ES2240753T3 - Metodo de deteccion de acido nucleico. - Google Patents
Metodo de deteccion de acido nucleico.Info
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Abstract
Un método para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra, cuyo método comprende: realizar multiplicación de ácido nucleico en la muestra en presencia de (a) un agente de unión doble de ADN, (b) una polimerasa de ácido nucleico y (c) un reactivo que comprende un cebador de multiplicación que puede hibridarse con dicha secuencia objetivo cuando está en forma de cadena sencilla y que está conectado en su extremo 5¿ a una sonda que lleva una marca mediante un grupo de enlace químico, siendo dicha sonda marcada de una secuencia que es similar a la de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo, de tal modo que puede hibridarse con una región complementaria en un producto de multiplicación, y en el que la marca es capaz de absorber fluorescencia de, o donar energía fluorescente a, el agente de unión doble de ADN; y comprobar la fluorescencia de dicha muestra.
Description
Método de detección de ácido nucleico.
La presente invención proporciona un método para
detectar un polinucleótido objetivo en una muestra, por ejemplo
comprobando una reacción de multiplicación, preferiblemente de
manera cuantitativa, así como equipos de uso en estos métodos. El
método también es adecuado para detectar características de
secuencias tales como polimorfismos o variación alélica, y puede
usarse así en métodos de diagnóstico.
Las técnicas de comprobación de reacción en
cadena de polimerasa (PCR) de fluorescencia conocidas incluyen
técnicas de intercalador de ADN específicas para la cadena y
genéricas que pueden usarse en dispositivos de ciclación térmica de
PCR de generación en unos pocos segundos.
Los métodos de PCR de fluorescencia genéricos
utilizan colorantes intercalantes de ADN que presentan fluorescencia
aumentada cuando se unen a especies de ADN de doble cadena. Puede
usarse un aumento de fluorescencia debido a una subida de la
concentración en volumen de ADN durante multiplicaciones para medir
el progreso de la reacción y para determinar el número de copias de
la molécula objetivo inicial. Además, comprobando la fluorescencia
con un cambio controlado de temperatura, pueden generarse curvas de
fusión de ADN, por ejemplo, al final de la ciclación térmica de
PCR.
Estos métodos de PCR de fluorescencia genéricos
comprueban la subida de la concentración en volumen de ácidos
nucleicos sin ninguna penalización de tiempo. Puede tomarse una
lectura fluorescente simple en el mismo punto en cada reacción.
Puede usarse análisis de la curva de fusión de punto final para
discriminar artefactos de amplicón, y para discriminar amplicones.
Pueden verse picos de productos a concentraciones que no pueden
visualizarse por electroforesis en gel de agarosa.
Se ha encontrado que el análisis de la curva de
fusión de ADN en general es una herramienta poderosa para optimizar
la ciclación térmica de PCR. Determinando las temperaturas de fusión
de los amplicones, es posible rebajar las temperaturas de
desnaturalización en ciclos de PCR posteriores a esta temperatura.
La optimización para multiplicación de productos de reacción de
primera generación en lugar del ADN genómico, reduce la formación de
artefactos que tienen lugar en ciclos posteriores. Pueden usarse las
temperaturas de fusión de oligonucleótidos cebadores y sus
complementos para determinar sus temperaturas de reasociación,
reduciendo la necesidad de optimización empírica.
Los métodos de intercalador genéricos son no
obstante sólo casi específicos para la cadena y no son por tanto muy
útiles cuando se requiere detección específica de la cadena.
Los métodos específicos para la cadena de PCR de
fluorescencia utilizan componentes de reacción de ácidos nucleicos
adicionales para comprobar el progreso de reacciones de
multiplicación. Estos métodos pueden usar transferencia de energía
de fluorescencia (FET) como base de detección. Una o más sondas de
ácidos nucleicos se marcan con moléculas fluorescentes, una de las
cuales es capaz de actuar como donante de energía y la otra de ellas
es una molécula aceptora de energía. Estas se conocen a veces como
molécula informadora y molécula atenuadora, respectivamente. La
molécula donante se excita con una longitud de onda de luz
específica para la que presentará normalmente una longitud de onda
de emisión de fluorescencia. La molécula aceptora se excita a esta
longitud de onda de emisión de tal modo que puede aceptar la energía
de emisión de la molécula donante por una variedad de mecanismos de
transferencia de energía dependientes de la distancia. Un ejemplo
específico de transferencia de energía de fluorescencia que puede
tener lugar es Transferencia de Energía de Resonancia de
Fluorescencia o "FRET". Generalmente, la molécula aceptora
acepta la energía de emisión de la molécula donante cuando están en
estrecha proximidad (por ejemplo, en la misma o una molécula
cercana). La base de la detección de FET o FRET es comprobar los
cambios en la longitud de onda de emisión de la donante. Cuando la
aceptora es también una molécula fluorescente, también pueden
comprobarse las longitudes de onda de emisión de la aceptora.
Hay dos tipos usados comúnmente de sondas de FET
o FRET, las que usan hidrólisis de sondas de ácidos nucleicos para
separar donante de aceptora, y las que usan hibridación para alterar
la relación espacial de moléculas donante y aceptora.
Están disponibles comercialmente sondas de
hidrólisis como sondas TaqMan®. Éstas consisten en oligonucleótidos
de ADN que están marcados con moléculas donantes y aceptoras. Las
sondas se diseñan para unirse a una región específica en una cadena
de un producto de PCR. Tras la reasociación del cebador de PCR a
esta cadena, la enzima Taq extiende el ADN con actividad de
polimerasa 5' a 3'. La enzima Taq también presenta actividad
de exonucleasa 5' a 3'. Las sondas TaqMan® están protegidas en el
extremo 3' por fosforilación para impedirlas cebar la extensión de
Taq. Si se hibrida la sonda TaqMan® con la cadena de
producto, también puede hidrolizar la sonda una molécula de
Taq que se extiende, liberando la donante de la aceptora como
base de detección. La señal en este caso es acumulativa, aumentando
la concentración de moléculas donante y aceptora libres con cada
ciclo de la reacción de multiplicación.
El hecho de que la generación de señal depende de
la aparición de reacciones de hidrólisis de sonda significa que hay
una penalización de tiempo asociada con este método. Además, la
presencia de la sonda puede interrumpir el funcionamiento suave del
procedimiento de PCR.
Además, se ha encontrado que la hidrólisis puede
hacerse no específica, particularmente cuando se requieren grandes
números de ciclos de multiplicación, por ejemplo más de 50 ciclos.
En estos casos, la hidrólisis no específica de la sonda producirá
una señal excesivamente elevada.
Esto significa que tales técnicas no son muy
compatibles con métodos de PCR rápidos que se hacen más destacados
con el desarrollo de cicladores térmicos de aire caliente rápidos
tales como los RapidCycler® y LightCycler® de Idaho Technologies
Inc. Otros dispositivos de PCR rápidos se describen por ejemplo en
la Patente Británica en tramitación junto con la presente Nº
2334904. Se ha informado en otra parte de los méritos de la
ciclación rápida sobre la ciclación térmica convencional. Tales
técnicas son particularmente útiles, por ejemplo, en sistemas de
detección para guerra biológica en la que la velocidad de resultado
es importante si ha de evitarse la pérdida de vida o un perjuicio
grave.
Además, las sondas de hidrólisis no proporcionan
información significativa con respecto a histéresis de fusión porque
la generación de señal es por lo general dependiente de la
hidrólisis de la sonda más que de la temperatura de masa fundida del
amplicón o sonda.
Las sondas de hibridación están disponibles en un
cierto número de formas. Las guías moleculares son oligonucleótidos
que tienen secuencias 5' y 3' complementarias de tal modo que forman
lazos de horquilla. Las marcas fluorescentes terminales están muy
próximas para que tenga lugar FRET cuando se forma la estructura de
horquilla. Tras la hibridación de guías moleculares con una
secuencia complementaria, se separan las marcas fluorescentes, de
modo que no tiene lugar FRET, y esto forma la base de detección.
Pueden usarse también pares de oligonucleótidos
marcados. Estos se hibridan muy próximos en una cadena de producto
de PCR, reuniendo moléculas donante y aceptora de modo que pueda
tener lugar FRET. Una FRET aumentada es la base de detección. Las
variantes de este tipo incluyen la utilización de un cebador de
multiplicación marcado con una sonda adyacente simple.
El uso de dos sondas, o un tipo de sonda de guía
molecular que incluye dos moléculas de marcado, aumenta el coste
implicado en el procedimiento. Además, este método requiere la
presencia de una secuencia conocida razonablemente larga de tal modo
que se conozcan dos sondas que sean lo suficientemente largas para
unirse específicamente en estrecha proximidad entre sí. Esto puede
ser un problema en algunas aplicaciones de diagnóstico, cuando la
longitud de secuencias conservadas en un organismo que puede usarse
para diseñar una sonda eficaz puede ser relativamente corta, tal
como el virus de HIV.
Además, el uso de pares de sondas implica un
diseño experimental más complejo. Por ejemplo, una señal
proporcionada por la masa fundida de una sonda es función de la
separación con fusión de ambas sondas. El estudio de pequeñas
desadaptaciones o cuando se requiere una de las sondas para unirse a
través de una región de empalme (por ejemplo, para detectar ARN en
comparación con ADN en una muestra en la que puede utilizarse la
secuencia en cualquier lado de un intrón como lugar de sonda) puede
prodicir resultados incorrectos si la otra sonda se funde
primero.
La Solicitud Internacional en tramitación junto
con la presente WO99/28500 describe un método para detectar la
presencia de una secuencia de ácido nucleico objetivo particular,
cuyo método comprende a) añadir a la muestra una sonda específica
para dicha secuencia, llevando la sonda un resto capaz de donar
fluorescencia a, o absorber energía fluorescente de, un agente de
unión doble de ADN, b) someter la mezcla a una reacción de
multiplicación, c) hibridar la sonda con la secuencia objetivo y
comprobar la fluorescencia de la muestra. La reacción puede
comprobarse midiendo la fluorescencia de dicha muestra porque ésta
se alterará durante el transcurso de la reacción ya que se forma más
producto que se hibrida con la sonda y da lugar a interacción de FET
o FRET entre el agente de unión doble de ADN y el resto fluorescente
de la sonda.
La Solicitud de Patente Internacional en
tramitación junto con la presente Nº PCT/GB99/00504 describe un
ensayo similar para detectar la presencia de secuencias de ácidos
nucleicos particulares, que puede adaptarse para cuantificar la
cantidad de la secuencia objetivo en la muestra. En este ensayo, se
efectúa una reacción de multiplicación usando un grupo de
nucleótidos, uno de los cuales al menos está marcado
fluorescentemente. Así, el producto de multiplicación tiene una
marca fluorescente incorporada en él. La reacción se efectúa en
presencia de una sonda que puede hibridarse con el producto de
multiplicación y que incluye una molécula reactiva que es capaz de
absorber fluorescencia de, o donar energía fluorescente a, dicho
nucleótido marcado fluorescente. Puede comprobarse después la
reacción midiendo la fluorescencia de dicha muestra porque ésta se
alterará durante el transcurso de la reacción ya que se forma más
producto que se hibrida con la sonda y da lugar a interacción de FET
o FRET entre ellas.
La Solicitud de Patente Internacional WO01/11078
describe un método relacionado adicional para detectar la presencia
de una secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra. En este
ensayo, en una primera fase, la secuencia objetivo se hace de cadena
sencilla de manera que pueda hibridarse con ella la región de
cebador del reactivo. Esto puede iniciar así la extensión de la
cadena para generar una cadena complementaria que incluirá
nucleótidos marcados y tendrá también una región de sonda marcada
aguas arriba de su extremo 5' y que es complementaria de una región
aguas abajo del producto. Una vez se completa la fase de extensión,
se separa el producto de su cadena de plantilla durante una fase de
masa fundida y se hace así de cadena sencilla. En esta forma, la
región de sonda marcada es capaz de retorcerse sobre, e hibridarse
con, la región complementaria de la cadena de producto, con lo cual
la marca que es capaz de donar energía fluorescente (donante) a la
otra marca por medio de FET o FRET lo hace, cambiando así la señal
fluorescente de la muestra. Este cambio de señal puede comprobarse
durante toda la reacción, con el fin de comprobar el progreso de la
reacción de multiplicación.
Se describen ensayos que comprenden el uso de
sistemas de sondas Scorpion en el documento GB2338301 y en Nucleic
Acids Research, 2000, vol. 28, nº 19, 3752-3761. Los
sistemas de sondas Scorpion comprenden una porción de cebador
incorporada a una porción de sonda por un resto enlazante. Los
sistemas de sondas comprenden restos donante y aceptor. En este
ensayo, en una primera fase, la secuencia objetivo se hace de cadena
simple de manera que la porción de cebador pueda hibridarse con la
secuencia objetivo. Esto puede iniciar así la extensión de la cadena
para generar una cadena complementaria que tendrá la porción de
sonda aguas arriba de su extremo 5', que es complementaria con una
región aguas abajo del producto. Una vez se completa la fase de
extensión, se separa el producto de su cadena de plantilla durante
una fase de masa fundida y se hace así de cadena sencilla. En esta
forma, la región de sonda marcada es capaz de retorcerse sobre, e
hibridarse con, la región complementaria de la cadena de producto.
La hibridación de la porción de sonda con la región complementaria
de la cadena de producto altera la relación espacial entre los
restos donante y aceptor, y se cambia así la señal fluorescente de
la muestra.
Los solicitantes han encontrado ahora un ensayo
mejorado alternativo.
La presente invención proporciona un método para
detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico objetivo en
una muestra, cuyo método comprende:
realizar multiplicación de ácido nucleico en la
muestra en presencia de (a) un agente de unión doble de ADN, (b) una
polimerasa de ácido nucleico y (c) un reactivo que comprende un
cebador de multiplicación que puede hibridarse con dicha secuencia
objetivo cuando está en forma de cadena sencilla y que está
conectado en su extremo 5' a una sonda que lleva una marca mediante
un grupo de enlace químico, siendo dicha sonda marcada de una
secuencia que es similar a la de dicha secuencia de ácido nucleico
objetivo, de tal modo que puede hibridarse con una región
complementaria en un producto de multiplicación, y en el que la
marca es capaz de absorber fluorescencia de, o donar energía
fluorescente a, el agente de unión doble de ADN; y comprobar la
fluorescencia de dicha muestra.
La presente invención es más barata y más simple
que el ensayo de la técnica anterior del documento WO01/11078 y es
sorprendentemente eficaz. En la presente invención, el agente de
unión doble de ADN se añade a la mezcla de reacción en estado no
unido, distribuyendo con necesidad de incorporar el agente a un
nucleótido, como en el documento WO01/11078, o al sistema de sonda
como en el documento GB2338301.
En el ensayo de la presente invención, en una
primera fase, la secuencia objetivo se hace de cadena sencilla, de
manera que la región de cebador del reactivo pueda hibridarse con
ella. Esto puede iniciar así la extensión de la cadena para generar
una cadena complementaria. La cadena de cebador tendrá también una
región de sonda marcada aguas arriba de su extremo 5', que es
complementaria con una región aguas abajo del producto. El material
de unión doble de ADN (preferiblemente un colorante intercalante)
resultará retenido dentro del doble formado así. Una vez que se
completa la fase de extensión, se separa el producto de su cadena de
plantilla durante una fase de masa fundida y se hace así de cadena
sencilla. En esta forma, la región de sonda marcada es capaz de de
retorcerse sobre, e hibridarse con, la región complementaria de la
cadena de producto, reteniendo así el agente de unión doble de ADN
entre la región de sonda y la región complementaria de la cadena de
producto. Debido a la proximidad mutua del agente de unión doble de
ADN y la marca de sonda, el resto fluorescente que es capaz de donar
energía fluorescente (donante) al resto aceptor mediante FET o FRET
lo hace así, cambiando así la señal fluorescente de la muestra. Este
cambio de señal puede comprobarse durante toda la reacción, con el
fin de comprobar el progreso de la reacción de
multiplicación.
multiplicación.
En la segunda y subsiguientes fases de la
multiplicación, la cadena de producto puede actuar por sí misma como
una cadena de plantilla para extensión. Sin embargo, el enlace
químico entre la sonda y el cebador detendrá la reacción de
extensión antes de que se produzca una secuencia complementaria con
dicha sonda. Así, la región de sonda permanece de cadena
sencilla.
Se prefiere que el método de la presente
invención comprenda:
- (a)
- añadir a una muestra de la que se sospecha que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo el agente de unión doble de ADN, la polimerasa de ácido nucleico y el reactivo;
- (b)
- someter dicha muestra a condiciones bajo las cuales el cebador se hibrida con la secuencia de ácido nucleico objetivo y se forma un producto de multiplicación que comprende la sonda;
- (c)
- someter dicha muestra a condiciones bajo las cuales la sonda marcada se hibrida con una región complementaria del producto de multiplicación; y
- (d)
- comprobar la fluorescencia de dicha muestra durante al menos una de las etapas (b) y (c).
Si se requiere, también puede estar presente
durante la reacción de multiplicación un cebador de multiplicación
correspondiente que no esté incorporado a una región de sonda
marcada. Este cebador daría como resultado la producción de un
producto de multiplicación no marcado convencional que puede servir
para mediar la señal al intervalo dinámico del dispositivo detector
usado. También puede mejorar la eficacia de la reacción, que puede
ser afectada adversamente por la presencia de una estructura de
sonda/cebador compleja.
Cuando la marca aceptora que es capaz de absorber
fluorescencia de la marca donante realiza esta función, se reduce la
fluorescencia de la donante. Esta reducción puede detectarse y esto
indica unión de la región de sonda.
Más preferiblemente, la marca que es capaz de
absorber fluorescencia (aceptora) es ella misma una molécula
fluorescente que emite fluorescencia a una longitud de onda
característica. Tales sondas incluyen un colorante de rodamina o
Cy5. En este caso, un aumento de fluorescencia de la molécula
aceptora, que es de una longitud de onda diferente de la de la marca
donante, indicará también unión de la sonda. Alternativamente, la
aceptora no fluoresce (aceptora oscura). Tales aceptoras incluyen
DABCYL, rojo metilo, colorantes de diarilrodamina
QSY-7 y perclorato de
6-(dimetilamino)-2-[4-[4-(dimetilamino)fenil]-1,3-butadienil]-1-etilquinolinio
(número CAS 181885-68-7).
Convenientemente, el agente de unión doble de ADN
comprende una marca donante, y se proporciona la marca aceptora en
la sonda. En este caso, y si la aceptora fluoresce, puede detectarse
la presencia del producto de multiplicación marcado así comprobando
la fluorescencia de la molécula aceptora en la sonda, que se une
principalmente a una región aguas debajo de la misma cadena de
producto. En este caso, la señal del producto de multiplicación
puede distinguirse de la señal de fondo de la marca fluorescente y
también de cualquier producto de multiplicación no específico.
Alternativamente, el agente de unión doble de ADN puede comprender
una marca aceptora, y la sonda comprende la marca donante.
En el sistema de la presente invención, hay
discriminación entre la elevación de la señal de intercalador
genérico (a medida que se multiplica el ADN) y la señal específica
de secuencia que sólo se genera cuando los dos restos fluorescentes
están en estrecha proximidad (es decir, cuando la sonda se hibrida
con producto de multiplicación). El hecho de que la señal específica
de secuencia se produce sólo por el producto de multiplicación
marcado significa que el sistema es altamente específico en términos
de detección de secuencias objetivo específicas en mezclas de
reacción que contienen grandes cantidades de ADN de fondo. Esto es
porque el producto de multiplicación no específico no se hibrida con
la región de sonda y no contribuye así a la señal medida. La
medición de la señal de intercalador genérico además de la señal
específica de la secuencia puede ser beneficiosa. La señal de
intercalador genérico es proporcional al grado de multiplicación en
la mezcla de reacción y puede usarse así para indicar la eficacia o
bloqueo de la multiplicación.
Un ensayo de esta naturaleza puede realizarse
usando reactivos baratos. Las sondas marcadas simples son más
económicas que las que incluyen moléculas aceptora y donante.
La multiplicación se efectúa convenientemente
usando reacciones de multiplicación conocidas tales como la reacción
en cadena de polimerasa (PCR) o la reacción en cadena de ligasa
(LCR), el ensayo de desplazamiento de cadena (SDA) o NASBA, pero
preferiblemente PCR.
Preferiblemente, se comprueba la fluorescencia de
los restos donante y aceptor y se calcula la relación entre las
emisiones.
La posición de la marca a lo largo de la sonda es
indiferente aunque, en general, estará situada en una región extrema
de la sonda. Puede usarse en el reactivo más de una marca, pero se
prefiere una porque es más barato.
Con el fin de FET, tal como FRET, la emisión
fluorescente del resto donante debe ser de una longitud de onda más
corta que el resto aceptor.
Se indican por tanto combinaciones adecuadas en
la siguiente Tabla:
Donante | Aceptor |
SYBRGold | Rodamina |
SYBRGreen I | Rodamina |
Fluoresceína | Rodamina |
SYBRGold | Cy5 |
SYBRGreen I | Cy5 |
Fluoresceína | Cy5 |
Fluoresceína | Bromuro de etidio |
(Continuación)
Donante | Aceptor |
Fluoresceína | Dabcilo |
Fluoresceína | Rojo metilo |
Fluoresceína | Colorantes de diarilrodamina QSY-7* |
SYBRGold | Cy5.5 |
*Disponible de Molecular Probes, R.U. |
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la técnica comprenderán que son
posibles muchas otras de tales combinaciones.
Preferiblemente, las moléculas usadas como
donante y/o aceptora producen picos de emisión agudos, y hay poca o
nula superposición de las longitudes de onda de la emisión. En estas
circunstancias, puede no ser necesario resolver el "pico
específico de la cadena" de la señal producida por el producto de
multiplicación. Una medición simple de la señal específica de la
cadena sola (es decir, la proporcionada por el resto aceptor)
proporcionará información relativa a la extensión de la FET o FRET
causada por la reacción objetivo.
Sin embargo, cuando hay una superposición
espectral en las señales fluorescentes de los restos donante y
aceptor, esto puede justificarse en los resultados; por ejemplo,
determinando empíricamente la relación entre los espectros y usando
esta relación para normalizar las señales a partir de las dos
señales.
El enlace químico que separa la sonda marcada del
cebador es convenientemente cualquier molécula que pueda enlazar
secuencias de nucleótidos pero que no sea reconocida por una
polimerasa de ADN. Está disponible un amplio intervalo de
enlazadores químicos que cumplirían este requisito.
Se describen por ejemplo en el documento WO
95/08642 ejemplos de los tipos de compuesto químico y reacciones que
pueden usarse en la formación de enlazadores. En particular, el
enlazador químico comprende un grupo de átomos que unen entre sí las
dos secuencias de polinucleótidos, cebador y sonda. El enlazador
puede unirse a las secuencias de polinucleótidos respectivas por
cualquiera de los métodos convencionales.
Hablando en términos generales, el enlazador se
derivará de un compuesto químico orgánico que tenga un primer y un
segundo grupo funcional mediante los cuales pueda incorporarse a las
secuencias de la sonda y el cebador respectivamente o a nucleótidos
individuales de los que se generen después subsiguientemente la
secuencia de la sonda o el cebador. El enlazador se diseña
generalmente no para unirse a nucleótidos.
La síntesis de enlazadores se discute con detalle
en, por ejemplo, S. Agrawal et al., Nucleic Acid Research,
1986, 14, 6227 y el documento WO88/02004 (Applied Biosystems); J.L.
Ruth y D.E. Bergstrom, J. Org. Chem., 1978, 43, 2870; D.E. Bergstrom
y M.K. Ogawa, J. Amer. Chem. Soc., 1978, 10, 8106; y C.F. Bigge, P.
Kalaritis, J.R. Deck y M.P. Martes, J. Amer. Chem. Soc., 1980, 102,
2033; y la Solicitud de Patente Europea Nº 063.879. Se dirige
también al lector a la Solicitud de Patente Internacional WO01/11078
para una discusión más detallada de la estructura y síntesis de
reactivos que tienen grupos de enlace químico que se unen a sonda y
cebador.
En particular, los enlazadores comprenden una
forma múltiple de etilenglicol, por ejemplo, hexaetilenglicol (HEG).
Tales enlazadores pueden ser de estructura
-(CHOH-CHOH)_{n}-, en la que n es un número
entero superior a 1, por ejemplo 1-10, y
convenientemente 6.
Tales reactivos que comprenden grupos enlazadores
que enlazan una sonda y cebador pueden obtenerse de Oswel Research
Products Ltd., R.U.
El método de la presente invención es
extremadamente versátil en sus aplicaciones. El método puede usarse
para generar datos cuantitativos y cualitativos con respecto a la
secuencia de ácidos nucleicos objetivo en la muestra, como se
discute con más detalle posteriormente. En particular, no sólo
proporciona la invención multiplicación cuantitativa, sino que
también puede usarse, adicional o alternativamente, para obtener
datos de caracterización tales como temperaturas de
desestabilización o puntos de fusión dobles.
En el método de la invención, la sonda marcada
forma parte de un cebador de multiplicación y está presente así en
todo el transcurso de la reacción de multiplicación. El
procedimiento permite efectuar la detección de manera homogénea,
porque la multiplicación y la comprobación pueden realizarse en un
recipiente simple con todos los reactivos añadidos inicialmente. No
se requieren etapas de adición de reactivos subsiguientes. Puede ser
posible usar el método de la presente invención en algunos sistemas
heterogéneos. Nótese que no hay necesidad de efectuar el método en
presencia de soportes sólidos (aunque ésta es una opción como se
discute después adicionalmente).
Puesto que la sonda está presente en toda la
reacción de multiplicación, la señal fluorescente puede permitir
comprobar el progreso de la reacción de multiplicación. Esto puede
proporcionar un medio para cuantificar la cantidad de secuencia
objetivo presente en la muestra.
Si se usa un resto de aceptor fluorescente,
durante cada ciclo de la reacción de multiplicación, cadenas de
amplicones que contienen la secuencia objetivo y una región de sonda
generan una señal de aceptor. Como la cantidad de tales amplicones
en la muestra aumenta, la señal de aceptor aumentará. Trazando la
proporción de aumento durante ciclos, puede determinarse el punto de
inicio del aumento.
La sonda marcada puede comprender una molécula de
ácido nucleico tal como ADN o ARN, que se hibridará con la secuencia
de ácido nucleico objetivo cuando esta última esté en forma de
cadena sencilla. En este caso, se usarán condiciones que hagan al
ácido nucleico objetivo de cadena sencilla. Alternativamente, la
sonda puede comprender una molécula tal como un ácido nucleico de
péptido u otro ácido nucleico análogo que se una también a la
secuencia objetivo en forma de cadena doble.
En particular, la reacción de multiplicación
implicará una etapa de someter la muestra a condiciones bajo las
cuales cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos objetivo
presentes en la muestra se hace de cadena sencilla, tales como PCR o
LCR. Es posible que para que se hibride la región de sonda con la
región aguas abajo de la cadena de amplicón que la contiene durante
el transcurso de la reacción de multiplicación proporcionada se
encuentren condiciones de hibridación apropiadas.
En una realización preferida, la sonda puede
diseñarse de tal modo que se encuentren estas condiciones durante
cada ciclo de la reacción de multiplicación. Así, en algún punto
durante cada ciclo de la reacción de multiplicación, la sonda se
hibridará con la secuencia objetivo, y generará una señal como
resultado de la FET o FRET. A medida que transcurre la
multiplicación, la región de sonda se separará o fundirá a partir de
la secuencia aguas abajo y así la señal generada por la marca
aceptora se reducirá o aumentará dependiendo de si comprende la
molécula donante o aceptora. Por ejemplo, cuando sea una aceptora,
en cada ciclo de la multiplicación, se genera un pico de
fluorescencia de la marca aceptora. La intensidad del pico aumentará
a medida que transcurre la multiplicación porque estarán disponibles
más cadenas de amplicones que incluyen sondas.
Comprobando la fluorescencia de la marca aceptora
de la muestra durante cada ciclo, puede comprobarse de diversas
formas el progreso de la reacción de multiplicación. Por ejemplo,
pueden analizarse los datos proporcionados por picos de fusión, por
ejemplo calculando el área bajo los picos de fusión y representando
este dato frente al número de ciclos.
La fluorescencia se comprueba convenientemente
usando un fluorímetro conocido. Las señales de éste, por ejemplo en
forma de voltajes fotomultiplicadores, se envían a un cuadro
procesador de datos y se convierten en un espectro asociado con cada
tubo de muestra. Pueden valorarse al mismo tiempo múltiples tubos,
por ejemplo 96 tubos. Pueden recogerse de este modo datos a
intervalos frecuentes, por ejemplo una vez cada 10 ms, durante toda
la reacción.
Los espectros generados de esta forma pueden
resolverse, por ejemplo, usando "adaptadores" de restos
fluorescentes preseleccionados tales como colorantes, para formar
picos representativos de cada resto de señalización (es decir,
agente de unión doble de ADN y/o marca de sonda). Pueden
determinarse las áreas bajo los picos, lo que representa el valor de
intensidad bajo cada señal, y, si se requiere, se expresan como
cocientes entre ellos. El diferencial de intensidades de señal y/o
relaciones permitirá registrar cambios en FET o FRET a través de la
reacción o en diferentes condiciones de reacción, tales como
temperaturas. Los cambios, como se ha indicado antes, están
relacionados con el fenómeno de unión entre la sonda y la secuencia
objetivo. La integral del área bajo los picos diferenciales
permitirá calcular valores de intensidad para los efectos de FET o
FRET.
Estos datos proporcionan un medio para
cuantificar la cantidad de ácido nucleico objetivo presente en la
muestra.
El reactivo de cebador/sonda marcada puede estar
libre en solución o inmovilizado en un soporte sólido, por ejemplo
en la superficie de una perla tal como una perla magnética, útil
para separar productos, o la superficie de un dispositivo detector,
tal como la guía de ondas de un detector de resonancia de plasmón
superficial y, por ejemplo, una disposición de ADN. La selección
dependerá de la naturaleza el ensayo particular examinado y del
medio de detección particular empleado.
La sonda puede diseñarse de tal modo que se
hidrolice por la polimerasa de ADN usada en la reacción de
multiplicación liberando por ello la molécula aceptora. Esto
proporciona una señal acumulativa, aumentando con cada ciclo la
cantidad de maca de sonda libre presente en el sistema. Sin embargo,
no es necesario en este ensayo que la sonda se consuma de esta forma
porque la señal no depende de la hidrólisis de la sonda.
Convenientemente, la sonda se diseña de tal modo
que se libere intacta de la secuencia objetivo y sea así capaz de
unirse de nuevo cuando se cumplen las condiciones de hibridación
adecuadas durante la reacción de multiplicación. Esto puede ser, por
ejemplo, durante la fase de extensión de la reacción de
multiplicación. Sin embargo, puesto que la señal no depende de la
hidrólisis de sonda, la sonda puede diseñarse para hibridarse y
fundirse a partir de la secuencia objetivo en cualquier fase durante
el ciclo de multiplicación. En particular, la sonda puede diseñarse
preferiblemente para hibridarse a temperaturas por debajo de la
temperatura de extensión de la reacción porque esto asegurará que se
minimice la interferencia con la reacción de multiplicación.
Esto proporciona una señal totalmente reversible
que está relacionada directamente con la cantidad de producto de
multiplicación presente en cada fase de la reacción. Además, es
ventajoso cuando la velocidad de reacción es de la mayor
importancia, por ejemplo en PCR rápida, porque una sonda que esté
integrada con la cadena de amplicón detectada será capaz de
hibridarse rápidamente con ella.
Los datos generados de esta manera pueden
interpretarse de diversas formas. En su forma más simple, un aumento
de fluorescencia de la molécula aceptora en el transcurso de la
reacción de multiplicación es indicativa de un aumento de la
cantidad de la secuencia objetivo presente, lo que sugiere el hecho
de que ha transcurrido la reacción de multiplicación y de que por
tanto la secuencia objetivo estaba de hecho presente en la muestra.
No obstante, como se ha indicado antes, también es posible la
cuantificación comprobando la totalidad de la reacción de
multiplicación. Finalmente, es posible obtener datos de
caracterización y en particular análisis del punto de fusión, como
una medición de punto final o totalmente, con el fin de obtener
información acerca de la secuencia como se discutirá adicionalmente
después.
Así, una realización preferida de la invención
comprende un método para detectar multiplicación de ácido nucleico
que comprende: realizar una multiplicación de ácido nucleico en un
polinucleótido objetivo en presencia de (a) una polimerasa de ácido
nucleico, (b) un agente de unión doble de ADN y (c) un reactivo que
comprende un cebador de multiplicación que puede hibridarse con
dicha secuencia objetivo cuando está en forma de cadena sencilla y
que está conectado en su extremo 5' a una sonda que lleva una
segunda marca, mediante un grupo de enlace químico, siendo dicha
sonda marcada de una secuencia que es similar a la de dicha
secuencia objetivo, de tal modo que puede hibridarse con una región
complementaria en un producto de multiplicación, y en el que uno de
los agente de unión doble de ADN o segunda marca comprende una marca
donante que es capaz de donar energía fluorescente al otro de los
agente de unión doble de ADN o segunda marca, que comprende una
marca aceptora capaz de absorber energía fluorescente de dicha
molécula donante, siendo dicho cebador capaz de hibridarse con dicho
polinucleótido objetivo; y comprobar cambios de fluorescencia
durante la reacción de multiplicación.
Convenientemente, la marca aceptora es ella misma
fluorescente y emite energía fluorescente con una longitud de onda
característica. La multiplicación se realiza convenientemente usando
un par de cebadores que se diseñan de tal modo que sólo la secuencia
de nucleótidos objetivo dentro de una cadena de ADN se multiplica
como se entiende bien en la técnica. La polimerasa de ácido nucleico
es convenientemente una polimerasa termoestable tal como polimerasa
Taq.
Las condiciones convenientes bajo las que puede
realizarse la reacción de multiplicación son muy conocidas en la
técnica. Las condiciones óptimas pueden ser variables en cada caso
dependiendo del amplicón particular implicado, la naturaleza de los
cebadores usados y las enzimas empleadas. Las condiciones óptimas
pueden determinarse en cada caso por la persona experta. Las
temperaturas de desnaturalización típicas son del orden de 95ºC, las
temperaturas de reasociación típicas son del orden de 55ºC y las
temperaturas de extensión son del orden de 72ºC.
En una realización particular de la invención,
puede usarse la sonda marcada para cuantificar transcriptos de ARN,
por ejemplo en experimentos de expresión, que pueden usarse para
descubrimiento de fármacos. En particular, esta realización es
adecuada para estudios de expresión en tejidos de organismos
eucariotas. El ADN que codifica proteínas en células eucariotas
puede contener intrones, regiones no codificantes de secuencia de
ADN y exones que codifican la secuencia de proteína. Las secuencias
de intrones no codificantes se separan de secuencias de ARN que se
derivan de las secuencias de ADN durante procesos de "empalme"
celular. Los cebadores de PCR se fijan como objetivo normalmente en
regiones codificantes y, cuando se usa PCR de transcriptasa inversa
en extractos de ácidos nucleicos totales, resultan productos de
multiplicación dependiente de ADN y multiplicación dependiente de
ARN. Así, la PCR sola, cuando se usa para estudios de expresión,
contiene multiplicación resultante de ADN genómico y ARN
expresado.
Una sonda marcada que se diseña para unirse a
través de intrones, en regiones terminales adyacentes de exones
codificantes, tendrá una interacción limitada debida a la región de
intrón. El ARN empalmado tiene estas regiones separadas y, por
tanto, las regiones terminales adyacentes de exones codificantes
forman una secuencia continua que permite una unión eficaz de la
región de sonda.
A la inversa, la región de sonda puede detectar
sólo un producto de multiplicación de ADN genómico si se diseña de
tal modo que se una a una región de intrón. La señal generada desde
tal sonda se referiría sólo a la concentración de ADN y no a la
concentración de ARN de la muestra. También es posible usar dos
reactivos, teniendo cada uno diferentes sondas y cebadores, siendo
un reactivo adecuado para su uso con la región de empalme del ARN y
un reactivo adecuado para el intrón en el ADN.
Así, en una realización adicional, la región de
sonda es específica para una región de empalme de ARN o un intrón en
ADN, de manera que sólo se detecte y/o cuantifique uno entre ARN
multiplicado o ADN multiplicado.
Alternativa o adicionalmente, el método de la
invención puede usarse en ensayos de hibridación para determinar
características de una secuencia. Así, en un aspecto adicional, la
invención proporciona un método para determinar una característica
de una secuencia de ácido nucleico, cuyo método comprende (a)
multiplicar dicha secuencia en presencia de un agente de unión doble
de ADN y un reactivo que comprende un cebador de multiplicación
enlazado mediante un enlace químico en su extremo 5' a una sonda que
comprende una secuencia que es similar a la de una región de la
secuencia objetivo y que comprende además una marca, en los que uno
de dichos agente de unión doble de ADN y la marca es una marca
donante y el otro es una marca aceptora, siendo capaz la marca
donante de donar energía fluorescente a la marca aceptora, de modo
que se forma un producto de multiplicación que incorpora una región
de sonda, (b) someter el producto de multiplicación a condiciones
bajo las cuales su región de sonda se hibrida con la región
complementaria del producto de multiplicación y (c) comprobar la
fluorescencia de dicha muestra y determinar una condición de
reacción particular, característica de dicha secuencia, a la que
cambia la fluorescencia como resultado de la hibridación de la
región de sonda con la muestra o desestabilización del doble formado
entre la región de sonda y la secuencia de ácido nucleico
objetivo.
Las condiciones de reacción adecuadas incluyen
temperatura, electroquímica, o la respuesta a la presencia de
enzimas o compuestos químicos particulares. Comprobando cambios de
fluorescencia a medida que se varían estas propiedades, puede
conseguirse información característica de la naturaleza precisa de
la secuencia. Por ejemplo, en el caso de temperatura, puede
determinarse la temperatura a la que la sonda se separa de las
secuencias en la muestra como resultado del calentamiento. Esto
puede ser extremadamente útil, por ejemplo, para detectar y, si se
desea, también cuantificar polimorfismos y/o variación alélica en
diagnosis genética. Por "polimorfismo" se incluyen
transiciones, transversiones, inserciones, supresiones o inversiones
que pueden tener lugar en secuencias, particularmente en la
naturaleza.
La histéresis de fusión será diferente si la
secuencia objetivo varía en sólo un par de bases. Así por ejemplo,
cuando una muestra contiene sólo una variante alélica simple, la
temperatura de fusión de la región de sonda será un valor particular
que será diferente del encontrado en una muestra que contenga sólo
otra variante alélica. Una muestra que contenga ambas variantes
alélicas mostrará dos puntos de fusión correspondientes a cada una
de las variantes alélicas.
Así, es una realización adicional de la presente
invención un método para detectar un polimorfismo y/o variación
alélica, cuyo método comprende multiplicar una secuencia de la que
se sospecha que contiene dicho polimorfismo o variación usando un
método de la presente invención, medir la temperatura a la que la
región de sonda se funde de su secuencia complementaria dentro del
producto de multiplicación usando la señal fluorescente generada y
relacionar esto con la presencia de un polimorfismo o variación
alélica.
Se aplican consideraciones similares con respecto
a propiedades electroquímicas, o en presencia de ciertas enzimas o
compuestos químicos. La sonda marcada puede inmovilizarse en una
superficie sólida a cuyo través puede aplicarse un potencial
electroquímico. La secuencia objetivo aguas abajo se unirá a, o será
rechazada por, la sonda a valores electroquímicos particulares
dependiendo de la naturaleza precisa de la secuencia.
Además, la cinética de la hibridación de sonda
permitirá la determinación, en términos absolutos, de la
concentración de secuencia objetivo. Los cambios de fluorescencia de
la muestra pueden permitir calcular la velocidad de hibridación de
la región de sonda con la muestra. Un aumento de la velocidad de
hibridación estará relacionado con la cantidad de secuencia objetivo
presente en la muestra. Como la concentración de la secuencia
objetivo aumenta a medida que transcurre la reacción de
multiplicación, la hibridación de la región de sonda tendrá lugar
más rápidamente. Así, este parámetro puede usarse también como base
de cuantificación. Este modo de tratamiento de datos es útil porque
no confía directamente en la intensidad de la señal para
proporcionar la información.
En una realización adicional de la invención, se
proporciona un equipo de uso en el método de la presente invención,
cuyo equipo comprende un reactivo que comprende un cebador de
multiplicación enlazado en su extremo 5' mediante un enlace químico
a una sonda específica para una secuencia de nucleótidos objetivo,
en el que la sonda comprende una primera marca que puede actuar como
una entre una marca donante y aceptora; y un agente de intercalación
de ADN que comprende una segunda marca, cuya segunda marca puede
actuar como una entre una marca donante y aceptora, en el que la
primera y segunda marcas forman un par
donante-aceptora.
Si se desea, la sonda puede inmovilizarse en un
soporte tal como una perla, por ejemplo una perla magnética, o un
soporte usado en un detector, tal como la guía de ondas de un
dispositivo detector de ondas evanescentes. Otros componentes
potenciales del equipo incluyen reactivos usados en reacciones de
multiplicación tales como una polimerasa de ADN.
El uso de una molécula aceptora no fluorescente
puede utilizarse también en el ensayo descrito en la Solicitud de
Patente Internacional en tramitación junto con la presente Nº
PCT/GB99/0504.
Se describirá ahora particularmente la presente
invención mrediante ejemplos con referencia a los dibujos
esquemáticos que se acompañan en los que:
La Figura 1 muestra esquemáticamente las
interacciones moleculares que tienen lugar en el método de la
invención.
La Figura 2 muestra la fluorescencia medida según
un método de la presente invención por el detector F3 en función del
número de ciclos para el sistema de beta-actina para
diversas concentraciones de ADN humano.
La Figura 3 muestra la fluorescencia medida por
el detector F3 según un método de la técnica anterior comparativo en
función del número de ciclos para el sistema de
beta-actina para diversas concentraciones de ADN
humano.
La Figura 4 muestra la fluorescencia medida por
el detector F1 usando un método Taqman® de la técnica anterior en
función del número de ciclos para el sistema de
beta-actina para diversas concentraciones de ADN
humano.
La Figura 5 muestra la fluorescencia medida según
un método de la presente invención por el detector F3 en función del
número de ciclos para un sistema de meningitis para diversas
concentraciones del gen de la meningitis.
La Figura 6 muestra la fluorescencia medida por
el detector F3 según un método de la técnica anterior comparativo en
función del número de ciclos para el sistema de meningitis para
diversas concentraciones del gen de la meningitis.
La Figura 7 muestra la fluorescencia medida por
el detector F1 usando un método Taqman® de la técnica anterior en
función del número de ciclos para el sistema de meningitis para
diversas concentraciones del gen de la meningitis.
La Figura 8 muestra la fluorescencia medida según
un método de la presente invención por el detector F3 en función del
número de ciclos para el sistema de clamidia para diversas
concentraciones del gen de la clamidia.
La Figura 9 muestra la fluorescencia medida por
el detector F1 usando un método Taqman® de la técnica anterior en
función del número de ciclos para el sistema de clamidia para
diversas concentraciones del gen de la clamidia.
La Figura 10 muestra la fluorescencia medida
según un método de la presente invención por el detector F3 en
función del número de ciclos para un sistema de soja modificada
genéticamente para diversas concentraciones del gen modificado;
y
La Figura 11 muestra la fluorescencia medida por
el detector F1 usando un método Taqman® de la técnica anterior en
función del número de ciclos para el sistema de soja modificada
genéticamente (GM) para diversas concentraciones del gen
modificado.
La Figura 1 muestra esquemáticamente las
interacciones moleculares que tienen lugar en el método de la
invención. En la reacción de multiplicación ilustrada, una molécula
de ADN (1) preparada para multiplicación poniéndola en contacto con
un par de cebadores de multiplicación (2), (3). Uno de los cebadores
(2) está enlazado a una sonda (6) que incluye una marca aceptora (7)
mediante un enlace químico (8). Se proporciona en la mezcla de
reacción un resto donante fluorescente (10).
La molécula de ADN (1) se hace de cadena sencilla
(Figura 1B) tras lo cual se unen los cebadores (2, 3) como cebadores
delantero e inverso respectivamente en una reacción de
multiplicación como es bien conocido.
Durante el transcurso de la reacción de
multiplicación subsiguiente, se forma un producto amplicón (9)
(Figura 1C).
Cuando este producto se funde durante la fase
subsiguiente de la multiplicación, la región de sonda (6) que
comprende una marca aceptora (7) se une a la región complementaria
dentro de la cadena de amplicón (Figura 1D). Restos intercaladores
(10) son retenidos entre la sonda y el producto. La interacción de
FRET entre los restos intercaladores fluorescentes (10) y la marca
aceptora (7) genera una señal a la longitud de onda característica
de la aceptora.
La señal de la molécula aceptora (7) puede
comprobarse después usando dispositivos de detección de
fluorescencia convencionales.
La persona experta en la técnica comprenderá que
el uso del segundo cebador (3) no es esencial para la presente
invención. Además, los expertor en la técnica comprenderán que la
marca en la sonda puede ser una marca donante y el resto
intercalador puede ser una marca aceptora.
Las mezclas de reacción PCR contenían los
siguientes reactivos, preparándose concentraciones de trabajo.
La composición fue:
Trizma 50 mM pH 8,8 a 25ºC, cloruro magnésico 3
mM, 8% p/v de glicerol, 250 ng/\mul de albúmina de suero de bovino
no acetilada, nucleótidos de PCR dNTP's 200 \muM, 0,01
unidades/\mul de
uracil-n-glicosilasa, 0,04
unidades/\mul de polimerasa de ADN Taq (deficitaria en exo
5'-3') y anticuerpo anti-Taq
TaqStart 0,03 \muM.
La polimerasa de ADN Taq y el anticuerpo
anti-Taq TaqStart se incubaron juntos durante 10
minutos antes de añadir a la mezcla.
Se incluyó SYBRGold como marca donante
fluorescente en las reacciones hasta una concentración final de
dilución 1:20.000 a 1:200.000 de la solución de referencia.
La polimerasa de ADN Taq se usó para asegurar que
el reactivo no se hidrolizaba durante el transcurso de la reacción.
No se encontró necesario el uso de esta polimerasa debido a los
tiempos de retención muy cortos usados en el método de la presente
invención.
Se investigaron varias plantillas objetivo y
genes asociados. Estos se listan a continuación.
Plantilla objetivo | Gen |
ADN de placenta humana | amplicón de beta-actina humana ABI |
Soja | lectina Le1 |
Soja modificada genéticamente | CP4 EPSPS |
Neisseria meningitidis | porA |
Chlamydia trachomatis | plásmido Ct |
Se fabricaron para cada gen objetivo nuevos
reactivos a medida que comprenden sondas y cebadores. Cada reactivo
tiene la estructura genérica: FL - SONDA - HEG - CEBADOR, en la que
FL es el resto fluorescente, SONDA es la secuencia de sonda, HEG es
HEG (hexaetilenglicol) y CEBADOR es la secuencia de cebador que se
hibrida con la secuencia objetivo apropiada. Los reactivos están
disponibles de Oswel Research Products Ltd., R.U. Pueden fabricarse
según la enseñanza del documento WO01/11078 reactivos con la misma
estructura genérica adecuados para su uso en el método de la
presente invención.
La estructura del reactivo correspondiente a cada
gen se lista a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Se varió según se deseó la concentración de la
secuencia del gen a detectar. La concentración final del reactivo
fue 0,2 \muM.
Se comparó el funcionamiento del método de la
presente invención con métodos de la técnica anterior repitiendo los
experimentos usando ensayos Taqman® análogos y los del documento
WO99/28500.
Se obtuvieron de Roche el instrumento de PCR en
tiempo real ThermalCycler y consumibles. El instrumento se calibró
usando técnicas convencionales. Se encontró que era extremadamente
beneficioso manejar el programa de calibración de color con producto
específico y SYBRGold. Se encontró también que era beneficioso
manejar el programa de calibración de color con Cy5.
Los protocolos de ciclación térmica fueron:
Para el método de la presente invención y el del
documento WO99/28500:
50ºC mantenidos durante 1 minuto para prevención
de sobrante
95ºC mantenidos durante 1 minuto para
desnaturalización inicial
50 ciclos de (95ºC, 5 segundos; 60ºC, 5 segundos;
74ºC, 5 segundos; extensión de 5 segundos, recoger
fluorescencia)
Para los ensayos Taqman®:
50ºC mantenidos durante 1 minuto para prevención
de sobrante
95ºC mantenidos durante 1 minuto para
desnaturalización inicial
50 ciclos de (95ºC, 5 segundos; 60ºC,
20-120 segundos; recoger fluorescencia al final de
la etapa)
Esto muestra que el método de la presente
invención es considerablemente más rápido que el que usa los ensayos
Taqman® de la técnica anterior.
El instrumento de PCR ThermalCycler usa tres
detectores, denominados F1, F2 y F3. F1 funciona a 520 nm,
optimizado para detectar las emisiones de SYBRGold y Fluoresceína.
F2 funciona a 640 nm, optimizado para detectar la señal generada por
LC640. F3 funciona a 705 nm, optimizado para trabajar con LC705.
Se usó el detector óptico F1 (520
nm/Fluoresceína) para detectar la señal de multiplicación no
específica para la cadena generada por el colorante de intercalación
SYBRGold. El detector óptico F3 (705 nm/colorante LC705) se usó para
detectar la multiplicación de producto específico usando la señal
generada por el resto Cy5 de la sonda. El sistema de sonda usó Cy5
en lugar de LC705 por el mejor rendimiento del colorante incorporado
durante la síntesis de oligonucleótidos.
La Figura 2 muestra la fluorescencia medida por
el detector F3 en función del número de ciclos para el sistema de
beta-actina para diversas concentraciones de ADN
humano usando el método de la presente invención. Cada grupo de
datos muestra una respuesta de fondo de bajo nivel para un número
dado de ciclos, dependiente de la concentración de ADN dentro de la
muestra. Dentro de cada grupo de datos, la fluorescencia observada
aumenta drásticamente a un cierto número de ciclos dependiendo de la
concentración de ADN humano en la muestra. La fluorescencia se
genera por la sección de sonda del reactivo que se une al producto
de multiplicación aguas abajo del cebador. Este proceso de unión
lleva el resto de Cy5 a la proximidad de la especie de SYBRGold. La
especie de SYBRGold experimenta fluorescencia, siendo adsorbida la
luz emitida por el resto de Cy5. El propio Cy5 emite después luz que
es detectada por el detector F3. A medida que aumenta adicionalmente
el número de ciclos, la fluorescencia alcanza un máximo y disminuye
después lentamente. Se cree que esto es debido a que la sección de
sonda es desplazada por el producto de multiplicación (a lo que se
hace referencia a menudo como el "efecto gancho", que también
se observa en químicas de información de sonda de doble hybe
(hiperhibridación)).
El análisis de los grupos de datos de la Figura
2A produce una curva de cuantificación como se muestra en la Figura
2B. El coeficiente de correlación para la curva es próximo a 1,0,
mostrando que el método de la presente invención es excelente para
cuantificar e identificar una secuencia de ácido nucleico.
La Figura 3 muestra datos comparativos obtenidos
usando ensayos del documento WO99/28500 para el gen de
beta-actina. La Figura 3A muestra la fluorescencia
medida en función del número de ciclos para el sistama de
beta-actina en función de la concentración de ADN.
Los datos obtenidos del sistema de la técnica anterior son más
ruidosos que los obtenidos del método de la presente invención.
Además, el gradiente de respuesta es más agudo usando el método de
la presente invención y el valor umbral de ciclos es también
ligeramente más bajo usando el método de la presente invención. Una
comparación de las Figuras 2B y 3B confirma esta observación.
La Figura 4 muestra datos comparativos usando los
ensayos Taqman® según un método de la técnica anterior. Las curvas
de respuesta son relativamente superficiales en comparación con las
de la presente invención. Además, la metodología Taqman® es muy
lenta en comparación con la de la presente invención.
La Figura 5 muestra la fluorescencia medida por
el detector F3 en función del número de ciclos para el sistema de
meningitis para diversas concentraciones de ADN humano usando el
método de la presente invención. Los datos mostrados usan el
reactivo de estructura Seq. No. 5. Cada grupo de datos muestra una
respuesta de fondo de bajo nivel para un número dado de ciclos,
dependiente de la concentración de ADN dentro de la muestra. Dentro
de cada grupo de datos, la fluorescencia observada aumenta
drásticamente a un cierto número de ciclos dependiendo de la
concentración de ADN humano en la muestra.
La Figura 6 muestra datos comparativos obtenidos
usando ensayos del documento WO99/28500 para el gen de porA.
\newpage
La Figura 7 muestra datos comparativos usando la
metodología Taqman® de la técnica anterior. De nuevo, las curvas de
respuesta son relativamente superficiales en comparación con las de
la presente invención. Además, la metodología Taqman® es muy lenta
en comparación con la de la presente invención. Las curvas de
respuesta Taqman® son más ruidosas y la curva de cuantificación
generada a partir de tales datos produce un coeficiente de
correlación más bajo que el presente método.
La Figura 8 muestra la fluorescencia medida por
el detector F3 en función del número de ciclos para el sistema de
clamidia para diversas concentraciones de ADN humano usando el
método de la presente invención. Cada grupo de datos muestra una
respuesta de fondo de bajo nivel para un número dado de ciclos,
dependiente de la concentración de ADN dentro de la muestra. Dentro
de cada grupo de datos, la fluorescencia observada aumenta
drásticamente a un cierto número de ciclos dependiendo de la
concentración de ADN humano en la muestra.
La Figura 9 muestra datos comparativos usando la
metodología Taqman® de la técnica anterior. De nuevo, las curvas de
respuesta son relativamente superficiales en comparación con las de
la presente invención. Además, la metodología Taqman® es muy lenta
en comparación con la de la presente invención.
La Figura 10 muestra la fluorescencia medida por
el detector F3 en función del número de ciclos para el sistema de
soja modificada genéticamente para diversas concentraciones del gen
modificado usando el método de la presente invención. La figura
muestra también la fluorescencia generada por el sistema de lect en
función del número de ciclos para diversas concentraciones del gen
modificado. Dentro de cada grupo de datos, la fluorescencia
observada aumenta drásticamente a un cierto número de ciclos
dependiendo de la concentración del gen relevante en la muestra. El
sistema de lect actúa eficazmente como testigo, siendo la curva de
respuesta de fluorescencia frente al número de ciclos como se
esperaba virtualmente independiente de la concentración del gen
modificado. En el caso del sistema de gen modificado, puede verse
que un aumento de la concentración del gen modificado causa una
disminución del número de ciclos al que la fluorescencia aumenta
drásticamente.
La Figura 11 muestra datos comparativos usando la
metodología Taqman® de la técnica anterior. De nuevo, las curvas de
respuesta son relativamente superficiales en comparación con las de
la presente invención. Además, la metodología Taqman® es muy lenta
en comparación con la de la presente invención.
Debe señalarse que, en virtualmente todas las
circunstancias, los datos obtenidos usando la metodología Taqman® de
la técnica anterior son más ruidosos que los obtenidos usando el
método de la presente invención. Además, las curvas de respuesta son
más superficiales que las de la presente invención y las curvas de
cuantificación generadas a partir de los datos obtenidos usando el
método de la presente invención tienen coeficientes de correlación
más altos que los obtenidos de la metodología Taqman®.
La presente invención proporciona también un
método que es potencialmente muy rápido. Los datos presentados aquí
para el método de la presente invención se obtuvieron usando la
instrumentación en el modo de funcionamiento más rápido posible. Se
cree que la longitud de sonda relativamente corta ayuda a producir
una respuesta rápida. Se anticipa así que la velocidad de la
presente invención está limitada por la especificación actual del
instrumento en el que se realiza el método.
Claims (20)
1. Un método para detectar la presencia de una
secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra, cuyo método
comprende:
realizar multiplicación de ácido nucleico en la
muestra en presencia de (a) un agente de unión doble de ADN, (b) una
polimerasa de ácido nucleico y (c) un reactivo que comprende un
cebador de multiplicación que puede hibridarse con dicha secuencia
objetivo cuando está en forma de cadena sencilla y que está
conectado en su extremo 5' a una sonda que lleva una marca mediante
un grupo de enlace químico, siendo dicha sonda marcada de una
secuencia que es similar a la de dicha secuencia de ácido nucleico
objetivo, de tal modo que puede hibridarse con una región
complementaria en un producto de multiplicación, y en el que la
marca es capaz de absorber fluorescencia de, o donar energía
fluorescente a, el agente de unión doble de ADN; y comprobar la
fluorescencia de dicha muestra.
2. Un método según la reivindicación 1ª, cuyo
método comprende:
(a) añadir a una muestra de la que se sospecha
que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo el agente de
unión doble de ADN, la polimerasa de ácido nucleico y el
reactivo;
(b) someter dicha muestra a condiciones bajo las
cuales el cebador se hibrida con la secuencia de ácido nucleico
objetivo y se forma un producto de multiplicación que comprende la
sonda;
(c) someter dicha muestra a condiciones bajo las
cuales la sonda marcada se hibrida con una región complementaria del
producto de multiplicación; y
(d) comprobar la fluorescencia de dicha muestra
durante al menos una de las etapas (b) y (c).
3. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que el producto de multiplicación comprende la sonda.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 3ª, en el que el agente de unión doble de ADN
es un colorante de intercalación.
5. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el agente de unión doble de
ADN comprende una marca donante y la sonda comprende la marca
aceptora.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 4ª, en el que el agente de unión doble de ADN
comprende una marca aceptora y la sonda comprende la marca
donante.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la marca aceptora es una
molécula fluorescente que emite energía a una longitud de onda
característica.
8. Un método según la reivindicación 7ª, en el
que la marca aceptora es un colorante de rodamina o Cy5.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 6ª, en el que la marca aceptora es un aceptor
oscuro.
10. Un método según la reivindicación 9ª, en el
que el aceptor oscuro se selecciona de uno cualquiera entre DABCYL,
rojo metilo, un colorante de diarilrodamina QSY-7 y
perclorato de
6-(dimetilamino)-2-[4-[4-(dimetilamino)fenil]-1,3-butadienil]-1-etilquinolinio.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la reacción de
multiplicación comprende la reacción en cadena de polimerasa
(PCR).
12. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 8ª y 11ª, en el que la molécula aceptora es
una molécula fluorescente y en el que se comprueba la fluorescencia
de las moléculas donante y aceptora y se calcula la relación entre
las emisiones.
13. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la señal fluorescente de la
muestra se comprueba por toda la reacción de multiplicación y se
usan los resultados para cuantificar la cantidad de secuencia
objetivo presente en la muestra.
14. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la reacción de
multiplicación se realiza en presencia de un cebador de
multiplicación correspondiente adicional que no está incorporado a
una sonda marcada.
15. Un método para detectar la multiplicación de
ácido nucleico que comprende: realizar multiplicación de ácido
nucleico en un polinucleótido objetivo en presencia de (a) una
polimerasa de ácido nucleico, (b) un agente de unión doble de ADN y
(c) un reactivo que comprende un cebador de multiplicación que puede
hibridarse con dicha secuencia objetivo cuando está en forma de
cadena sencilla y que está conectado en su extremo 5' a una sonda
que lleva una segunda marca, mediante un grupo de enlace químico,
siendo dicha sonda marcada de una secuencia que es similar a la de
dicha secuencia objetivo, de tal modo que puede hibridarse con una
región complementaria en un producto de multiplicación, y en el que
uno de los agente de unión doble de ADN o segunda marca comprende
una marca donante que es capaz de donar energía fluorescente al otro
de los agente de unión doble de ADN o segunda marca, que comprende
una marca aceptora capaz de absorber energía fluorescente de dicha
molécula donante, siendo dicho cebador capaz de hibridarse con dicho
polinucleótido objetivo; y comprobar cambios de fluorescencia
durante la reacción de multiplicación.
16. Un método según la reivindicación 15ª, en el
que la multiplicación se realiza usando un par de cebadores que se
diseñan de tal modo que sólo la secuencia de nucleótidos objetivo
dentro de una cadena de ADN se multiplica.
17. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la sonda es específica para
una región de empalme de ARN o un intrón en ADN, de manera que sólo
se detecte y/o cuantifique uno entre ARN multiplicado o ADN
multiplicado.
18. Un método para determinar una característica
de una secuencia de ácido nucleico objetivo, cuyo método comprende
(a) multiplicar dicha secuencia en presencia de un agente de unión
doble de ADN y un reactivo que comprende un cebador de
multiplicación enlazado mediante un enlace químico en su extremo 5'
a una sonda que comprende una secuencia que es similar a la de una
región de la secuencia objetivo y que comprende además una marca, en
los que uno de dichos agente de unión doble de ADN y la marca es una
marca donante y el otro es una marca aceptora, siendo capaz la marca
donante de donar energía fluorescente a la marca aceptora, de modo
que se forma un producto de multiplicación que incorpora una región
de sonda, (b) someter el producto de multiplicación a condiciones
bajo las cuales su región de sonda se hibrida con la región
complementaria del producto de multiplicación y (c) comprobar la
fluorescencia de dicha muestra y determinar una condición de
reacción particular, característica de dicha secuencia, a la que
cambia la fluorescencia como resultado de la hibridación de la
región de sonda con la muestra o desestabilización del doble formado
entre la región de sonda y la secuencia de ácido nucleico
objetivo.
19. Un método para detectar un polimorfismo y/o
variación alélica, cuyo método comprende multiplicar una secuencia
de la que se sospecha que contiene dicho polimorfismo o variación
alélica usando un método según se ha definido en una cualquiera de
las reivindicaciones 1ª a 6ª, medir la temperatura a la que la
región de sonda se funde de su secuencia complementaria dentro del
producto de multiplicación usando la señal fluorescente generada y
relacionar esto con la presencia de un polimorfismo o variación
alélica.
20. Un equipo de uso en el método de una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuyo equipo
comprende un reactivo que comprende un cebador de multiplicación
enlazado en su extremo 5' mediante un enlace químico a una sonda
específica para una secuencia de nucleótidos objetivo, en el que la
sonda comprende una primera marca que puede actuar como una entre
una marca donante y aceptora; y un agente de intercalación de ADN
que comprende una segunda marca, cuya segunda marca puede actuar
como una entre una marca donante y aceptora, en el que la primera y
segunda marcas forman un par donante-aceptora.
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