CN110669851A - 检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物及其应用 - Google Patents
检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110669851A CN110669851A CN201911042212.5A CN201911042212A CN110669851A CN 110669851 A CN110669851 A CN 110669851A CN 201911042212 A CN201911042212 A CN 201911042212A CN 110669851 A CN110669851 A CN 110669851A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- seq
- detecting
- primer
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请提供了检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物及其应用。本申请具体涉及用于检测肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、脑膜炎奈瑟菌以及凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种的引物和/或探针组合物或相关的试剂或试剂盒，由此大大缩短这些球菌的检测周期，提高了效率和检测通量，迎合了检测需求。此外，本申请的方法及其相关产品具有较高的特异性、灵敏度和准确性。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学领域，具体涉及用于检测引发血流感染的球菌，特别是革兰氏阳性球菌的引物和/或探针组合物及其应用。
背景技术
血流感染(BSI)是指各种病原菌入血液循环引起的全身炎症反应、感染及中毒，是一种严重危及生命的感染性疾病。由于该病起病隐匿、发展迅速，若未能及时有效治疗，会危及患者生命。但是，血流感染的临床表现缺乏特异性，易漏诊、误诊，因此早期诊断血流感染具有重要的临床意义。
引起血流感染的病原菌主要分为三类:革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。在常见的血流感染病原菌中，革兰氏阳性菌主要包括各种球菌，如肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌以及凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌等，而脑膜炎奈瑟菌(又称为脑膜炎球菌)为革兰氏阴性球菌。
一直以来，血培养是公认的诊断血流感染的“金标准”，通过生化方法或显微镜观察来确定病原菌。然而，该方法所需周期长，对于较难生长的病原菌或者已使用过抗菌药物治疗的患者敏感度较低，因而在血流感染早期诊断中的作用十分有限。缺乏准确诊断结果导致临床医师难以选择最佳的治疗方案，而盲目使用抗生素可能会导致患者的生存率降低、细菌耐药性的出现以及治疗费用的增加等不良后果。
因此，亟需能够对血流感染进行早期诊断的方法及相关产品。
发明内容
为了解决上述问题，第一方面，本申请提供了用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物，其包含选自用于检测以下一种或多种靶标的引物和/或探针：肺炎链球菌自溶素基因(lytA基因)，粪肠球菌转录调控基因(Ef0027基因)，屎肠球菌d-丙氨酸聚连接酶基因(ddl基因)，化脓性链球菌致热外毒素B基因(speB基因)，无乳链球菌表面免疫相关蛋白基因(Sip基因)，脑膜炎奈瑟菌荚膜转移基因A(ctrA基因)，凝固酶阴性葡萄球菌超氧化物歧化酶基因(sodA基因)，以及金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因(femA基因)。
在具体实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物包含分别用于检测所述lytA基因、所述Ef0027基因、所述ddl基因、所述speB基因、所述Sip基因、所述ctrA基因、所述sodA基因和所述femA基因的引物和/或探针中的任意两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。
例如，在一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物包含分别用于检测所述lytA基因和/或所述Ef0027基因的引物和/或探针。
在一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物包含分别用于检测所述ddl基因和/或所述speB基因的引物和/或探针。
在一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物包含分别用于检测所述Sip基因和/或所述ctrA基因的引物和/或探针。
在一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物包含分别用于检测所述sodA基因和/或所述femA基因的引物和/或探针。
在另一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物中，用于检测所述lytA基因的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。
在另一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物中，用于检测所述Ef0027基因的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，探针序列如SEQ ID NO.6所示；
在另一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物中，用于检测所述ddl基因的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；
在另一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物中，用于检测所述speB基因的引物序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQ ID NO.12所示；
在另一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物中，用于检测所述Sip基因的引物序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，探针序列如SEQ ID NO.15所示；
在另一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物中，用于检测所述ctrA基因的引物序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，探针序列如SEQ ID NO.18所示；
在另一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物中，用于检测所述sodA基因的引物序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，探针序列如SEQ ID NO.21所示。
在另一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物中，用于检测所述femA基因的引物序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，探针序列如SEQ ID NO.24所示。
在又一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物中，探针序列分别用荧光报告基团和猝灭基团标记。在具体实施方案中，荧光报告基团选自FAM，ROX，JOE，HEX或TET，猝灭基团选自BHQ1，BHQ2或TAMRA。
在又一实施方案中，本申请提供的用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。
第二方面，本申请提供了上述任一实施方案中的引物和/或探针组合物在制备用于检测引发血流感染的球菌的试剂或试剂盒中的用途。
第三方面，本申请提供了用于检测引发血流感染的球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中的引物和/或探针组合物。
在一实施方案中，本申请提供的试剂或试剂盒还包含用于检测内标基因的引物和/或探针。在具体实施方案中，所述内标基因为int基因。在另一具体实施方案中，用于检测内标基因int基因的引物序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示，探针序列如SEQ IDNO.27所示。
在另一实施方案中，本申请提供的试剂或试剂盒，其还包含以下中的一种或多种：核酸抽提液、PCR反应酶系、阴性对照品或阳性对照品。在具体实施方案中，所述核酸抽提液包含：2％(M/V)Chelex-100和1％(V/V)Tris-HCl。在另一具体实施方案中，所述PCR反应酶系包含：5U/μL Taq DNA聚合酶和2U/μL尿嘧啶-N-糖基化酶。在另一具体实施方案中，所述阴性对照品为纯化的双蒸水。在另一具体实施方案中，所述阳性对照品为携带所检测靶标的T载体质粒或含有携带所检测靶标的T载体质粒的大肠杆菌工程菌。
第四方面，本申请提供了用于检测引发血流感染的球菌的方法，其包括利用上述任一实施方案中的引物和/或探针组合物或者上述任一实施方案中的试剂或试剂盒对生物样品进行检测。
第五方面，本申请提供了用于检测肺炎链球菌的引物和/或探针。在一实施方案中，用于检测肺炎链球菌的引物和/或探针的靶标为肺炎链球菌自溶素基因(lytA基因)。在一实施方案中，用于检测所述lytA基因的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。在另一实施方案中，用于检测所述lytA基因的探针序列如SEQ ID NO.3所示。在又一实施方案中，用于检测所述lytA基因的探针序列5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
进一步地，本申请提供了用于检测肺炎链球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测肺炎链球菌自溶素基因(lytA基因)的引物和/或探针。
第六方面，本申请提供了用于检测粪肠球菌的引物和/或探针。在一实施方案中，用于检测粪肠球菌的引物和/或探针的靶标为粪肠球菌转录调控基因(Ef0027基因)。在一实施方案中，用于检测所述Ef0027基因的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。在另一实施方案中，用于检测所述Ef0027基因的探针序列如SEQ ID NO.6所示。在又一实施方案中，用于检测所述Ef0027基因的探针序列5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有淬灭基团BHQ2。
进一步地，本申请提供了用于检测粪肠球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测粪肠球菌转录调控基因(Ef0027基因)的引物和/或探针。
第七方面，本申请提供了用于检测屎肠球菌的引物和/或探针。在一实施方案中，用于检测屎肠球菌的引物和/或探针的靶标为屎肠球菌d-丙氨酸聚连接酶基因(ddl基因)。在一实施方案中，用于检测所述ddl基因的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。在另一实施方案中，用于检测所述ddl基因的探针序列如SEQ ID NO.9所示。在又一实施方案中，用于检测所述ddl基因的探针序列5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
进一步地，本申请提供了用于检测屎肠球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测屎肠球菌d-丙氨酸聚连接酶基因(ddl基因)的引物和/或探针。
第八方面，本申请提供了用于检测化脓性链球菌的引物和/或探针。在一实施方案中，用于检测化脓性链球菌的引物和/或探针的靶标为化脓性链球菌致热外毒素B基因(speB基因)。在一实施方案中，用于检测所述speB基因的引物序列如SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示。在另一实施方案中，用于检测所述speB基因的探针序列如SEQ ID NO.12所示。在又一实施方案中，用于检测所述speB基因的探针序列5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有淬灭基团BHQ2。
进一步地，本申请提供了用于检测化脓性链球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测化脓性链球菌致热外毒素B基因(speB基因)的引物和/或探针。
第九方面，本申请提供了用于检测无乳链球菌的引物和/或探针。在一实施方案中，用于检测无乳链球菌的引物和/或探针的靶标为无乳链球菌表面免疫相关蛋白基因(Sip基因)。在一实施方案中，用于检测所述Sip基因的引物序列如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示。在另一实施方案中，用于检测所述Sip基因的探针序列如SEQ ID NO.15所示。在又一实施方案中，用于检测所述Sip基因的探针序列5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
进一步地，本申请提供了用于检测无乳链球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测无乳链球菌表面免疫相关蛋白基因(Sip基因)的引物和/或探针。
第十方面，本申请提供了用于检测脑膜炎奈瑟菌的引物和/或探针。在一实施方案中，用于检测脑膜炎奈瑟菌的引物和/或探针的靶标为脑膜炎奈瑟菌荚膜转移基因A(ctrA基因)。在一实施方案中，用于检测所述ctrA基因的引物序列如SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.17所示。在另一实施方案中，用于检测所述ctrA基因的探针序列如SEQ ID NO.18所示。在又一实施方案中，用于检测所述ctrA基因的探针序列5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有淬灭基团BHQ2。
进一步地，本申请提供了用于检测脑膜炎奈瑟菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测脑膜炎奈瑟菌荚膜转移基因A(ctrA基因)的引物和/或探针。
第十一方面，本申请提供了用于检测脑凝固酶阴性葡萄球菌的引物和/或探针。在一实施方案中，用于检测脑凝固酶阴性葡萄球菌的引物和/或探针的靶标为脑凝固酶阴性葡萄球菌超氧化物歧化酶基因(sodA基因)。在一实施方案中，用于检测所述sodA基因的引物序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。在另一实施方案中，用于检测所述sodA基因的探针序列如SEQ ID NO.21所示。在又一实施方案中，用于检测所述sodA基因的探针为MGB探针，其5’端标记有荧光报告基团为FAM。
进一步地，本申请提供了用于检测脑凝固酶阴性葡萄球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测脑凝固酶阴性葡萄球菌超氧化物歧化酶基因(sodA基因)的引物和/或探针。
第十二方面，本申请提供了用于检测金黄色葡萄球菌的引物和/或探针。在一实施方案中，用于检测金黄色葡萄球菌的引物和/或探针的靶标为金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因(femA基因)。在一实施方案中，用于检测所述femA基因的引物序列如SEQ IDNO.22和SEQ ID NO.23所示。在另一实施方案中，用于检测所述femA基因的探针序列如SEQID NO.24所示。在又一实施方案中，用于检测所述femA基因的探针序列5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记淬灭基团BHQ2。
进一步地，本申请提供了用于检测金黄色葡萄球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因(femA基因)的引物和/或探针。
第十三方面，本申请提供了用于检测肺炎链球菌和粪肠球菌的引物和/或探针组合物。在一实施方案中，用于检测肺炎链球菌的引物和/或探针的靶标为肺炎链球菌自溶素基因(lytA基因)，用于检测粪肠球菌的引物和/或探针的靶标为粪肠球菌转录调控基因(Ef0027基因)。在一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物包含SEQ ID NO.1至6。在另一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含用于检测内标基因int基因的引物和/或探针。在又一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含SEQ ID NO.25至27。在又一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。在另一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物包含以下成分：2μL 10×PCR缓冲液、2μL 25mmol/L MgCl2、1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L的SEQ ID NO.1和2以及SEQ ID NO.4和5、0.2μL 10μmol/L的SEQ ID NO.3和6、0.6μL 10μmol/L的SEQ ID NO.25和26，0.2μL 10μmol/L的SEQ ID NO.27，以及7μL灭菌纯化水。
进一步地，本申请提供了用于检测肺炎链球菌和粪肠球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测肺炎链球菌自溶素基因(lytA基因)和粪肠球菌转录调控基因(Ef0027基因)的引物和/或探针组合物。
第十四方面，本申请提供了用于检测屎肠球菌d-丙氨酸聚连接酶基因(ddl基因)和化脓性链球菌致热外毒素B基因(speB基因)的引物和/或探针组合物。在一实施方案中，用于检测屎肠球菌的引物和/或探针的靶标为屎肠球菌d-丙氨酸聚连接酶基因(ddl基因)，用于检测化脓性链球菌的引物和/或探针的靶标为化脓性链球菌致热外毒素B基因(speB基因)。在一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物包含SEQ ID NO.7至12。在另一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含用于检测内标基因int基因的引物和/或探针。在又一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含SEQ ID NO.25至27。在又一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。在另一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物包含以下成分：2μL 10×PCR缓冲液、2μL25mmol/L MgCl2、1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L的SEQ ID NO.7和8以及SEQID NO.10和11、0.2μL 10μmol/L的SEQ ID NO.9和12、0.6μL 10μmol/L的SEQ ID NO.25和26，0.2μL 10μmol/L的SEQ ID NO.27，以及7μL灭菌纯化水。
进一步地，本申请提供了用于检测屎肠球菌和化脓性链球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测屎肠球菌d-丙氨酸聚连接酶基因(ddl基因)和化脓性链球菌致热外毒素B基因(speB基因)的引物和/或探针组合物。
第十五方面，本申请提供了用于检测无乳链球菌和脑膜炎奈瑟菌的引物和/或探针组合物。在一实施方案中，用于检测无乳链球菌的引物和/或探针的靶标为无乳链球菌表面免疫相关蛋白基因(Sip基因)，用于检测脑膜炎奈瑟菌的引物和/或探针的靶标为脑膜炎奈瑟菌荚膜转移基因A(ctrA基因)。在一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物包含SEQ ID NO.13至18。在另一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含用于检测内标基因int基因的引物和/或探针。在又一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含SEQ ID NO.25至27。在又一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。在另一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物包含以下成分：2μL 10×PCR缓冲液、2μL 25mmol/L MgCl2、1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L的SEQ ID NO.13和14以及SEQ ID NO.16和17、0.2μL 10μmol/L的SEQ ID NO.15和18、0.6μL10μmol/L的SEQ ID NO.25和26，0.2μL 10μmol/L的SEQ ID NO.27，以及7μL灭菌纯化水。
进一步地，本申请提供了用于检测无乳链球菌和脑膜炎奈瑟菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测无乳链球菌表面免疫相关蛋白基因(Sip基因)和脑膜炎奈瑟菌荚膜转移基因A(ctrA基因)的引物和/或探针组合物。
第十六方面，本申请提供了用于检测脑凝固酶阴性葡萄球菌超氧化物歧化酶基因(sodA基因)和金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因(femA基因)的引物和/或探针组合物。在一实施方案中，用于检测脑凝固酶阴性葡萄球菌的引物和/或探针的靶标为脑凝固酶阴性葡萄球菌超氧化物歧化酶基因(sodA基因)，用于检测金黄色葡萄球菌的引物和/或探针的靶标为金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因(femA基因)。在一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物包含SEQ ID NO.19至24。在另一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含用于检测内标基因int基因的引物和/或探针。在又一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含SEQ ID NO.25至27。在又一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。在另一具体实施方案中，所述引物和/或探针组合物包含以下成分：2μL 10×PCR缓冲液、2μL 25mmol/L MgCl2、1.6μL2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L的SEQ ID NO.19和20以及SEQ ID NO.22和23、0.2μL10μmol/L的SEQ ID NO.21和24、0.6μL 10μmol/L的SEQ ID NO.25和26，0.2μL 10μmol/L的SEQ ID NO.27，以及7μL灭菌纯化水。
进一步地，本申请提供了用于检测脑凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的试剂或试剂盒，其包含上述任一实施方案中用于检测检测脑凝固酶阴性葡萄球菌超氧化物歧化酶基因(sodA基因)和金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因(femA基因)的引物和/或探针组合物。
第十七方面，本申请提供了上述试剂或试剂盒的使用方法。
可见，本申请提供了用于检测引发血流感染的球菌，包括肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、脑膜炎奈瑟菌、凝固酶阴性葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌中的任一种或多种的引物和/或探针组合物以及相关的检测试剂或试剂盒，采用实时荧光定量PCR对生物样品进行检测。
与目前常规临床检测方法相比，本申请提供的方法检测周期大大缩短，提高了效率和检测通量，迎合了检测需求。此外，本申请提供的引物和/或探针组合物以及相关的检测试剂或试剂盒具有较高的特异性、灵敏度和准确性，同时由于实验中没有扩增之后的检测过程，能够有效解决实验中的污染问题。
附图说明
图1为本申请实施例2中lytA基因阳性对照扩增结果的荧光定量PCR曲线图；
图2为本申请实施例2中Ef0027基因阳性对照扩增结果的荧光定量PCR曲线图；
图3为本申请实施例2中ddl基因阳性对照扩增结果的荧光定量PCR曲线图；
图4为本申请实施例2中speB基因阳性对照扩增结果的荧光定量PCR曲线图；
图5为本申请实施例2中Sip基因阳性对照扩增结果的荧光定量PCR曲线图；
图6为本申请实施例2中ctrA基因阳性对照扩增结果的荧光定量PCR曲线图；
图7为本申请实施例2中sodA基因阳性对照品扩增结果的荧光定量PCR曲线图；
图8为本申请实施例2中femA基因阳性对照品扩增结果的荧光定量PCR曲线图；
图9为本申请实施例2中mecA基因阳性对照品扩增结果的荧光定量PCR曲线图。
具体实施方案
为了能够实现对血流感染进行早期诊断，发明人对引发血流感染的各种主要球菌，包括肺炎链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、脑膜炎奈瑟菌、凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌进行了深入研究，最终分别筛选确定出以下检测靶标基因：肺炎链球菌检测靶标为自溶素基因(lytA)，粪肠球菌检测靶标为转录调控基因(Ef0027)，屎肠球菌检测靶标为d-丙氨酸聚连接酶基因(ddl)，化脓性链球菌检测靶标为致热外毒素B基因(speB)，无乳链球菌检测靶标为表面免疫相关蛋白基因(Sip)，脑膜炎奈瑟菌检测靶标为荚膜转移基因A(ctrA)，凝固酶阴性葡萄球菌检测靶标为超氧化物歧化酶基因(sodA)，金黄色葡萄球菌检测靶标为甲氧西林耐药辅助基因(femA)。
在此基础上，发明人通过序列比对，进一步选择各基因的保守且特异的区段，分别设计了诸多用于检测靶标基因的特异性引物和探针，从中筛选出能够有效避免同管扩增时引物之间的互相干扰的序列，由此建立了特异性和灵敏度良好的多重荧光定量PCR反应体系。
具体地，所筛选确定的检测引物和探针序列如下：
1)根据lytA基因序列(Genebank登录号：FM865975.1)设计的一对引物及一条探针如下：
| 正向引物(SEQ ID NO.1) | 5’-CGCTGGAGGAAGCACACA-3’ |
| 反向引物(SEQ ID NO.2) | 5’-TGGCACCTTCTTCGTTGAAAT-3’ |
| 探针(SEQ ID NO.3) | 5’-FAM-ACGGCAACTGGTACTGGTTCGACAACTC-BHQ1-3’ |
2)根据Ef0027基因序列(Genebank登录号：CP039752.1)设计的一对引物及一条探针如下：
| 正向引物(SEQ ID NO.4) | 5’-GCCAAAGTCGCGGAAATG-3’ |
| 反向引物(SEQ ID NO.5) | 5’-TGCCACCAACACCGAACAC-3’ |
| 探针(SEQ ID NO.6) | 5’-ROX-AAAATGATTGAGCGTGCGAA-BHQ2-3’ |
3)根据ddl基因序列(Genebank登录号：AF550666.1)设计的一对引物及一条探针如下：
| 正向引物(SEQ ID NO.7) | 5’-AGAAAAACCTGCCAGCAAAGAT-3’ |
| 反向引物(SEQ ID NO.8) | 5’-CCTGTAAAGCCTTCCTCTGTCTGT-3’ |
| 探针(SEQ ID NO.9) | 5’-FAM-TCTTGCATCTTTCATGGGACCCAAGTG-BHQ1-3’ |
4)根据speB基因序列(Genebank登录号：EU250019.1)设计的一对引物及一条探针如下：
| 正向引物(SEQ ID NO.10) | 5’-GATATTTCATAATTTGAGCAGTTGCA-3’ |
| 反向引物(SEQ ID NO.11) | 5’-CCAGTTGTTAAATCTCTCCTTGAT-3’ |
| 探针(SEQ ID NO.12) | 5’-ROX-ACATCCTGTAGCTGCATGTTGACCT-BHQ2-3’ |
5)根据Sip基因序列(Genebank登录号：CP019978.1)设计的一对引物及一条探针如下：
| 正向引物(SEQ ID NO.13) | 5’-CTTCGCTATTATCAGTCGCAA-3’ |
| 反向引物(SEQ ID NO.14) | 5’-GCTTCTGAAATAACGCTTAGTGTAT-3’ |
| 探针(SEQ ID NO.15) | 5’-FAM-CACAAGAAACAGATACGACGTGGACA-BHQ1-3’ |
6)根据ctrA基因序列(Genebank登录号：AF315858.1)设计的一对引物及一条探针如下：
| 正向引物(SEQ ID NO.16) | 5’-GCTGCGGTAGGTGGTTCAA-3’ |
| 反向引物(SEQ ID NO.17) | 5’-TTGTCGCGGATTTGCAACTA-3’ |
| 探针(SEQ ID NO.18) | 5’-ROX-CATTGCCACGTGTCAGCTGCACAT-BHQ2-3’ |
7)根据sodA基因序列(Genebank登录号：AJ343947.1)设计的一对引物及一条探针如下：
| 正向引物(SEQ ID NO.19) | 5’-TTCAGCAGTTGAAGGGACAGATT-3’ |
| 反向引物(SEQ ID NO.20) | 5’-GATGGCACACTATCTAAATTAGCAACA-3’ |
| 探针(SEQ ID NO.21) | 5’-FAM-AGAAGCTAAATCAATCGAAG-MGB-3’ |
8)根据femA基因序列(Genebank登录号：CP020618.1)设计的一对引物及一条探针如下：
| 正向引物(SEQ ID NO.22) | 5’-ATGAAGTTTACAAATTTAACAGCTAC-3’ |
| 反向引物(SEQ ID NO.23) | 5’-GTGTCTTATACACTGAATACAAAGG-3’ |
| 探针(SEQ ID NO.24) | 5’-ROX-AATGACTCCAACATCTTCAGCGTCTT-BHQ2-3’ |
9)此外，进一步设置内标基因(int)，用于鉴别仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素或样本中存在抑制物等造成的结果不理想的原因。发明人选取水稻核糖体DNA内转录间隔区ITS1基因片段作为内标，对int基因及前述检测目的基因序列进行比对，选取特异性片段设计针对所述int基因的特异性引物和荧光标记探针如下：
| 正向引物(SEQ ID NO.25) | 5’-GCGATACCACGAGCTAAATC-3’ |
| 反向引物(SEQ ID NO.26) | 5’-GCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’ |
| 探针(SEQ ID NO.27) | 5’-JOE-ACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC-TAMRA-3’ |
在此基础上，本申请提供了一种用于检测引发血流感染的常见球菌的试剂盒，其包含核酸抽提液、PCR反应酶系、内标、阴性对照品、阳性对照品、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液和第四引物探针混合液。
在一实施方案中，试剂盒中包含的核酸抽提液由2％(M/V)Chelex-100、1％(V/V)Tris-HCl，1M，pH9.0组成。
在一实施方案中，试剂盒中包含的PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和2U/μL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)按体积比3:1比例混合组成。
在一实施方案中，试剂盒中包含的内标为含有内标int基因片段的质粒。
在一实施方案中，试剂盒中包含的阴性对照品为经过Millipore纯水仪纯化的双蒸水。
在一实施方案中，试剂盒中包含的阳性对照品为携带检测肺炎链球菌靶标基因(lytA)的T载体质粒、携带粪肠球菌靶标基因(Ef0027)的T载体质粒、携带屎肠球菌靶标基因(ddl)的T载体质粒、携带化脓性链球菌靶标基因(speB)的T载体质粒、携带无乳链球菌靶标基因(Sip)的T载体质粒、携带脑膜炎奈瑟菌靶标基因(ctrA)的T载体质粒、携带凝固酶阴性葡萄球菌靶标基因(sodA)的T载体质粒、携带检测金黄色葡萄球菌靶标基因(femA)的T载体质粒和携带甲氧西林耐药基因(mecA)的T载体质粒，或者含有上述质粒的大肠杆菌工程菌，作为对照品的菌液菌浓度105CFU/mL。
在一实施方案中，试剂盒中包含的第一引物探针混合液包含：分别用于检测所述lytA基因和所述Ef0027基因的正向引物、反向引物和探针组成第一引物探针组合物。进一步地，第一引物探针混合液还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。
在一具体实施方案中，试剂盒中包含的第一引物探针混合液由2μL 10×PCR缓冲液、2μL 25mmol/L MgCl2、1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L的分别用于检测lytA基因和Ef0027基因的正向引物和反向引物、0.2μL 10μmol/L的分别用于检测lytA基因和Ef0027基因的探针、0.6μL 10μmol/L的分别用于检测内标int基因的正向引物和反向引物及0.2μL 10μmol/L的分别用于检测内标int基因的探针和7μL灭菌纯化水组成。
在一实施方案中，试剂盒中包含的第二引物探针混合液包含：分别用于检测所述ddl基因和所述speB基因的正向引物、反向引物和探针组成第二引物探针组合物。进一步地，第二引物探针混合液还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。
在一具体实施方案中，试剂盒中包含的第二引物探针混合液由2μL 10×PCR缓冲液、2μL 25mmol/L MgCl2、1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L的用于检测ddl基因和speB基因的正向引物和反向引物、0.2μL 10μmol/L的用于检测ddl基因和speB基因的探针、0.6μL 10μmol/L的用于检测内标int基因的正向引物和反向引物及0.2μL 10μmol/L的用于检测内标int基因的探针和7μL灭菌纯化水组成。
在一实施方案中，试剂盒中包含的第三引物探针混合液包含：分别用于检测所述Sip基因和所述ctrA基因的正向引物、反向引物和探针。进一步地，第三引物探针混合液还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。
在一具体实施方案中，试剂盒中包含的第三引物探针混合液由2μL 10×PCR缓冲液、2μL 25mmol/L MgCl2、1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L的分别用于检测Sip基因和ctrA基因的正向引物和反向引物、0.2μL 10μmol/L的分别用于检测Sip基因和ctrA基因的探针、0.6μL 10μmol/L的分别用于检测内标int基因的正向引物和反向引物及0.2μL10μmol/L的分别用于检测内标int基因的探针和7μL灭菌纯化水组成。
在一实施方案中，所述第四引物探针混合液包含：分别用于检测所述sodA基因和所述femA基因的正向引物、反向引物和探针。进一步地，第四引物探针混合液还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。
在一具体实施方案中，试剂盒中包含的第四引物探针混合液由2μL 10×PCR缓冲液、2μL 25mmol/L MgCl2、1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L的分别用于检测sodA基因和femA基因的正向引物和反向引物、0.2μL 10μmol/L的分别用于检测sodA基因和femA基因的探针、0.6μL 10μmol/L的分别用于检测内标int基因的正向引物和反向引物及0.2μL 10μmol/L的分别用于检测内标int基因的探针和7μL灭菌纯化水组成。
在另一实施方案中，所述试剂盒包括分隔并集中包装所述试剂的试剂瓶或管的包装盒。
此外，本申请还提供了一种用于检测引发血流感染的常见球菌的试剂盒的使用方法，其包括：
(1)制备样本核酸，取上清液备用；
(2)取阴性对照品、阳性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液备用；
(3)配制酶试剂，将5U/μL Taq DNA聚合酶和2U/μL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)按体积比3:1混合；
(4)配制PCR检测混合液：分别将所配制的第一、第二、第三或第四引物探针混合液与酶试剂震荡混匀并离心；
(5)分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液和含有内标int基因片段的质粒加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号；
(6)对于lytA基因、ddl基因、Sip基因和sodA基因，用荧光PCR仪上的FAM通道进行检测，对于Ef0027基因、speB基因、ctrA基因和femA基因，用荧光PCR仪上的ROX通道进行检测，对于int基因，用荧光PCR仪上的JOE通道进行检测，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
可见，本申请建立了特异性和灵敏度良好的多重荧光定量PCR反应体系，在4个PCR管中扩增8个目标基因，一次就确定样本中是否带有肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、脑膜炎奈瑟菌以及凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌，为诊断病情提供依据。
此外，本申请应用实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、脑膜炎奈瑟菌以及凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌，与目前常规临床检测方法相比检测周期大大缩短，提高了效率和检测通量，迎合了检测需求，而且具有较高的特异性、灵敏度和准确性，同时由于实验中没有扩增之后的检测过程，能够有效解决实验中的污染问题。
为了更好地理解本申请的内容，下面将结合具体实施例和附图作进一步说明。应当理解的是，这些实施例仅用于对本申请进一步说明而非限制本申请的范围。此外，在阅读了本申请所述的内容后，本领域技术人员对本申请所作出的一些非实质性的改动或调整，仍落入本申请的保护范围。
下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例1
本实施例提供了示例性试剂盒的组成。
具体地，示例性试剂盒包括分别装有以下组分的试剂瓶或管，以及集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
1)核酸抽提液：2％(M/V)Chelex-100、1％(V/V)Tris-HCl，1M，pH9.0组成；
2)PCR反应酶系：5U/μL Taq DNA聚合酶和2U/μL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)按体积比3:1比例混合组成；
3)内标：含有内标int基因片段的质粒；
4)阴性对照品：经过Millipore纯水仪纯化的双蒸水；
5)阳性对照品：携带检测肺炎链球菌靶标基因(lytA)的T载体质粒、携带粪肠球菌靶标基因(Ef0027)的T载体质粒、携带屎肠球菌靶标基因(ddl)的T载体质粒、携带化脓性链球菌靶标基因(speB)的T载体质粒、携带无乳链球菌靶标基因(Sip)的T载体质粒、携带脑膜炎奈瑟菌靶标基因(ctrA)的T载体质粒、携带凝固酶阴性葡萄球菌靶标基因(sodA)的T载体质粒、携带检测金黄色葡萄球菌靶标基因(femA)的T载体质粒和携带甲氧西林耐药基因(mecA)的T载体质粒或含有上述质粒的大肠杆菌工程菌，作为对照品的病菌液的菌浓度105CFU/mL；
6)第一引物探针混合液：由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、肺炎链球菌靶标基因(lytA)的引物(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)及荧光标记探针(如SEQ ID NO.3所示，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1)、粪肠球菌靶标基因(Ef0027)的引物(如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)及荧光标记探针(如SEQ ID NO.6所示，5’端标记荧光报告基团ROX，3’端标记淬灭荧光基团BHQ2)、内标int基因的引物及荧光标记探针组成，具体含量如下：
7)第二引物探针混合液：由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、屎肠球菌靶标基因(ddl)的引物(如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)及荧光标记探针(如SEQ ID NO.9所示，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1)、化脓性链球菌靶标基因(speB)的引物(如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示)及荧光标记探针(如SEQ ID NO.12所示，5’端标记荧光报告基团ROX，3’端标记淬灭荧光基团BHQ2)、内标int基因的引物及荧光标记探针组成，具体含量如下：
8)第三引物探针混合液：由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、无乳链球菌靶标基因(Sip)的引物(如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示)及荧光标记探针(如SEQ ID NO.15所示，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1)、脑膜炎奈瑟菌靶标基因(ctrA)的引物(如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示)及荧光标记探针(如SEQ ID NO.18所示，5’端标记荧光报告基团ROX，3’端标记淬灭荧光基团BHQ2)、内标int基因的引物及荧光标记探针组成，具体含量如下：
9)第四引物探针混合液：由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、凝固酶阴性葡萄球菌靶标基因(sodA)的引物(如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示)及荧光标记探针(如SEQ IDNO.21所示，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1)、金黄色葡萄球菌靶标基因(femA)的引物(如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示)及荧光标记探针(如SEQ IDNO.24所示，5’端标记荧光报告基团ROX，3’端标记淬灭荧光基团BHQ2)、内标int基因的引物及荧光标记探针组成，具体含量如下：
以上各混合液中，内标int基因的引物如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示，内标int基因的探针如SEQ ID NO.27所示，5’端标记荧光基团JOE，3’端标记淬灭基团TAMRA。
实施例2
本实施例提供了建立利用实施例1中的示例性试剂盒进行检测的方法。
具体地，所述方法包括以下步骤：
1)对照品准备：取阳性对照品、阴性对照品各50μL，分别置于1.5mL(或0.5mL)离心管中(冻存试剂融化后振荡混匀10s)，分别加入核酸抽提液50μL充分混匀，于98℃保温10min，然后于12,000rpm下离心5min，取上清2μL进行PCR反应。
2)反应体系混合液的配制：分别取16μL各引物探针混合液与0.2μL PCR反应酶系混合，振荡混匀数秒，并于3000rpm下离心混匀数秒。
3)PCR扩增：将阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各2μL分别加入上述2)中配制的各反应体系混合液的PCR管中，并分别向阴性对照品、阳性对照品的PCR管中加入2μL内标，盖好管盖，立即进行PCR扩增反应。
反应程序如下：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为20μL。
荧光通道检测选择：lytA、ddl、Sip和sodA基因选用FAM通道，Ef0027、speB、ctrA和femA基因选用ROX通道，内标int基因选用JOE通道。
阳性对照品的扩增结果分别如图1至图9所示。
4)结果判定：检测结束后，基线调整取6～15个循环的荧光信号，阈值设定原则为阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。根据目标基因扩增结果的CT值判定检测结果，若CT值≤35，表示检测样品低于检测限，报告为阴性；若CT值≤35，检测结果报告为阳性；CT显示在35～40之间为灰度区。
实施例3
本实施例提供了对本申请的试剂盒和方法进行的特异性实验。
1)实验材料
以下实验中使用的实验材料及其来源如下所示：
2)实验方法
采用实施例2所建立的实验方法，对上述12种致病菌分别进行检测，以对试剂盒的特异性进行分析评价。
3)实验结果
利用实施例1中的试剂盒检测12种常见致病菌(白喉杆菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、血链球菌、白色念珠菌、产酸克雷伯菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌)，结果均为阴性(见表1)。
表1本申请试剂盒特异性验证结果
可见，以上结果表明，本申请试剂盒和方法的检测特异性良好。
实施例4
本实施例提供了对本申请的试剂盒和方法进行的灵敏度实验。
1)实验材料
分别建立4个浓度梯度(5×105拷贝/mL、5×104拷贝/mL、5×103拷贝/mL、5×102拷贝/mL)的质粒阳性参考品作为试剂盒的灵敏度参考品。
2)实验方法
分别对lytA、Ef0027、ddl、speB、Sip、ctrA、sodA和femA基因的4个浓度梯度的质粒阳性参考品进行检测，确定试剂盒检测质粒浓度(拷贝/mL)的灵敏度。
具体方法如下：分别将质粒阳性参考品测定OD值(260nm)，换算为拷贝/mL单位，再进行梯度稀释，试验中选择4个浓度梯度，即以5×105拷贝/mL、5×104拷贝/mL、5×103拷贝/mL、5×102拷贝/mL作为参考品。
使用实施例1中的试剂盒对上述参考品进行灵敏度试验。每个浓度参考品各重复检测20次，统计各个浓度阳性检出次数，确定产品最低检出限。
3)实验结果
使用实施例1中的试剂盒，采用实施例2中建立的实验方法，对不同浓度的质粒阳性参考品进行检测，试剂盒能稳定检出浓度为5×104拷贝/mL质粒阳性参考品，结果见表2。
表2各浓度质粒阳性参考品的检出次数
可见，根据灵敏度试验结果，本申请的试剂盒按照质粒拷贝数浓度确定的最低检测限为5×104拷贝/mL。
实施例5
本实施例使用3批实施例1中的试剂盒，采用实施例2中所建立的实验方法，分别对lytA、Ef0027、ddl、speB、Sip、ctrA、sodA和femA基因质粒阳性参考品(5×104拷贝/mL)进行重复性研究。
1)实验材料
使用实施例4中的5×104拷贝/mL质粒阳性参考品作为实验对象对试剂盒的精密度进行评估。
2)实验方法
(1)批内重复实验：使用同一时间配制的质粒阳性参考品，每个参考品按照实施例2所建立的方法重复检测3次；
(2)批间重复实验：使用3批(P1、P2、P3)不同时间配制的质粒阳性参考品，每个参考品按照实施例2所建立的方法重复检测3次。
3)实验结果
结果见表3和表4，显示批内和批间精密度变异系数(CV％)均小于5％。
表3批内重复性研究结果
表4批间重复性研究结果
| 基因 | 均值(C<sub>T</sub>) | SD | CV％ |
| lytA | 24.21207 | 0.862926 | 3.56％ |
| Ef0027 | 26.17793 | 0.616685 | 2.36％ |
| ddl | 24.53727 | 0.481533 | 1.96％ |
| speB | 23.03627 | 0.119038 | 0.52％ |
| Sip | 22.52367 | 0.680286 | 3.02％ |
| ctrA | 21.8446 | 0.936434 | 4.29％ |
| sodA | 26.3782 | 0.208683 | 0.79％ |
| femA | 25.97273 | 0.377605 | 1.45％ |
实施例6
本实施例提供了利用本申请的试剂盒和方法对临床样本进行检测。
对采集自浙江省宁波市鄞州人民医院的30例临床样本，包括：肺炎链球菌1例、粪肠球菌1例、屎肠球菌2例、化脓性链球菌1例、无乳链球菌1例、脑膜炎奈瑟菌1例、凝固酶阴性葡萄球菌阳性4例，金黄色葡萄球菌阳性3例进行检测。将利用本申请试剂盒的检测结果与临床细菌培养鉴定及药敏试验结果进行比较，统计符合率。结果见表5。
表5符合率实验结果
可见，以上检测结果显示，本申请的试剂盒检测结果与临床细菌培养鉴定试验结果完全一致。
上述说明并非对本申请的限制，本申请也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本申请的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本申请的保护范围。
Claims (10)
1.用于检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物，其包含选自用于检测以下一种或多种靶标的引物和/或探针：肺炎链球菌自溶素基因(lytA基因)，粪肠球菌转录调控基因(Ef0027基因)，屎肠球菌d-丙氨酸聚连接酶基因(ddl基因)，化脓性链球菌致热外毒素B基因(speB基因)，无乳链球菌表面免疫相关蛋白基因(Sip基因)，脑膜炎奈瑟菌荚膜转移基因A (ctrA基因)，凝固酶阴性葡萄球菌超氧化物歧化酶基因(sodA基因)，以及金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因(femA基因)。
2.如权利要求1所述的引物和/或探针组合物，其包含分别用于检测所述lytA基因和/或所述Ef0027基因的引物和/或探针；
任选地，其包含分别用于检测所述ddl基因和/或所述speB基因的引物和/或探针；
任选地，其包含分别用于检测所述Sip基因和/或所述ctrA基因的引物和/或探针；和/或
任选地，其包含分别用于检测所述sodA基因和/或所述femA基因的引物和/或探针。
3.如权利要求1或2所述的引物和/或探针组合物，其中用于检测所述lytA基因的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；
任选地，用于检测所述Ef0027基因的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，探针序列如SEQ ID NO.6所示；
任选地，用于检测所述ddl基因的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；
任选地，用于检测所述speB基因的引物序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQ ID NO.12所示；
任选地，用于检测所述Sip基因的引物序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，探针序列如SEQ ID NO.15所示；
任选地，用于检测所述ctrA基因的引物序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，探针序列如SEQ ID NO.18所示；
任选地，用于检测所述sodA基因的引物序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO. 20所示，探针序列如SEQ ID NO.21所示；和/或
任选地，用于检测所述femA基因的引物序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，探针序列如SEQ ID NO.24所示。
4.如权利要求1至3中任一项所述的引物和/或探针组合物，其中所述探针序列分别用荧光报告基团和猝灭基团标记；
任选地，所述荧光报告基团选自FAM，ROX，JOE，HEX或TET；和/或所述猝灭基团选自BHQ1，BHQ2或TAMRA。
5.如权利要求1至4中任一项所述的引物和/或探针组合物，其还包含脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP。
6.权利要求1至5中任一项所述的引物和/或探针组合物在制备用于检测引发血流感染的球菌的试剂或试剂盒中的用途。
7.用于检测引发血流感染的球菌的试剂或试剂盒，其包含权利要求1至5中任一项所述的引物和/或探针组合物。
8.如权利要求7所述的试剂或试剂盒，其还包含用于检测内标基因的引物和/或探针；
任选地，所述内标基因为int基因；
任选地，用于检测所述int基因的引物序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示，探针序列如SEQ ID NO.27所示。
9.如权利要求7或8所述的试剂或试剂盒，其还包含以下中的一种或多种：核酸抽提液、PCR反应酶系、阴性对照品或阳性对照品；
任选地，所述核酸抽提液包含：2%(M/V)Chelex-100和1%(V/V)Tris-HCl；
任选地，所述PCR反应酶系包含：5 U/µL Taq DNA聚合酶和2 U/µL尿嘧啶-N-糖基化酶；
任选地，所述阴性对照品为纯化的双蒸水；
任选地，所述阳性对照品为携带所检测靶标的T载体质粒或含有携带所检测靶标的T载体质粒的大肠杆菌工程菌。
10.用于检测引发血流感染的球菌的方法，其包括利用权利要求1至5中任一项所述的引物和/或探针组合物或者权利要求7至9中任一项所述的试剂或试剂盒对生物样品进行检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911042212.5A CN110669851A (zh) | 2019-10-30 | 2019-10-30 | 检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911042212.5A CN110669851A (zh) | 2019-10-30 | 2019-10-30 | 检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110669851A true CN110669851A (zh) | 2020-01-10 |
Family
ID=69084757
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911042212.5A Pending CN110669851A (zh) | 2019-10-30 | 2019-10-30 | 检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110669851A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110093434A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-08-06 | 宁波基内生物技术有限公司 | 一种引物和探针组合物及试剂盒 |
| CN110656188A (zh) * | 2019-10-30 | 2020-01-07 | 宁波基内生物技术有限公司 | 检测引发血流感染的杆菌的引物和/或探针组合物及其应用 |
| CN113621727A (zh) * | 2021-06-24 | 2021-11-09 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 5种病原菌多重pcr检测的引物、探针及其试剂盒 |
| CN114836579A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-02 | 昆明理工大学 | 中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测引物组合 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110093434A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-08-06 | 宁波基内生物技术有限公司 | 一种引物和探针组合物及试剂盒 |
| CN110656188A (zh) * | 2019-10-30 | 2020-01-07 | 宁波基内生物技术有限公司 | 检测引发血流感染的杆菌的引物和/或探针组合物及其应用 |
-
2019
- 2019-10-30 CN CN201911042212.5A patent/CN110669851A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110093434A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-08-06 | 宁波基内生物技术有限公司 | 一种引物和探针组合物及试剂盒 |
| CN110656188A (zh) * | 2019-10-30 | 2020-01-07 | 宁波基内生物技术有限公司 | 检测引发血流感染的杆菌的引物和/或探针组合物及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YING LIU 等: "PCR-based Approaches for the Detection of Clinical Methicillinresistant Staphylococcus aureus", 《THE OPEN MICROBIOLOGY JOURNAL》 * |
| 朱昆蓉 等: "TaqMan-MGB探针法快速检测脑膜炎奈瑟菌的研究", 《预防医学情报杂志》 * |
| 汪一萍 等: "多重荧光聚合酶链式反应法在血流感染诊断中的应用评价", 《中华检验医学杂志》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110093434A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-08-06 | 宁波基内生物技术有限公司 | 一种引物和探针组合物及试剂盒 |
| CN110656188A (zh) * | 2019-10-30 | 2020-01-07 | 宁波基内生物技术有限公司 | 检测引发血流感染的杆菌的引物和/或探针组合物及其应用 |
| CN113621727A (zh) * | 2021-06-24 | 2021-11-09 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 5种病原菌多重pcr检测的引物、探针及其试剂盒 |
| CN114836579A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-02 | 昆明理工大学 | 中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测引物组合 |
| CN114836579B (zh) * | 2022-06-02 | 2024-05-07 | 昆明理工大学 | 中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测引物组合 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110669851A (zh) | 检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物及其应用 | |
| CN112501268B (zh) | 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用 | |
| US6258570B1 (en) | PCR assay for bacterial and viral meningitis | |
| US20180135108A1 (en) | Method for detecting bacterial and fungal pathogens | |
| CN113512602B (zh) | 血流感染病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用 | |
| US20100255474A1 (en) | Method for Detecting Bacteria and Fungi | |
| JP2016520314A (ja) | 微生物マーカーおよびその使用 | |
| CN110894533B (zh) | 用于检测下呼吸道感染细菌的核酸试剂、试剂盒及系统 | |
| CN113151610B (zh) | 中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用 | |
| CN110551840A (zh) | 用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 | |
| CN109735639A (zh) | 一种用于检测肺炎克雷伯菌及三种主要碳青霉烯酶基因的引物和探针组合物及试剂盒 | |
| CN111440886A (zh) | 一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法 | |
| Stefani | Diagnostic techniques in bloodstream infections: where are we going? | |
| CN107365869B (zh) | 利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物 | |
| US20110200984A1 (en) | Using nucleic acids for clinical microbiology testing | |
| CN110656188A (zh) | 检测引发血流感染的杆菌的引物和/或探针组合物及其应用 | |
| Deutch et al. | Diagnosis of ventricular drainage-related bacterial meningitis by broad-range real-time polymerase chain reaction | |
| CN105950773A (zh) | 一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
| CN113584191A (zh) | 7种耐药基因多重pcr检测的引物、探针及其试剂盒 | |
| CN112094930B (zh) | 一种肺炎链球菌血清分型试剂盒及分型方法 | |
| US20100196894A1 (en) | Procedure for the detection of paratuberculosis | |
| US20130157265A1 (en) | Composition, method and kit for detecting bacteria by means of sequencing | |
| Ben et al. | Rapid diagnosis of bacterial meningitis using a microarray | |
| US20150087540A1 (en) | Composition for Diagnosing Sepsis, and Method and Kit Therefor | |
| CN114438238A (zh) | 检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字pcr试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200110 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |