΙ, incluindo os seguintes componentes: 2 μΙ (~0,2pg) clone HPV DNA solução tampão de polimerase (concentração final: 90 ιτιΜμΗΡν DNA clonados, 18 Tris-HCI (f = 8,0), 1mM DTT1 50 mM KCI, 7 mM de MgCI2, 1% Tween-20 (Sigma), 1% M deμ M cada dNTP (ATP, CTP, GTP, PTT) (Promega), 0,28 μΡίοοΙΙ, 1% PVP, 250 M de cada molecular beacons SEQ. ID^cada Primários: SEQ. ID. NÃO: 1-32, 0,18 NO :33-52, e de 7,5 U AmpIiTaq Gold DNA polimerase (Roche)). A reação foi realizada em LightCicIer 2,0 PCR ciclo termal, com os seguintes parâmetros:

Nível 1:10 minutos a 95 °C;

Nível 2: 5 minutos a 55 °C;

Nível 3 : Ciclos 1-37: 30 segundos a 95 °C, 60 segundos a 42 0C - modo de simples detecção, e 30 segundos a 72 °C;

Genótipos HPV de alto risco foram detectados em genótipos molecular beacons SEQ. ID. NO :38-51. Os dados foram coletados em fluorescente 530nm.

HPV de baixo risco foram detectados em genótipos molecular beacons SEQ. ID. NO :33-37. Os dados foram coletados em fluorescente 560nm. A reação de controle interno foi detectada por molecular baliza SEQ. ID. NÃO: 52. Os dados foram coletados em fluorescente 610nm.

Os seguintes genótipos foram detectados com sucesso: de baixo risco (6, 11, 42, 43, 44/55), de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) e de controle interno.

Exemplo 2

detecção de HPV16, HPV18 e HPV6, HPV11 HPV DNA PCR em tempo real

O volume total de reação foi de 20μl, incluindo os seguintes componentes: 2 μl (~0,2pg) clone HPV DNA solução tampão de polimerase (concentração final: 90 ιτιΜμΗΡν DNA clonados, 18 Tris-HCl (f = 8,0), 10mM DTT, 50 mM KCl, 7 mM de MgCl2, 1% Tween-20 (Sigma), 1% Ficoll, 1% PVP, 250 μΜ cada dNTP (ATP, CTP, GTP1 TTP) (Promega)1 0,28 μΜ de cada um dos primers: SEQ. ID. NO: 1-32, 0,18 μΜ de cada beacons moleculares SEQ. ID. NO:33, 34, 38, 39, 52, e 7,5 U AmpliTaq Gold DNA polimerase (ROCHE)). A reação foi realizada em LightCicIer 2,0 PCR ciclo termal, com os seguintes parâmetros

Nível 1:10 minutos a 95 °C; Nível 2 : 2: 5 minutos a 55 °C; Nível 3 : Ciclos 1-37: 30 segundos a 95 0C, 60 segundos a 42°C - modo de simples detecção, e 30 segundos a 72°C;

Os genótipos HPV16 e HPV18 foram detectadas pelos beacons molecular SEQ. ID. NO :38-39. Os dados foram coletados em fluorescente 530nm.

O HPV6 e HPV11 genótipos foram detectadas pelos beacons molecular SEQ. ID. NO :33-34. Os dados foram coletados em fluorescente 560nm

A reação de controle interno foi detectada por baliza molecular SEQ. ID. NÃO: 52. Os dados foram coletados em fluorescente 610nm.

Os seguintes genótipos foram detectados com sucesso: de baixo risco (6, 11) e de alto risco (16, 18) e de controle interno.

Apêndice 1

Primários Próximos :

SEQ. ID. NO:1 KP-F/1 CGCACCAACATATTTTATT SEQ. ID. NO:2 KP-F/2 CGCACAAGCATCTATTATTA SEQ. ID. NO:3 KP-F/3 CGCACAAGCATATTTTATC SEQ. ID. NO:4 KP-F/4 CGCACCAGTATATTTTATCA SEQ. ID. NO:5 KP-F/5 CGCACAAGCATTTACTATCA SEQ. ID. NO:6 KP-F/6 CGCACCAACTACTTTTACC SEQ. ID. NO:7 KP-F/7 CGTACCAGTATTTTCTACCAC 33/40

SEQ. ID. NO:8 KP-F/8 CGCACAGGCATATATTACT SEQ. ID. NO:9 KP-F/9 CGCACCAACATATATTATCA SEQ. ID. NO: 10 KP-F/10 CGTACCAACCTGTACTATTATG SEQ. ID. NO:11 KP-F/11 GCACCAACTTATTTTACCAT SEQ. ID. NO: 12 KP-F/12 ACCAACCTCTTTTATTATGG SEQ. ID. NO:13 KP-F/13 AGCACAAATATATATTATTATGG SEQ. ID. NO: 14 KP-F/14 CGCACCGGATATATTACT SEQ. ID. NO: 15 KP-F/15 CGCACAAATATTTATTATTATGC SEQ. ID. NO: 16 KP-F/16 CGGACGAATGTTTATTACC

Primers Reversos:

SEQ. ID. NO: 17 L1C2 TACCCTAAATACTCTGTATTG SEQ. ID. NO: 18 L1R2 TACCCTAAATACCCTATATTG SEQ. ID. NO: 19 R1 AATTCTAAAAACTCTGTACTG SEQ. ID. N0:20 R45 TACTCTAAATACTCTGTATTG SEQ. ID. NO:21 R11 TACCTTAAACACTCTATATTG SEQ. ID. NO:22 R16 TATTCTAAATACCCTGTATTG SEQ. ID. NO:23 R42 AACTCTAAATACTCTGTACTG SEQ. ID. NO:24 R44 CATCTTAAAAACCCTATATTG SEQ. ID. NO:25 R03 AACCCTAAACACCCTGTATTG SEQ. ID. NO:26 R04 AACGCGAAAAACCCTATATTG SEQ. ID. NO:27 R05 TACCCTAAAGACCCTATACTG SEQ. ID. NO:28 R06 AACTCTAAATACCCTATACTG SEQ. ID. NO:29 R07 AACGTGAAATACACGATATTG SEQ. ID. NO:30 R08 CACACGGAACACCCTGTACTG SEQ. ID. NO:31 R54 CACCCTAAACACCCTATATTG SEQ. ID. NO:32 R85 AACCCGAAACACTCGATACTG

Seqüências de teste (Probe)

SEQ.ID.NO:33 HPV6B3: GGGTCATCCTTATTTTTCCATAA SEQ.ID.NO:34 HPV11B2: GGGACATCCATATTACTCTATCAAA SEQ.ID.NO:35 HPV42B2: GGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAA SEQ.ID.NO:36 HPV43B2: CACCCATATTTCCCCCTTAAA SEQ.ID.NO:37 HPV44/55B2: ACGACCAGCAAACAAGACAC SEQ.ID.NO:38 HPV16B5: CAATAACAAAATATTAGTTCCTAAA SEQ.ID.NO:39 HPV18B8: TATCCTGCTTATTGCCACC SEQ.ID.NO:40 HPV31B5: CATACCTAAATCTGACAATCC SEQ.ID.NO:41 HPV33B7: TTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTT SEQ.ID.NO:42 HPV35B2: AAAACAAGATTCTAATAAAATAGCA SEQ.ID.NO:43 HPV39B3: TTAAAGTGGGTATGAATGGTTG SEQ.ID.NO:44 HPV45B3: GCTGTTCCTAAGGTATCCG SEQ.ID.NO:45 HPV51B2: AGCACGCGTTGAGGTTTTA SEQ.ID.NO:46 HPV52B2: AGTTTTAGTTCCCAAGGTGTC SEQ.ID.NO:47 HPV56B2: CTGTGACTAAGGACAATACCAAA SEQ.ID.NO:48 HPV58B2: TTCCATCAAAAGTCCCAATAAC SEQ.ID.NO:49 HPV59B2: AAAGGTGGTAATGGTAGACAGG SEQ.ID.NO:50 HPV66B2: AATCTGGTACCAAAACAAACATC SEQ.ID.NO:51 HPV68B2: TTAAGGTTCCTATGTCTGGGG SEQ.ID.NO:52 HPV-ICB2: TGACATAGATCCCCATAGACAGTT SEQ.ID.NO:53

>Hpv2a

cgga ctaatgtgta ttaccatggt ggcagttcta ggcttctcac tgtgggtcat ccatattact ctataaagaa gagtaataat aaggtggctg tgcccaaggt atctgggtac caatatcgtg tatttcacgt g SEQ.ID.NO:54

>HPV3

cgc accaacattt attattatgc aggcagttct cgcttgctga ccgtgggtca tccttatttt gctatcccca aatcttctaa ttccaagatg gatattccta aggtgtccgc ctttcaatat agagtgttta gggtg SEQ.ID.NO:55

>HPV6

cgcacca acatatttta tcatgccagc agttctagac ttcttgcagt gggtcatcct tatttttcca taaaacgggc taacaaaact gttgtgccaa aggtgtcagg atatcaatac agggtattta aggtg

SEQ.ID.NO:56

>HPV11

cgcacc aacatatttt atcatgccag cagttctaga ctccttgctg tgggacatcc atattactct atcaaaaaag ttaacaaaac agttgtacca aaggtgtctg gatatcaata tagagtgttt aaggta SEQ.ID.NO:57

>HPV13

cgtac caacatattt tatcatgcta gcagttctag actacttgca gtgggaaatc cttattttcc tattaagaaa caaaacaaaa ctgttgtccc taaggtatct ggttatcagt ttagggtatt taaagtt SEQ.ID.NO:58

>HPV16

cgcacaa acatatatta tcatgcagga acatccagac tacttgcagt tggacatccc tattttccta ttaaaaaacc taacaataac aaaatattag ttcctaaagt atcaggatta caatacaggg tatttagaat a SEQ.ID.NO:59

>HPV18

c ccacaagcat attttatcat gctggcagct ctagattatt aactgttggt aatccatatt ttagggttcc tgcaggtggt ggcaataagc aggatattcc taaggtttct gcataccaat atagagtatt tagggtg SEQ.ID.NO:60

>HPV26

cgcacc ggcatatatt attatgcggg cagctctcgt ttattaacat taggacatcc atatttttcc atacctaaaa ctggccaaaa ggccgaaatt cctaaggtat ctgcctatca gtacagggta tttagagtg

SEQ.ID.NO:61

>HPV27

cggacgaatg tctattacca tggtggcagt tctaggctcc tcactgtcgg ccacccatat tattctataa agaagggtag caataatagg ttggcagtgc ctaaggtgtc cggctaccaa taccgtgtat ttcacgtt

SEQ.ID.NO:62

>HPV28

cgca ccaatattta ttattatgca ggcacttctc ggttgctgac cgtgggtcat ccttattttc ccattcctaa atcatccact aacaaagcag atgtgcccaa agtgtccgcc tttcagtata gggtattccg ggtg

SEQ.ID.NO:63

>HPV29

c gcacaaatat ttattattat gcaggcagtt ctcgcctgct cactgtgggt catccacatt attcaattcc caaatcctct ggtaataagg tagatgtgcc taaggtgtct gcatttcagt acagggtttt ccgtgtg

SEQ.ID.NO:64

>HPV30

cg caccaatata ttttatcatg caggcagctc acgtttgctt gctgttggac atecatatta ttctatttct aaggctggta attccaaaac agatgttccc aaggtgtctg catttcagta tagggtcttt agggtc

SEQ.ID.NO:65

>HPV31

cg aaccaacata tattatcacg caggcagtgc taggctgctt acagtaggcc atccatatta ttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta ccaaaggtgt caggattaca atatagggta tttagggtt

SEQ.ID.NO:66

>HPV33

cgcacaagca tttattatta tgctggtagt tccagacttc ttgctgttgg ccatccatat ttttctatta aaatcctac taacgctaaa aaattattgg tacccaaagt atcaggcttg caatataggg tttttagggt c

SEQ.ID.NO:67

>HPV34

cg cacaaatata tattattatg caggtagtac acgcttgctg gcagtaggac atccctatta tcctataaag gatactaatg ggaaacgtaa gattgctgta cctaaagttt caggtttgca atacagggta tttagaata

SEQ.ID.NO:68

>HPV35

cgcacaaaca tctactatca tgcaggcagt tctaggctat tagctgtggg tcacccatac tatgctatta aaaaacaaga ttctaataaa atagcagtac ccaaggtatc tggtttgcaa tacagagtat ttagagt

SEQ.ID.NO:69

>HPV39 cgcacaggcat atattattat gctggcagct ctagattatt aacagtagga catccatatt ttaaagtggg tatgaatggt ggtcgcaagc aggacattcc aaaggtgtct gcatatcaat atagggtatt tcgcgtg

SEQ.ID.NO:70

>HPV40

cgcaccag tttatattat catgctggta gtgccaggtt actgactata ggacatccat actttgagtt aaaaaaaccc aatggtgaca tttcagtgcc taaggtttct ggacatcaat acagggtatt tagggta SEQ.ID.NO:71 >HPV42

cgcacca actactttta ccatgccagc agttctaggc tattggttgt tggtcaccct tattactcta ttacaaaaag gccaaataag acatctatcc ccaaagtgtc tggtttacag tacagagtat ttagagtt SEQ.ID.NO:72 >HPV43

cgcaccaact tattttatta tgctggcagt tcacgtttgc ttgcagtggg tcacccatat ttccccctta aaaattcctc tggtaaaata actgtaccta aggtttctgg ttatcaatac agagtattta gagtt SEQ.ID.NO:73 >HPV44

cgc accaacatat attaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtgggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaggttt cgggatttca atatagggtt tttaagatg SEQ.ID.NO:74 >HPV45

cgcaca agcatatttt atcatgcagg cagttcccga ttattaactg taggcaatcc atattttagg gttgtaccta atggtgcagg taataaacag gctgttccta aggtatccgc atatcagtat agggtgttta gagta SEQ.ID.NO:75 >HPV51

cgc accggcatat attactatgc aggcagttcc agactaataa cattaggaca tccctatttt ccaataccta aaacctcaac gcgtgctgct attcctaaag tatctgcatt tcaatacagg gtatttaggg ta SEQ.ID.NO:76 >HPV52

cgcacaagcat ctattattat gcaggcagtt ctcgattact aacagtagga catccctatt tttctattaa aaacaccagt agtggtaatg gtaaaaaagt tttagttccc aaggtgtctg gcctgcaata cagggtattt agaatt SEQ.ID.NO:77 >HPV53

cgcaccact atattttatc atgctggaag ctctcgcttg cttaccgtgg gacatcctta ttaccccatt tctaaatctg gtaaagcaga catccctaag gtgtctgcat ttcagtatag ggtgtttaga gta SEQ.ID.NO:78 >HPV54

cgcaca agcatatact atcatgcaag cagctctaga ttattggctg ttggacatcc atattttaaa gtacaaaaaa ccaataataa gcaaagtatt cctaaagtat caggatatca atatagggtg tttagggtg SEQ.ID.NO:79 >HPV55

cgc accaacatag tttaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtaggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaagttt caggatttca atatagggtt tttaaggtg SEQ.ID.NO:80 >HPV56

cgcacta gtatatttta tcatgcaggc agttcacgat tgcttgccgt aggacatccc tattactctg tgactaagga caataccaaa acaaacattc ccaaagttag tgcatatcaa tatagggtat ttagggta SEQ.ID.NO:81>HPV57

cgg acgaatgttt attatcatgg tgggagctct cggctcctca cagtaggcca tccatattat tctataaaaa aaagtggcaa taataaggtg tctgtgccca aggtatcggg ctaccagtac cgtgtgttcc atgtg SEQ.ID.NO:82 >HPV58

c gcacaagcat ttattattat gctggcagtt ccagactttt ggctgttggc aatccatatt tttccatcaa aagtcccaat aacaataaaa aagtattagt tcccaaggta tcaggcttac agtatagggt ctttagggtg SEQ.ID.NO:83 >HPV59

cgtaccag tattttctac cacgcaggca gttccagact tcttacagtt ggacatccat attttaaagt acctaaaggt ggtaatggta gacaggatgt tcctaaggtg tctgcatatc aatacagagt atttagggtt SEQ.ID.NO:84 >HPV61

cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tcccgtctgc ttactgtagg acatccctat tgtagtttgc agcttgatgg gctgcagggc aagaaaaaca ctatccccaa ggtgtctggc tatcaatata gggtgtttag ggta SEQ.ID.NO:85 >HPV62

cgcacca acctttttta ttatgggggc agctcccgcc ttcttactgt gggacatcca tattgtactt tacaggttgg ccagggtaaa cgggccacca ttcctaaggt gtctgggtat cagtacaggg tgtttcgtgt g

SEQ.ID.NO:86 >HPV66

cgtacca gtatatttta tcatgcaggt agctctaggt tgcttgctgt tggccatcct tattactctg tttccaaatc tggtaccaaa acaaacatcc ctaaagttag tgcatatcag tatagagtgt ttagggta SEQ.ID.NO:87

>HPV67

cgcacaag catttactat tacgctggta gctccagact tttagctgta ggccatcctt acttttccat tcctaatccc tccaacacta aaaaggtgtt agtgcccaag gtgtcaggtt tgcagtatag ggtatttage gtt SEQ.ID.NO:88 >HPV68 cgcactggca tgtattacta tgctggtaca tctaggttat taactgtagg ccatccatat tttaaggttc ctatgtctgg

gggccgcaag cagggcattc ctaaggtgtc tgcatatcaa tacagagtgt ttagggtt

SEQ.ID.NO:89

>HPV69

cgcac cggatatatt actatgcagg cagctctcga ttattaactt tgggtcatcc ctattttcca attcctaaat ctggttcaac agcagaaatt cctaaagtgt ctgcttacca atatagggtt tttcgtgtt SEQ.ID.NO:90 >HPV70

cgta caggcatata ttattatgct ggaagctctc gcttattaac agtagggcat ccttatttta aggtacctgt aaatggtggc cgcaagcagg aaatacctaa ggtgtctgca tatcagtata gggtatttag ggta SEQ.ID.NO:91 >HPV72

cgcacca acctctatta ttatggtggc agttctcgtc tactaactgt aggacatcct tactgtgcca tacctctcaa cggacagggc aaaaaaaaca ccattcctaa ggtttcgggg tatcaataca gggtgtttag agta SEQ.ID.NO:92 >HPV73

agaaca aatatatatt attatgcagg tagcacacgt ttgttggctg tgggacaccc atattttcct atcaaggatt ctcaaaaacg taaaaccata gttcctaaag tttcaggttt gcaatacagg gtgtttaggc tt SEQ.ID.NO:93 >HPV74

cgcacc aacatctttt atcatgctag cagttctaga ctacttgctg taggaaatcc ctatttccct ataaaacagg

ttaacaaaac agttgttcct aaagtgtctg gatatcaatt tagggtgttt aaggtg

SEQ.ID.NO:94

>HPV81

cgcacc aacctttttt attatggggg cagttcccgc cttcttactg tagggcatcc atattgtaca ttaactattg gtacccaagg aaagcgttcc actattccca aggtgtctgg gtatcagtac cgggtgtttc gtgtg SEQ.ID.NO:95 >HPV82

cgc accggcatat attattatgc aggcagttcc agacttatta ccttaggaca tccatatttt tcaataccca aaaccaatac acgtgctgaa atacctaagg tatctgcctt tcagtatagg gtgtttaggg ta SEQ.ID.NO:96 >HPV83

cg caccaacctc ttttattacg gtggcagctc cagacttctt accgtaggac atccatatta tcctgtacag gttaatggtc aaggaaaaaa agccactatc cccaaggttt ctggctacca atatagggtg tttcgcatt SEQ.ID.NO:97 >HPV84

cgcaccaac ttattttatt atggtggtag ttctcgcctg cttactgtgg gacatccata ttattctgtt cctgtgtcta cccctgggca aaacaacaaa aaggccacta tccccaaggt ttctgggtat caatacaggg tgtttagggt c SEQ.ID.NO:98 >HPV85

cgta ccagtacatt ttatcatgct ggcagctcta ggcttctaac cgttggacat ccatactata aagttacctc aaatggaggc cgcaagcaag acattcctaa agtgtctgcc tatcagtatc gagtgtttcg ggtt SEQ.ID.NO:99 >HPV86

cgtaccaac ctattttatt atggtggtag ttcccgcttg cttactgtgg gccatccata ttatcctgtt actgtttcct ccagccctgg acaaaacaac aaaaaggcca atattcccaa ggtttcgggg tatcaataca gggtttttag ggtg SEQ.ID.NO:100 >HPV87

cgcaccaac ttattttatt atggtggcag ttctcgcctg cttactgtgg gtcaccctta ctatccagtt actgttacca cccctggtca gaacaagaaa tccaatattc caaaggtgtc tggctatcag tacagggtgt ttcgggtg SEQ.ID.NO:101 >HPV89

cgtaccaac ctgtactatt atggaggcag ctcccgcctt attacagttg gccaccctta ttatactgta caggtcaatg gtgctaacaa aaaggccaac atacctaagg tatcagggta tcaatacagg gtatttaggg ta SEQ.ID.NO:102 >HPV90

agaacaaacata tattattatg caggcagttc ccgactgtta actgttggcc atccttattt tgctatcaaa aagcaatcag gaaaaaaccc tatagtggtt cccaaggtgt ctggatatca atatagggtg tttagggta SEQ.ID.NO:103 >HPV91

cgcacc aacttatttt accatgctgg cagttcccgt ttactggctg tgggccaccc tttttttcct ataaaaaata attctggtaa agtaattgtt cctaaagttt caggtcacca atatagggtg tttagagtt SEQ.ID.NO:104 HPV-IC

CGGACGAATGTTTATTACCAGATAGATAGAGATAGATACCCAT AT ACAGAT AATGACA TAGATCCCCATAGACAGTTTATACAGATCAGTAGCAGTTTTTATATATGAGATGATGAT AG C AAT AC AG AG TATTT AG G GT A

SEQ.ID.NO:105 HPV11B3/2: AAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTG SEQ.ID.NO:106 HPV42B1: CAAAAAGGCCAAATAAGACA SEQ.ID-N0:107 HPV43B6: CCCCCTTAAAAATTCCTCT SEQ.ID-N0:108 HPV44/55B1 ATACGACCAGCAAACAAGAC SEQ.ID.NO:109 HPV39B4: TATGAATGGTGGTCGCAAG SEQ.ID.NO:110 HPV52B7: AAAACACCAGTAGTGCTAATG SEQ.ID.NO:111 HPV56B3: CCAAAACAAACATTCCCAA SEQ.ID.NO:112 HPV59B3: ATCCATATTTTAAAGTACCTAAAG SEQ.ID.NO:113 HPV66B1: CAAATCTGGTACCAAAACAAA SEQ.ID.NO:114 HPV-ICB4: CCCATAGACAGTTTATACAGATCA SEQ.ID.NO:115 HPV6B6: ATAAAACGGGCTAACAAAA SEQ.ID.NO:116 HPV26B1: TACCTAAAACTGGCCAAAAG SEQ.ID.NO:117 HPV35B4: ATTCTAATAAAATAGCAGTACCCAAG

Claims (68)

1. Método de detecção da presença de pelo menos um contato com um agente patogênico composto de ácidos nucleicos obtidos a partir de uma amostra com um conjunto composto de pelo menos quatro sondas caracterizado pelo fato onde cada uma das ditas sondas compreende uma seqüência complementar a uma seqüência de um agente patogênico ladeado por quatro ou cinco pares de bases complementares, onde ditas bases formam uma estrutura caule, na ausência de uma hibridização de ácidos nucléicos a partir de organismos patogênicos, onde dita sonda é marcada com um primeiro e um segundo marcador interagindo por hibridização de tal forma que dita sonda de ditos ácidos nucleicos dito patógeno provoca uma mudança de sinal detectável.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato onde dito interagindo primeiro marcador interagindo e dito segundo rótulo estão interagindo é um FRET e FRET aceitador.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato onde dito FRET aceitante é um quencher.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 3,, caracterizado pelo fato onde dita seqüência complementar a uma seqüência de um agente patogênico está ligado ao par dito de bases complementares em ambos os extremos, associando seqüências.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 4, caracterizado pelo fato onde ditos pares de bases complementares incluem pares CG.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato no qual dita sonda 5 compreende a seqüência 3 '- CGCG-F-seqüência único para patógeno-F' - CGCG -5 ' F onde F e 'são opcionais ligando seqüências.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 6, caracterizado pelo fato onde a única seqüência do agente patogênico dentro da sonda contém pelo menos um desencontro com a seqüência do genoma do patógeno.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 7, caracterizado pelo fato onde cada uma das ditas sondas pode ser distinguida de cada uma das outras ditas sondas.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 8, caracterizado pelo fato em que cada uma das ditas sondas está anexado a um sólido apoio a uma localização definida.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato onde dito conjunto de sondas compreende, pelo menos, 10, pelo menos 15 ou, pelo menos, 20 sondas.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato onde dito método inclui ainda a determinação da temperatura de fusão da dupla ociosa de ácidos nucleicos formados por uma molécula de sondas ditas complementares obtidas a partir de ácidos nucleicos de dita amostra.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato onde ditos ácidos nucleicos obtidos a partir de uma amostra é amplificado antes de ser contactada a dizer conjunto de sondas.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato onde dita amplificação é realizada através da utilização da reação em cadeia da polimerase (PCR).

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato onde a produção de ácidos nucleicos é amplificada é monitorada permanentemente.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato onde dito amplificado é contactado com ácidos nucleicos de dito conjunto de sondas após um ciclo de amplificação.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato onde dito amplificado é contactado com ácidos nucleicos de dito conjunto de sondas após cada ciclo de amplificação.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato onde dita amplificação é realizada na presença do referido conjunto de sondas.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato onde dito método inclui ainda uma amplificação de controle interno.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -12 a 18, caracterizado pelo fato onde a amplificação de ácidos nucleicos contaminantes é impedida.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato onde dita amplificação dos ácidos nucleicos contaminantes é impedido pelo desempenho da amplificação, na presença de uracilo.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender ainda mais tratando-se ditos ácidos nucleicos com uracilo-DNA glicosilase antes de amplificação.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato onde dita amostra é selecionada a partir de raspados amostras citológicas ou biópsia de aspirados brônquicos, urina, massa próstata, ejaculação, sangue e cervical, vulvar, anal, genital, pele ou laringe.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de detecção de um organismo associado a uma doença sexualmente transmissível.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de detectar a presença de pelo menos um genótipo HPV.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de detecção de alto risco ou de baixo risco de genótipos HPV.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24 ou na reivindicação 25, caracterizado pelo fato onde dito conjunto de sondas inclui pelo menos uma sonda que contém pelo menos uma das seqüências selecionadas a partir de ID SEQ N °s 33 a 52 ou SEQ IDNºS 105-117.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 26, caracterizado pelo fato onde ditos obtidos a partir de ácidos nucleicos de ditas amostra é amplificado utilizando pelo menos um primer selecionados a partir de Seq ID. N º s 1 a 32.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir de ácidos nucleicos em que dita amostra é amplificada utilizando uma mistura de primer Seq ID. N º s 1 a 32.

29. Conjunto de sondas incluindo pelo menos quatro sondas, caracterizado pelo fato onde cada uma das ditas sondas compreende uma seqüência complementar a uma seqüência de um agente patogênico ladeado por quatro ou cinco pares de bases complementares, onde ditas bases formam uma estrutura caule, na ausência de uma hibridização de ácidos nucleicos a partir de organismos patogênicos, onde dita sonda é marcada com um primeiro e um segundo marcador rotulado por hibridização interagindo de tal forma que dita sonda de ácidos nucleicos de dito patógeno provoca uma alteração no sinal detectável.

30. Conjunto de sondas, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato onde dito primeiro marcador interagindo e dito rótulo estão interagindo segundo um FRET doador e um FRET aceitador.

31. Conjunto, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato onde dito FRET aceitante é um quencher

32. Conjunto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 29 a 31, caracterizado pelo fato onde dita seqüência complementar a uma seqüência de um agente patogênico está ligado ao par dito de bases complementares em ambos os extremos, associando seqüências.

33. Conjunto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 29 a 32, caracterizado pelo fato onde ditos pares de bases complementares incluem CG pares.

34. Conjunto, de acordo com a reivindicação, caracterizado pelo fato em que cada uma das 33 ditas sondas compreende a seqüência 3 '- CGCG-F- seqüência único para patógeno-F' - CGCG -5 ' F onde F e 'são opcionais ligando seqüências.

35. Conjunto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 29 a 34, caracterizado pelo fato do qual a única seqüência do agente patogênico dentro da sonda contém pelo menos um desencontro com a seqüência do genoma do patógeno.

36. Conjunto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 29 a 35, caracterizado pelo fato em que cada um ditas sondas podem distinguir-se de cada uma das outras ditas sondas.

37. Conjunto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 29 a 36, caracterizado pelo fato em que cada uma das ditas sondas está anexado a um sólido apoio a uma localização definida.

38. Conjunto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 29 a 37, caracterizado pelo fato onde disse um organismo patógeno associado a uma doença sexualmente transmissível.

39. Conjunto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato onde dito organismo é um vírus.

40. Conjunto, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato onde é dito vírus humano pappillomavirus.

41. Conjunto, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato em que cada uma das 40 ditas sondas compreende uma seqüência que é complementar a um genótipo HPV.

42. Conjunto, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato onde disseram cada um de ditas sondas compreende uma seqüência que é complementar a um risco elevado de HPV genótipo.

43. Conjunto, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato onde disseram cada um de ditas sondas compreende uma seqüência que é complementar a um baixo risco HPV genótipo.

44. Conjunto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizado pelo fato onde disse conjunto de sondas inclui pelo menos uma sonda que contém pelo menos uma das seqüências selecionadas a partir de ID SEQ N° s 33 a 52 ou SEQ ID N° s 105-117.

45. Conjunto, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato em que cada sonda desse conjunto de sondas compreende uma seqüência de selecionados SEQ ID N 0 s 33 a 52 ou SEQ IDn0S 105-117.

46. Conjunto, de acordo com as reivindicações 44 ou 45, caracterizado pelo fato em que cada sonda desse conjunto de sondas compreende uma seqüência de selecionados SEQ ID N 0 s 33 a 52.

47. Seqüência de ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de que incluir qualquer uma das SEQ ID N 0 s 33 a 52.

48. Seqüência de ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de incluir qualquer um dos η 0 s 105-117 SEQ ID.

49. Utilização de ácidos nucleicos das reivindicações 47 ou -48, caracterizado pelo fato para detectar a presença ou ausência de pelo menos um genótipo HPV.

50. Utilização da reivindicação 49 utilizando reação em cadeia da polimerase, caracterizado pelo fato onde a produção de ácidos nucleicos amplificado é monitorada permanentemente.

51. Método de identificação de um conjunto mínimo de primers que amplificam seqüências de ácidos nucleicos a partir de dois ou mais organismos relacionados, caracterizado pelo fato de compreender: (a) identificar locais primers que tenham, pelo menos, 30% de identidade entre ditos organismos; (b) Desenhar um conjunto de iniciadores capaz de iniciar a amplificação do local do primer identificados em (a), onde cada um dos ditos iniciadores não tenham mais de 3 inadequações de um primário obrigatório, pelo menos em um local onde cada um dos organismos e ditos primers diferem de cada um dos ditos iniciadores por 4 ou menos nucleótidos; e (c) Determinar o menor número de primers necessários para detectar o maior número possível de ditos organismos.

52. Método, de acordo com reivindicação 51, caracterizado pelo fato que inclui: (d) Determinar a quantia relativa de cada primer exigidos nos ditos conjunto de primer de garantir a igualdade de amplificação dos ácidos nucleicos a partir de seqüências de todos os ditos organismos.

53. Método, de acordo com as reivindicações 51 ou 52, caracterizado pelo fato onde ditos organismos estão associados a uma doença sexualmente transmissível.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 53, caracterizado pelo fato onde ditos organismos são vírus.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato onde ditos vírus são pappillomaviruses humanos.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 55, caracterizado pelo fato onde passo (d) acrescentando ainda que inclua uma ou mais primers, onde ditos primers não têm mais do que 3 inadequação para o primer vinculativo no local de ditos organismos onde priming carece de correção para a realização da igualdade de amplificação.

57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 56, caracterizado pelo fato onde ditas inadequações estão no primer mais próximo a 5 'end.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 57, caracterizado pelo fato onde dito conjunto de primer permite sensibilidade de detecção de todos os organismos presentes nó prazo de duas ordens de grandeza.

59. Conjunto de primers obtida através do método de qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de incluir pelo menos um primer selecionados a partir de Seq ID. N 0 s 1 a 32.

60. Conjunto de iniciadores, de acordo com a reivindicação -59, caracterizado pelo fato de compreender 59 Seq ID. N 0 s 1 a 32.

61. Kit de detecção de um ou mais patógenos, caracterizado pelo fato que compreende uma série de sondas como reivindicado, em qualquer uma das reivindicações de 29 a 46.

62. Kit de detecção de um ou mais agentes patogênicos caracterizado pelo fato que compreende um conjunto de primers identificados de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 51 a 58.

63. Kit, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de compreender um conjunto de primers identificados de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 51 a 58.

64. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 63, caracterizado pelo fato onde dito patógeno é um organismo associado a uma doença sexualmente transmissível.

65. Kit de detecção de um ou mais genótipos HPV, caracterizado pelo fato de compreender um conjunto de sondas como reivindicado, em qualquer uma das reivindicações de 29 a 46.

66. Kit de detecção de um ou mais genótipos HPV, caracterizado pelo fato de compreender o conjunto de iniciadores da reivindicação 59 ou da reivindicação 60.

67. Kit, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de incluir a reivindicação 65 mais o conjunto de iniciadores da reivindicação 59 ou da reivindicação 60.

68. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 67, caracterizado pelo fato de incluir um maior controle interno.