CN106480183A - 焦磷酸测序检测结核分枝杆菌卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法，包括以下顺序步骤：步骤(1)，从痰液中直接提取核酸；步骤(2)，对结核分枝杆菌rrs基因进行特异性的PCR扩增；步骤(3)，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rrs基因是否具有突变位点。本发明提供的检测结核分枝杆菌对二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法可以从患者痰标本直接进行耐药性检测，并给出准确的耐药突变比例，无需再做分离培养结核分枝杆菌菌株，相比现在常用检测方法具有检测时间短，定量结果准确，操作简便，成本较低的优点。

Description

焦磷酸测序检测结核分枝杆菌卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素 耐药性的方法

技术领域

本发明涉及一种利用焦磷酸序列分析法进行结核分枝杆菌基因耐药突变检测的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的慢性传染性疾病，如果病人感染的结核分枝杆菌对一种或一种以上的抗结核药物产生了耐药性，即为耐药结核病。结核分枝杆菌耐药的发生主要通过以下三种机制：

(1)细胞壁结构与组成发生变化，使得细胞壁通透性改变，降低药物通透性，产生降解或灭活酶类，改变药物作用靶位；

(2)结核分枝杆菌中存在着活跃的药物外排泵系统，外排胞内药物，使得胞内药物浓度不能有效抑制或杀死结核分枝杆菌；

(3)结核分枝杆菌基因组中药物作用靶基因或与药物作用相关酶基因序列的突变，导致药物失效而产生的耐药性，目前被认为是结核分枝杆菌产生耐药性的主要分子机制。这为结核菌耐多药(MDR：Multidrug resistance)乃至广泛耐药(XDR：Extensivelydrug-resistance)的快速分子诊断提供了理论依据。

耐阿米卡星(AMK)、卡那霉素的结核杆菌中，16SrRNA基因突变率为67.4％，最常见的突变型是1401(A-G)的单碱基置换(60.5％)。少数分离株为1402(C-T或A)，1484(G-T)，这些突变主要发生于高水平耐药株，还有32.6％的耐卡那霉素分离株未发现16SrRNA基因突变，可能还存在其他耐药机制。

卡那霉素(Kanamycin，KAN)和阿米卡星(Amikacin，AMK)是氨基糖苷类抗生素，它们结合到细菌核糖体30S亚基的16SrRNA，干扰甲酰甲硫氨酰tRNA(formyl-methionyl-tRNA)与30SrRNA的连接，阻断细菌蛋白质的合成，从而达到抑菌的作用。

卷曲霉素(Capreomycin，CAP)为多肽复合物，对结核分枝杆菌起抑制作用，但作用机制尚不明确，可能与抑制细菌蛋白合成有关。

卷曲霉素耐药与相关基因突变关系密切，包括16SrRNA基因和tlyA基因，但是，最主要的耐药基因是16SrRNA基因，大约78-80％的卷曲霉素耐药性与该基因的突变相关，特别是1401(A-G)的单碱基置换，突变率约为72％。

WHO2008年报道显示，全球结核病总耐药率为20.0％，耐多药率为5.3％，由此造成的结核病患病率和死亡率居高不下。因此，快速准确的检测MTB耐药性成为结核病防治工作的当务之急，是制定恰当的治疗方案的重要依据。

目前结核耐药检测常规方法多采用细菌学药敏方法，该方法所需时间长，不能及时为临床提供用药指导，而直接测序，费用昂贵，检测时间长。

针对上述情况，本发明应用焦磷酸测序技术完成对受试物扩增产物的突变检测分析。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析出峰值的情况，达到实时测定DNA序列并精确分析序列变化的目的。由于焦磷酸测序技术操作简单，且结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。与其它方法相比，该方法具有特异性好，通量高，成本低，检测方法简便快速等优点。利用焦磷酸测序技术直接从痰液中检测结核分枝杆菌卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药基因的产品在技术上具备竞争优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便快速的结核分枝杆菌基因耐药突变的检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供一种利用焦磷酸测序技术直接从痰液样本中检测分析结核分枝杆菌对于二线药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药基因突变的方法。

所述的方法包括对耐二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素相关的突变位点rrs1401的焦磷酸序列分析检测。

其特征及具体步骤为：

步骤1，从待测痰液样本中提取核酸；

步骤2，使用荧光定量PCR仪对上步中提取的核酸进行扩增；

步骤3，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rrs基因是否有耐药突变位点。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法中，其中对rrs基因1401位点进行焦磷酸测序并设计引物。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐药性的方法中，其中所述对rrs基因进行PCR扩增，以痰标本结核杆菌DNA提取物为模板。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐药性的方法中，其中所述的扩增使用的PCR引物根据结核分枝杆菌rrs基因的高保守区域，设计多对引物，最优引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列，其中PCR扩增使用的引物SEQ ID NO.2的5’端带有生物素标记。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐药性的方法中，其中所述PCR引物的最佳浓度为0.4μM，。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐药性的方法中，其中在焦磷酸测序中用的测序引物具有SEQ ID NO.3所示序列，测序引物终浓度为800nM。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌耐药性的方法中，其中所述PCR扩增反应过程包括下列顺序步骤：

步骤1：在95℃下进行预热2分钟；

步骤2：在95℃下保持30秒进行变性、60℃下保持30秒进行退火、72℃下保持30秒进行扩增和延伸，信号收集通道为“Green”，循环45次；

步骤3：在72℃下保持5分钟。

本发明提供的检测结核分枝杆菌耐药性的方法可以从患者痰标本直接进行对于二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素的耐药性检测，并给出准确的耐药突变比例，无需再做分离培养结核分歧杆菌菌株。

相比常用的分离培养检测方法具有检测时间短，操作简便，成本较低的优点。

并且市面上还没有除分离培养方法之外的检测结核分枝杆菌耐二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素的方法。

由于rrs基因序列在各菌种之间差别不大，相对保守，这对结核分枝杆菌特异性的引物设计带来了挑战，并且市面上的rrs扩增引物往往具有非特异性扩增，对后续的测序灵敏度有不良影响。

本发明PCR引物是根据结核分枝杆菌特异的rrs基因的高保守区域设计的，对于不含结核分枝杆菌的样本无法扩增。消除了非特异性扩增产物对后续焦磷酸测序反应的干扰，提高了焦磷酸测序的灵敏度。

荧光定量PCR结果显示，使用此PCR引物扩增，无非特异性扩增产物，说明本发明提供的PCR引物特异性好；并且能够扩增低至1000拷贝/ml的结核分枝杆菌rrs基因片段，说明本发明提供的PCR引物扩增效率高。

本发明特异性好，通量高，成本低，检测方法简便快速，耐药突变比例检测准确，可适用于于肺结核患者对抗结核二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素治疗的耐药辅助诊断及疗效检测。

附图说明

图1是本发明中突变比例为0％即野生型的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

图2是本发明中突变比例为5％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

图3是本发明中突变比例为10％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

图4是本发明中突变比例为15％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

图5是本发明中突变比例为20％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

图6是本发明中突变比例为25％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

图7是本发明中突变比例为50％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

图8是本发明中突变比例为75％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

图9是本发明中突变比例为100％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

图10是本发明中痰样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果；

具体实施方式

由于rrs基因的突变主要集中于1401位点，在本发明主要针对二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素rrs耐药基因1401位点进行焦磷酸测序检测方法。本发明提供的一种检测结核分枝杆菌对二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法，先对rrs基因进行PCR扩增，再对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rrs基因是否具有突变位点；其中焦磷酸测序采用AQ模式、核苷酸加样顺序为CGTGCAGCGT。

以下通过实施例对本发明内容作进一步的详细说明，以便更好理解本发明创造的内容，但是下述实施例并不限制本发明创造的保护范围。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

1.采集检测物。

收集病人晨痰并存放在无菌样本保存管内，痰量以：2mL为宜，密封后送检。

2.检测物DNA的提取。

使用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)按照如下步骤进行检测物DNA的提取，其中，DNA提取步骤中步骤(6)为本发明对天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)的优化步骤，原说明书中不包含该步骤。

(1)在痰液样本中加入等体积4％氢氧化钠溶液，在150rpm、37℃震摇30分钟，或者室温下1小时，使其充分液化；

(2)取液化后的痰液1mL，13,000rpm离心10min，尽量吸净上清；

(3)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；

(4)向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀；

(5)加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(6)95℃金属浴加热15min，冷却至室温，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(7)加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(8)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(9)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(10)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；

(11)重复操作步骤10；

(12)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液PW；

(13)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置3min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

(14)将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min。

3.二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素rrs耐药基因的PCR扩增。

用具有SEQ ID NO.1所示序列和具有SEQ ID NO.2所示序列的PCR引物进行扩增，模板为病人痰检测物的结核杆菌DNA提取物。在30uL反应体系中，PCR引物最佳的浓度为0.4μM。PCR反应过程如下：先在95℃下进行预热2分钟；在95℃下保持30秒进行变性、60℃下保持30秒进行退火、72℃下保持30秒进行扩增和延伸，信号收集通道为“Green”并循环该过程45次；最后在72℃下保持5分钟。

通过荧光PCR扩增仪显示的Ct值来检查扩增效果：检测反应体系的荧光信号强度，以荧光信号达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为判定标准，Ct值小于38为合格，可以用于焦磷酸测序；Ct值大于等于38为不合格，无法用于焦磷酸测序。

具有SEQ ID NO.1所示序列扩增引物和具有SEQ ID NO.2所示序列扩增引物的序列如下所示：

SEQ ID NO.1：AGGTTAAGCGAATCCTTAAAAGCC

SEQ ID NO.2：GGCGTTTTCGTGGTGCTC

具有SEQ ID NO.1所示序列的PCR引物为正向引物，带有生物素标记的具有SEQ IDNO.2所示序列的PCR引物为反向引物，带有生物素标记的引物在检测中起到标记作用。

4.焦磷酸测序。

4.1实验材料：

焦磷酸测序仪及配套试剂(吸附缓冲液，变性缓冲液，退火缓冲液，洗涤缓冲液，酶，底物和4种dNTPs)均购置于QIAGEN公司。

链霉亲合素包被的琼脂糖微珠购置于GE公司。

4.2焦磷酸测序检测步骤

(1)PCR产物固定：在PCR板中加入8.5μL的PCR扩增产物，再分别加入31.5μL超纯水、39μL的吸附缓冲液和1μL链亲和素包被的磁珠，将PCR板放在涡旋振荡器上常温振荡10分钟，使PCR产物固定在磁珠上；

(2)单链模板的纯化：打开真空泵，将真空样品转移器移到PCR板中，抓取结合PCR产物的微珠，检查是否大部分微珠都被吸附在了真空样品转移器上，再将真空样品转移器放入70％乙醇中轻微振荡5～10秒，然后移到变性缓冲液中抽吸10～15秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5～10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA；

(3)引物杂交：先用退火缓冲液稀释SEQ ID NO.3所示序列测序引物，使测序引物的终浓度为800nM，再在焦磷酸测序微孔板各孔中加入含测序引物的退火缓冲液25μL，然后将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与具有SEQ ID NO.3所示序列测序引物混和，在80℃下变性1.5分钟，然后室温温浴5～10分钟，使引物与模板退火杂交；

具有SEQ ID NO.3所示序列测序引物的序列如下所示：

SEQ ID NO.3：TTGTACACACCGCCC

(4)焦磷酸测序：利用由QIAGEN公司生产的PyroMark测序仪和试剂盒，依次在试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用AQ检测模式、以CGTGCAGCGT的核苷酸加样顺序加入顺序进行测序反应，通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

图1是用AQ模式对已知突变比例为0％即野生型的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测突变比例为2％。图2是用AQ模式对已知突变比例为5％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测突变比例为6％。图3是用AQ模式对已知突变比例为10％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测突变比例为11％。图4是用AQ模式对已知突变比例为15％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测突变比例为16％。图5是用AQ模式对已知突变比例为20％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测突变比例为20％。图6是用AQ模式对已知突变比例为25％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测突变比例为25％。图7是用AQ模式对已知突变比例为50％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测突变比例为45％。图8是用AQ模式对已知突变比例为75％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测突变比例为73％。图9是用AQ模式对已知突变比例为100％的标准株样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测突变比例为99％。图1～9的焦磷酸测序结果给出的突变比例数值与标准株的突变比例吻合度高，说明本发明的方法准确可靠。

图10是用AQ模式对痰样本rrs基因1401位点的焦磷酸测序结果，检测得出的序列为GTCA/GCGTCATGAA，可以看出，菌株发生A1401G突变，突变比例为58％，焦磷酸测序可以准确的检测样本耐药基因的分型，对判断样本是否具有耐药性提供依据。

根据多次检验结果与二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素rrs基因1401位点标准株焦磷酸测序结果相比较，具有SEQ ID NO.3所示序列的测序引物能准确的检测出二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药突变位点，由此在临床研究中可以方便将其应用在检测之中。

在本发明中能够从痰标本获得高质量的耐药基因目的片段，进行焦磷酸测序检测，实现从痰标本直接进行结核杆菌耐药性测定，满足临床快速诊断耐药结核病的需求，并且能够给出准确的耐药基因突变比例，为临床合理用药提供实验室依据。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种焦磷酸测序技术直接从痰液中检测结核分枝杆菌二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法，其特征在于，包括以下顺序步骤：

步骤(1)，从痰液中直接提取核酸，无需进行分离培养；

步骤(2)，对结核分枝杆菌rrs基因进行特异性的PCR扩增；

步骤(3)，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rrs基因是否具有突变位点。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述从痰液中直接提取核酸，该核酸提取过程的步骤6为95℃金属浴加热15min，冷却至室温，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)针对rrs基因1401位点进行PCR扩增，PCR引物浓度为0.4μM。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的PCR引物是根据结核分枝杆菌rrs基因特异的高保守区域设计的PCR引物，具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的PCR引物SEQ ID NO.2的5’端带有生物素标记。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增反应过程包括下列顺序步骤：

步骤1：在95℃下进行预热2分钟；

步骤2：在95℃下保持30秒进行变性、60℃下保持30秒进行退火、72℃下保持30秒进行扩增和延伸，循环退火过程45次；

步骤3：在72℃下保持5分钟。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)焦磷酸测序中用的测序引物具有SEQ ID NO.3所示序列，测序引物终浓度为800nM。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)焦磷酸测序中采用AQ模式，核苷酸加样顺序为CGTGCAGCGT。