CN1340705A

CN1340705A - 一种检测等位基因点突变的方法

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Publication number: CN1340705A
Application number: CN 00119758
Authority: CN
Inventors: 程新建
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2002-03-20

Abstract

一种检测等位基因点突变的方法是采用基因扩增技术,在扩增反应体系中的引物,一条是按常规设计的引物,另一条是在3’端第二位碱基与目的基因对应的碱基按不互补原则设计的特异引物。该方法可检测等位基因的不同点突变,特异性强,敏感性高,操作简便,使用的试剂价格低廉,实用性强,便于推广。

Description

一种检测等位基因点突变的方法

本发明涉及分子生物学基因诊断技术领域，尤其是关于一种检测等位基因点突变的方法。

目前，检测基因点突变的主要技术有：DNA测序、熔解曲线分析配合荧光探针杂交、等位基因特异扩增等多种技术。在众多技术中，以DNA测序和熔解曲线分析配合荧光探针杂交技术代表了当前基因突变检测的最高水平(参见文献：Allen et al.，Hepatolog.1998；Vol.27 No.6：1670～1677；NorioOgata et al.，Journal of Medical virology 1999；59：270～276；Patricia A.Cane etal.，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1999；Vol.43，No.7：1600-1608)。DNA测序的最大优点在于能全面反映被检基因的碱基排列顺序及多处发生点突变的情况，适合对复杂的基因突变进行检测。但被检样品中若含有几种等位基因时，DNA测序只能反映处于优势的等位基因突变情况。另外，DNA测序所用的测序仪价格极其昂贵，除少数专门研究机构外，很少有用DNA测序技术进行基因点突变常规检测的。DNA测序所用试剂价格昂贵，操作复杂，化费时间长等，均是DNA测序技术难以克服的缺点。而熔解曲线分析配合荧光探针杂交的优势是能在一次检测中，同时检测等位基因的几种点突变，但仅所用的专用仪器“Light Cycler”售价就需七万美元，除此所用试剂价格也不菲，是普通实验室难以承受的，该技术所用的荧光探针的设计，合成技术要求较高，一般实验室难以办到。熔解曲线分析配合荧光探针杂交技术是近二年Roche(罗氏)公司发明的，国内尚未有成功使用该技术检测基因突变的报道。因此，该技术检测基因突变的稳定性、重复性还有待进一步研究观察。等位基因特异抗突变扩增系统(Amplification RefractoryMutation system简称ARMS)技术(Schuster H.et al..Biochemistry，1992；204(1)：22-25)，虽不需特殊设备，但此技术检测基因点突变的特异性欠佳，目前用该技术检测基因点突变已较为少见。因此，建立一种操作简便，检测结果准确，无需特殊设备且所用试剂价格低廉的检测基因点突变的新方法，是从事基因突变研究工作者，临床基因诊断实验室迫切需要的。

为此，本发明的目的是提供一种检测等位基因点突变的方法，该方法是在采用基因扩增技术检测时，其中用的一条引物在3’端第二位碱基与目的基因对应的碱基是不互补的。该检测方法特异性强，敏感性高，简便且实用。

本发明提供一种检测等位基因点突变的方法，是采用基因扩增技术，在基因扩增反应体系中，加入被检DNA样品，再加入一条按常规方法设计合成的引物和一条在3’端第二位碱基与目的基因对应的碱基按不互补原则设计的引物。所述3’端第二位碱基与目的基因对应的碱基按不互补原则设计的引物包括以下11种形式：A-A，A-G，A-C，G-G，G-T，G-U，C-C，C-T，C-U，T-T，T-U。经基因扩增反应后，只需对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，就可得知被检样品是否发生了基因点突变。

本发明的详细技术方案叙述如下：

1、引物的设计合成

从有关文献或DNA基因库中查到需检测的基因序列，根据该基因的碱基排列顺序，按常规的碱基互补(A-T、A-U、G-C)的原则设计一条引物，写出该引物的碱基排列顺序，再标明引物的5’端和3’端。然后，按引物的3’→5’方向依次将碱基的代号输入“DNA合成仪”合成。另一条引物是按3’端第二位碱基与对应的目的基因的碱基不互补原则设计的，除了3’端第二位碱基与目的基因不互补外，引物的其余碱基均与目的基因互补。与第一条引物一样，通过“DNA合成仪”合成。

2、基因扩增

按常规的方法，在扩增反应试管中加入基因扩增反应液，需检测的DNA样品，合成的二条引物及DNA聚合酶。然后将试管放入扩增仪中进行扩增。扩增产物用电泳检测，电泳板放在紫外灯下照射，若出现特异的荧光条带，则说明被检测样品DNA存在基因点突变；反之则说明被检样品DNA不存在基因点突变。

3、本发明检测方法以检测乙肝病毒DNA-P基因区点突变为例的说明

乙型肝炎患者在接受药物贺普丁(Lamivudine，拉米夫丁)治疗过程中，部分患者体内原有的乙肝病毒野生株(即YMDD株)在DNA-P基因区的第741碱基发生A→G的点突变成为YVDD变异株，同时野生株(YMDD株)也可在DNA-P基因区的第743位碱基发生G→T的点突变，成为另一种变异株，即YIDD株。YMDD株、YVDD株、YIDD株的DNA-P基因区的各等位基因部分碱基序列如下：741位 743位(1)YMMD株5’——

T GATGATGTGGTATTGGGG-3’741位(2)YVDD株5’——

T G GATGATGTGGTATTGGGG-3’743位(3)YIDD株5’——A T

GATGATGTGGTATTGGGG-3’

为了检测741位发生的A→G的点突变的YVDD变异株，设计一条通用引物，又设计一条在3’端第二位碱基与目的基因对应的碱基不互补的特异引物(检测步骤详见实施例)。检测结果电泳显示YVDD株是阳性反应，而YMDD株和YIDD株都是呈阴性反应。检测结果证明本发明检测方法具有高度特异性，即YVDD株设计的特异引物仅能检测得YVDD株上的突变点。

本发明的高度特异性是由特异引物3’端第二位碱基与目的基因不互补决定的，从YVDD特异引物与YVDD株，YMDD株，YIDD株的互补情况也可充分证明检测结果的高度特异性。

YVDD特异引物与YVDD株，YMDD株，YIDD株的碱基互补情况如下：

(1)YVDD特异引物与YVDD株碱基互补情况

(上下两个碱基之间以“｜”连接表示两者互补，以“×”连接表示两者不互补)

由于引物仅3’端第二位碱基与目的基因不互补，其余碱基均互补，尤其是3’端第一位碱基与目的基因互补，因此检测一定呈阳性。

(2)YVDD特异引物与YMDD株碱基互补情况

引物3’端连续二个碱基与目的基因不互补，尤其是3’端第一位碱基与目的基因不互补，因此用YVDD特异引物检测YMDD株只能得到阴性结果。(3)YVDD特异引物与YIDD株碱基互补情况

YVDD特异引物3’端连续有三个碱基与目的基因不互补，检测结果也一定是阴性。

同理，若用YIDD特异引物检测YVDD和YMDD株，得到的也是阴性结构。YIDD特异引物只能检测出YIDD株。

本发明优点：

1、检测等位基因点突变的特异性高及敏感性强

由于在基因扩增中使用了一条3’端第二位碱基与目的基因对应碱基不互补的特异引物，因此扩增不受其它可能共存的等位基因影响，这种影响在DNA测序技术及“ARMS”技术中表现得尤为明显。当被检标本存在几种突变的等位基因时，DNA测序技术只能检出处于优势(含量较高)的等位基因，即使对同一份标本进行多次测序，往往也不能检出处于弱势的等位基因。而本发明的方法只需根据等位基因发生的几种不同点突变，在相应的扩增反应体系中加入与之对应的点突变特异引物，就可方便地检测出各种点突变的等位基因，即具有高度的特异性。另外，当某一种发生突变的等位基因处于弱势时，其它技术较难检出，而本发明的方法具有很强的特异性，因此，对弱势的等位基因也能检出，即本发明的方法具有很强的敏感性。

2、本发明具有简便性和实用性

用本发明的方法检测基因点突变操作上简便易行，对仪器设备无特殊要求，凡能开展基因扩增研究和基因诊断的实验室，均可利用现有设备进行基因点突变的研究和检测。另外发明方法所用的试剂都已国产化，价格低廉，有很强的实用性。本发明方法尤其适用于对大量标本的检测，省时简便，便于普及推广。

附图说明：

图1是乙肝病毒DNA YVDD变异株的电泳检测图。

图中：

1-药物治疗前HBV DNA呈阳性反应；

2-药物治疗前YVDD株呈阴性反应；

3-药物治疗52周后HBV DNA仍呈阳性反应；

4-药物治疗52周后YVDD株呈阳性反应。

以下通过检测乙肝病毒DNA YMDD区点突变为实施例进一步阐述本发明，但不限制本发明的保护范围。

实施例1检测乙肝病毒DNA YMDD株在741位发生A→G点突变后的YVDD变异株

乙型肝炎患者在接受药物贺普丁(Lamivudine拉米夫丁)治疗过程中，部分患者体内原有的乙肝病毒野生株(即YMDD株)在DNA-P基因区的第741碱基发生A→G的点突变成为YVDD变异株，同时野生株(YMDD株)也可在DNA-P基因区的第743位碱基发生G→T的点突变，成为另一种变异株，即YIDD株。YMDD株、YVDD株、YIDD株的DNA-P基因区的各等位基因部分碱基序列如下：

741位 743位(1)YMMD株5’——

T GATGATGTGGTATTGGGG-3’ 741位(2)YVDD株5’—— T G GATGATGTGGTATTGGGG-3’743位(3)YIDD株5’——A T

GATGATGTGGTATTGGGG-3’

(一)引物的设计与合成

1、上游通用引物的设计与合成

按常规的碱基互补(A-T，A-U，G-C)方法，在基因的上游(5’端)，设计上游通用引物：5’TCTTCATCCTGCTGCTATGC 3’

然后，按引物的3’→5’方向依次将碱基的序列输入”DNA合成仪”自动合成。

2、下游通用引物的设计与合成

按常规的碱基互补方法，在基因的下游(3’端)，设计下游通用引物：5’TCAAATGTATACCCAAAGAC 3’下游通用引物同上法合成。

3、YVDD株的特异引物的设计与合成

以发生A→G点突变的YVDD株基因的第741位碱基G为特异引物的3’端第一个碱基，设计3’端第二个碱基与目的基因不互补，而引物其余碱基均是互补的特异引物为：3’CGCCTACTACACCATAACCCC 5’，该特异引物与YVDD株的互补情况如下：

741位

可以看出特异引物的3’端第二位碱基G与目的的基因对应的碱基T不互补。然后如同上法合成引物。

(二)基因扩增

取4支0.2(或0.5)m1的专用试管，按1、2、3、4依次编号。在各管中均加入市售(上海普洛麦格生物产品有限公司)基因扩增反应液20μl，耐高温DNA聚合酶1μl(含一个国际单位)，1、3号管内加上下游通用引物(HBVDNA定性用)各0.5μl，并在1号管内加入患者在用贺普丁药物治疗前的HBVDNA 3μl，3号管内加入同一患者经贺普丁药物治疗52周后的HBV DNA 3μl；在2、4号管内加入上游通用引物和YVDD特异引物(检测YVDD株)各0.5μl，并在2号管内加入上述患者用贺普丁治疗前的HBV DNA 3μl，4号管内加入同一患者经贺普丁治疗52周后的HBV DNA 3μl，然后将上述4支试管放入基因扩增仪上进行扩增。扩增条件如下：先经94℃预变性2分钟，然后按94℃25秒，56℃20秒，72℃50秒为一个扩增循环，扩增35个循环。扩增结束后，对扩增的产物进行电泳分析。

(三)电泳分析

用2％的琼脂糖(100ml 2％的琼脂糖中需加溴化乙锭5-10mg)凝胶电泳板，对扩增产物进行电泳分析，取上述4管的扩增产物各10μl，加到电泳板对应的1、2、3、4号孔内，在5v/cm电场强度下进行电泳，电泳30分钟后，取出电泳板，在紫外灯照射下，电泳板上出现的荧光条带(见图1)表明：患者经贺普丁药物治疗前与治疗后HBV DNA均呈阳性(图1中1和3)，阳性条带为430bp；在贺普丁药物治疗前未检出YVDD株(图1中2)，而经贺普丁药物治疗52周后YVDD株呈阳性反应，在352bp处出现了特异荧光条带(图1中4)。

Claims

1、一种检测等位基因点突变的方法，采用基因扩增技术，其特征在于在扩增反应体系中用的引物，一条是按常规设计的引物，另一条是在3’端第二位碱基与目的基因对应的碱基按不互补原则设计的引物。

2、按权利要求1所述的方法，其特征在于所述3’端第二位碱基与目的基因对应的碱基按不互补原则设计的引物包括以下11种形式：A-A，A-G，A-C，G-G，G-T，G-U，C-C，C-T，C-U，T-T，T-U。