CN102787161A - 一种检测结核分枝杆菌方法及其专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测结核分枝杆菌方法及其专用引物。本发明提供了一种辅助检测结核杆菌的引物对，所述引物对的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述引物对的另一条引物的核苷酸为序列表中的序列2。本发明的实验证明，使用本发明的特异性引物进行新的MDA-PCR两步法，利用MDA全基因组恒温扩增技术对痰液中结核分枝杆菌核酸进行富集，通过特异性引物结合PCR技术，检测结核分枝杆菌，其具有以下优点：耗时短、敏感性高、准确性高。

Description

一种检测结核分枝杆菌方法及其专用引物

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种检测结核分枝杆菌方法及其专用引物。

背景技术

结核病是一种严重危害人民身体健康的慢性传染病。20世纪90年代以来，结核病再度在全球范围内“死灰复燃”。我国政府向来比较重视结核病的防治工作，并相继出台了一系政策和措施。经过多年的努力，我国结核病疫情上升势头有所遏制，发病率和死亡率均有所下降。但目前我国的结核病疫情仍然十分严重。据WHO估算，全球每年新发生肺结核患者约130万人，每年约有13万人死于结核病，每年近10万个耐多药结核(MDR-TB)病例。结核病患者的治疗费用高、治疗周期长、疗效差、死亡率高，医疗负担十分沉重。同时由于患者流动求医，增大了结核菌的传播机会。我国作为人口大国，人口流动性较大，不易对结核病患者进行管理，容易造成肺结核病在人群中的传播。因而结核病如得不到控制将直接影响社会的稳定和经济的持续发展。在对抗肺结核病的战斗中，当今面临的最大挑战是无法在大量的人群中迅速且准确地诊断出患者。没有可靠的快速诊断技术，患者就无法被早期发现和纳入规范的抗结核治疗，从而导致病情的恶化、耐药的发生和病原体的扩散。及时的诊断可以帮助临床医生选择早期靶向治疗，降低病死率，同时，减少经验性用药，降低医疗负担。

目前结核分枝杆菌的诊断方法主要是临床症状结合痰结核菌检查结果。痰结核菌检查方法主要为以下三种：

1痰结核菌培养。结果可信度高，但需要1-2个月培养时间，耗时长。

2痰结核菌抗酸染色。敏感性较低，敏感性仅为30％-40％，为肺结核病的临床快速准确诊断带来一定困难。.

3聚合酶链式反应(PCR)，敏感性较常规培养方法及抗酸染色方法有一定提高，但特异性较差。

综上，随着分子生物学技术的不断进步，结核杆菌检测方法均有一定的进展，但在应用于临床的检测的实际应用中仍存在各方面的局限性，因此应该拓宽该领域的研究，积极寻找一种能解决实际应用问题的新技术。建立快速、高效的结核杆菌检测方法，以指导临床的早期治疗和有效的控制结核分枝杆菌的传播。

多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)作为全基因组扩增的代表性技术，在法医学、不可培养微生物检测方面有着广泛的应用，被誉为微量DNA分析的金钥匙。MDA全基因组扩增技术利用六聚体随机引物和高扩增效率的phi29聚合酶，可从低至单个细胞fg数量级的基因组DNA模板扩增至μg左右(约109倍扩增)，扩增产物平均长度为10-100Kb。实现高效的全基因组水平的核酸富集。很好的解决了从少量细胞中富集DNA，以获取大量的基因组信息。本发明根据结核分枝杆菌检测靶点设计特异性引物，将MDA全基因组扩增技术与PCR技术相结合，建立两步法分子检测技术MDA-PCR。MDA-PCR技术突破了临床样本核酸量不足的瓶颈，作为一种全新的分子生物学技术在结核分枝杆菌检测方面具有一定的应用前景。目前，国内外尚未见MDA-PCR两步法检测结核分枝杆菌的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种辅助检测结核杆菌的引物对。

本发明提供的辅助检测结核杆菌的引物对，所述引物对的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述引物对的另一条引物的核苷酸为序列表中的序列2。

本发明的第二个目的是提供一种辅助检测结核杆菌的引物组。

本发明提供的引物组，由所述的引物对和随机引物组成；

所述随机引物的核苷酸序列为5’-NNNNNN-3’，且自3’末端第1位和第2位核苷酸之间形成硫磷键，第2位和第3位核苷酸之间形成硫磷键。

N代表通用的碱基(ATCG随机合成)。

本发明的第三个目的是提供一种辅助检测结核杆菌的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，由A组试剂和B组试剂组成，

所述A组试剂由所述的引物对、dNTP、DNA聚合酶、Mg²⁺及PCR缓冲液1组成；

所述引物对中的各引物在所述A组试剂中的浓度均为0.5μM；

所述dNTP在所述A组试剂中的浓度为0.2mM；

所述dNTP在所述A组试剂中的浓度为每一种dNTP的浓度。

所述DNA聚合酶在所述A组试剂中的浓度为1.25U/50μl；

所述B组试剂由所述随机引物、dNTP、BSA、phi29DNA聚合酶及PCR缓冲液2组成；

所述随机引物在所述B组试剂中的浓度为25μM；

所述dNTP在所述B组试剂中的浓度为0.5mM；

所述dNTP在所述B组试剂中的浓度为每一种dNTP的浓度。

所述phi29DNA聚合酶在所述B组试剂中的浓度为5U/10μl；

所述BSA在所述B组试剂中的浓度为0.2μg/μl。

所述A组试剂和所述B组试剂为独立包装。

上述浓度均为终浓度。

含有所述引物对、所述引物组或所述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

所述引物对、所述引物组或所述的PCR试剂或所述的试剂盒在辅助检测结核杆菌中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第四个目的是提供一种辅助检测待测样品中结核杆菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用所述的PCR试剂中的所述B组试剂对待测样品进行多重置换扩增，得到MDA产物；

2)用所述的PCR试剂中的所述A组试剂对步骤1)得到的所述MDA产物进行再次PCR扩增，若得到PCR产物，则待测样品中疑似含有结核杆菌，若没有得到PCR产物，则待测样品中疑似不含有结核杆菌。

步骤1)中，所述多重置换扩增中，以待测样品的基因组DNA为模板；

步骤2)中，所述PCR扩增中，以步骤1)得到的所述MDA产物为模板。

所述PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列3。

所述待测样品为痰液，具体为结核病人的痰液标本(含结核分枝杆菌)。

所述试剂还可包括阳性对照和阴性对照。所述阳性对照可为结核分枝杆菌H37Rv的DNA模板。所述阴性对照可为无菌水和健康人痰液DNA。

本发明的实验证明，使用本发明的特异性引物进行新的MDA-PCR两步法，利用MDA全基因组恒温扩增技术对痰液中结核分枝杆菌核酸进行富集，通过特异性引物结合PCR技术，检测结核分枝杆菌，其具有以下优点：

1、耗时短，相对常规培养方法耗时长的不足，本方法在一天之内即可完成。

2、敏感性高，MDA作为全基因组恒温扩增技术，对于微量核酸的富集有很好的效果，最低检测限可低至10个以内的细胞。MDA-PCR两步法检测敏感性可达到低至10个细胞内核酸量。

3、准确性高，以MDA-PCR扩增产物做测序分析，扩增产物为结核分枝杆菌靶序列IS6110区域内序列。覆盖率和准确性均为100％。

附图说明

图1MDA扩增方法最低检测限(模板为结核分枝杆菌H37Rv的DNA)

图2MDA-PCR两步法最低检测限(模板为结核分枝杆菌H37Rv的DNA)

图3MDA-PCR两步法检测21份结核病患者的痰液

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明检测系统中的特异性引物均通过核酸合成设备制备。核酸合成设备可委托相关基因公司合成。本发明检测系统中的MDA-PCR体系以及反应程序均由发明人设计，结核分枝杆菌的核酸特异性序列、MDA-PCR反应体系及反应程序如下：

实施例1、结核分枝杆菌特异性引物的获得

IS6110为结核分枝杆菌复合群特有的插入序列，此插入序列在基因组的拷贝数为1-20个，选择插入序列作为结核分枝杆菌的检测靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性。

以IS6110为靶序列利用Primer V5.0设计引物，序列如下：

实施例2、检测结核分枝杆菌

1、模板的准备

提取结核分枝杆菌H37Rv(张媛媛，张选民，赵秀芹，曾令城，刘志广，王西临，王艳，杜新玲，韩跃玲，万康林。一种直接检测结核病痰标本的PCR技术的建立与评价。中国人兽共患病学报，2008，24(11)：1017-1021。公众可从中国科学院微生物研究所获得。)的DNA作为模板，进行梯度稀释，分别取浓度为300fg/μl和30fg/μl作为模板进行以下反应。

2、MDA-PCR两步法反应程序

1)MDA反应

MDA随机引物的核苷酸序列为5’-NNNNNN-3’，且自3’末端第1和第2位核苷酸之间形成硫磷键，第2和第3位核苷酸之间形成硫磷键。

N代表通用的碱基(ATCG随机合成)。

以结核分枝杆菌H37Rv的DNA作为模板，采用随机引物进行PCR扩增，按照表1中的反应体系和条件进行PCR扩增，结果如图1所示，为琼脂糖凝胶电泳MDA扩增产物，M：λDNA/HindIII；1为DNA的浓度为300fg/μl；2DNA的浓度为30fg/μl；3阴性对照(水)，均得到23Kb的PCR产物(从图1可看出，为23Kb)，即为MDA产物。

证明MDA反应的敏感性高，MDA作为全基因组恒温扩增技术，对于微量核酸的富集有很好的效果，最低检测限可低至DNA的浓度为30fg/μl(10个以内的细胞)。

表1 MDA 10μl反应体系

2)MDA-PCR反应

以上述获得的MDA产物作为模板，采用表2中特异性上游引物和下游引物进行PCR扩增，按照表2中的反应体系和条件进行PCR扩增，结果如图2所示，为琼脂糖凝胶电泳MDA-PCR扩增产物，M：DL2000；1 DNA的浓度为300fg/μl的MDA产物；2DNA的浓度为30fg/μlMDA产物；3阴性对照(水)，1和2均得到244bp的PCR产物，可以看出，MDA-PCR两步法检测敏感性可达到低至DNA的浓度为30fg/μl(10个细胞内核酸量)。

将得到的PCR产物均送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，进行Genbank比对，发现序列3所示的核苷酸与结核分枝杆菌复合群特有的IS6110序列的同源性为100％(ACCESSION：Y14048)。

表2PCR：50ul反应体系

实施例3、检测方法的灵敏度分析

1、DNA的制备

①取500μl临床样本痰液(痰液，已知含有结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病研究室提供，患者知情)加入1.5ml Eppendorf中，9500×g离心15min，弃上清液。

②加入裂解液100μl(含50mM Tris-HCl，pH 8，50mM KCl，2.5mM MgCl₂，0.45％Tween 20，0.45％Nonidet P-40，10μg蛋白酶K)。

③振荡均匀后，56℃水浴3小时。

④95℃10min灭活蛋白酶K。

⑤9500×g离心5min。

将上清液转移至一个新的Eppendorf管中，即可作为DNA模板。

2、MDA-PCR两步法反应程序。

按照实施例2中的步骤2对21例临床诊断为结核病的临床样本痰液(由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病研究室提供，患者知情)。以健康人痰液(痰液，已知不含有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB))的DNA作为阴性对照，以无菌水作为空白对照。

结果如图3所示，为琼脂糖凝胶电泳MDA-PCR扩增产物，其中M：DL2000；1-21：临床样品痰液DNA；22：阴性对照；23：空白对照；从图中可以看出，4和5没有目的片段，1-21中除去泳道4和5的其余泳道均得到244bp的PCR产物，22：阴性对照；23：空白对照均无目的片段，将PCR产物送去测序，该产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，即为IS6110片段。

表明，21份结核病人的痰液标本，19份检测结果为阳性，检测敏感性为90.5％(19/21)。

Claims (9)

1.一种辅助检测或检测结核杆菌的引物对，所述引物对的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述引物对的另一条引物的核苷酸为序列表中的序列2。

2.一种辅助检测结核杆菌的引物组，由权利要求1所述的引物对和随机引物组成；

所述随机引物的核苷酸序列为5’-NNNNNN-3’，且自3’末端第1位和第2位核苷酸之间形成硫磷键，第2位和第3位核苷酸之间形成硫磷键。

3.一种辅助检测结核杆菌的PCR试剂，由A组试剂和B组试剂组成，

所述A组试剂由所述的引物对、dNTP、DNA聚合酶、Mg²⁺及PCR缓冲液1组成；

所述引物对中的各引物在所述A组试剂中的浓度均为0.5μM；

所述dNTP在所述A组试剂中的浓度为0.2mM；

所述DNA聚合酶在所述A组试剂中的终浓度1.25U/50μl；

所述B组试剂由所述随机引物、dNTP、BSA、phi29DNA聚合酶及PCR缓冲液2组成；

所述随机引物在所述B组试剂中的浓度为25μM；

所述dNTP在所述B组试剂中的浓度为0.5mM；

所述phi29DNA聚合酶在所述B组试剂中的终浓度5U/10μl；

所述BSA在所述B组试剂中的浓度为0.2μg/μl。

4.含有权利要求1所述引物对、权利要求2所述引物组或权利要求3所述的PCR试剂的试剂盒。

5.权利要求1所述引物对、权利要求2所述引物组或权利要求3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在辅助检测结核杆菌中的应用。

6.一种辅助检测待测样品中结核杆菌的方法，包括如下步骤：

1)用权利要求3所述的PCR试剂中的所述B组试剂对待测样品进行多重置换扩增，得到MDA产物；

2)用权利要求3所述的PCR试剂中的所述A组试剂对步骤1)得到的所述MDA产物进行再次PCR扩增，若得到PCR产物，则待测样品中疑似含有结核杆菌，若没有得到PCR产物，则待测样品中疑似不含有结核杆菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述多重置换扩增中，以待测样品的基因组DNA为模板；

步骤2)中，所述PCR扩增中，以步骤1)得到的所述MDA产物为模板。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：

所述PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列3。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：

所述待测样品为痰液。

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