CN103866024A - 基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法 - Google Patents

基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法 Download PDF

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Abstract

基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法,包括步骤1，对embB基因进行PCR扩增:针对embB基因306位点设计PCR扩增引物；以标本结核杆菌DNA提取物为模板，对包含embB基因306位点的embB基因进行PCR扩增；扩增结核分枝杆菌embB基因的DNA片段长度165bp，包含embB基因306位点序列为atg;步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断embB基因306位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。通过多次检验，本发明所示序列的测试引物能高度准确的检测出乙胺丁醇embB基因耐药突变位点，可以快速筛查结核分枝杆菌耐药株，有助于实现对感染耐药结核分枝杆菌患者的早发现、早诊断和早治疗。

Description

基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法
技术领域
本发明涉及一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法，具体是一种基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法。 
背景技术
结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，是目前传染病中威胁人类健康的头号杀手。耐药结核菌株的产生和播散，尤其是耐多药菌株的出现，已成为新世纪结核病控制的三大难题之一。快速准确的耐多药结核病的检测对于早期发现、阻断耐药结核病的传播，规范指导用药，提高耐药结核病的治愈率具有非常重要的意义。 
结核分枝杆菌生长缓慢,传统用于结核分枝杆菌耐药性的检测方法主要以培养为基础的绝对浓度法或比例法，因不能及时确定药物的耐药性,可导致多重耐药发生,以及耐药结核的传播。已报道的药敏基因检测方法如传统测序法、单链构象多态性分析法、RNA/RNA错配法、线性探针杂交法、异源双链形成分析法和基因芯片法，多数存在检测时间长、检测过程繁琐且不能精确确定突变位置及突变类型等缺点。 
焦磷酸测序技术是一种新型DNA测序技术，与作为分子药敏金标准的Sanger测序法相比，无需对整个基因进行测定，只需对特定短片段进行测序即可检测到所有类型的突变，赵锦荣等用此法在结核菌利福平耐药决定区突变检测中取得良好的效果,目前用焦磷酸测序技术检测已胺丁醇耐药性还没有相关报道。 
药物乙胺丁醇(EMB)是具有广谱抗分支杆菌活性的一线抗结核合成药物，被广泛应用于结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等引起的结核的治疗，具有比异烟肼更广的抗菌谱。embB基因全长约3246bp,编码阿拉伯糖基转移酶,embB基因突变使阿拉伯糖基转移酶的结构发生改变,影响其与EMB的相互作用,使EMB失去作用靶分子或结合力降低而失去作用,导致耐EMB的产生。 
研究表明结核EMB耐药主要由embB基因306位点(embB306)的突变引起。长期以来embB306突变一直被视为结核分枝杆菌耐已胺丁醇(EMB)的分子诊断标记。但是，最近研究发现，embB306突变并不特异性地引起结核分枝杆菌EMB耐药性，而是容易产生对任何药物的耐药性，检测embB306基因突变可作为耐多药结核病的标志。 
发明内容
本发明的目的是提供一种基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法，通过检测其embB基因306位点的变异，判断结核杆菌耐多药性，以克服现有技术的不足，并有助于实现对感染MDR.TB以及其他多耐药结核分枝杆菌患者的早发现、早诊断和早治疗。 
本发明的技术构思如下： 
由于embB基因的突变主要集中于306位点，本发明主要针对乙胺丁醇耐药基因306位点进行焦磷酸测序检测。 
先对embB基因进行PCR扩增，再对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断embB基因是否具有突变；其中焦磷酸测序采用序列分析模式（Sequence Analysis，SQA）SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。 
本发明的主要原理为: 
焦磷酸测序技术 
1)焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是全新的一种DNA序列分析技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。 
2)焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，基本原理如下：将1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出摩尔数的焦磷酸基团。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。加入另一种dNTP，使第2～4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。 
3)焦磷酸测序操作系统中共有2个模式能进行碱基突变的检测，即序列分析模式（Sequence Analysis，SQA）和单核苷酸多态性模式（Single Nucleotide polymorphism，SNP）。其中SQA模式的核苷酸加样顺序为循环顺序加样法，即通过循环反复的加入A、G、C、T四种核苷酸以检测出待检样品的序列，该法一次能准确判读40bp左右的碱基，将所测定序列与已知序列比对后自行判读突变情况。SNP模式的核苷酸加样顺序为特定顺序加样法，即系统根据设定的待检位点及位点周围的序列自动生成核苷酸的加样顺序，仅对单个位点的碱基变化进行检测，不对整个序列进行测定。针对不同的检测对象，需要摸索不同的焦磷酸测序检测方法。 
为了实现上述基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法，其特征在于包括以下顺序步骤： 
步骤1，对embB基因进行PCR扩增； 
步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断embB基因306位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。 
步骤1包括针对embB基因306位点设计PCR扩增引物； 
以标本结核杆菌DNA提取物为模板，对包含embB基因306位点的embB基因进行PCR扩增； 
扩增使用的PCR引物在embB基因306位点序列是高度保守和唯一的，扩增结核分枝杆菌embB基因的DNA片段长度165bp，包含embB基因306位点序列为atg 
所用的扩增embB基因的PCR引物序列如下： 
F:CGTGGTGATATTCGGCTTCCT 
R:AGGTTGTAATACCAGCCGAAGG 
其中F引物5端用生物素标记；F为PCR上游引物；R为PCR下游引物； 
在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的方法中，其中所述PCR引物的浓度为50nmol/L。 
上述基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的方法中，所述的扩增反应过程包括下列顺序步骤： 
步骤1：在95℃下进行预热2分钟； 
步骤2：在95℃下保持15秒进行变性、59℃下保持15秒进行退火、72℃下保持15秒进行扩增和延伸，循环退火过程36次； 
步骤3：在72℃下保持7分钟。 
步骤2所述焦磷酸测序检测步骤具体如下 
（1）PCR产物固定：在PCR板中放入40μL的PCR扩增产物，再分别加入36μL的结合缓冲液和4μL链亲和素包被的磁珠；将PCR板放在涡旋振荡器上常温振荡20分钟，使PCR产物固定在磁珠上； 
（2）单链模板的纯化：打开真空泵，将真空样品转移器移到PCR板中，抓取结合PCR产物的磁珠，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空样品转移器上；再将真空样品转移器放入70%乙醇中轻微振荡5秒，然后移到变性缓冲液中抽吸5秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5-10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA； 
（3）引物杂交：先在焦磷酸测序微孔板各孔中加入退火缓冲液50μL，再加入具有表1所示序列测序引物；测序引物的最低要求浓度为1μmol/L，最高浓度为0.2mmol/L；再将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与序列测序物引物混和，在80℃下变性2分钟，然后冷却至室温，使引物与模板退火杂交； 
测序引物的序列如下所示： 
GTGGTCGGCGACTCG 
（4）焦磷酸测序：依次在测序仪试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用SQA检测模式、以A、G、C、T顺序循环加样16次的碱基加入顺序进行测序反应；通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息； 
（5）将焦磷酸测序结果与结核分枝杆菌标准株的embB基因306位点序列相比较，即可准确的判断出结核分枝杆菌embB基因306位点是否发生耐药突变，embB306突变被视为结核分枝杆菌耐已胺丁醇(EMB)和耐多药结核病的分子诊断标记，进一步判断检测结核分枝杆菌具有耐已胺丁醇(EMB)和耐多药性。 
发明优点 
通过将多次检验结果与结核分枝杆菌标准株的embB基因306位点序列相比较，具有所示序列的测试引物能高度准确的检测出结核分枝杆菌embB基因耐药突变位点，在临床研究中可以方便将其应用在检测之中。 
利用焦磷酸测序技术进行embB基因306位点突变检测较其他分子检测方法具有独特的优势，焦磷酸测序法既快速、简便、经济，又有很好的灵敏度和特异度，可以作为快速筛查结核分枝杆菌耐药株的初筛试验.克服现有技术的缺点，有助于实现对感染MDR.TB以及其他多耐药结核分枝杆菌患者的早发现、早诊断和早治疗 
附图说明
图1是本发明中对结核分枝杆菌embB基因PCR扩增电泳图。 
图2是用SQA模式测序乙胺丁醇embB基因306位点标准株焦磷酸结果 
注：方框内为306位点，序列为CCTGGGC-ATG-GCC（ATG为306野生型位点） 
图3是本发明中用SQA模式检测乙胺丁醇embB基因306位点焦磷酸结果 
注：方框内为306位点，序列为CCCTTGGGC-GTG-GGCCC（GTG为突变位点） 
图4是本发明中用SQA模式检测乙胺丁醇embB基因306位点焦磷酸结果 
注：方框内为306位点，序列为CCTGGGCATC GCC（ATC突变位点） 
具体实施方式
以下通过实施例对本发明内容作进一步的详细说明，以便更好理解本发明创造的内容，但是下述实施例并不限制本发明创造的保护范围。 
DNA提取 
将菌株接种于改良罗氏培养基上，37℃培养2-3周，使用Takara公司生产的细菌裂解液提取MTB基因组DNA。具体操作如下:无菌生理盐水洗下菌株新鲜培养物，吸取菌悬液1ml于无菌Eppendorf离心管中，取50μl裂解液离心管中，在涡旋震荡器上震荡至块状固体菌落均匀溶于溶液中,80℃热变性15min后，12000r/min离心3min，取1-5μl裂解后的上清液作为PCR反应模板或-20℃冷冻保存备用，即得到到结核杆菌DNA提取物。 
乙胺丁醇embB耐药基因的PCR扩增 
用具有R所示序列的PCR引物和带有生物素（Biotin）标记的具有F所示序列的PCR引物进行PCR扩增，以标本结核杆菌DNA提取物为模板。在25μL反应体系中，引物最佳的浓度为50nmol/L。PCR反应过程如下： 
先在在95℃下进行预热2分钟；在95℃下保持15秒进行变性、59℃下保持15秒进行退火、72℃下保持15秒进行扩增和延伸，循环退火过程36次；在72℃下保持7分钟。 
取2μL的PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在12V/cm电位梯度下电泳20分钟，后在紫外灯下检查扩增效果。图1是对乙胺丁醇embB基因进行PCR扩增结果，其中M为标准带，1-8为结核杆菌标本。图中可以看到存在一条单一信号较强的条带，并且没有剩余的引物，也没有引物二聚体或其他非特异的条带存在。 
带有生物素（BIO）标记F所示序列的PCR引物为正向引物。具有R所示序列的PCR引物为反向引物，带有生物素标记的引物在检测中起到标记作用。 
焦磷酸测序 
1.检测试剂配制 
结合缓冲液：将10mmol/L Tris-HCl、2mol/L NaCl、1mmol/L EDTA和0.1%Tween20去离子水溶解，用1mol/L HCl调pH至7.6。 
变性缓冲液（denatureation buffer）：0.5mol/L NaOH。 
退火缓冲液：将20mmol/L Tris-Acetate、2mmol/L MgAc2溶液混合，用4mol/L乙酸调pH至7.6。 
洗涤缓冲液（washing buffer）：用4mol/L乙酸将10mmol/L Tris-Acetate溶液调pH至7.6。 
70%乙醇：在70mL无水乙醇中加入高纯水20mL，充分混匀后定容至100mL。 
2.检测仪器及配套试剂 
（1）PSQTM96全自动焦磷酸测序仪、PSQ96单链制备工具台（Vacuum prep workstation）、真空样品转移器（Vacuum prep tool）、真空泵、涡旋振荡器、PCR仪。 
（2）瑞典PYROSEQUENCING AB公司生产的焦磷酸微测序试剂盒（PSQ96MA SQA Upgrade Kit）和链亲和素包被的磁珠（Sepharose beads）。 
3.焦磷酸测序检测步骤 
（1）PCR产物固定：在PCR板中放入40μL的PCR扩增产物，再分别加入36μL的结合缓冲液和4μL链亲和素包被的磁珠。将PCR板放在涡旋振荡器上常温振荡20分钟，使PCR产物固定在磁珠上。 
（2）单链模板的纯化：打开真空泵，将真空样品转移器移到PCR板中，抓取结合PCR产物的磁珠，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空样品转移器上。再将真空样品转移器放入70%乙醇中轻微振荡5秒，然后移到变性缓冲液中抽吸5秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5～10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA。 
（3）引物杂交：先在焦磷酸测序微孔板各孔中加入退火缓冲液50μL，再加入具有表1所示序列测序引物。测序引物的最低要求浓度为1μmol/L，最高浓度为0.2mmol/L。再将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与序列测序物引物混和，在80℃下变性2分钟，然后冷却至室温，使引物与模板退火杂交。 
测序引物的序列如下所示。 
GTGGTCGGCGACTCG 
焦磷酸测序：利用由德国QIAGEN公司的PyroMark Q96ID测序仪和试剂盒，依次在试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用SQA检测模式、以A、G、C、T顺序循环加样16次的碱基加入顺序进行测序反应。通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。 
图4是采用SQA模式乙胺丁醇embB基因306位点焦磷酸测序结果，检测得出的序列分别为CCCTTGG GCGTGGGCCC；CCTGGGCATC GCC。将其与图3的乙胺丁醇embB基因306位点标准株焦磷酸测序结果得到序列CCTGGGCATGGCC相比较，可得出图中方框内为突变的基因序列（GTG、ATC为突变位点）。 
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。 
Figure DEST_PATH_GDA0000493317810000061
Figure IDA0000477606810000011

Claims (3)

1.基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法，其特征在于包括以下顺序步骤：
步骤1，对embB基因进行PCR扩增；包括针对embB基因306位点设计PCR扩增引物，以标本结核杆菌DNA提取物为模板，对embB基因进行PCR扩增，
扩增使用的PCR引物在embB基因306位点序列是高度保守和唯一的，扩增结核分枝杆菌embB基因的DNA片段长度为165bp，包含embB基因306位点序列:atg
所用的扩增embB基因的PCR引物及其序列如下：
F:CGTGGTGATATTCGGCTTCCT
R:AGGTTGTAATACCAGCCGAAGG
其中F引物5端用生物素标记；F为PCR上游引物；R为PCR下游引物。
步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断embB基因306位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT；
所述焦磷酸测序检测步骤具体如下
（1）PCR产物固定：在PCR板中放入40μL的PCR扩增产物，再分别加入36μL的结合缓冲液和4μL链亲和素包被的磁珠；将PCR板放在涡旋振荡器上常温振荡20分钟，使PCR产物固定在磁珠上；
（2）单链模板的纯化：打开真空泵，将真空样品转移器移到PCR板中，抓取结合PCR产物的磁珠，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空样品转移器上；再将真空样品转移器放入70%乙醇中轻微振荡5秒，然后移到变性缓冲液中抽吸5秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5-10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA；
（3）引物杂交：先在焦磷酸测序微孔板各孔中加入退火缓冲液50μL，再加入具有表1所示序列测序引物；测序引物的最低要求浓度为1μmol/L，最高浓度为0.2mmol/L；再将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与序列测序物引物混和，在80℃下变性2分钟，然后冷却至室温，使引物与模板退火杂交；
测序引物的序列如下所示：
GTGGTCGGCGACTCG
（4）焦磷酸测序：依次在测序仪试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用SQA检测模式、以A、G、C、T顺序循环加样16次的碱基加入顺序进行测序反应；通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息；
（5）将焦磷酸测序结果与结核分枝杆菌标准株的embB基因306位点序列相比较，即可准确的判断出结核分枝杆菌embB基因306位点是否发生耐药突变，embB306突变被视为结核分枝杆菌耐已胺丁醇(EMB)和耐多药结核病的分子诊断标记，进一步判断检测结核分枝杆菌具有耐已胺丁醇(EMB)和耐多药性。
2.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的方法，其特征在于在50μL反应体系中，其中所述PCR引物的浓度为50nmol/L。
3.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的方法，其特征在于所述的扩增反应过程包括下列顺序步骤：
步骤1：在95℃下进行预热2分钟；
步骤2：在95℃下保持15秒进行变性、59℃下保持15秒进行退火、72℃下保持15秒进行扩增和延伸，循环退火过程36次；
步骤3：在72℃下保持7分钟。
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