CN101360833A

CN101360833A - 检测病原体的方法

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Publication number: CN101360833A
Application number: CNA2006800509886A
Authority: CN
Inventors: C·耶奈伊; T·陶卡奇
Original assignee: Genoid Kft
Current assignee: Genoid Kft
Priority date: 2005-11-15
Filing date: 2006-11-15
Publication date: 2009-02-04
Also published as: DK1844164T3; NZ568290A; PT1844164E; GB0523250D0; ES2348607T3; BRPI0620507A2

Abstract

描述了用于检测病原体、尤其是与性传播疾病相关的生物、特别是人乳头瘤病毒基因型的方法。该方法涉及实时PCR的使用，所述实时PCR使用特别设计的探针。还描述了探针、用于进行该方法的试剂盒，以及设计适用于本发明方法的引物的方法。

Description

检测病原体的方法

技术领域

本发明涉及特别针对与性传播疾病相关的生物的诊断学，更具体地涉及人乳头瘤病毒(HPV)基因型、尤其是生殖器人乳头瘤病毒基因型的检测。

技术背景

人乳头瘤病毒及其重要性

据世界卫生组织(WHO)报告，宫颈癌是女性癌症死亡的第二个最常见的起因。HPV感染的存在已证明与全世界99％以上的宫颈癌相关。据估计，全世界每年500,000以上的女性罹患宫颈癌，且273,000以上的病例是致死的。即便使用Pap筛选程序，每年仍有大量女性死于宫颈癌。

HPV感染是全世界最频繁的性传播(STD)疾病，多至60％的性行为活跃的女性在其一生中会被HPV感染生殖道一次。不论HPV感染的状态如何，不到1/10,000的女性会发生浸润性宫颈癌(invasive cervical cancer)。大部分HPV感染的女性不发生细胞异常或癌症的事实解释了在HPV感染的女性中子宫颈疾病向癌症发展的调节因素的重要性。这些因素可包括HPV基因型和分子变体、HPV病毒载量、HPV感染的持久性、与其它STD物质的共感染、宿主的免疫状态和环境因素如吸烟。

乳头瘤病毒是小DNA病毒，其感染哺乳动物上皮细胞，引起上皮增生性病变，所述病变可以是良性的，例如纤维乳头瘤(肉赘)，或其可以是恶性的。所有的乳头瘤病毒是相似的，因为它们共享基因组大小、排布、开放读码框和蛋白质功能。许多(但不是所有)基因组区域在多种乳头瘤病毒间是保守的。

因为乳头瘤病毒生活周期和宿主细胞分化状态之间密切相关，乳头瘤病毒生活周期的细节尚未完全阐明。已知乳头瘤病毒感染宿主上皮基底细胞，在此病毒基因组得以建立并作为低拷贝数附加体维持，所述附加体与宿主细胞复制协调复制。因为被感染的细胞分化为角质形成细胞，所以病毒DNA被扩增、晚期基因被诱导，并且随后乳头瘤病毒进行增殖复制。

乳头瘤病毒感染广泛的动物，包括人。人乳头瘤病毒(HPV)(包括乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)，α-、β-、γ-、δ-丑型乳头瘤病毒属(Mupapillomavirus)和未分类的乳头瘤病毒属)是性传播疾病的主要原因。已经通过DNA序列数据鉴定了若干类型的HPV，并且迄今为止完全测序了96种HPV基因型。HPV的基因分型是以L1、E6和E7基因的DNA序列为基础的。相对于先前确定的菌株而言10％的序列差异足够定义新的病毒类型。

人乳头瘤病毒群体的异质性一般描述于deVilliers，1989，J.Virology63：4898-4903中，其被并入本文作为参考。大量HPV类型的基因组已经被测序和/或表征。

HPV是DNA肿瘤病毒，其基因组被排布在三个区域内：早期基因(E1到E7)、晚期基因(L1和L2)区域和上游调控区(URR)或长控制区(LCR)。URR拥有针对许多转录阻遏物和激活剂的结合位点，提示其可参与确定特定HPV类型的宿主范围。同时，E1和E2编码的蛋白质对于染色体外DNA复制和病毒生活周期的完成是至关重要的。E2编码两个蛋白质：一个抑制早期区的转录；另一个提高早期区的转录。HPV相关宫颈癌的标致是病毒E2蛋白质表达的缺失。最近描述了一个新的E2蛋白质，其由小E8 ORF的产物和E2蛋白质的部分组成。该蛋白质能够阻抑病毒复制和转录，因此被认为在病毒潜伏期中具有重要作用。

E4蛋白质在完整病毒体得以装配的感染晚期表达，并已知不具有转化特性；然而，其被认为对病毒的成熟和复制起重要作用。E4蛋白质也诱导人角质形成细胞中细胞质的细胞角蛋白网络的崩溃，该情况可加速病毒体从被感染的细胞中释放。

同时，E5开放读码框(ORF)通常在宫颈癌细胞中被删除，指示其在维持宿主细胞的恶性转化中可能不是必需的。E5存在时与多种跨膜蛋白如上皮生长因子受体、血小板衍生的生长因子β和集落刺激因子相互作用。使用HPV 16感染的细胞的研究发现E5蛋白质具有弱的转化活性。

在致癌作用中，E6和E7 ORF被认为起最重要的作用。这两个单位编码癌蛋白，所述癌蛋白允许病毒的复制和具有HPV DNA的细胞的永生化和转化。

晚期单元L1和L2在病毒体装配的晚期编码病毒衣壳蛋白。L1编码的蛋白质在不同的乳头瘤病毒物种间是高度保守的。L2编码的较小的衣壳蛋白与L1蛋白质序列相比具有更多序列变异。

HPV能够感染皮肤或组织内衬的基底上皮细胞，并因此被归为表皮类型或粘膜(肛门生殖器)类型。

HPV DNA在良性宫颈前体病变中通常是染色体外的或附加体。然而，在许多宫颈癌细胞以及宫颈癌细胞系和体外HPV转化的人角质形成细胞中，HPV DNA被整合进宿主基因组中。

癌组织可同时含有附加体和整合的HPV DNA，尽管整合显示在HPV18相关的宫颈癌中比在HPV 16相关的宫颈癌中更频繁地发生。整合的HPV16存在于一些癌前病变中，但并不总是存在于癌中。在HPV DNA整合期间，病毒基因组通常在E1/E2区域中断裂。断裂通常导致E1和E2区域的丧失。已知E2(其编码蛋白质，包括抑制E6和E7区转录的蛋白质)的丧失导致E6和E7致癌蛋白失控和增加的表达。同时，已经观察到增加的E6和E7表达导致宿主细胞的恶性转化和肿瘤形成。HPV病毒进入宿主基因组DNA的整合伴随着宫颈上皮内瘤(CIN)从多克隆到单克隆状态的发展，这些事件在从低级到高级子宫颈瘤的发展中起根本作用。

DNA拷贝数失衡(CNI)模式是子宫颈鳞状上皮内病变(SIL)级别、人乳头瘤病毒(HPV)状态和术后复发的特征。尽管在HG-SIL(高级SIL)和LG-SIL(低级SIL)中以相似的频率观察到一些CNI，但是在发现其它(包括1q、3q和16q的增加)在HG-SIL而非LG-SIL中频繁出现。在显示缺失HPV16E2基因的HG-SIL和在随后复发的HG-SIL中存在显著更多的CNI/病例。所述数据与宫颈SIL发展中的CNI相继获得相一致。与E2基因缺失相关的更高的CNI频率支持这样的体外证据：即高危型HPV整合与基因组不稳定性有关。

基于可获得的分子、临床和流行病学数据，明确HPV的一个亚类为宫颈癌及其前体的病原体。已经在约90％的宫颈腺癌和鳞状上皮细胞癌中检测到HPV。大部分HPV感染自发清除，但是已经在来自子宫颈肿瘤的转移灶中发现HPV DNA的持续感染。然而已知的高危型(或致癌)HPV是宫颈癌的重要风险因子，并且日益发现它们在其它癌症中的作用。事实上所有宫颈癌(99％)含有高危型HPV的基因，最常见的是类型16、18、31和45。其它高危型包括31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73型。HPV 31、33、35、51和52有时被认为是“中危型”，因为它们更常见于轻度或严重的发育异常病变(dysplastic lesion)而不是癌。在高危型菌株中，HPV 16和18是与宫颈癌最密切相关的。已经在50％以上的鳞状上皮细胞癌中发现HPV16 DNA，而在50％以上的腺癌中发现HPV 18 DNA。然而，大部分肛门生殖器HPV具有致癌能力。

HPV与宿主细胞的相互作用具有两个主要的生物学后果：

a)所有的肛门生殖器HPV诱导低级鳞状病变，其为生产性感染(productive infection)与正常E6、E7表达带来的永生化表型的形态学关联。永生化是乳头瘤病毒利用资源进行DNA复制并产生新后代的固有策略。

b)罕见的是，HPV诱导增殖性上皮表型，此公认为高级病变，并且是浸润性宫颈癌的近端细胞组织学前体(proximate cytohistologicprecursor)，这可能涉及失控的E6、E7表达。

迄今为止，与HPV感染相关的临床疾病以及HPV检测和分型方法的潜在应用领域包括：尖锐湿疣、硬化性苔藓(lichen sclerosus)、鳞状细胞增生(squamosus cell hyperplasia)、外阴上皮内瘤变(vulvar intraepithelialneoplasia)、鳞状细胞癌(squamosus cell carcinoma)、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia)、宫颈癌、子宫颈腺癌、肛门上皮内瘤变(anal intraepithelial neoplasia)、阴茎上皮内瘤变(penile intraepithelialneoplasia)、喉腺癌(adenocarcinoma of the larynx)、复发性呼吸系统乳头瘤病(recurrent respiratory papillomatosis)，和疣状表皮发育不良(epidermodysplasias verruciformis)。最近的证据提示HPV同样可在男性前列腺癌的发生中起作用。

使用巴氏染色法(Papanicolaou Stain)即以发明人George Papanicolaou命名的巴氏涂片(Pap Smear)，对宫颈癌前体病变(上皮内病变)或细胞学异常进行测试。该技术包括将子宫颈刮取物(cervical scrape)涂抹在玻璃片上，并用核染料苏木精对得自肛门生殖道的细胞进行染色。然而巴氏涂片缺乏可重复性，并且不足以预测即将发生的HPV诱导的瘤变。已经显示25％高级原位癌的患者在诊断前数年可显示正常的巴氏涂片，或在宫颈癌病例中末次阴性细胞学在复查时一致为阳性。日渐普遍的问题是阴性巴氏涂片3年内浸润性癌症的发生。

目前可接受的假阴性率(即，根据观察组织活检而非涂片样品的病理学家专业仪器判断的确患有发育异常，但是在常规涂片筛选中未予诊断的女性)为大约5-10％，但是最近的研究提出实际的比率要高得多。另外，在约7-8％的病例中，巴氏涂片显示了无明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)。在另外20-30％的病例中，巴氏涂片由于存在炎症细胞而不足以判读。在子宫颈的情况下，(通过阴道镜检查显现的)平疣是可疑的癌前病变。平疣到原位癌和宫颈癌的组织病理学发展已有充分描述。

上皮内病变是患有偶发HPV感染的女性中常见的早期事件，偶发HPV-16或HPV-18感染和活检确认的CIN级别2-3之间的间隔似乎相对较短。然而，研究证明高危型HPV的感染通常是瞬时的。HPV感染的持久性显著地增加发展成高级上皮内病变和浸润性疾病的风险。

疾病的发展是可变的，并与HPV的丧失或持续相关。大量的发育异常病变自发退化，其它不能发展，而少数则发展迅速。

作为宫颈癌中高危型基因型选择作用的结果，而且由于其它病理学状况不同、继发(consequential)和特征性的类型模式，HPV的鉴定和分型均非常重要。另外，不同的高危型HPV对受染个体造成不同的风险。例如，与其它HPV类型相比，HPV16和HPV18更一致地在高级宫颈发育异常和宫颈癌中鉴定。HPV16在鳞状癌(squamosus carcinoma)病例中更为流行，而HPV18在腺癌病例中更为流行。

HPV诊断学

从1980起，已经克隆了若干种病毒基因组并在HPV诊断中用作类型特异性探针。已利用滤膜杂交技术在与常规细胞学样品一起收集的子宫颈刮取物中检测HPV DNA。已利用HPV DNA探针进行不同的基于杂交的测定(例如Southern(DNA杂交)和杂交印迹/Southern测定)，以检测来自临床的组织样品中的HPV DNA。另外，已经展示了经纯化的活检DNA和保存的组织标本中的原位杂交，即在完整的细胞中直接定位与核酸探针互补的序列。

已经报导了使用反向印迹(reverse-blotting)操作检测HPV DNA类型的方法。该操作包括形成膜，从而来自四种不同HPV类型的基因组DNA与所述膜结合，然后使来自生物样品的标记的DNA和与膜结合的DNA杂交。

已经开发了众多方法使用类型特异性反应来检测人乳头瘤类型，一次检测一种HPV类型。已经使用聚合酶链式反应(PCR)扩增和检测HPV16和HPV18 DNA的存在，尤其是在口和宫颈活检中检测HPV16。已经描述了通过PCR特异性扩增类型1a、5、6a、8、11、16、18和33的HPV序列的引物混合物。美国专利No.4,683,195和4,683,202公开了PCR和PCR在检测样品中核酸序列存在与否方面的用途。

美国专利No.5,447,839(其并入本文作为参考)公开了用于HPV检测和分型的方法。在该方法中，使用共有引物(consensus primer)扩增样品中的HPV DNA序列，所述共有引物既扩增致癌HPV类型又扩增非致癌HPV类型。因此，样品中HPV的存在由扩增产物的形成指示。然后使用类型特异性DNA探针对HPV进行分型，所述DNA探针与扩增的DNA区域杂交。该专利中公开的类型特异性杂交探针能够鉴定和区分五种已知的HPV致癌类型，即HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18和HPV-33。

已经设计了多种用于检测高危型HPV的方法。许多这些方法依赖于检测HPV基因组中的独特序列。例如，本领域已经报导了与特定的高危型HPV菌株基因的部分互补的DNA或RNA探针，其适用于在患者样品中筛选特定高危型HPV菌株的存在(美国专利No.4,849,332，并入本文作为参考)。美国专利No.5,705,627(其并入本文作为参考)报导了使用PCR扩增和检测HPV DNA，所述PCR使用简并引物或混合的共有引物，然后使用基因型特异性DNA探针混合物来分型。使用共有引物的其它实例可见于美国专利No.5,364,758和Kleter，B.等，Am.J.of Pathology，第153卷，第6期，1731-39(1998)。这些参考文献也通过参考并入本文。

存在以杂交和信号扩增为基础的可商业获得的方法(Hybrid CaptureII，Digene公司)。然而，该方法据报导具有特异性方面的问题，因为HPV基因组的一些部分具有高序列同源性。

基于扩增的方法包括负责灵敏度的部分(扩增)，所述部分独立于负责特异性的其它部分(通过杂交检测)。这些技术在扩增的基因组区段、引物数量和检测技术方面存在差异。最常用的扩增方法为GP5+-GP6+(通用引物-GP)、MY9-MY11、PGMY、SPF、L1C和类型特异性PCR反应。最常用的检测技术为序列特异性杂交、限制性片段长度多态性(RFLP)和线性探针测定(LiPA)。有时(但很少)使用测序或其它方法。扩增的分析特性在大范围内变化，并可通过能够被扩增的基因型数量、分析灵敏度、基因型扩增/检测特异性和基因型之间灵敏度的差异来表征。

HPV实时PCR

人乳头瘤病毒-16(HPV-16)的病毒载量能够作为预测高级子宫颈病变存在的生物标记。已经开发了若干种实时PCR测定法，以精确地测量HPV-16病毒载量(HPV-16 L1、HPV-16 E6和HPV-16 E6 PG)。所述方法教导我们进行实时HPV检测，但是一次只检测一种基因型。

使用SYBR

Green实时PCR在青少年发作的复发性呼吸道乳头瘤病(juvenile-onset recurrent respiratory papillomatosis)的患者中进行HPVDNA鉴定。使用该方法在实时PCR反应中检测多种人乳头瘤病毒基因型。然而，所述扩增方法与本发明所述的不同。产生的扩增子比本领域基于探针的实时扩增方法所接受的更长(约450bp)。优选的长度为150bp或更短。检测方法是非特异性的并且不能可靠地区分基因型，这使得必须随后使用实时PCR进行病毒分型，所述PCR使用针对HPV类型6、11、16、18、31和33的类型特异性引物。这再一次对种种分离株(isolate)中人乳头瘤病毒的类型进行检测，但是一次只能检测一种基因型。

与此类似，他人通过使用单管嵌套反应(single-tube nested reaction)方法以一般方式检测人乳头瘤病毒基因型。然而，未描述型别(group)的特异性检测。

还使用另一种方法在性伴侣中检测人乳头瘤病毒DNA，所述方法使用两步途径评价基因型和病毒载量数据。该方法使用GP5+/6+聚合酶链式反应(PRC)，然后是反向线点分析(reverse-line blot analysis)。该方法被用于在宫颈和阴茎刮取物样品中检测45种HPV类型。然后通过基于LightCycler的实时PCR测定法在HPV类型16、18、31和33阳性的刮取物样品中测定病毒载量。GP5+/GP6+PCR产生长150bp的扩增子，这使得能够应用基于实时探针的方法。然而该方法不能在一个反应中检测多个基因型或型别。

使用限制酶消化设计了用于核酸扩增均相实时检测和定量的方法。在该均相系统中，检测由其5’端含有报告子和猝灭剂部分的引物介导，所述报告子和猝灭剂由编码限制酶识别序列的短DNA区段隔开。在单链形式中，来自荧光报告子的信号由于荧光共振能量转移(FRET)而被猝灭。然而，当引物被掺入双链扩增子中时，反应中存在的限制酶切割连接报告子与猝灭剂的DNA，允许报告子的无限制性荧光。该体系使用与可切割的能量转移标记组合的、特异于人乳头瘤病毒(HPV)16 E6基因的引物来测试，并被用于扩增HPV16阳性DNA。该方法不能用于检测多个基因型或型别。

也已经描述了用于同时定量与高危型宫颈癌相关的人乳头瘤病毒类型的基于实时PCR的体系。开发了用于检测和定量HPV16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-52、-58和-67的实时PCR测定法。该测定法以来自每个患者样品的三个并列实时PCR为基础：(i)反应1用三种不同的荧光团检测和定量HPV16、-31、-18、和-45(HPV18和-45使用一种探针一起检测和定量)；(ii)反应2再次用三种不同的荧光团检测和定量HPV33、-35、-39、-52、-58和-67(HPV33、-52、-58和-67一起检测和定量)，并且仅使用三种不同的探针；和(iii)反应3检测和定量人单拷贝基因(HMBS，智人(Homo sapiens)羟甲基胆色烷合酶；GenBank登录号M95623.1)的量。反应1包括总共七种PCR引物和三种探针，反应2包括总共七中PCR引物和三种探针，而反应3包括两种PCR引物和单个探针。该方法使用TaqMan可水解实时PCR探针。描述了一个反应中仅有的三种探针在相同反应中检测最多6种基因型的用途。该方法不能作为通用教导被用于设计检测多个HPV基因型的反应，因为基因型之间的序列同一性是有限的。反应的扩展受到使用基因型之间序列同一性的限制。

先前已经开发了通过使用荧光5’外切核酸酶测定法检测和定量致癌人乳头瘤病毒(HPV)的方法。该方法以使用针对HPV类型16、18、31、33和35的类型特异性探针在单次PCR中扩增来自E1开放读码框3’部分的180-bp片段为基础。探针可独立使用或每次测定与多达三种探针组合使用。该方法局限于每次测定三种探针。

也描述了使用SybrGreen和分子信标(molecular beacon)聚合酶链式反应用于人乳头瘤病毒检测和基因分型的策略。该测定通过HPV-DNA扩增子的SybrGreen报告完成一般的HPV检测，并通过实时分子信标PCR完成七种流行HPV类型(HPV-6、-11、-16、-18、-31、-33、-45)的基因分型。所述两步法在一个PCR反应中使用三种不同标记的分子信标。

也描述了另一种方法：称为蝎子(Scorpion)的简并HPV自身探测荧光引物(self-probing fluorescent primer)和Scorpion混合物与带尾的通用引物组合使用。通过使用带尾的引物使得引入共有位点成为可能，所述共有位点使得单个Scorpion能够识别许多不同的HPV扩增子。这是理论上能够检测超过40种不同HPV类型的两步过程。在该研究中使用10种Scorpion分型引物(HPV6、11、16、18、31、33、39、45、51、56)。每种Scorpion的引物序列是类型特异性的，并位于Jacobs等的GP 6+引物相同的序列位置上。该方法教导了检测HPV存在的通用检测方法和对阳性样品分型的类型特异性检测方法。其没有解决用多种探针筛选导致探针交叉反应性的问题。事实上，该方法避免在一个反应中使用多种探针。

已对使用实时LightCycler^TM和TaqMan^TM测定的基于实时PCR的HPV检测方法与常规GP5+/6+PCR/酶免疫测定(EIA)进行了比较，以评价宫颈刮取物标本中的人乳头瘤病毒载量。两种实时PCR测定均类似地测定了刮取物标本中的HPV16载量，但是这些测定与GP5+/6+PCR/EIA之间一致性低，提示后一种方法不适合定量HPV DNA。也已经通过同时检测两种HPV基因类型的实时荧光定量PCR测定了HPV6/11和HPV 16/18DNA载量。

共有引物设计方法

仅用于检测一种人乳头瘤病毒核酸分子(例如编码L1的部分的核酸分子)的引物和探针可以使用例如计算机程序如OLIGO(Molecular BiologyInsights Inc.，Cascade，Colo.)或Primer3设计。这些寡核苷酸的适当特征是本领域技术人员公知的。

存在许多关于PCR引物设计通用原则的文献，导致了大量软件应用，最值得注意的是Primer3及多种扩展。还开发了用于测试引物配对相容性的快速动态编程公式(fast dynamic programming formulation)。在过去的数十年，多元PCR的应用稳定增长，需要更先进的引物选择方案。不同的算法可支持特定的对象，或可以针对特定的技术平台设计。一般而言，鉴定引物对以最大化单个测定的多元水平的问题已经显示是NP完全问题(NP-complete)。已提出了消除3’碱基互补性同时解决产物大小约束(constraint)的近似算法。

本发明的方法涉及设计多元PCR测定法的问题，尤其是设计共有引物的问题。该问题的一般途径是设计共有引物，从而使用少于靶标数量的引物对扩增众多靶标。而且，设计同样应考虑多元PCR测定法的设计原则，所述设计原则以共有的疱疹病毒为例进行说明。

开发了基于共有简并杂种寡核苷酸引物(CODEHOP)鉴定关系较远的基因序列的特定途径。具有高保守水平的蛋白质短区域可以被表示为多重比对蛋白质序列的无空位区段(ungapped block)。CODEHOP来自这些保守的序列区段，并在PCR中用以扩增它们之间的区域。CODEHOP PCR引物由引物库组成，每种引物在3’简并核心区中含有不同的序列，其中每种引物提供可能的密码子组合(其编码序列区段中靶向的3-4个保守氨基酸基序)之一。另外，库中每种引物上具有相同的5’共有钳区(clamp region)，其来自编码侧接靶向基序的保守氨基酸的每个位置上最可能的核苷酸。通过库中3’简并核心与靶模板具有最大相似性的引物的退火和延伸启始扩增。退火由5’共有钳部分稳定，所述5’共有钳部分与靶模板部分匹配。一旦引物被掺入，其成为随后扩增循环的模板。因为所有的引物在5’共有钳区是相同的，所以它们在随后几轮扩增中都会以高严格度退火。该方法同样用于病毒学领域中。该途径与本发明的方法是不同的，因为其中的特异性序列区段被用于实现相关序列的有效扩增。Codehop程序寻找用于扩增未知靶标的引物，但是在操作上进行蛋白质序列比对而非DNA序列比对。

存在处理共有/简并引物设计的众多方法，但是它们通常使用不同的算法解决基本相同的问题：鉴定用于有效扩增相关靶序列的最适引物集合。引物之间的协作不考虑在内。

另一种途径是PriFi程序(http://cgi-www.daimi.au.dk/cgi-chili/PriFi/main)。该程序设计适用于PCR扩增物种基因组DNA的引物对，所述物种无法使用先前的序列信息。该程序在操作上进行来自系统发生相关物种的DNA序列比对，并输出满足许多标准的可能的简并引物对列表，从而所述引物高度可能在其他系统发生相关物种中扩增直系同源序列。然而，该程序不使用引物之间协作的概念。

基于比对的DNA序列型别设计PCR引物的Amplicon程序是类似的方法。Amplicon的最重要的应用是设计“型别特异的”PCR引物集合，以扩增来自给定分类型别的DNA区，而不扩增来自其他分类型别的直系同源区域。引物之间的协作仍未予考虑。

关于如何设计扩增反应引物以通过靶向众多相关的扩增靶标进行检测，文献中没有简单明了的规则。然而，普遍接受的是不能预料的引物之间的相互作用及其对扩增资源的竞争降低了反应的灵敏度，并且更多的引物意味着更大的误引发概率，产生进一步竞争资源的无特异性产物。

HPV测试在宫颈癌筛选中的可能作用高度依赖于现存的基础设施(infrastructure)。对于开展有效的、有条理的、基于细胞学的程序的临床情况而言，焦点在于是否HPV测试对既有的程序、以及对目前实践的成本效益、质量控制和附加值方面的问题有所裨益。相反，对于不存在筛选，或筛选因为细胞学质量差或炎症涂片的高发生率引起的固有限制而无效的情况而言，更基础的有关灵敏度、特异性和测试步骤简单性的问题变得至关重要。

实时PCR技术提供了满足甚至超越上述两种情形的需求的特征。最近的研究确定了对于一些最频繁的HPV类型而言，HPV DNA的量是发展为子宫颈恶性肿瘤(CIS)的决定因素。每个细胞的拷贝数范围在HPV类型之间无差异，但是在具有最高病毒载量的百分位数中CIS的让步比(odds ratio)对于HPV16(OR＝36.9；95％CI＝8.9-153.2)而言显著高于HPV 31(OR＝3.2；95％CI＝1.1-9.1)或HPV 18/45(OR＝2.6；95％CI＝1.0-6.4)。因此，在涂片处于鳞状异常阴性的阶段，HPV病毒载量可以预测子宫颈CIS的未来风险。实时技术提供了比现存HPV检测技术更精确地测定病毒载量的前提。实时技术提供了胜过现存方法的若干优点。然而，尚未开发出在一个反应中能够检测三种以上人乳头瘤病毒的实时扩增和检测方法。另外，尚未开发出在一个反应中分型别类地检测临床上重要的病毒型别(例如种种低危型或高危型人乳头瘤病毒)的方法。

精确的自取样(self-sampled)HPV测试具有巨大的意义。这类测试展开了评价否则不愿意或不能够进行骨盆检的女性的可能性。在不发达地区，这会提供胜过目前实践的优点。在开展有组织的筛选的地区，自取样提供了触及拒绝进行常规筛选的女性中附加途径，并且可以在HPV阳性细胞学阴性女性治疗后的监护或监测中起作用，这些女性需要以短间隔进行随访检查。具有接近患者的测试能力的自取样途径能够提高筛选程序的质量和可及性(accessibility)。

以常规筛选和初步筛选市场为导向的HPV测试应满足所有这些需求。实时PCR技术特别适用于在技术上满足这些要求。该技术固有的简单性有助于降低基础设施障碍，并且也比其它技术具有成本效益。另一方面，实时PCR技术会加强分析的灵敏度和更重要地加强HPV检测的特异性，提供了改进这些参数的临床对应物的更坚实的基础。内部对照为该体系增加了质量控制能力。

在HPV检测的接近患者的应用中，实时技术是最可行的选择。接近患者的测试将是初步筛选中的下一前沿，而实时技术在该领域中其它病原体的病例中已经引起了大量关注，并可在实践中提供附加值。

与其它方法相比实时PCR提高的灵敏度，以及实时PCR提供的特征改进(包括样品纳入(sample containment)和扩增的产物的实时检测)表明了执行该技术用于临床实验室中人乳头瘤病毒感染常规诊断的可行性。

发明内容

第一方面，本发明提供了检测至少一种病原体存在的方法，所述方法包括将得自样品的核酸与包含至少四个探针的集合接触，其中每种所述探针包含与来自病原体的序列互补的、侧接四对或五对互补碱基的序列，其中所述碱基在不与来自病原体的核酸杂交时形成茎结构，其中所述探针用第一相互作用标记和第二相互作用标记标记，从而所述探针与来自病原体的核酸的杂交引起检测信号的改变。

本文使用术语“核酸”是指DNA和多种形式的RNA如mRNA和hnRNA。核酸可以是单链的或双链的。

本文使用术语“病原体”表示破坏动物的正常生理，引起或伴随着疾病和病症的生物因子。病原体可以是致病因子，即单独或存在一种或多种其它辅因子时用病原体感染患者产生疾病。

优选病原体是与性传播疾病相关的生物。本文使用术语“与性传播疾病相关的生物”表示遭受性传播疾病的患者中存在的生物。与性传播疾病相关的生物的实例包括与衣原体(chlamydia)相关的沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、与淋病(Gonorrhoea)相关的淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、与生殖器疱疹相关的单纯疱疹病毒(HSV)、与生殖器疣相关的人乳头瘤病毒，和与梅毒(Syphilis)相关的梅毒螺旋体(Treponemapallidum)。生物优选为病毒，更优选为人乳头瘤病毒(HPV)。所述方法优选用于检测一种或多种HPV基因型的存在。

尽管本发明的方法涉及病原体的检测，但是所述方法可用于检测任何生物的存在与否，尤其是含有多于一种亚种的生物，或相关的生物。本文使用“相关的生物”是指来自相同纲、属或种，并具有高水平遗传相似性的生物，优选至少80％的同一性，更优选90％。相关生物优选为病毒，更优选人乳头瘤病毒。

每种探针优选具有通式结构：

3’-茎-F-HPV互补序列-F’-茎’-5’

F和F’是任选的连接序列，其将互补序列和侧翼碱基对、茎和茎’连接起来。茎和茎’是由互补碱基对形成的序列，所述互补碱基对在溶液中形成双螺旋茎结构。这些序列优选是回文的。优选在探针的每一端存在4个碱基。构成茎的碱基优选包含C-G对，优选包含1、2、3、4或5个C-G对。茎优选具有序列CGCG。

在我们的实验中确定，不存在可检测的靶标DNA时，四个碱基对茎分子信标随着时间的推移不彼此相互作用引起不可预见的假扩增信号，这似乎依赖于茎结构的开关速率(on-off rate)。偶尔需要使用五碱基对茎分子信标来优化反应。具有较长茎的信标在单一检测和多元检测中均造成失控的假扩增信号。具有更短茎的信标通常具有过低的解链温度，而不能在实时扩增反应中使用。

本文使用术语“相互作用标记”是指标记对中一个标记与标记对的另一个协作。该协作发生于标记密切接近时，例如当探针具有茎环结构时。当探针与互补核酸杂交时，标记之间的协作减小或完全去除，因为它们之间的距离增加。标记在探针的每一端附着于探针，优选位于形成茎环结构的碱基上或与之相邻。标记附着在哪里并不重要，条件是当探针从一种构象变为另一种(即茎环打开)时能够检测到信号改变。当探针处于开放位置时(即其与互补的核酸序列杂交时，例如一个相互作用标记猝灭来自第二个相互作用标记的信号时)，信号改变可以是信号的增强。或者当探针处于开放位置时(即其与互补的核酸序列杂交时，例如第一相互作用标记引起来自第二相互作用信号的信号被发射)，信号改变可以是信号的减弱。

在优选的实施方案中，相互作用标记是FRET供体和相应的FRET受体。

FRET技术(参阅例如美国专利No.4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于这样的事实：即当供体和相应的受体荧光部分被定位为彼此之间处于某距离时，在两个荧光部分之间发生能量转移，所述能量转移可视或以其它方式被检测和/或定量。本文使用FRET技术形式利用分子信标技术检测人乳头瘤病毒的存在与否。分子信标技术使用杂交探针，所述杂交探针用供体荧光部分和受体荧光部分标记。荧光标记通常位于探针的每一端。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为探针内二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分在空间上接近。与靶核酸(即HPV基因型核酸)杂交后，探针的二级结构被破坏并且荧光部分彼此分离，从而用合适波长的光激发后，第一荧光部分的发射与不存在来自HPV基因型的核酸时所检测的发射不同。

本文就供体和相应受体荧光部分而言使用“相应的”是指受体荧光部分具有与供体荧光部分的激发光谱重叠的发射光谱。受体荧光部分的发射光谱的最大波长优选应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长至少大100nm。因此，有效的非辐射能量转移可以在它们中间产生。

通常选择荧光供体和受体部分用于(a)高效Forster能量转移；(b)巨大的最终Stokes迁移(＞100nm)；(c)发射尽可能远地迁移进入可见光谱的红光部分(＞600nm)；和(d)发射迁移至比在供体激发波长激发产生的拉曼(Raman)水荧光发射更高的波长。例如，可选择供体荧光部分，从而具有接近激光线(例如氦-镉442nm或氩488nm)的激发最大值、高消光系数、高量子产率和其荧光发射与相应的受体荧光部分激发光谱的良好重叠。可选择相应的受体荧光部分，从而具有高消光系数、高量子产率、其激发与受体荧光部分发射和可见光谱红光部分发射(＞600nm)的良好重叠。

在FRET技术中可与多种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素(fluorescein)、荧光黄(Lucifer Yellow)、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸盐(9-acridineisothiocyanate)、荧光黄VS、4-乙酰胺基-4’-异硫代-氰酸芪-2，2’-二磺酸(4-acetamido-4’-isothio-cyanatostilbene-2，2’-disulfonicacid)、7-二乙氨基-3-(4’-异硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺基1-吡啶酸(succinimdyl 1-pyrenebutyrate)、4-乙酰氨基-4’-异硫代氰酸芪-2，2’-二磺酸衍生物(4-acetamido-4’isothiocyanatostilbene-2，2’-disulfonic acidderivatives)、任意取代的芘类、蒽类、萘类、吖啶类、芪类、吲哚类、苯并吲哚类、噁唑类、苯并噁唑类、噻唑类、苯并噻唑类、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑类(4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazoles)、花菁类、羰花菁类、喹诺酮类(carbostyryls)、卟啉类(porphyrins)、水杨酸类、邻氨基苯甲酸类、甘菊蓝类(azulenes)、苝类、吡啶类、喹啉类、香豆素类、polyazaindacenes、呫吨类、噁嗪类、苯并噁嗪类(benzoxazines)、卡巴嗪类(carbazines)、次联苯甲酮类(phenalenones)、苯次联苯甲酮类(benzphenalenones)、卡巴嗪类、噁嗪类、4-bora-3a，4a-diaza-s-indacenes、fluorophoresceins、罗丹明类、对甲氨基酚类(rhodols)、5-carboxyfluorophoresceins(FAM)、5-(2’-氨乙基)氨基奈-1-磺酸类(EDANS)、邻氨基苯甲酰胺类(anthranilamides)、铽螯合物类(terbium chelates)、活性红4(Reactive Red 4)、德克萨斯红类(Texas reds)、ATTO类染料、EVO类染料、DYO类染料、Alexa类染料和BODLPY类染料。

取决于使用的供体荧光部分，代表性的受体荧光部分包括LC.TM.-RED 640(LightCycler.TM.-Red 640-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、LCTM.-RED 705(LightCycler.TM.-Red 705-亚磷酰胺)、花菁类染料如CY5和CY5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯(Lissamine rhodamine B sulfonylchloride)、四甲基罗丹明异硫氰酸盐、罗丹明x异硫氰酸盐、赤藓红异硫氰酸盐(erythrosine isothiocyanate)、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸酯(diethylenetriamine pentaacetate)或镧系离子(例如铕或铽)的其它螯合物。供体和受体荧光部分可得自例如分子探针公司(Molecular Probes，Junction City，Oreg.)或希格玛化学公司(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。

优选受体荧光部分为猝灭剂。本文使用猝灭剂是指减少由荧光标记发射的荧光的部分。这包括完全和部分抑制荧光的发射。抑制程度并不重要，只要去除猝灭剂就能检测到荧光改变即可。

猝灭部分优选选自任意取代的苯基类、萘基类、蒽基类(anthracenyls)、苯并噻唑类、苯并噁唑类、或苯并咪唑类、芘类、蒽类、萘类、吖啶类、芪类、吲哚类、苯并吲哚类、噁唑类、苯并噁唑类、噻唑类、苯并噻唑类、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑类、花菁类、羰花菁类、喹诺酮类、卟啉类、水杨酸类、邻氨基苯甲酸类、甘菊蓝类、苝类、吡啶类、喹啉类、香豆素类、polyazaindacenes、呫吨类、噁嗪类、苯并噁嗪类、卡巴嗪类、次联苯甲酮类、苯次联苯甲酮类、卡巴嗪类、噁嗪类、4-bora-3a，4a-diaza-s-indacenes、fluorophoresceins、罗丹明类、对甲氨基酚类、5-carboxyfluorophoresceins(FAM)、5-(2’-氨乙基)氨基奈-1-磺酸类(EDANS)、邻氨基苯甲酰胺类、铽螯合物类、活性红4、dabcyls、硝基酪氨酸类、孔雀石绿类、德克萨斯红类、二硝基苯类、ATTO类染料、EVO类染料、DYO类染料、Alexa类染料和BODLPY类染料。

合适的FRET供体和受体或猝灭剂的选择落入技术人员知识范围内。

通常，如果检测到的FRET量与缺乏人乳头瘤病毒核酸分子的样品中的FRET在量统计学上有差异，则表明个体中存在人乳头瘤病毒。探针与核酸的杂交增加了供体和受体部分之间的距离，从而减少了FRET相互作用。例如，当使用猝灭剂时，检测到的波长发射的改变可以是发射的增加或不同波长处的发射。或者使用非猝灭供体受体时，可以存在发射减少或不同波长处的发射。

可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(epifluorescentmicroscope system)(含有适当的二色镜和滤膜用于监测特定范围内的荧光发射)、光子计数光电倍增系统，或荧光计进行荧光分析。可以使用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或被适当过滤用于在期望的范围内激发的其它高强度光源进行激发以启动能量转移。

供体和受体荧光部分优选附着于连接序列上的探针。供体和受体荧光部分可以通过连接臂附着于适当的探针寡核苷酸。各连接臂的长度也是重要的，因为连接臂会影响供体荧光部分和受体荧光部分之间的距离。就本发明的目的而言，连接臂的长度是以埃(ANG)计的、从核苷酸碱基到荧光部分的距离。通常，连接臂为约10到约25ANG。连接臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开了将连接臂附着于特定的核苷酸碱基的方法，以及将荧光部分附着于连接臂的方法。

探针必须与病原体或性传播疾病相关生物的核酸具有足够水平的同一性，从而能够在合适的条件下与来自一种或多种病原体或性传播疾病相关生物的核酸杂交。如果一条单链核酸与另一条之间形成双链体，则称它们彼此杂交。这发生在一条核酸含有的序列与另一条的反向或互补的情况下(该相同的排列引起基因组中DNA有义链和反义链之间的天然相互作用，并成为双螺旋构型的基础)。杂交区域之间的完全互补性不是形成双链体所必需的；只需配对碱基的数量足以在所用的杂交条件下维持双链体即可。通常期望探针序列和病原体基因组序列之间存在一个或多个错配。这是防止探针中形成不想要的二级结构所必需的。因此，在一个优选的实施方案中，探针中病原体独特的序列含有与病原体基因组序列的至少一个错配。合适的杂交条件是本领域技术人员公知的。例如42℃ 0.2×SSC/0.1％SDS(对中等严格条件而言)；和68℃ 0.1×SSC(对高严格条件而言)。洗涤可仅使用给定条件之一进行，或每种条件都可使用(例如以上文所列顺序在每种条件下洗涤10-15分钟)。可以重复任何或所有洗涤。最适条件可有所不同，并可由技术人员根据经验确定。

探针和病原体核酸之间的同一性程度可根据探针的功能变化。例如，可使用探针鉴定病原体所有亚种如所有HPV基因型的存在，在该情况下探针应具有与这样的序列杂交的序列，所述序列来自在所有亚种如HPV基因型中高度保守的核酸区域。

可使用探针检测来自某危险型别(例如高风险或低风险的基因型等)的病原体(例如HPV基因型)的存在。应相应地设计探针序列。例如，探针可以被设计为检测高风险基因型，能够结合类型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73，而不结合来自其它基因型的核酸。它们被称作“危险型别探针”。

或者，每种探针可以具有这样的序列，所述序列与一种特定基因型的可变区具有高水平相似性，从而所述探针能够仅与来自该基因型的核酸杂交。这类探针被称作“基因型特异性的”。人乳头瘤病毒类型特异性探针的成员可以在定义的基因型特异性区域内杂交，优选所扩增的DNA上包含SEQ ID NO：53到103的那些区域。HPV基因型特异性探针优选包含选自SEQ ID NO：33到52或SEQ ID No.105到117的序列。这些序列形成了病原体独特序列的全部或部分。

探针集合包含至少四种探针，优选5、10、15或20种不同的探针。这些探针被仔细地设计，使得茎环结构的“环”中含有的序列不仅与待检测核酸中的期望序列杂交，而且它们与其它探针环中的序列不形成二级结构。因此，探针环部分的序列通常不仅仅是与待检测基因组中序列100％互补的序列。优选人乳头瘤病毒类型特异性探针能够在定义的类型特异性区域中杂交，优选包含SEQ ID NO：53到103或SEQ ID NO.105到117的那些区域。在一个优选的实施方案中，每种探针包含选自SEQ ID NO：33到52或SEQID NO.105到117的序列。在尤其优选的实施方案中，探针集合包括：

5’TET-CGGCGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAGCCG-Dabcyl-3’

5’TET-CGGCGGGACATCCATATTACTCTATCAAAGCCG-Dabcyl-3’

5’TET-CGCGGGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAACGCG-Dabcyl-3’

5’TET-CCGGCACCCATATTTCCCCCTTAAACCGG-Dabcyl-3’

5’TET-CCGGACGACCAGCAAACAAGACACCCGG-Dabcyl-3’

5’FAM-CGGCCAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGCCG-Dabcyl-3’

5’FAM-CCGGTATCCTGCTTATTGCCACCCCGG-Dabcyl-3’

5’FAM-CGGCCATACCTAAATCTGACAATCCGCCG-Dabcyl-3’

5’FAM-GCCGTTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTTCGGC-Dabcyl-3’

5’FAM-CGGCAAAACAAGATTCTAATAAAATAGCAGCCG-Dabcyl-3’

5’FAM-CGGCTTAAAGTGGGTATGAATGGTTGGCCG-Dabcyl-3’

5’FAM-CCGGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCCGG-Dabcyl-3’

5’FAM-CGGCAGCACGCGTTGAGGTTTTAGCCG-Dabcyl-3’

5’FAM-CCGGAGTTTTAGTTCCCAAGGTGTCCCGG-Dabcyl-3’

5’FAM-CCCGCTGTGACTAAGGACAATACCAAACGGG-Dabcyl-3’

5’FAM-CGGCTTCCATCAAAAGTCCCAATAACGCCG-Dabcyl-3’

5’FAM-CGGCAAAGGTGGTAATGGTAGACAGGGCCG-Dabcyl-3’

5’FAM-CGGCAATCTGGTACCAAAACAAACATCGCCG-Dabcyl-3’

5’FAM-CGGCTTAAGGTTCCTATGTCTGGGGGCCG-Dabcyl-3’和

5’(德克萨斯红)-TTTTTT-(荧光素)-CGGCTGACATAGATCCCCATAGACAGTTGCCG-Dabcyl-3’。

来自特定危险型别的病原体的存在可以用两种方式检测。首先可以使用“危险型别”探针。优选探针集合含有多于一种类型的危险型别探针，其中每种类型被差异标记。例如，高危险型别探针能够与低危险型别探针区分开。因此，能够检测到来自任一危险型别的病原体(例如HPV)的存在。或者探针组可包含基因型特异性探针，其中针对来自某危险型别的基因型(例如高风险基因型)的所有探针均用相同的相互作用标记进行标记。因此，不能测定存在的特定基因型的身份，但是可以确认来自某型别的基因型的存在。

在优选的实施方案中，方法还包括测定双链核酸分子的解链温度，所述双链核酸分子由所述探针之一和得自所述样品的互补核酸形成。因为每种探针具有某核酸序列，所以双链核酸分子的解链温度对于每种探针而言是独特的，所述双链核酸分子由探针和得自所述样品的互补核酸形成。因此，能够检测存在的特定病原体或基因型。例如，可以使用针对某危险型别的基因型特异性探针来确定是否存在来自该型别的基因型。然后可以测定解链温度以鉴定存在何种特定的基因型。

可以在进行了检测人乳头瘤病毒科、属或型别的方法之后，或与检测人乳头瘤病毒的方法同时，进行检测个体HPV类型的方法。

如果使用多于一种探针，则它们可彼此区分开，即在某波长下激发时每种探针可检测地发射不同的信号。因此如果使用两种探针，一种与来自病原体的核酸杂交时在一个波长发射，所述波长能够与溶液中两种探针发射的波长(即不与来自病原体的核酸如HPV基因型杂交时发射的波长)以及另一个探针与来自病原体的核酸杂交时发射的波长区分开。这允许同时显现与核酸杂交的两种探针的存在。或者用不同的相互作用标记(例如FRET供体)标记两种探针，所述标记在不同的波长激发。

这可通过使用相互作用标记(例如FRET供体和受体)的不同的组合实现。感兴趣的标记的合适组合的选择对本领域技术人员而言是常规的。

方法优选利用四种或多种探针检测四种或多种病原体或基因型的存在。优选探针与固相支持物结合，从而每种类型的探针位于空间限定的位置，所述位置能够与其它探针的位置区分开。这允许使用以相同或相似的相互作用标记进行标记的探针(其在相同或相似的波长产生信号)，同时又提供了区分每种探针产生的信号的方式。或者，可以标记探针使得每种类型的探针产生不同的信号。技术人员会明白，大量可能的固相支持物在阵列领域内是广泛使用的，并且任何这些“基质”均能够用于本发明探针阵列的生产中。

在一个优选的实施方案中，提供了用于构建反应的方法，所述反应在一个反应中使用至少四种实时分子信标探针来检测靶向众多相关的检测靶标。所述方法包括选择探针结合位点，确定满足通常应用于探针的标准的探针序列(即针对完全互补性计算机程序如Primer3检查探针)，和对探针序列两端均添加碱基(优选四个或五个碱基)使得它们互补并能够形成双链茎，所述双链茎精确地刚好包括所述寡核苷酸的两端。这些结构一般被称作四茎分子信标。另外，在接近平衡加热和冷却率测量时，探针序列的解链温度应当高于茎结构的解链温度。四茎分子信标通常比其它茎长度更有利，因为其具有比更长茎分子信标更短的开关速率，并具有比更短茎分子信标更高的解链温度。

通常，探针混合物的成员与扩增产物在某定义的类型特异性区域中杂交。探针通常在一端用供体荧光部分标记，而在另一端通常用相应的受体或猝灭剂荧光部分标记。在一些实施方案中，供体荧光部分可含有荧光染料的特异性复合物，包括所谓的采集染料(harvester dye)，以迁移探针的发射波长，从而提供独特的荧光信号用于检测。所述方法还包括检测供体荧光部分和受体或猝灭剂荧光部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在、不存在或改变。FRET的存在或改变指示着生物样品中存在人乳头瘤病毒，而FRET的不存在指示生物样品中不存在人乳头瘤病毒。

通常，核酸与探针杂交并在被供体荧光部分吸收的波长下被激发。通过显现和/或测量由受体或猝灭剂荧光部分发射的波长，检测结合探针的存在与否。或者可以通过定量FRET检测。

在一个优选的实施方案中，在与所述探针集合接触之前，扩增得自样品的核酸。优选使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。扩增反应可以是PCR(参阅例如美国专利No.4,683,195和4,683,202，和Innis等编辑，PCRProtocols，(Academic Press，New York，1989)；Sambrook等，《分子克隆》(Molecular Cloning)，第二版，(Cold Spring Harbour Laboratory，NewYork 1989))。当RNA被分离并(优选通过反转录)转化为cDNA时，也可以使用PCR。优选使用Taq DNA聚合酶例如Amplitaq^TM(珀金埃尔默公司，Perkin-Elmer，Norwalk，Conn.)进行PCR。Taq聚合酶可得自MBIFermentas公司，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)，宝灵曼公司(BoehringerMannheim)和贝克曼仪器公司(Beckman Instruments)。本发明的方法中也可以使用等同的、优选热稳定的DNA聚合酶，例如Tfl(黄色栖热菌(Thermus flavus))聚合酶(Gut等，Virol.Methods 77(1)：37-46(1999))。

或者，扩增反应可以是RT-PCR(Yajima等，Clin.Chem，44(12)：2441-2445(1998)；Martell等，J.Clin.Microbiol，37(2)：327-332(1999)；Gut等，Virol.Methods 77(1)：37-46(1999)；Predhomme等，Leukemia，13(6)：957-964(1999))，其中RNA被反转录为cDNA，随后对所述cDNA进行PCR扩增。

众所周知，PCR包括DNA(或RNA)样品的提取和(优选通过热)变性。与聚合酶(其可以是热稳定的)、用于形成被扩增的序列的dNTP一起，添加摩尔过量的寡核苷酸引物。设计寡核苷酸引物，与期望扩增序列的相反末端杂交。在第一轮扩增中，聚合酶复制DNA，产生两条始于相应引物的“长产物”。然后变性总DNA并进行第二轮聚合反应(例如通过降低温度)，所述总DNA包括所述两条长产物和两条原始链。第二轮的结果是两条原始链、来自第一轮的两条长产物、(产自原始链的)两条新的长产物，和产自长产物的两条“短产物”。这些短产物具有靶序列(有义或反义)的序列，每个末端带有一个引物。对于每轮额外的扩增而言，短产物的数量指数增长，每轮产生两条额外的长产物和大量短产物，所述短产物等于前一轮结束时剩余的长和短产物之和。

寡核苷酸引物可以通过多种途径合成，例如Ozaki等，Nuc.Acids Res.20：5205-5214(1992)；Agrawal等，Nuc.Acids Res.18：5419-5423(1990)等等。寡核苷酸引物可通过自动DNA合成仪(例如应用生物系统公司，AppliedBiosystems，Inc，Foster City，California 392或394型DNA/RNA合成仪)使用标准化学如亚磷酰胺化学(Beaucage和Iyer，Tetrahedron 48：2223-2311(1992)、美国专利No.4980460、4725677、4415732、4458066和4973679)便利地合成。也可使用其他化学(包括非天然主链基团如硫代磷酸酯和磷酰胺)，只要得到的寡核苷酸的杂交效率不受不良影响即可。DNA引物的精确长度和序列将取决于要扩增的靶多核苷酸。优选DNA引物的长度范围为10到60个核苷酸，更优选范围为15到30个或25个核苷酸。

优选持续监测扩增核酸的产量。本文使用“持续监测”表示定期测量扩增产物的量。例如，可以在第一个扩增循环后和此后在每一个、两个或五个循环后进行读数。或者可以在某时间段(例如每一、二、五或十秒)对存在的扩增产物的量进行测量。这允许“实时”地监测所述过程。本领域技术人员应当理解，随着循环经过退火、扩增和变性的不同阶段时，结合的探针产生的信号水平会波动。

与FRET技术结合的常规PCR方法能够用于实施本发明的方法。在一个实施方案中，使用快速热循环仪如LIGHTCYCLER^TM设备。LIGHTCYCLER^TM系统和PCR的实时和在线监测的详细描述可见于罗氏(Roche)网站。以下的专利申请描述了LIGHTCYCLER^TM技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。LIGHTCYCLER^TM设备是利用高品质光学的与小体积荧光计组合的快速热循环仪。该快速热循环技术使用薄玻璃管作为反应器。通过交替的加热的空气和环境空气来控制反应室的加热和冷却。因为低的空气质量以及管的高表面积与体积比，可在热量室中达到非常快速的温度改变速率。该设备允许实时和在线地监测PCR。另外，反应管起信号收集光学元件的作用(与玻璃光纤相似)，将信号集中在管端。效果是有效的光照和小体积样品的荧光监测。放置反应管的旋转式传送带(carousel)可以从设备中取出。因此，可以在设备外对样品上样(例如在PCR清洁室中)。另外，该特征允许对样品旋转式传送带容易地清洁和灭菌。荧光计作为装置的一部分放置光源。发射的光经过滤并由落射光照透镜(epi-illumination lens)聚焦在管顶。然后用相同的透镜将从样品发射的荧光聚焦、经过二色镜、适当地过滤，并聚焦在数据收集滤光片(photohybrid)上。设备中的光学单元优选包括三带通滤波器(530nm、640nm和710nm)，所述滤波器提供了六种色彩的检测和若干种荧光捕获选项。然而，本发明不受商业可获得的设备的构造限制。数据收集选项包括每个循环步骤监测一次、用于解链曲线分析的完全连续单样品采集、连续取样(其中取样频率取决于样品数量)和/或限定的温度间隔后所有样品的分步测量。热循环仪优选使用PC工作站操作并可使用Windows NT操作系统。当机器将毛细管相继地定位到光学单元上时获得来自样品的信号。所述软件可以在每次测量后立即实时展示荧光信号。荧光采集时间是10-100msec。在每步循环后，可以对所有样品持续地更新相对于循环数的荧光定量展示。产生的数据可存储用于进一步分析。

在优选的实施方案中，使用至少一个选自SEQ ID NO 1到32的引物，优选使用包括SEQ ID NO 1到32的引物混合物扩增核酸。

在一个优选的实施方案中，该方法使用人工或天然的内部对照DNA，优选通过在不同的、可区分的波长处检测信号或FRET发射，或不考虑使用的发射波长，检测固相结合探针的空间可分辨定位处的发射改变。

上述方法还可以包括防止来自先前扩增反应的污染核酸的扩增。防止这类不想要的扩增可以包括在存在尿嘧啶时进行扩增步骤，并在第一步扩增前用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理生物样品。另外，可以对独立的对照样品进行循环步骤，以确定合适的扩增条件。对照样品可以包括人乳头瘤病毒核酸分子的一部分。或者，这样的对照样品可以使用一对对照引物扩增并使用一对对照探针杂交。如果样品中存在对照模板且对照探针与对照扩增产物杂交，则产生了对照扩增产物。

对得自生物样品的核酸进行本发明的方法。代表性的生物样品包括子宫颈刮取物、活检、涂片或石蜡组织切片，人乳头瘤病毒感染发生的解剖学位点的其它刮取物，和尿。优选样品选自支气管吸出物(aspirate)、尿液、前列腺按摩液(massate)、精液(ejaculatum)、血液和宫颈、外阴、肛门、生殖器、皮肤或喉细胞学样品、刮取物或活组织检查。

另一方面，本发明提供了包含至少四种探针的探针集合，其中每种所述探针包含与来自病原体的序列互补的、侧接四对或五对互补碱基的序列，其中所述碱基在不与来自病原体的核酸杂交时形成茎结构，其中所述探针用第一相互作用标记和第二相互作用标记进行标记，从而所述探针与来自所述病原体的核酸的杂交引起检测信号的改变。

涉及探针的第一方面的优选的实施方案适用于第二方面。

如上所述，选择形成探针“环”部分的序列，使得它们不仅与靶生物中期望的序列杂交，而且它们与其它探针的环区域不形成二级结构。因此，第三方面，本发明提供了包含SEQ ID NO.33到52或SEQ ID NO.105-117中任一的核酸序列。这些核酸序列可在其它方法中用于检测一种或多种HPV基因型的存在。因此，本发明还提供了本发明的核酸用于检测至少一种HPV基因型存在与否的用途。优选在持续监测得自样品的核酸的扩增的方法中使用所述核酸。

这类方法包括TAQMAN^TM技术，序列作为scorpion分子一部分的用途和其它基于PCR的方法。

TAQMAN^TM技术检测扩增产物的存在与否，从而检测人乳头瘤病毒的存在与否。TAQMAN^TM技术利用一个单链杂交探针，所述探针用两种荧光部分标记。当第一荧光部分被合适波长的光激发时，根据FRET的原理，吸收的能量被转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤中，标记的杂交探针与靶DNA结合，并在随后的延伸阶段被Taq聚合酶的5’到3’外切核酸酶活性降解。结果，被激发的荧光部分和第二荧光部分彼此在空间上被隔开。结果，不存在第二荧光部分时激发第一荧光后，来自第一荧光部分的荧光发射可检测地被改变。例如，如果第二荧光部分是猝灭剂，来自第一荧光部分的荧光发射增加，并因此可以被检测。举例而言，ABI PRISM^TM 7700序列检测系统(应用生物系统公司，Applied Biosystems，Foster City，Calif.)使用TAQMAN^TM技术，并适用于实施检测人乳头瘤病毒的方法。使用ABI PRISM^TM 7700系统进行PCR扩增和检测的信息可见于应用生物系统公司(Applied Biosystems)的网站。

本发明第六方面提供了鉴定最小引物集合的方法，所述引物扩增来自两种或多种相关生物的核酸序列，所述方法包括：

(a)鉴定所述生物之间具有至少30％同一性的引物结合位点；

(b)设计能够在(a)中鉴定的引物位点处启动扩增的引物集合，其中每种所述引物与至少一种所述生物的引物结合位点具有不多于3个错配，且其中每种所述引物之间存在4个或更少核苷酸的差异；和

(c)确定检测可能的最大数目所述生物所需的最小引物数目；

(d)确定所述引物集合中确保来自所有所述生物的核酸序列等同扩增所需的每种引物的相对量。

本文使用“相关生物”是指来自相同纲、属或种，并具有高水平遗传相似性的生物，优选至少80％的同一性，更优选90％同一性。相关生物优选为病毒，更优选人乳头瘤病毒。引物优选扩增人乳头瘤病毒的L1区。

两核酸序列的同一性百分比通过将序列就最佳比较的目的(例如可以在第一个序列中引入空位，用于与序列最佳比对)进行比对，并比较相应位置上的核苷酸来确定。“最佳比对”是指导致最高同一性百分比的两序列比对。通过比较的序列中相同的核苷酸数确定同一性百分比(即同一性％＝相同位置数/位置总数×100)。

可以使用本领域技术人员公知的数学算法完成两序列之间的同一性百分比测定。用于比较两个序列的数学算法的一个实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci USA 87：2264-2268的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中所述经改良。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST程序整合了这样的算法。BLAST核苷酸搜索可以使用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。为了获得有空位的比对用于比较的目的，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述使用空位BLAST(Gapped BLAST)。或者可使用PSI-Blast进行重复搜索(iterated search)，所述搜索检测分子之间的距离关系(Id)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。用于比较序列的数学算法的另一实例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。属于CGC序列比对软件包一部分的ALIGN程序(2.0版)整合了这样的算法。本领域已知的用于序列分析的其它算法包括如Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci，10：3-5所述的ADVANCE和ADAM；和Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.55：2444-8中所述的FASTA。在FASTA中，ktup是设定搜索灵敏度和速度的控制选项。

最小引物集合是含有从所需的尽可能多的相关生物中扩增核酸序列所需的最小数目引物的引物集合。所述引物集合可任选地含有校正引物，其被用于在特定引物结合位点上控制引物之间的引发差异。校正引物应当与引物结合位点具有不多于三个错配，所述引物结合位点是它们被设计作用的引物结合位点。校正引物的添加有助于在检测中产生至少为所有旨在被检测生物(例如所有人乳头瘤病毒)的两个数量级或更高的灵敏度水平。

本文使用“错配”是指引物中的碱基不根据Watson-Crick碱基配对原则与引物结合位点中相应的碱基形成碱基对。在两个相应的碱基不符合Watson-Crick标准(例如C-T、G-A)的情况下形成错配。错配优选在引物最接近5’端的一半中，更优选形成引物5’端之前的3个核苷酸。

引物集合中的每种引物之间仅存在4个或更少核苷酸的差异。因此，如果引物在长度上全部为15个核苷酸，则一种引物中的11个核苷酸与其它每种引物中的11个核苷酸相同。相同的核苷酸优选不是连续的。

在一个优选的实施方案中，提供了用于构建高度复杂的人乳头瘤病毒扩增多元反应的方法。所述方法包括选择适当接近的保守的引物结合位点(少于70％变异性)。所述引物结合位点应当以彼此间这样的距离定位，所述距离确保产生适当大小的扩增子。优选产生长度为30-160个核苷酸的扩增子，更优选长度为40-120、50-100、60-90或70-80个核苷酸。尤其优选长度130和160个核苷酸的扩增子。引物构成了所产生的扩增子的部分。引物优选长度为10-30个核苷酸，更优选长度为12-25、15-22或18、19、20或21个核苷酸。然后确定完整的引物集合的序列，其中引物满足通常施加于引物的标准(即针对完全互补性计算机程序如Primer3检查引物)，并设计与所有旨在被扩增的相关生物(如人乳头瘤病毒类型)仅具有三个错配(优选位于引物一端，更优选位于5’端)的可能的最小引物数。另外，所述引物应与几乎等同数目的类型结合，而具有不多于三个错配。其它扩增差异通过改变引物的相对浓度控制。得到的检测灵敏度优选对旨在检测的所有相关生物(例如人乳头瘤病毒类型)而言在至少两个数量级之内。

相对于近来本领域所遵循的后续添加引物和试错法的技术而言，这为重大的成就。设计的方法使竞争保持最小量。存在针对所有靶标的被校正的引发效率，导致高度等同的扩增灵敏度。另外，通过确保引物优选在其5’端可变降低了误引发的概率。

引物混合物能够扩增至少一种人乳头瘤病毒类型L1区，优选包含SEQID NO.53到103。优选包含至少一个来自SEQ ID NO.1到16的正向引物和至少一个来自SEQ ID NO 17到32的反向引物。

本发明的第七方面提供了可以通过第六方面的方法获得的引物集合，所述集合包含至少一个选自SEQ ID NO 1到32的引物。优选包含至少一个来自SEQ ID NO.1到16的正向引物和至少一个来自SEQ ID NO 17到32的反向引物。更优选包括SEQ ID NO 1到32。

另一方面，本发明提供了用于检测一种或多种病原体的试剂盒，所述试剂盒包含第二方面定义的探针集合。所述试剂盒优选还包含根据第六方面的方法鉴定的引物集合。

另外，本发明提供了用于检测一种或多种病原体的试剂盒，所述试剂盒包含根据第六方面的方法鉴定的引物集合。

优选所述试剂盒可用于检测与性传播疾病相关的一种或多种生物，优选HPV基因型。优选探针包含选自SEQ ID NO.17到33的序列。探针集合优选包含至少一个选自SEQ ID NO 1到32的序列，更优选至少一个选自SeqID No 1到16的序列和至少一个选自SEQ ID NO 17-32的序列。最优选引物混合物包括SEQ ID NO.1-32的引物。

优选试剂盒还包含内部对照。

试剂盒还包含包装标签或包装插页，其上记载着有关使用引物混合物和探针检测生物样品中人乳头瘤病毒存在与否的说明书。

试剂盒可还包含其它成分，例如PCR所需的试剂。这类试剂包括缓冲液、合适的DNA聚合酶，和dNTP如dATP、dCTP、dGTP和dTTP。试剂盒成分可以存在于大量瓶或其它容器中。试剂可以是冻干的，随后在用前重构。或者所述成分可以提供在即用型的适当缓冲的溶液中。这类溶液可含有合适的防腐剂。

除非另有说明，本文使用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。下文描述了合适的方法和材料，不过与本文公开的相似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或检验。另外，材料、方法和实施例仅用于举例说明目的而非旨在限制。本文提到的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考文献都以其整体并入本文作为参考。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

本发明通过以下的非限制性实施例举例说明。本发明的其它特征、对象和优点将会由于附图和详细说明以及权利要求书而变得显而易见。

实施例1

实时PCR检测高危型和低危型HPV DNA

总反应体积为20μl，包括以下成分：2μl(～0,2pg)克隆的HPV DNA、18μl聚合酶缓冲液(终浓度90mM TRIS-HCl(pH＝8,0)、1mM DTT、50mMKCl、7mM MgCl₂、1％ Tween-20(希格玛公司，SIGMA)、1％ Ficoll、1％PVP、250μM每种dNTP(ATP，CTP，GTP，TTP)(普洛麦格公司，Promega)、0,28μM每种引物：SEQ.ID.NO：1-32、0.18μM每种分子信标SEQ.ID.NO：33-52，和7,5U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(罗氏，ROCHE))。反应在LightCycler 2.0PCR热循环仪中进行，参数如下：

步骤1：95℃ 10分钟；

步骤2：55℃ 5分钟；

步骤3：1-37个循环：95℃ 30秒、42℃ 60秒-单检测模式，和72℃ 30秒。

通过分子信标SEQ.ID.NO：38-51检测高危型HPV。在530nm处收集荧光数据。

通过分子信标SEQ.ID.NO：33-37检测低危型HPV基因型。在560nm处收集荧光数据。

通过分子信标SEQ.ID.NO：52检测反应内部对照。在610nm处收集荧光数据。

成功地检测了以下基因型：低危型(6、11、42，43、44/55)、高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)和内部对照。

实施例2

实时PCR检测HPV16、HPV18和HPV6、HPV11 HPV DNA

总反应体积为20μl，包括以下成分：2μl(～0,2pg)克隆的HPV DNA、18μl聚合酶缓冲液(终浓度90mM TRIS-HCl(pH＝8,0)、10mM DTT、50mM KCl、7mM MgCl₂、1％ Tween-20(希格玛公司，SIGMA)、1％ Ficoll、1％ PVP、250μM每种dNTP(ATP，CTP，GTP，TTP)(普洛麦格公司，Promega)、0,28μM每种引物：SEQ.ID.NO：1-32、0.18μM每种分子信标SEQ.ID.NO：33、34、38、39、52，和7,5U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(罗氏，ROCHE))。反应在LightCycler 2.0 PCR热循环仪中进行，参数如下：

步骤1：95℃ 10分钟；

步骤2：55℃ 5分钟；

通过分子信标SEQ.ID.NO：38-39检测HPV16和HPV18基因型。在530nm处收集荧光数据。

通过分子信标SEQ.ID.NO：33-34检测HPV6和HPV 11基因型。在560nm处收集荧光数据。

成功地检测了以下基因型：低危型(6、11)、高危型(16、18)和内部对照。

附录1

正向引物

SEQ.ID.NO：1 KP-F/1 CGCACCAACATATTTTATT

SEQ.ID.NO：2 KP-F/2 CGCACAAGCATCTATTATTA

SEQ.ID.NO：3 KP-F/3 CGCACAAGCATATTTTATC

SEQ.ID.NO：4 KP-F/4 CGCACCAGTATATTTTATCA

SEQ.ID.NO：5 KP-F/5 CGCACAAGCATTTACTATCA

SEQ.ID.NO：6 KP-F/6 CGCACCAACTACTTTTACC

SEQ.ID.NO：7 KP-F/7 CGTACCAGTATTTTCTACCAC

SEQ.ID.NO：8 KP-F/8 CGCACAGGCATATATTACT

SEQ.ID.NO：9 KP-F/9 CGCACCAACATATATTATCA

SEQ.ID.NO：10KP-F/10 CGTACCAACCTGTACTATTATG

SEQ.ID.NO：11KP-F/11 GCACCAACTTATTTTACCAT

SEQ.ID.NO：12KP-F/12 ACCAACCTCTTTTATTATGG

SEQ.ID.NO：13KP-F/13 AGCACAAATATATTATTATGG

SEQ.ID.NO：14KP-F/14 CGCACCGGATATATTACT

SEQ.ID.NO：15KP-F/15 CGCACAAATATTTATTATTATGC

SEQ.ID.NO：16KP-F/16 CGGACGAATGTTTATTACC

反向引物

SEQ.ID.NO：17L1C2 TACCCTAAATACTCTGTATTG

SEQ.ID.NO：18L1R2 TACCCTAAATACCCTATATTG

SEQ.ID.NO：19R1 AATTCTAAAAACTCTGTACTG

SEQ.ID.NO：20R45 TACTCTAAATACTCTGTATTG

SEQ.ID.NO：21R11 TACCTTAAACACTCTATATTG

SEQ.ID.NO：22R16 TATTCTAAATACCCTGTATTG

SEQ.ID.NO：23R42 AACTCTAAATACTCTGTACTG

SEQ.ID.NO：24R44 CATCTTAAAAACCCTATATTG

SEQ.ID.NO：25R03 AACCCTAAACACCCTGTATTG

SEQ.ID.NO：26R04 AACGCGAAAAACCCTATATTG

SEQ.ID.NO：27R05 TACCCTAAAGACCCTATACTG

SEQ.ID.NO：28R06 AACTCTAAATACCCTATACTG

SEQ.ID.NO：29R07 AACGTGAAATACACGATATTG

SEQ.ID.NO：30R08 CACACGGAACACCCTGTACTG

SEQ.ID.NO：31R54 CACCCTAAACACCCTATATTG

SEQ.ID.NO：32R85 AACCCGAAACACTCGATACTG

探针序列

SEQ.ID.NO：33HPV6B3：GGGTCATCCTTATTTTTCCATAA

SEQ.ID.NO：34HPV11B2：GGGACATCCATATTACTCTATCAAA

SEQ.ID.NO：35HPV42B2：GGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAA

SEQ.ID.NO：36HPV43B2：CACCCATATTTCCCCCTTAAA

SEQ.ID.NO：37HPV44/55B2：ACGACCAGCAAACAAGACAC

SEQ.ID.NO：38HPV16B5：CAATAACAAAATATTAGTTCCTAAA

SEQ.ID.NO：39HPV18B8：TATCCTGCTTATTGCCACC

SEQ.ID.NO：40HPV31B5：CATACCTAAATCTGACAATCC

SEQ.ID.NO：41HPV33B7：TTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTT

SEQ.ID.NO：42HPV35B2：AAAACAAGATTCTAATAAAATAGCA

SEQ.ID.NO：43HPV39B3：TTAAAGTGGGTATGAATGGTTG

SEQ.ID.NO：44HPV45B3：GCTGTTCCTAAGGTATCCG

SEQ.ID.NO：45HPV51B2：AGCACGCGTTGAGGTTTTA

SEQ.ID.NO：46HPV52B2：AGTTTTAGTTCCCAAGGTGTC

SEQ.ID.NO：47HPV56B2：CTGTGACTAAGGACAATACCAAA

SEQ.ID.NO：48HPV58B2：TTCCATCAAAAGTCCCAATAAC

SEQ.ID.NO：49HPV59B2：AAAGGTGGTAATGGTAGACAGG

SEQ.ID.NO：50HPV66B2：AATCTGGTACCAAAACAAACATC

SEQ.ID.NO：51HPV68B2：TTAAGGTTCCTATGTCTGGGG

SEQ.ID.NO：52HPV-ICB2：TGACATAGATCCCCATAGACAGTT

SEQ.ID.NO：53

>Hpv2a

cgga ctaatgtgta ttaccatggt ggcagttcta ggcttctcac tgtgggtcat ccatattact ctataaagaa gagtaataat

aaggtggctg tgcccaaggt atctgggtac caatatcgtg tatttcacgt g

SEQ.ID.NO：54

>HPV3

cgc accaacattt attattatgc aggcagttct cgcttgctga ccgtgggtca tccttatttt gctatcccca aatcttctaa

ttccaagatg gatattccta aggtgtccgc ctttcaatat agagtgttta gggtg

SEQ.ID.NO：55

>HPV6

cgcacca acatatttta tcatgccagc agttctagac ttcttgcagt gggtcatcct tatttttcca taaaacgggc

taacaaaact gttgtgccaa aggtgtcagg atatcaatac agggtattta

aggtg

SEQ.ID.NO：56

>hpv11

cgcacc aacatatttt atcatgccag cagttctaga ctccttgctg tgggacatcc atattactct atcaaaaaag

ttaacaaaac agttgtacca aaggtgtctg gatatcaata tagagtgttt aaggta

SEQ.ID.NO：57

>HPV13

cgtac caacatattt tatcatgcta gcagttctag actacttgca gtgggaaatc cttattttcc tattaagaaa caaaacaaaa

ctgttgtccc taaggtatct ggttatcagt ttagggtatt taaagtt

SEQ.ID.NO：58

>HPV16

cgcacaa acatatatta tcatgcagga acatccagac tacttgcagt tggacatccc tattttccta ttaaaaaacc

taacaataac aaaatattag ttcctaaagt atcaggatta caatacaggg tatttagaat a

SEQ.ID.NO：59

>HPV18

c ccacaagcat attttatcat gctggcagct ctagattatt aactgttggt aatccatatt ttagggttcc tgcaggtggt

ggcaataagc aggatattcc taaggtttct gcataccaat atagagtatt tagggtg

SEQ.ID.NO：60

>HPV26

cgcacc ggcatatatt attatgcggg cagctctcgt ttattaacat taggacatcc atatttttcc atacctaaaa ctggccaaaa

ggccgaaatt cctaaggtat ctgcctatca gtacagggta tttagagtg

SEQ.ID.NO：61

>HPV27

cggacgaatg tctattacca tggtggcagt tctaggctcc tcactgtcgg ccacccatat tattctataa agaagggtag

caataatagg ttggcagtgc ctaaggtgtc cggctaccaa taccgtgtat ttcacgtt

SEQ.ID.NO：62

>HPV28

cgca ccaatattta ttattatgca ggcacttctc ggttgctgac cgtgggtcat ccttattttc ccattcctaa atcatccact

aacaaagcag atgtgcccaa agtgtccgcc tttcagtata gggtattccg ggtg

SEQ.ID.NO：63

>HPV29

c gcacaaatat ttattattat gcaggcagtt ctcgcctgct cactgtgggt catccacatt attcaattcc caaatcctct

ggtaataagg tagatgtgcc taaggtgtct gcatttcagt acagggtttt ccgtgtg

SEQ.ID.NO：64

>HPV30

cg caccaatata ttttatcatg caggcagctc acgtttgctt gctgttggac atccatatta ttctatttct aaggctggta

attccaaaac agatgttccc aaggtgtctg catttcagta tagggtcttt agggtc

SEQ.ID.NO：65

>HPV31

cg aaccaacata tattatcacg caggcagtgc taggctgctt acagtaggcc atccatatta

ttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta ccaaaggtgt caggattaca atatagggta tttagggtt

SEQ.ID.NO：66

>HPV33

cgcacaagca tttattatta tgctggtagt tccagacttc ttgctgttgg ccatccatat ttttctatta aaatcctac

taacgctaaa aaattattgg tacccaaagt atcaggcttg caatataggg tttttagggt c

SEQ.ID.NO：67

>HPV34

cg cacaaatata tattattatg caggtagtac acgcttgctg gcagtaggac atccctatta tcctataaag gatactaatg

ggaaacgtaa gattgctgta cctaaagttt caggtttgca atacagggta tttagaata

SEQ.ID.NO：68

>HPV35

cgcacaaaca tctactatca tgcaggcagt tctaggctat tagctgtggg tcacccatac tatgctatta aaaaacaaga

ttctaataaa atagcagtac ccaaggtatc tggtttgcaa tacagagtat ttagagt

SEQ.ID.NO：69

>HPV39

c gcacaggcat atattattat gctggcagct ctagattatt aacagtagga catccatatt ttaaagtggg tatgaatggt

ggtcgcaagc aggacattcc aaaggtgtct gcatatcaat atagggtatt tcgcgtg

SEQ.ID.NO：70

>HPV40

cgcaccag tttatattat catgctggta gtgccaggtt actgactata ggacatccat actttgagtt aaaaaaaccc

aatggtgaca tttcagtgcc taaggtttct ggacatcaat acagggtatt tagggta

SEQ.ID.NO：71

>HPV42

cgcacca actactttta ccatgccagc agttctaggc tattggttgt tggtcaccct tattactcta ttacaaaaag

gccaaataag acatctatcc ccaaagtgtc tggtttacag tacagagtat ttagagtt

SEQ.ID.NO：72

>HPV43

cgcaccaact tattttatta tgctggcagt tcacgtttgc ttgcagtggg tcacccatat ttccccctta aaaattcctc

tggtaaaata actgtaccta aggtttctgg ttatcaatac agagtattta gagtt

SEQ.ID.NO：73

>HPV44

cgc accaacatat attaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtgggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa

gacacttgtg cctaaggttt cgggatttca atatagggtt tttaagatg

SEQ.ID.NO：74

>HPV45

cgcaca agcatatttt atcatgcagg cagttcccga ttattaactg taggcaatcc atattttagg

gttgtaccta atggtgcagg taataaacag gctgttccta aggtatccgc atatcagtat agggtgttta gagta

SEQ.ID.NO：75

>HPV51

cgc accggcatat attactatgc aggcagttcc agactaataa cattaggaca tccctatttt ccaataccta aaacctcaac

gcgtgctgct attcctaaag tatctgcatt tcaatacagg gtatttaggg ta

SEQ.ID.NO：76

>HPV52

c gcacaagcat ctattattat gcaggcagtt ctcgattact aacagtagga catccctatt tttctattaa aaacaccagt

agtggtaatg gtaaaaaagt tttagttccc aaggtgtctg gcctgcaata cagggtattt agaatt

SEQ.ID.NO：77

>HPV53

cgcaccact atattttatc atgctggaag ctctcgcttg cttaccgtgg gacatcctta ttaccccatt tctaaatctg

gtaaagcaga catccctaag gtgtctgcat ttcagtatag ggtgtttaga gta

SEQ.ID.NO：78

>HPV54

cgcaca agcatatact atcatgcaag cagctctaga ttattggctg ttggacatcc atattttaaa

gtacaaaaaa ccaataataa gcaaagtatt cctaaagtat caggatatca atatagggtg tttagggtg

SEQ.ID.NO：79

>HPV55

cgc accaacatag tttaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtaggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa

gacacttgtg cctaaagttt caggatttca atatagggtt tttaaggtg

SEQ.ID.NO：80

>HPV56

cgcacta gtatatttta tcatgcaggc agttcacgat tgcttgccgt aggacatccc tattactctg tgactaagga

caataccaaa acaaacattc ccaaagttag tgcatatcaa tatagggtat ttagggta

SEQ.ID.NO：81>HPV57

cgg acgaatgttt attatcatgg tgggagctct cggctcctca cagtaggcca tccatattat tctataaaaa aaagtggcaa

taataaggtg tctgtgccca aggtatcggg ctaccagtac cgtgtgttcc atgtg

SEQ.ID.NO：82

>HPV58

c gcacaagcat ttattattat gctggcagtt ccagactttt ggctgttggc aatccatatt tttccatcaa aagtcccaat

aacaataaaa aagtattagt tcccaaggta tcaggcttac agtatagggt ctttagggtg

SEQ.ID.NO：83

>HPV59

cgtaccag tattttctac cacgcaggca gttccagact tcttacagtt ggacatccat attttaaagt

acctaaaggt ggtaatggta gacaggatgt tcctaaggtg tctgcatatc aatacagagt atttagggtt

SEQ.ID.NO：84

>HPV61

cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tcccgtctgc ttactgtagg acatccctat tgtagtttgc agcttgatgg

gctgcagggc aagaaaaaca ctatccccaa ggtgtctggc tatcaatata gggtgtttag ggta

SEQ.ID.NO：85

>HPV62

cgcacca acctttttta ttatgggggc agctcccgcc ttcttactgt gggacatcca tattgtactt tacaggttgg

ccagggtaaa cgggccacca ttcctaaggt gtctgggtat cagtacaggg tgtttcgtgt

g

SEQ.ID.NO：86

>HPV66

cgtacca gtatatttta tcatgcaggt agctctaggt tgcttgctgt tggccatcct tattactctg tttccaaatc tggtaccaaa

acaaacatcc ctaaagttag tgcatatcag tatagagtgt ttagggta

SEQ.ID.NO：87

>HPV67

cgcacaag catttactat tacgctggta gctccagact tttagctgta ggccatcctt acttttccat tcctaatccc tccaacacta

aaaaggtgtt agtgcccaag gtgtcaggtt tgcagtatag ggtatttagg gtt

SEQ.ID.NO：88

>HPV68

cgcactggca tgtattacta tgctggtaca tctaggttat taactgtagg ccatccatat tttaaggttc ctatgtctgg

gggccgcaag cagggcattc ctaaggtgtc tgcatatcaa tacagagtgt ttagggtt

SEQ.ID.NO：89

>HPV69

cgcac cggatatatt actatgcagg cagctctcga ttattaactt tgggtcatcc ctattttcca attcctaaat ctggttcaac

agcagaaatt cctaaagtgt ctgcttacca atatagggtt tttcgtgtt

SEQ.ID.NO：90

>HPV70

cgta caggcatata ttattatgct ggaagctctc gcttattaac agtagggcat ccttatttta aggtacctgt aaatggtggc

cgcaagcagg aaatacctaa ggtgtctgca tatcagtata gggtatttag ggta

SEQ.ID.NO：91

>HPV72

cgcacca acctctatta ttatggtggc agttctcgtc tactaactgt aggacatcct tactgtgcca tacctctcaa

cggacagggc aaaaaaaaca ccattcctaa ggtttcgggg tatcaataca gggtgtttag agta

SEQ.ID.NO：92

>HPV73

agaaca aatatatatt attatgcagg tagcacacgt ttgttggctg tgggacaccc atattttcct atcaaggatt ctcaaaaacg

taaaaccata gttcctaaag tttcaggttt gcaatacagg gtgtttaggc tt

SEQ.ID.NO：93

>HPV74

cgcacc aacatctttt atcatgctag cagttctaga ctacttgctg taggaaatcc ctatttccct ataaaacagg ttaacaaaac

agttgttcct aaagtgtctg gatatcaatt tagggtgttt aaggtg

SEQ.ID.NO：94

>HPV81

cgcacc aacctttttt attatggggg cagttcccgc cttcttactg tagggcatcc atattgtaca ttaactattg gtacccaagg

aaagcgttcc actattccca aggtgtctgg gtatcagtac cgggtgtttc gtgtg

SEQ.ID.NO：95

>HPV82

cgc accggcatat attattatgc aggcagttcc agacttatta ccttaggaca tccatatttt tcaataccca aaaccaatac

acgtgctgaa atacctaagg tatctgcctt tcagtatagg gtgtttaggg ta

SEQ.ID.NO：96

>HPV83

cg caccaacctc ttttattacg gtggcagctc cagacttctt accgtaggac atccatatta tcctgtacag gttaatggtc

aaggaaaaaa agccactatc cccaaggttt ctggctacca atatagggtg tttcgcatt

SEQ.ID.NO：97

>HPV84

cgcaccaac ttattttatt atggtggtag ttctcgcctg cttactgtgg gacatccata ttattctgtt cctgtgtcta cccctgggca

aaacaacaaa aaggccacta tccccaaggt ttctgggtat caatacaggg tgtttagggt c

SEQ.ID.NO：98

>HPV85

cgta ccagtacatt ttatcatgct ggcagctcta ggcttctaac cgttggacat ccatactata aagttacctc aaatggaggc

cgcaagcaag acattcctaa agtgtctgcc tatcagtatc gagtgtttcg ggtt

SEQ.ID.NO：99

>HPV86

cgtaccaac ctattttatt atggtggtag ttcccgcttg cttactgtgg gccatccata ttatcctgtt actgtttcct ccagccctgg

acaaaacaac aaaaaggcca atattcccaa ggtttcgggg tatcaataca

gggtttttag ggtg

SEQ.ID.NO：100

>HPV87

cgcaccaac ttattttatt atggtggcag ttctcgcctg cttactgtgg gtcaccctta ctatccagtt actgttacca

cccctggtca gaacaagaaa tccaatattc caaaggtgtc tggctatcag tacagggtgt ttcgggtg

SEQ.ID.NO：101

>HPV89

cgtaccaac ctgtactatt atggaggcag ctcccgcctt attacagttg gccaccctta ttatactgta caggtcaatg

gtgctaacaa aaaggccaac atacctaagg tatcagggta tcaatacagg gtatttaggg ta

SEQ.ID.NO：102

>HPV90

agaacaaacata tattattatg caggcagttc ccgactgtta actgttggcc atccttattt tgctatcaaa aagcaatcag

gaaaaaaccc tatagtggtt cccaaggtgt ctggatatca atatagggtg tttagggta

SEQ.ID.NO：103

>HPV91

cgcacc aacttatttt accatgctgg cagttcccgt ttactggctg tgggccaccc tttttttcct ataaaaaata attctggtaa

agtaattgtt cctaaagttt caggtcacca atatagggtg tttagagtt

SEQ.ID.NO：104

HPV-IC

CGGACGAATGTTTATTACCAGATAGATAGAGATAGATACCCATATACAGATAAT

GACATAGATCCCCATAGACAGTTTATACAGATCAGTAGCAGTTTTTATATATGA

GATGATGATAGCAATACAGAGTATTTAGGGTA

SEQ.ID.NO：105HPV11B3/2：AAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTG

SEQ.ID.NO：106HPV42B1：CAAAAAGGCCAAATAAGACA

SEQ.ID.NO：107HPV43B6：CCCCCTTAAAAATTCCTCT

SEQ.ID.NO：108HPV44/55B1 ATACGACCAGCAAACAAGAC

SEQ.ID.NO：109HPV39B4：TATGAATGGTGGTCGCAAG

SEQ.ID.NO：110HPV52B7：AAAACACCAGTAGTGCTAATG

SEQ.ID.NO：111HPV56B3：CCAAAACAAACATTCCCAA

SEQ.ID.NO：112HPV59B3：ATCCATATTTTAAAGTACCTAAAG

SEQ.ID.NO：113HPV66B1：CAAATCTGGTACCAAAACAAA

SEQ.ID.NO：114HPV-ICB4：CCCATAGACAGTTTATACAGATCA

SEQ.ID.NO：115HPV6B6：ATAAAACGGGCTAACAAAA

SEQ.ID.NO：116HPV26B1：TACCTAAAACTGGCCAAAAG

SEQ.ID.NO：117HPV35B4：ATTCTAATAAAATAGCAGTACCCAAG

序列表

<110> 类基因有限责任公司

<120> 检测病原体的方法

<130> P38434WO

<150> US 60/737006

<151> 2005-11-15

<150> GB 0523250.9

<151> 2005-11-15

<160> 117

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 1

cgcaccaaca tattttatt 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 2

cgcacaagca tctattatta 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 3

cgcacaagca tattttatc 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 4

cgcaccagta tattttatca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 5

cgcacaagca tttactatca 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 6

cgcaccaact acttttacc 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 7

cgtaccagta ttttctacca c 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 8

cgcacaggca tatattact 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 9

cgcaccaaca tatattatca 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 10

cgtaccaacc tgtactatta tg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 11

gcaccaactt attttaccat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 12

accaacctct tttattatgg 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 13

agcacaaata tatattatta tgg 23

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 14

cgcaccggat atattact 18

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 15

cgcacaaata tttattatta tgc 23

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 16

cggacgaatg tttattacc 19

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 17

taccctaaat actctgtatt g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 18

taccctaaat accctatatt g 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 19

aattctaaaa actctgtact g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 20

tactctaaat actctgtatt g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 21

taccttaaac actctatatt g 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 22

tattctaaat accctgtatt g 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 23

aactctaaat actctgtact g 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 24

catcttaaaa accctatatt g 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 25

aaccctaaac accctgtatt g 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 26

aacgcgaaaa accctatatt g 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 27

taccctaaag accctatact g 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 28

aactctaaat accctatact g 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 29

aacgtgaaat acacgatatt g 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 30

cacacggaac accctgtact g 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 31

caccctaaac accctatatt g 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 32

aacccgaaac actcgatact g 21

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 33

gggtcatcct tatttttcca taa 23

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 34

gggacatcca tattactcta tcaaa 25

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 35

ggtcaccctt attactctat tacaaaa 27

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 36

cacccatatt tcccccttaa a 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 37

acgaccagca aacaagacac 20

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 38

caataacaaa atattagttc ctaaa 25

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 39

tatcctgctt attgccacc 19

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 40

catacctaaa tctgacaatc c 21

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 41

ttttttagcg ttagtaggat tttt 24

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 42

aaaacaagat tctaataaaa tagca 25

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 43

ttaaagtggg tatgaatggt tg 22

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 44

gctgttccta aggtatccg 19

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 45

agcacgcgtt gaggtttta 19

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 46

agttttagtt cccaaggtgt c 21

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 47

ctgtgactaa ggacaatacc aaa 23

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 48

ttccatcaaa agtcccaata ac 22

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 49

aaaggtggta atggtagaca gg 22

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 50

aatctggtac caaaacaaac atc 23

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 51

ttaaggttcc tatgtctggg g 21

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 52

tgacatagat ccccatagac agtt 24

<210> 53

<211> 135

<212> DNA

<213> Hpv2a

<400> 53

cggactaatg tgtattacca tggtggcagt tctaggcttc tcactgtggg tcatccatat 60

tactctataa agaagagtaa taataaggtg gctgtgccca aggtatctgg gtaccaatat 120

cgtgtatttc acgtg 135

<210> 54

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV3

<400> 54

cgcaccaaca tttattatta tgcaggcagt tctcgcttgc tgaccgtggg tcatccttat 60

tttgctatcc ccaaatcttc taattccaag atggatattc ctaaggtgtc cgcctttcaa 120

tatagagtgt ttagggtg 138

<210> 55

<211> 132

<212> DNA

<213> HPV6

<400> 55

cgcaccaaca tattttatca tgccagcagt tctagacttc ttgcagtggg tcatccttat 60

ttttccataa aacgggctaa caaaactgtt gtgccaaagg tgtcaggata tcaatacagg 120

gtatttaagg tg 132

<210> 56

<211> 132

<212> DNA

<213> hpv11

<400> 56

cgcaccaaca tattttatca tgccagcagt tctagactcc ttgctgtggg acatccatat 60

tactctatca aaaaagttaa caaaacagtt gtaccaaagg tgtctggata tcaatataga 120

gtgtttaagg ta 132

<210> 57

<211> 132

<212> DNA

<213> HPV13

<400> 57

cgtaccaaca tattttatca tgctagcagt tctagactac ttgcagtggg aaatccttat 60

tttcctatta agaaacaaaa caaaactgtt gtccctaagg tatctggtta tcagtttagg 120

gtatttaaag tt 132

<210> 58

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV16

<400> 58

cgcacaaaca tatattatca tgcaggaaca tccagactac ttgcagttgg acatccctat 60

tttcctatta aaaaacctaa caataacaaa atattagttc ctaaagtatc aggattacaa 120

tacagggtat ttagaata 138

<210> 59

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV18

<400> 59

cccacaagca tattttatca tgctggcagc tctagattat taactgttgg taatccatat 60

tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa 120

tatagagtat ttagggtg 138

<210> 60

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV26

<400> 60

cgcaccggca tatattatta tgcgggcagc tctcgtttat taacattagg acatccatat 60

ttttccatac ctaaaactgg ccaaaaggcc gaaattccta aggtatctgc ctatcagtac 120

agggtattta gagtg 135

<210> 61

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV27

<400> 61

cggacgaatg tctattacca tggtggcagt tctaggctcc tcactgtcgg ccacccatat 60

tattctataa agaagggtag caataatagg ttggcagtgc ctaaggtgtc cggctaccaa 120

taccgtgtat ttcacgtt 138

<210> 62

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV28

<400> 62

cgcaccaata tttattatta tgcaggcact tctcggttgc tgaccgtggg tcatccttat 60

tttcccattc ctaaatcatc cactaacaaa gcagatgtgc ccaaagtgtc cgcctttcag 120

tatagggtat tccgggtg 138

<210> 63

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV29

<400> 63

cgcacaaata tttattatta tgcaggcagt tctcgcctgc tcactgtggg tcatccacat 60

tattcaattc ccaaatcctc tggtaataag gtagatgtgc ctaaggtgtc tgcatttcag 120

tacagggttt tccgtgtg 138

<210> 64

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV30

<400> 64

cgcaccaata tattttatca tgcaggcagc tcacgtttgc ttgctgttgg acatccatat 60

tattctattt ctaaggctgg taattccaaa acagatgttc ccaaggtgtc tgcatttcag 120

tatagggtct ttagggtc 138

<210> 65

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV31

<400> 65

cgaaccaaca tatattatca cgcaggcagt gctaggctgc ttacagtagg ccatccatat 60

tattccatac ctaaatctga caatcctaaa aaaatagttg taccaaaggt gtcaggatta 120

caatataggg tatttagggt t 141

<210> 66

<211> 140

<212> DNA

<213> HPV33

<400> 66

cgcacaagca tttattatta tgctggtagt tccagacttc ttgctgttgg ccatccatat 60

ttttctatta aaatcctact aacgctaaaa aattattggt acccaaagta tcaggcttgc 120

aatatagggt ttttagggtc 140

<210> 67

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV34

<400> 67

cgcacaaata tatattatta tgcaggtagt acacgcttgc tggcagtagg acatccctat 60

tatcctataa aggatactaa tgggaaacgt aagattgctg tacctaaagt ttcaggtttg 120

caatacaggg tatttagaat a 141

<210> 68

<211> 137

<212> DNA

<213> HPV35

<400> 68

cgcacaaaca tctactatca tgcaggcagt tctaggctat tagctgtggg tcacccatac 60

tatgctatta aaaaacaaga ttctaataaa atagcagtac ccaaggtatc tggtttgcaa 120

tacagagtat ttagagt 137

<210> 69

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV39

<400> 69

cgcacaggca tatattatta tgctggcagc tctagattat taacagtagg acatccatat 60

tttaaagtgg gtatgaatgg tggtcgcaag caggacattc caaaggtgtc tgcatatcaa 120

tatagggtat ttcgcgtg 138

<210> 70

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV40

<400> 70

cgcaccagtt tatattatca tgctggtagt gccaggttac tgactatagg acatccatac 60

tttgagttaa aaaaacccaa tggtgacatt tcagtgccta aggtttctgg acatcaatac 120

agggtattta gggta 135

<210> 71

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV42

<400> 71

cgcaccaact acttttacca tgccagcagt tctaggctat tggttgttgg tcacccttat 60

tactctatta caaaaaggcc aaataagaca tctatcccca aagtgtctgg tttacagtac 120

agagtattta gagtt 135

<210> 72

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV43

<400> 72

cgcaccaact tattttatta tgctggcagt tcacgtttgc ttgcagtggg tcacccatat 60

ttccccctta aaaattcctc tggtaaaata actgtaccta aggtttctgg ttatcaatac 120

agagtattta gagtt 135

<210> 73

<211> 132

<212> DNA

<213> HPV44

<400> 73

cgcaccaaca tatattacca tgctagcagt tctagacttc ttgctgtggg caacccttat 60

tttgccatac gaccagcaaa caagacactt gtgcctaagg tttcgggatt tcaatatagg 120

gtttttaaga tg 132

<210> 74

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV45

<400> 74

cgcacaagca tattttatca tgcaggcagt tcccgattat taactgtagg caatccatat 60

tttagggttg tacctaatgg tgcaggtaat aaacaggctg ttcctaaggt atccgcatat 120

cagtataggg tgtttagagt a 141

<210> 75

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV51

<400> 75

cgcaccggca tatattacta tgcaggcagt tccagactaa taacattagg acatccctat 60

tttccaatac ctaaaacctc aacgcgtgct gctattccta aagtatctgc atttcaatac 120

agggtattta gggta 135

<210> 76

<211> 147

<212> DNA

<213> HPV52

<400> 76

cgcacaagca tctattatta tgcaggcagt tctcgattac taacagtagg acatccctat 60

ttttctatta aaaacaccag tagtggtaat ggtaaaaaag ttttagttcc caaggtgtct 120

ggcctgcaat acagggtatt tagaatt 147

<210> 77

<211> 132

<212> DNA

<213> HPV53

<400> 77

cgcaccacta tattttatca tgctggaagc tctcgcttgc ttaccgtggg acatccttat 60

taccccattt ctaaatctgg taaagcagac atccctaagg tgtctgcatt tcagtatagg 120

gtgtttagag ta 132

<210> 78

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV54

<400> 78

cgcacaagca tatactatca tgcaagcagc tctagattat tggctgttgg acatccatat 60

tttaaagtac aaaaaaccaa taataagcaa agtattccta aagtatcagg atatcaatat 120

agggtgttta gggtg 135

<210> 79

<211> 132

<212> DNA

<213> HPV55

<400> 79

cgcaccaaca tagtttacca tgctagcagt tctagacttc ttgctgtagg caacccttat 60

tttgccatac gaccagcaaa caagacactt gtgcctaaag tttcaggatt tcaatatagg 120

gtttttaagg tg 132

<210> 80

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV56

<400> 80

cgcactagta tattttatca tgcaggcagt tcacgattgc ttgccgtagg acatccctat 60

tactctgtga ctaaggacaa taccaaaaca aacattccca aagttagtgc atatcaatat 120

agggtattta gggta 135

<210> 81

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV57

<400> 81

cggacgaatg tttattatca tggtgggagc tctcggctcc tcacagtagg ccatccatat 60

tattctataa aaaaaagtgg caataataag gtgtctgtgc ccaaggtatc gggctaccag 120

taccgtgtgt tccatgtg 138

<210> 82

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV58

<400> 82

cgcacaagca tttattatta tgctggcagt tccagacttt tggctgttgg caatccatat 60

ttttccatca aaagtcccaa taacaataaa aaagtattag ttcccaaggt atcaggctta 120

cagtataggg tctttagggt g 141

<210> 83

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV59

<400> 83

cgtaccagta ttttctacca cgcaggcagt tccagacttc ttacagttgg acatccatat 60

tttaaagtac ctaaaggtgg taatggtaga caggatgttc ctaaggtgtc tgcatatcaa 120

tacagagtat ttagggtt 138

<210> 84

<211> 144

<212> DNA

<213> HPV61

<400> 84

cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tcccgtctgc ttactgtagg acatccctat 60

tgtagtttgc agcttgatgg gctgcagggc aagaaaaaca ctatccccaa ggtgtctggc 120

tatcaatata gggtgtttag ggta 144

<210> 85

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV62

<400> 85

cgcaccaacc ttttttatta tgggggcagc tcccgccttc ttactgtggg acatccatat 60

tgtactttac aggttggcca gggtaaacgg gccaccattc ctaaggtgtc tgggtatcag 120

tacagggtgt ttcgtgtg 138

<210> 86

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV66

<400> 86

cgtaccagta tattttatca tgcaggtagc tctaggttgc ttgctgttgg ccatccttat 60

tactctgttt ccaaatctgg taccaaaaca aacatcccta aagttagtgc atatcagtat 120

agagtgttta gggta 135

<210> 87

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV67

<400> 87

cgcacaagca tttactatta cgctggtagc tccagacttt tagctgtagg ccatccttac 60

ttttccattc ctaatccctc caacactaaa aaggtgttag tgcccaaggt gtcaggtttg 120

cagtataggg tatttagggt t 141

<210> 88

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV68

<400> 88

cgcactggca tgtattacta tgctggtaca tctaggttat taactgtagg ccatccatat 60

tttaaggttc ctatgtctgg gggccgcaag cagggcattc ctaaggtgtc tgcatatcaa 120

tacagagtgt ttagggtt 138

<210> 89

<211> 134

<212> DNA

<213> HPV69

<400> 89

cgcaccggat atattactat gcaggcagct ctcgattatt aactttgggt catccctatt 60

ttccaattcc taaatctggt tcaacagcag aaattcctaa agtgtctgct taccaatata 120

gggtttttcg tgtt 134

<210> 90

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV70

<400> 90

cgtacaggca tatattatta tgctggaagc tctcgcttat taacagtagg gcatccttat 60

tttaaggtac ctgtaaatgg tggccgcaag caggaaatac ctaaggtgtc tgcatatcag 120

tatagggtat ttagggta 138

<210> 91

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV72

<400> 91

cgcaccaacc tctattatta tggtggcagt tctcgtctac taactgtagg acatccttac 60

tgtgccatac ctctcaacgg acagggcaaa aaaaacacca ttcctaaggt ttcggggtat 120

caatacaggg tgtttagagt a 141

<210> 92

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV73

<400> 92

agaacaaata tatattatta tgcaggtagc acacgtttgt tggctgtggg acacccatat 60

tttcctatca aggattctca aaaacgtaaa accatagttc ctaaagtttc aggtttgcaa 120

tacagggtgt ttaggctt 138

<210> 93

<211> 132

<212> DNA

<213> HPV74

<400> 93

cgcaccaaca tcttttatca tgctagcagt tctagactac ttgctgtagg aaatccctat 60

ttccctataa aacaggttaa caaaacagtt gttcctaaag tgtctggata tcaatttagg 120

gtgtttaagg tg 132

<210> 94

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV81

<400> 94

cgcaccaacc ttttttatta tgggggcagt tcccgccttc ttactgtagg gcatccatat 60

tgtacattaa ctattggtac ccaaggaaag cgttccacta ttcccaaggt gtctgggtat 120

cagtaccggg tgtttcgtgt g 141

<210> 95

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV82

<400> 95

cgcaccggca tatattatta tgcaggcagt tccagactta ttaccttagg acatccatat 60

ttttcaatac ccaaaaccaa tacacgtgct gaaataccta aggtatctgc ctttcagtat 120

agggtgttta gggta 135

<210> 96

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV83

<400> 96

cgcaccaacc tcttttatta cggtggcagc tccagacttc ttaccgtagg acatccatat 60

tatcctgtac aggttaatgg tcaaggaaaa aaagccacta tccccaaggt ttctggctac 120

caatataggg tgtttcgcat t 141

<210> 97

<211> 150

<212> DNA

<213> HPV84

<400> 97

cgcaccaact tattttatta tggtggtagt tctcgcctgc ttactgtggg acatccatat 60

tattctgttc ctgtgtctac ccctgggcaa aacaacaaaa aggccactat ccccaaggtt 120

tctgggtatc aatacagggt gtttagggtc 150

<210> 98

<211> 138

<212> DNA

<213> HPV85

<400> 98

cgtaccagta cattttatca tgctggcagc tctaggcttc taaccgttgg acatccatac 60

tataaagtta cctcaaatgg aggccgcaag caagacattc ctaaagtgtc tgcctatcag 120

tatcgagtgt ttcgggtt 138

<210> 99

<211> 153

<212> DNA

<213> HPV86

<400> 99

cgtaccaacc tattttatta tggtggtagt tcccgcttgc ttactgtggg ccatccatat 60

tatcctgtta ctgtttcctc cagccctgga caaaacaaca aaaaggccaa tattcccaag 120

gtttcggggt atcaatacag ggtttttagg gtg 153

<210> 100

<211> 147

<212> DNA

<213> HPV87

<400> 100

cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tctcgcctgc ttactgtggg tcacccttac 60

tatccagtta ctgttaccac ccctggtcag aacaagaaat ccaatattcc aaaggtgtct 120

ggctatcagt acagggtgtt tcgggtg 147

<210> 101

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV89

<400> 101

cgtaccaacc tgtactatta tggaggcagc tcccgcctta ttacagttgg ccacccttat 60

tatactgtac aggtcaatgg tgctaacaaa aaggccaaca tacctaaggt atcagggtat 120

caatacaggg tatttagggt a 141

<210> 102

<211> 141

<212> DNA

<213> HPV90

<400> 102

agaacaaaca tatattatta tgcaggcagt tcccgactgt taactgttgg ccatccttat 60

tttgctatca aaaagcaatc aggaaaaaac cctatagtgg ttcccaaggt gtctggatat 120

caatataggg tgtttagggt a 141

<210> 103

<211> 135

<212> DNA

<213> HPV91

<400> 103

cgcaccaact tattttacca tgctggcagt tcccgtttac tggctgtggg ccaccctttt 60

tttcctataa aaaataattc tggtaaagta attgttccta aagtttcagg tcaccaatat 120

agggtgttta gagtt 135

<210> 104

<211> 140

<212> DNA

<213> HPV-IC

<400> 104

cggacgaatg tttattacca gatagataga gatagatacc catatacaga taatgacata 60

gatccccata gacagtttat acagatcagt agcagttttt atatatgaga tgatgatagc 120

aatacagagt atttagggta 140

<210> 105

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 105

aaaacagttg taccaaaggt gtctg 25

<210> 106

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 106

caaaaaggcc aaataagaca 20

<210> 107

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 107

cccccttaaa aattcctct 19

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 108

atacgaccag caaacaagac 20

<210> 109

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 109

tatgaatggt ggtcgcaag 19

<210> 110

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 110

aaaacaccag tagtgctaat g 21

<210> 111

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 111

ccaaaacaaa cattcccaa 19

<210> 112

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 112

atccatattt taaagtacct aaag 24

<210> 113

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 113

caaatctggt accaaaacaa a 21

<210> 114

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 114

cccatagaca gtttatacag atca 24

<210> 115

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 115

ataaaacggg ctaacaaaa 19

<210> 116

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 116

tacctaaaac tggccaaaag 20

<210> 117

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 117

attctaataa aatagcagta cccaag 26

Claims

1.检测至少一种病原体存在的方法，所述方法包括将来自样品的核酸与包含至少四种探针的集合接触，其中每种所述探针包含与来自病原体的序列互补的、侧接四对或五对互补碱基的序列，其中所述碱基在不与来自病原体的核酸杂交时形成茎结构，其中所述探针用第一相互作用标记和第二相互作用标记进行标记，从而所述探针与来自所述病原体的核酸的杂交引起检测信号的改变。

2.权利要求1所述的方法，其中所述第一相互作用标记和所述第二相互作用标记是FRET供体和FRET受体。

3.权利要求2所述的方法，其中所述FRET受体是猝灭剂。

4.权利要求1到3中任一项所述的方法，其中与来自病原体的序列互补的所述序列在任一端通过连接序列与所述互补碱基对连接。

5.权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述互补碱基对包含C-G对。

6.权利要求5所述的方法，其中所述探针包含序列：

3’-CGCG-F-病原体独特的序列-F’-CGCG-5’，

其中F和F’是任选的连接序列。

7.权利要求1到6中任一项所述的方法，其中探针中病原体独特的序列含有与病原体基因组序列的至少一个错配。

8.权利要求1到7中任一项所述的方法，其中每种所述探针可以与每种其它所述探针的区分开。

9.权利要求1到8中任一项所述的方法，其中每种所述探针附着在固相支持物限定的位置处。

10.权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述探针集合包含至少10个、至少15个或至少20个探针。

11.权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测定双链核酸分子的解链温度，所述双链核酸分子由所述探针之一和得自所述样品的互补核酸形成。

12.权利要求1到11中任一项所述的方法，其中在与所述探针集合接触之前扩增得自样品的所述核酸。

13.权利要求12所述的方法，其中所述扩增使用聚合酶链式反应(PCR)完成。

14.权利要求12或权利要求13的方法，其中持续监测被扩增的核酸的产量。

15.权利要求12到15中任一项所述的方法，其中所述被扩增的核酸在一个扩增循环后与所述探针集合接触。

16.权利要求12到15中任一项所述的方法，其中所述被扩增的核酸在每个扩增循环后与所述探针集合接触。

17.权利要求12到16中任一项所述的方法，其中所述扩增在所述探针集合存在时进行。

18.权利要求12到17中任一项所述的方法，其中所述方法还包括内部对照的扩增。

19.权利要求12到18中任一项所述的方法，其中防止污染核酸的扩增。

20.权利要求19所述的方法，其中通过在尿嘧啶存在时进行扩增来防止所述污染核酸的扩增。

21.权利要求20所述的方法，还包括在扩增前用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理所述核酸。

22.权利要求1到21中任一项所述的方法，其中所述样品选自支气管吸出物、尿液、前列腺按摩液、精液、血液和宫颈、外阴、肛门、生殖器、皮肤或喉细胞学样品、刮取物或活组织检查。

23.权利要求1到22中任一项所述的方法，所述方法用于检测与性传播疾病相关的生物。

24.权利要求1到23中任一项所述的方法，所述方法用于检测至少一种HPV基因型的存在。

25.权利要求24所述的方法，所述方法用于检测高危型或低危型HPV基因型。

26.权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述探针集合包含至少一种探针，所述探针包含至少一个选自SEQ ID NO.33到52或SEQ IDNO.105-117的序列。

27.权利要求24到26中任一项所述的方法，其中使用选自SEQ ID NO.1到32的至少一种引物扩增得自所述样品的所述核酸。

28.权利要求27所述的方法，其中使用包括SEQ ID NO.1到32的引物混合物扩增得自所述样品的核酸。

29.包含至少四种探针的探针集合，其中每种所述探针包含与来自病原体的序列互补的、侧接四对或五对互补碱基的序列，其中所述碱基在不与来自病原体的核酸杂交时形成茎结构，其中所述探针用第一相互作用标记和第二相互作用标记进行标记，从而所述探针与来自所述病原体的核酸的杂交引起检测信号的改变。

30.权利要求29所述的探针集合，其中所述第一相互作用标记和所述第二相互作用标记是FRET供体和FRET受体。

31.权利要求30所述的探针集合，其中所述FRET受体是猝灭剂。

32.权利要求29到31中任一项所述的探针集合，其中与来自病原体的序列互补的所述序列在任一端通过连接序列与所述互补碱基对连接。

33.权利要求29到32中任一项所述的探针集合，其中所述互补碱基对包含C-G对。

34.权利要求33所述的探针集合，其中所述探针包含序列：

3’-CGCG-F-病原体独特的序列-F’-CGCG-5’，

其中F和F’是任选的连接序列。

35.权利要求29到34中任一项所述的探针集合，其中探针中病原体独特的序列含有与病原体基因组的至少一个错配。

36.权利要求29到35中任一项所述的探针集合，其中每种所述探针可以与每种其它所述探针区分开。

37.权利要求29到36中任一项所述的探针集合，其中每种所述探针附着在固相支持物限定的位置处。

38.权利要求29到37中任一项所述的探针集合，其中所述病原体是与性传播疾病相关的生物。

39.权利要求38所述的探针集合，其中所述生物是病毒。

40.权利要求39所述的探针集合，其中所述病毒是人乳头瘤病毒。

41.权利要求40所述的探针集合，其中每种所述探针包含与HPV基因型互补的序列。

42.权利要求41所述的探针集合，其中所述每种所述探针包含与高危型HPV基因型互补的序列。

43.权利要求41所述的探针集合，其中所述每种所述探针包含与低危型HPV基因型互补的序列。

44.权利要求40到43中任一项所述的探针集合，其中所述探针集合包含至少一种探针，所述探针包含至少一个选自SEQ ID NO.33到52或SEQID NO.105-117的序列。

45.权利要求44的探针集合，其中所述探针集合的每种探针包含选自SEQ ID NO.33到52或SEQ ID NO 105-117的序列。

46.权利要求44或权利要求45的探针集合，其中所述探针集合的每种探针包含选自SEQ ID NO.33到52的序列。

47.核酸序列，包含SEQ ID NO.33到52中的任一序列。

48.核酸序列，包含SEQ ID NO 105-117中的任一序列。

49.权利要求47或权利要求48的核酸在检测至少一种HPV基因型存在与否中的用途。

50.权利要求49的用途，采用聚合酶链式反应，其中持续监测被扩增的核酸的产量。

51.鉴定最小引物集合的方法，所述引物扩增来自两个或多个相关生物的核酸序列，所述方法包括：

(a)鉴定所述生物之间具有至少30％同一性的引物结合位点；

(c)确定检测可能的最大数目所述生物所需的最小引物数目。

52.权利要求51所述的方法，还包括：

53.权利要求51或权利要求52所述的方法，其中所述生物与性传播疾病相关。

54.权利要求51到53中任一项所述的方法，其中所述生物为病毒。

55.权利要求54所述的方法，其中所述病毒是人乳头瘤病毒。

56.权利要求51到55中任一项所述的方法，其中步骤(d)还包括添加一种或多种引物，其中所述引物与所述生物的引物结合位点具有不多于3个错配，在所述生物中需要校正引发以实现等同扩增。

57.权利要求51到56中任一项所述的方法，其中所述错配位于最接近5’端的一半引物中。

58.权利要求51到57中任一项所述的方法，其中所述引物集合允许以两个数量级检测存在的所有生物。

59.能够通过权利要求55到58中任一项的方法获得的引物集合，其包含至少一个选自SEQ ID NO.1到32的引物。

60.权利要求59所述的引物集合，包括SEQ ID NO.1到32。

61.用于检测一种或多种病原体的试剂盒，其包含权利要求29到46中任一项所述的探针集合。

62.用于检测一种或多种病原体的试剂盒，其包含根据权利要求51到58中任一项的方法鉴定的引物集合。

63.权利要求61所述的试剂盒，其还包含根据权利要求51到58中任一项的方法鉴定的引物结合。

64.权利要求61到63中任一项所述的试剂盒，其中所述病原体是与性传播疾病相关的生物。

65.用于检测一种或多种HPV基因型的试剂盒，其包含权利要求29到46中任一项所述的探针集合。

66.用于检测一种或多种HPV基因型的试剂盒，其包含权利要求59或权利要求60所述的探针集合。

67.权利要求65的试剂盒，其还包含权利要求59或权利要求60的引物集合。

68.权利要求61到67中任一项所述的试剂盒，其还包含内部对照。