CN100420943C

CN100420943C - Dna分子内杂交-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法

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Publication number: CN100420943C
Application number: CNB2005100189870A
Authority: CN
Inventors: 李卫; 高枫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2005-06-23
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2025-06-23
Also published as: CN1721848A

Abstract

一种用于检测已知基因点突变的DNA分子内杂交-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，所用的引物是DNA分子内杂交探针及与之相连的引物。本发明的方法，特异性高，成本低，简便易行，无需使用放射性同位素，已成功用于检测已知的上一种β地中海贫血基因点突变和两种α地中海贫血基因点突变，即，-28(A-G)、-29(A-G)、CD17(A-T)、CD26(G-A，HbE)、CD30(A-G)、CDs41/42(-TTCT)、CD43(G-T)、CDs71/72(+A)、CD95(+A)、IVS-I-1(G-T)IVS-II-654(C-T)以及CD125(CTG-CCG，Hb Quong Sze)和终止密码子(TAA-CAA，HbConstant Spring)的检测。

Description

DNA分子内杂交-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法

技术领域

本发明属医疗领域中检测基因点突变的非同位素方法领域。

背景技术

随着医药科学的发展，人们早已发现许多疾病起因于基因发生了点突变；为了准确地找出点突变的位置，医学科学工作者作了大量研究，也取得了令人瞩目的成绩，例如针对已知点突变的检测技术已有了以下公开报道：

1)聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交(Polymerase Chains Reaction-AlleleSpecific Oligonucleotide，PCR-ASO)的方法：首先应用PCR方法对靶基因片断进行扩增，扩增产物经变性后直接在尼龙膜上点样，再与放射性同位素(³²P)标记的特异性寡核苷酸探针进行杂交，最后通过放射自显影得出检测结果。该法特异性高，可靠性强，被许多实验室采用。但由于需要使用放射性同位素，对操作人员的身体有一定损害，且检测结果易受放射性同位素半衰周期的影响。也有学者开发了逆向杂交方法：将针对多种突变的特异性寡核苷酸探针固定在同一张尼龙膜上，然后将待测的标记有生物素或地高辛的PCR产物经变性后，与尼龙膜上的寡核苷酸探针杂交，可同时检测多种突变，但对检测单个突变而言，此方法的操作比PCR-ASO略复杂，所用试剂也较昂贵。

2)等位基因特异PCR方法：因PCR对引物3’-端与模板的互补性要求较高，只要3′端序列有一个碱基错配即可使PCR的扩增效率明显降低。设计引物时，要同时设计针对正常和突变序列的两条引物。正常序列引物与正常模板互补，突变序列引物与突变模板互补。若只有正常引物能扩增，则提示无相应突变。若只有突变引物扩增，则提示受检标本为突变的纯合子。若正常与突变引物都能扩增，则提示突变的杂合子状态。此方法无需PCR之后的分子杂交等过程，操作上更为简便。但其特异性较低，易出现假阳性或假阴性。故一般只用于已知点突变的筛查，不作为最后诊断的依据。

3)PCR-限制性内切酶长度多态性分析(PCR-RFLP)：点突变可使DNA上的限制性内切酶位点发生改变，即出现新的酶切位点或使原有的酶切位点消失。根据这一现象，可设计适当的PCR引物来扩增靶DNA片段，然后选用适当的限制性内切酶对PCR产物进行酶解，用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离酶解片段，最后根据酶解片段长度的变化来分析有无酶切位点的改变，由此判断有无突变存在。该方法有赖于DNA上有无合适的限制性酶切位点，从而使它能检测的突变类型受到一定程度的限制。已有人通过PCR引物引入酶切位点，从而扩大本方法的检测范围。其可靠性取决于限制性内切酶的特异性及活性。操作上要同时设置阳性及阴性对照。

4)连接酶链反应(Ligase Chain Reaction，LCR)：本方法不依赖PCR技术。在LCR中，需要两对互补的寡核苷酸链，两条寡核苷酸链杂交到靶DNA的相邻序列上，两者之间形成的缺口由耐热Taq连接酶连接，经变性后再与互补的寡核苷酸链杂交，连接，进行温度循环扩增。该方法检测点突变特异性较高，灵敏度与PCR相似，但检测结果易受酶活性及特异性的影响。

5)基因芯片技术：该技术与逆向杂交技术相似之处是都建立在核酸分子杂交基础上。不同的是：基因芯片技术是通过喷墨或针式打印的方式将作为探针的DNA片段(cDNA或寡核苷酸等)按一定的排列顺序点样并固定在玻璃片或尼龙膜上，再与标记有荧光物质(Cy3和/或Cy5)或生物素的受检DNA片段杂交，经清洗等处理后，在显微镜上进行激光扫描，最后由计算机对大量的杂交信号进行分析处理，得出结论。该方法的特点是高通量和高效率，可同时检测成千上万个基因片段，适合于细胞基因组mRNA表达谱的研究。但若仅用于少数几个点突变的筛查，其优势并不明显。所用仪器设备及试剂较昂贵。由于此方法的基础是核酸分子杂交，因此，也不能检出未知突变。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、简便、不用同位素的检测已知基因点突变的方法。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：将DNA分子内杂交探针连接到PGR引物的5’端上，在同一条DNA单链上的两个互补序列可以自发的发生分子内杂交。若在互补序列上发生碱基错配，则在一定的温度条件下两个互补序列间的分子内杂交将受到阻碍而分开。有分子内杂交的DNA单链构象呈现为套索状，而无分子内杂交的DNA单链则为线状。这两种不同构象的DNA单链在聚丙烯酰胺中具有不同的电泳迁移率，因此可以通过非变性、非连续pH聚丙烯酰胺凝胶电泳检出互补序列上的碱基错配或突变。

用于检测地中海贫血基因点突变的DNA分子内杂交探针及其与之相连的引物有：

检测点突变-28(A-G)的探针和引物： 5’-ggcatagaagtcTAAGCAATAGATGGCTCTG-3’

检测点突变-28(A-G)的探针和引物： 5’-ggcataaaagtcTAAGCAATAGATGGCTCTG-3’

检测点突变-29(A-G)的探针和引物： 5’-ggcatgaaagtTAAGCAATAGATGGCTCTG-3’

检测点突变CD17(A-T)的探针和引物： 5’-tcacctagccccCTGCCGTTACTGCCCTG-3’

检测点突变CD26(G-A)的探针和引物： 5’-gccttaccaGGTGAACGTGGATGAAGTT-3’

检测点突变IVS-I-1(G-T)的探针和引物： 5’-ccaaactgcATGAAGTTGGTGGTGAGG-3’

检测点突变CD30(A-G)的探针和引物： 5’-aacccgcccATGAAGTTGGTGGTGAGG-3’

检测点突变CDs41-42(-TTCT)的探针和引物： 5’-aggttgagtGTGGACAGATCCCCAAAG-3’

检测点突变CD43(G-T)的探针和引物： 5’-cttttagtcATAACAGCATCAGGAGTGG-3’

检测点突变CDs71-72(+A)的探针和引物： 5’-cacttaaaCTCATGGCAAGAAAGTGCT-3’

检测点突变CD95(+A)的探针和引物： 5’-acaaagctgTGAAGTTCTCAGGATCCACG-3’

检测点突变IVS-II-654(C-T)的探针和引物： 5’-gctattaccttaGAATAACAGTGATAATTTCTGG-3’

检测点突变Hb Constant Spring的探针和引物：5’-gcttgacggGAGCACCGTGCTGACCTCCAAA-3’

检测点突变Hb Quong Sze的探针和引物： 5’-tccggggGCCGAGTTCACCCCTGCGGTG-3’

其中，用小写英文字母书写的碱基序列为探针序列，用大写英文字母书写的碱基序列为引物序列。

本发明方法的检测基因奌突变的方法，最大优点是特异性高、成本低、简便易行、无需使用放射性同位索等，主要用于已知的十一种β地中海贫血基因点突变(即，-28(A-G)、-29(A-G)、CD17(A-T)、CD26(G-A，HbE)、CD30(A-G)、CDs41/42(-TTCT)、CD43(G-T)、CDs71/72(+A)、CD95(+A)、IVS-I-1(G-T)和IVS-II-654(C-T))和两种α地中海贫血基因点突变，即，CD125(CTG-CCG，Hb Quong Sze)和终止密码子terminating codon(TAA-CAA，Hb Constant Spring)的检测。

具体实施方式

本发明DNA分子内杂交-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(DNA intramolecularhybridization-polyacrylamide gel electrophoresis，DNA IMH-PAGE)，其原理是根据在同一条DNA单链上的两个互补序列可以自发的发生分子内杂交。若在互补序列上发生碱基错配，则在一定的温度条件下两个互补序列间的分子内杂交将受到阻碍而分开。有分子内杂交的DNA单链构象呈现为套索状，而无分子内杂交的DNA单链则为线状。这两种不同构象的DNA单链在聚丙烯酰胺中具有不同的电泳迁移率，因此可以通过非变性、非连续pH聚丙烯酰胺凝胶电泳检出互补序列上的碱基错配或突变。

以下是用本发明DNA分子内杂交-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测基因点突变的方法的一种实施方案：

(一)试剂

所用试剂无论进口或国产，必须达到分析纯。

(二)方法

1)用标准的酚/氯仿法提取DNA。

2)PCR：用巢式PCR(nested PCR)方法扩增β-珠蛋白基因。扩增片段和引物序列见表1。

2.1引物设计：引物F、D、C、β54、α8和α9为外引物。分别产生片段FD、片段Cβ54和片段89，用作内引物PCR的模板。其它引物为内引物，其所产生的PCR片段用于IMH-PAGE检测。

2.2外引物PCR：外引物PCR混合物的体积为10μl。其中含有50mMKCl、10mM Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)-HCl(pH 8.8 at 25℃)、0.08％(体积％)Nonidet(乙基苯基聚乙二醇)P40、1.5mM MgCl₂、dNTP(三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧鸟苷和三磷酸脱氧胸苷4种三磷酸核苷的等量混合物)各0.125mM、外引物各10pmol、0.4u TaqDNA polymerase(耐热DNA聚合酶，美国MBI Fermentas)和0.2μg基因组DNA。片段FD的PCR热循环条件为，95℃，预变性5分钟，然后94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸4分钟，共35个循环。片段Cβ54的PCR热循环条件除了延伸时间改为1分钟外，其余与片段FD相同。片段α89的循环条件为95℃下预变性5分钟，然后94℃下变性1分钟，65℃下退火及延伸1.5分钟，共35个循环。用灭菌蒸馏水将外引物PCR产物稀释500倍，用作内引物PCR的模板。

2.3内引物PCR：内引物PCR混合物的体积为10μl。其中含有50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃)，0.08％(体积％)Nonidet P40，1.5mM MgCl₂，dNTP各0.125mM，外引物各10pmol，0.4u Taq DNA polymerase(MBI Fermentas，美国)和1μl 500倍稀释的外引物PCR产物。扩增β珠蛋白基因片段的内引物PCR热循环条件为95℃下预变性3分钟，然后94℃下变性30秒，56℃下退火30秒，72℃下延伸2分钟，共35个循环。扩增α-珠蛋白基因片段的内引物PCR条件为95℃下预变性3分钟，然后94℃下变性1分钟，65℃下退火及延伸2.5分钟。所用PCR热循环仪型号为Gene cycler^TM(Bio-Rad，美国)。用含有0.5μg/ml溴乙锭的2％(重量％)琼脂糖凝胶电泳检测内引物的PCR扩增效果，并用DNA长度和定量标记物GeneRuler^TM 50bp DNA ladder，(MBI Fermentas美国)进行粗略定量。

3)IMH-PAGE：

3.1探针：为了在DNA单链内产生互补序列，在内引物的5’端插入一段与突变点碱基序列互补的，长约7-15bp的寡核苷酸片段(见表1)。这段插入的寡核苷酸即作为分子内杂交的探针(IMH探针)，用于检测基因点突变。IMH探针既可与PCR的正链引物相连，亦可与反链引物相连，分别称为正链探针和反链探针。

3.2分子内杂交：DNA单链上的两个互补序列在DNA单链产生后即可通过碱基互补规律自发地进行分子内杂交，而不需要象PCR-ASO方法那样的杂交和洗膜过程。

3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶的浓度为18％(重量％)，其中含有10％(体积％)的甘油。丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺之重量比为35/1。凝胶的大小为10×10cm，厚度为0.3mm。电极缓冲液为0.025M Tris 0.088M L-glycine(甘氨酸)，pH8.8。凝胶缓冲液为0.112M Tris-0.112M acetate(乙酸)，pH6.5。所用电泳槽型号为Hoefer 260(美国)。用于支撑凝胶的玻璃板的厚度为2mm。加样液为含有0.05％(重量％)溴芬兰的10％(重量％)蔗糖溶液。将1-4μl内引物PCR产物(约含50ngDNA)与3μl加样液混匀，于98℃变性30秒，迅速插入0-4℃的冰水中，以产生DNA单链。将上述已变性的PCR产物加样于18-20％(重量％)的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。每次电泳均要设置正常对照和异常对照。为了保持电泳温度的相对恒定，将电泳槽放置在生化培养箱中进行电泳。所用培养箱为MIR-153(SANYO，日本)，其控温精度为±0.5℃。为了保持电泳缓冲液的温度与培养箱内的温度基本一致，必要时可将电泳缓冲液进行预冷或预热。电泳条件为恒电压300伏，电泳2小时，各受检DNA片段的电泳温度列于表1。

3.4银染色：电泳结束后参照Bassam等所介绍的方法稍有改动的对凝胶进行银染色。即：用50ml 10％(体积)乙酸固定凝胶5分钟，用蒸馏水漂洗2次，每次3分钟。用20ml 0.1％(重量％)AgNO₃溶液[含有30μl of 37％(体积％)formaldehyde(福尔马林)]浸泡7分钟。用20ml 3％(重量％)NaCO₃溶液[含30μl 37％(体积％)formaldehyde和20μl最后用2mg/ml Na₂S₂O₃]显影2-5分钟直到DNA电泳带充分显色。这时DNA电泳带呈现黑色或棕褐色。最后用50ml 10％(体积％)乙酸终止显影。

3.5结果分析：点突变杂合子显示既有正常电泳带，亦有异常电泳带。纯合子则仅有异常电泳带，无正常电泳带。

实施例1

患者韦某，因重症β地中海贫血患儿生育史就诊。取静脉血0.5毫升，用标准酚/氯仿方法提取DNA后，用IMH-PAGE方法进行检测，引物采用aggttgagtGTGGACAGATCCCCAAAG时确诊患者携带有CDs41-42(-TTCT)β-地中海贫血基因点突变，与用传统的PCR-ASO法检测结果一致。

实施例2

患者李某，因重症β地中海贫血患儿生育史就诊。取静脉血0.5毫升，用标准酚/氯仿方法提取DNA后，用IMH-PAGE方法进行检测，引物采用tcacctagccccCTGCCGTTACTGCCCTG时确诊患者携带有CD17(A-T)β-地中海贫血基因点突变，与用传统的PCR-ASO法检测结果一致。

实施例3

患者吴某，因中度贫血就诊。取静脉血0.5毫升，用标准酚/氯仿方法提取DNA后，用IMH-PAGE方法进行检测，引物采用gcttgacggGAGCACCGTGCTGAC CTCCAAA时确诊患者携带有Hb constant springα-地中海贫血基因点突变，与用传统的PCR-ASO方法检测结果一致。

表1.PCR扩增片段、所用的PCR引物序列、IMH探针和IMH-PAGE电泳温度

1.星号表示该DNA片段为外引物PCR产物，用作内引物PCR的模板。

2.用小写字母书写的碱基序列为IMH探针序列，其中的粗体并被画线的字母代表突变位点。大写字母书写的碱基序列为引物序列。

3.Tm值用公式Tm＝2×(A+T)+4×(C+G)计算。Ti表示最佳IMH-PAGE电泳温度。

序列表

<110>李卫，高枫

<120>用于检测已知基因点突变的DNA分子内杂交-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法

<160>14

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因-28(A-G)点突变。

<400>1

ggcatagaagtctaagcaatagatggctctg

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggcataaaagtctaagcaatagatggctctg

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因-29(A-G)点突变。

<400>3

ggcatgaaagttaagcaatagatggctctg

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因CD17(A-T)点突变。

<400>4

tcacctagccccctgccgttactgccctg

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因CD26(G-A)点突变。

<400>5

gccttaccaggtgaacgtggatgaagtt

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因CD30(A-G)点突变。

<400>6

aacccgcccatgaagttggtggtgagg

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因IVS-I-1(G-T)点突变。

<400>7

ccaaactgcatgaagttggtggtgagg

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因CDs41-42(-TTCT)点突变。

<400>8

cagaggttgagtcgtggacagatccccaaag

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-蛋白基因CD43(G-T)点突变。

<400>9

cttttagtcataacagcatcaggagtgga

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因CDs71-72(+A)点突变。

<400>10

cacttaaactcatggcaagaaagtgct

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因CD95(+A)点突变。

<400>11

acaaagctgtgaagttctcaggatccacg

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测β-珠蛋白基因IVS-II-654(C-T)点突变。

<400>12

gctattaccttagaataacagtgataatttctgg

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测α-珠蛋白基因Hb Constant Spring点突变。

<400>13

gcttgacgggagcaccgtgctgacctccaaa

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据基因突变点的碱基序列而设计，用于检测α-珠蛋白基因Hb Quong Sze点突变。

<400>14

tccggggccgagttcacccctgcggtg

Claims

1. 一种DNA分子内杂交-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，将一段长约7-15bp的寡核苷酸片段作为DNA单链分子内杂交探针连接到PCR引物的5’端，对靶DNA片段进行PCR扩增，由此在同一条DNA单链上产生探针及其靶序列的两个互补序列；其特征是分子内杂交探针与突变的碱基序列互补；若在互补序列上发生碱基错配，则在一定的温度条件下两个互补序列间的分子内杂交将受到阻碍而分开；因此，在一定的温度条件下，通过以三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸pH8.8为电极缓冲液，以三羟甲基氨基甲烷-乙酸pH6.5为胶缓冲液的非变性、非连续pH聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检出互补序列上的突变。

2. 如权利要求1所述的DNA分子内杂交-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，其特征是检测α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因突变所用的探针和与之相连的引物是：

检测点突变-28(A-G)的探针和引物 5’-ggcatagaagtcTAAGCAATAGATGGCTCTG-3’

检测点突变-28(A-G)的探针和引物 5’-ggcataaaagtcTAAGCAATAGATGGCTCTG-3’

检测点突变-29(A-G)的探针和引物 5’-ggcatgaaagtTAAGCAATAGATGGCTCTG-3’

检测点突变CD17(A-T)的探针和引物 5’-tcacctagccccCTGCCGTTACTGCCCTG-3’

检测点突变CD26(G-A)的探针和引物 5’-gccttaccaGGTGAACGTGGATGAAGTT-3’

检测点突变IVS-I-1(G-T)的探针和引物 5’-ccaaactgcATGAAGTTGGTGGTGAGG-3’

检测点突变CD30(A-G)的探针和引物 5’-aacccgcccATGAAGTTGGTGGTGAGG-3’

检测点突变CDs41-42(-TTCT)的探针和引物 5’-aggttgagtGTGGACAGATCCCCAAAG-3’

检测点突变CD43(G-T)的探针和引物 5’-cttttagtcATAACAGCATCAGGAGTGG-3’

检测点突变CDs71-72(+A)的探针和引物 5’-cacttaaaCTCATGGCAAGAAAGTGCT-3’

检测点突变CD95(+A)的探针和引物 5’-acaaagctgTGAAGTTCTCAGGATCCACG-3’

检测点突变IVS-II-654(C-T)的探针和引物 5 ’-gctattaccttaGAATAACAGTGATAATTTCTGG-3’

检测点突变Hb Constant Spring的探针和引物 5’-gcttgacggGAGCACCGTGCTGACCTCCAAA-3’

检测点突变Hb Quong Sze的探针和引物 5’-tccggggGCCGAGTTCACCCCTGCGGTG-3’

其中，用小写英文字母书写的碱基序列为探针序列，而用大写英文字母书写的碱基序列为引物序列。