CN105734164B - 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒 - Google Patents

一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105734164B
CN105734164B CN201610296666.5A CN201610296666A CN105734164B CN 105734164 B CN105734164 B CN 105734164B CN 201610296666 A CN201610296666 A CN 201610296666A CN 105734164 B CN105734164 B CN 105734164B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
pathogen
detection
meningitis
consensus primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610296666.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105734164A (zh
Inventor
孙万平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jienuo Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou University filed Critical Suzhou University
Priority to CN201610296666.5A priority Critical patent/CN105734164B/zh
Publication of CN105734164A publication Critical patent/CN105734164A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105734164B publication Critical patent/CN105734164B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，能够快速检测六种细菌性脑膜炎病原体，肺炎链球菌（SP）、无乳链球菌（GBS）、流感嗜血杆菌（HI）、单核细胞增生李斯特菌（LM）、金黄色葡萄球菌（SA）、脑膜炎奈瑟菌（NM）；本发明公开的“公共引物”介导的多重PCR方法，具体包括构建质粒模板、筛选公共引物、设计多重引物、多重PCR体系检测；结合两步退火温度法提高多重PCR体系的特异性、敏感性和检测通量，该多重PCR方法具有一定的包容性，可继续增加检测靶标，有利于提高多重PCR的检测通量。本发明能有效检测六种常见细菌，具有灵敏度高，经济、快速、操作简单等优点，利于应用临床诊断。

Description

一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体设计一种检测细菌性脑膜炎六种常见病原体的多重PCR试剂盒。
技术背景
多重PCR是在普通PCR的基础上，于同一个反应体系中利用多对引物同时扩增多段靶序列的PCR技术。自多重PCR报道以来，由于其高效性、灵敏性和经济简便性，已广泛应用于核酸诊断的多个领域，如遗传疾病诊断、突变和多态性分析、转基因鉴定、病原体检测等；多重PCR体系，一般包括以下试剂：PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、引物、模板和去离子水。
细菌性脑膜炎（Bacterial Meningitis，BM）是由各种细菌感染引起的脑膜和脑脊髓膜炎症，是一种较为常见的急性严重性中枢神经系统感染性疾病，临床主要症状表现为头痛、发热、呕吐、意识改变、脑膜刺激征。该病多发于婴幼儿，起病急、病情发展迅速，病死率较高，易遗留有严重的后遗症，如听力障碍、癫痫发作、瘫痪、智力低下等。在发达国家，BM的发病率为1.4~6.0/10万，病死率约为5%，发展中国家发病率为其10倍以上，而且具有更高的病死率。目前我国婴幼儿细菌性脑膜炎的病死率高达60%，1月龄至15 岁BM 患儿后遗症发生率为22.6%，严重影响患者的身心健康。早期、快速和明确的病原体鉴别诊断，合理的抗菌治疗是降低本病死亡率和致残率的关键。
BM感染病原体种类繁多，而不同年代的这些致病菌在BM 病因学上所占地位不同，并存在明显的地域差异，不同的国家和地区，其发病率和所感染的病原体类型也不同。随着疫苗的不断开发推广和抗生素的广泛应用，BM病原菌的种类也在发生变化。参考临床细菌性脑膜炎的发病情况，最常见的六种病原菌为肺炎链球菌、B型链球菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟菌。
目前，临床常用的细菌性脑膜炎病原体的检测方法为培养、镜检、革兰染色以及乳胶凝集试验。细菌培养法对菌的筛选范围较广，一直被视为金标准，但培养时间较长，一般2～7天以上，而且抗生素的使用、样品质量和培养条件等因素都会影响阳性率。镜检仅作为辅助方法，革兰染色和乳胶凝集试验虽然快速简便但准确度有限，常出现假阳性。多重PCR技术可对多个病原体同时进行检测，是细菌性脑膜炎病原体检测中最适宜的方法之一。作为PCR的衍生技术，多重PCR有其特有的优势：（1）高效性，同一反应中可同时检测多个靶标，省时省力；（2）经济简便性，减少了操作流程，并节约试剂成本。随着引物对数的增加，引物间的抑制作用降低了多重PCR的检测通量，在多重 PCR 技术的实际应用过程中，由于在同一反应管内添加多条引物，因此如何提高引物的特异性避免非特异的扩增、如何减少多条引物之间形成的二聚体、如何调控 PCR 反应试剂的浓度及其反应条件，使之对每个目的片段都能达到有效的扩增等问题，都限制了多重 PCR 技术的应用。因此，开发高通量和高敏感性的病原体多重PCR检测技术和相应的检测试剂盒对脑膜炎的诊断、治疗及预后具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，用于细菌性脑膜炎六种常见病原体的多重PCR检测，通过设计公共引物及菌特异性引物，结合六种病原体的多重PCR检测体系和条件，可检测临床细菌性脑膜炎感染的病原体。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，包括公共引物、针对细菌性脑膜炎病原体的嵌合引物对；所述公共引物的序列SEQ ID NO.1及 所述针对细菌性脑膜炎病原体的嵌合引物对如下核苷酸序列所示：
。
上述技术方案中，检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒还包括Taq 聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水。
上述技术方案中，检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒还包括阳性对照引物对，可用来检测DNA模板质量和反应体系扩增效率，本发明优选的阳性对照引物具体序列为：SEQ ID NO.14，5’-AGCGGGAAATCGTGCGTGA-3’；SEQ ID NO.15，5’-AGTGAGGACCCTGGATGTGA-3’。
上述技术方案中，公共引物与细菌性脑膜炎病原体相关基因组无同源性，当以细菌性脑膜炎病原体基因组为模板进行扩增时，不论条件如何，均应没有特异性产物；当以嵌合引物的扩增产物为模板时，公共引物可以扩增出特异性产物；并且公共引物的Tm值比病原体靶特异性引物的Tm值低8～10 ℃。
上述技术方案中，进行PCR反应时，针对细菌性脑膜炎感染病原体的每条嵌合引物的终浓度为10nM，本发明嵌合引物用于扩增六种病原体SP、GBS、LM、SA、NM、HI。
上述技术方案中，进行PCR反应时，公共引物的终浓度为2000nM，针对细菌性脑膜炎感染病原体的每条嵌合引物的终浓度为10nM；进行PCR反应时，采用两步退火温度法，第一步退火温度高于第二步退火温度8～10 ℃。
上述试剂盒可用于临床细菌性脑膜炎感染病原体的检测，本发明公开的是公共引物介导的多重PCR结合两步退火温度法。以细菌性脑膜炎感染病原体基因为靶标序列，采用两步退火温度法，用嵌合引物先扩增10个循环，退火温度为63.5℃，进行第一步多重PCR扩增，可产生公共引物末端的PCR产物；然后以带有公共引物末端的PCR产物为模板，用公共引物进行25个循环的第二步多重PCR扩增，退火温度为55℃；即完成细菌性脑膜炎感染病原体的多重PCR扩增；前10个循环的多重PCR扩增退火温度高于后面25个循环的多重PCR扩增退火温度8～10 ℃。循环早期，在高退火温度下，低浓度的嵌合引物扩增靶标序列，产生带有公共引物末端的PCR产物；循环后期，在低退火温度下，高浓度的公共引物以早期产生的PCR产物为模板进行大量扩增。已构建的用于检测体系特异性和敏感性的质粒模板有cfb，hly，lytA ，ctrA，P6和nuc基因。多重PCR采用的25μL反应体系包括：10μM的公共引物5μL，0.05μM（每条）的嵌合引物混合物5μL，5U/μL的Taq polymerase 0.15μL，25mM的MgCl2 2μL，10mM的dNTP 0.5μL，10×Taq Buffer 2.5µL，DNA模板 1μL，灭菌ddH2O 8.85μL；PCR反应条件为：95℃预变性 5min；95℃ 变性30s，63.5℃退火 30s，72℃ 延伸45s，共10个循环；72℃ 延伸3min；95℃ 变性30s，55℃退火 30s，72℃ 延伸45s，共25个循环；最后72℃延伸7min。然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明本发明的检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒可特异性检测六种细菌的基因组；利用构建的质粒模板，本发明的检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒的敏感性最高可达10拷贝/25µL。
本发明进一步公开了针对细菌性脑膜炎病原体的嵌合引物对及公共引物，如下列核苷酸序列所示：
。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有以下优点：
（1）本发明公开的检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，可同时检测六种常见致病菌，比如肺炎链球菌、B型链球菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟菌，不仅可以节约试剂使用量和降低检测成本，同时提高了检测效率，具有灵敏度高，经济、快速、操作简单等优点；
（2）本发明公开的试剂盒进行检测时，嵌合引物浓度低至10μM/每条，公共引物浓度为2000μM；降低嵌合引物的浓度有利于加入更多对嵌合引物，提高多重PCR检测通量；采用单条公共引物且较短，有利于减少二聚体的形成，高浓度可以放大特异性产物的量，进而提高敏感性；
（3）本发明公开的试剂盒采用一个PCR反应中的两步退火温度法，前10个循环扩增采用高退火温度（63.5℃）有利于嵌合引物的特异性结合，减少非特异性产物；后25个循环扩增低退火温度（55℃）使公共引物发挥放大作用；中间额外增加3 min延伸，有利于为公共引物获得足够的模板。
（4）本发明公开的试剂盒中，公共引物与每条多重PCR特异引物的5' 末端连接，一起构成了嵌合引物；公共引物介导的多重PCR可以降低引物对的浓度，抑制二聚体的形成，从而提高多重PCR的检测通量；通过创造性的设计克服了现有多重PCR体系存在的非特异性扩增、易存在二聚体的缺陷；
（5）本发明的多重PCR检测体系特异性高，敏感性高达10拷贝/25µL，单管进行，操作简单，且具有灵敏度高、经济、快速等优点，能用于开发相关的检测试剂盒，具有临床应用价值。
附图说明
图1是实施例一中多重体系的特异性检测电泳图；
图2是实施例一中多重体系的敏感性检测电泳图；
图3是实施例二中临床脑脊液标本的检测图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明作进一步的描述
实施例一 多重体系的特异性和敏感性检测
1.多重体系的特异性检测
检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，包括常规多重PCR组件，还包括针对常见脑膜炎感染细菌的嵌合引物和公共引物；嵌合引物和公共引物序列见表1，常规多重PCR组件包括Taq 聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水；阳性对照引物对，可用来检测DNA模板质量和反应体系扩增效率，具体序列为：SEQ ID NO.14，5’-AGCGGGAAATCGTGCGTGA-3’；SEQ ID NO.15，5’-AGTGAGGACCCTGGATGTGA-3’。
表1 针对脑膜炎感染细菌病原体的嵌合引物和公共引物
多重体系的特异性检测：采用多引物+单模板的PCR方法，扩增各个检测细菌的基因组或靶标基因， HI、SA、SP、GBS和LM的模板采用基因组DNA，NM采用合成的ctrA质粒DNA，模板DNA浓度均约为2ng/μL。多重PCR采用的25μL反应体系包括：10μM的公共引物5μL，0.05μM（每条）的嵌合引物混合物5μL，5U/μL的Taq polymerase 0.15μL，25mM的MgCl2 2μL，10mM的dNTP 0.5μL，10×Taq Buffer 2.5µL，DNA模板 2.5μL，灭菌ddH2O 7.35μL；PCR反应条件为：95℃预变性 5min；95℃ 变性30s，63.5℃退火 30s，72℃ 延伸45s，共10个循环；72℃延伸3min；95℃ 变性30s，55℃退火 30s，72℃ 延伸45s，共25个循环；最后72℃延伸7min。图1为多重体系的特异性检测，其中1-6泳道是PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，依次为NM、HI、SA、SP、GBS、LM，N为阴性对照，M为DNA标准分子量（目的带大小依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000bp）；结果显示，运用本发明的多重体系检测靶标DNA，可以从相应模板中扩增出预期大小的单一产物，且条带清晰，结果表明本发明的多重体系具有高特异性。
2. 多重体系的敏感性检测
采用构建的含六种细菌检测靶标基因的质粒进行模板梯度PCR检测，SP、GBS、HI、LM、SA、NM的靶基因依次是lytA、cfb、P6、hly、nuc、ctrA。将各质粒模板用ddH2O进行10倍梯度稀释，依次得到107到101 copies/μL 稀释度的质粒模板。每个稀释度取1μL作为模板，分别对6个靶标基因进行模板梯度PCR反应。多重PCR采用的25μL反应体系包括：10μM的公共引物5μL，0.05μM（每条）的嵌合引物混合物5μL，5U/μL的Taq polymerase 0.15μL，25mM的MgCl2 2μL，10mM的dNTP 0.5μL，10×Taq Buffer 2.5µL，DNA模板 1μL，灭菌ddH2O 8.85μL；PCR反应条件为：95℃预变性 5min；95℃ 变性30s，63.5℃退火 30s，72℃ 延伸45s，共10个循环；72℃ 延伸3min；95℃ 变性30s，55℃退火 30s，72℃ 延伸45s，共25个循环；最后72℃延伸7min。检测结果见图2，a-f分别对应的质粒模板是cfb，hly，lytA ，ctrA，P6， nuc基因，1-7泳道对应的模板浓度分别为101到107拷贝，N为阴性对照，M为100bp DNA标准分子量；a-f敏感性依次为102，103，10，102，102 和 104拷贝，最高敏感性可达10拷贝。结果显示本发明的多重检测体系具有较高的敏感性，可用于细菌性脑膜炎病原体的检测。
实施例二 临床脑脊液标本的检测
收集60份疑为中枢神经系统感染的脑脊液标本（CSF），按照QIAgen公司的DNAmini Kit（货号51304）中革兰阳性菌的提取方法，对收集到的CSF标本进行基因组提取。采用本发明的检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，对提取标本基因组DNA进行检测，多重PCR采用的25μL反应体系包括：10μM的公共引物5μL，0.05μM（每条）的嵌合引物混合物5μL，5U/μL的Taq polymerase 0.15μL，25mM的MgCl2 2μL，10mM的dNTP 0.5μL，10×TaqBuffer 2.5µL，DNA模板 1μL，灭菌ddH2O 8.85μL；PCR反应条件为：95℃预变性 5min；95℃变性30s，63.5℃退火 30s，72℃ 延伸45s，共10个循环；72℃ 延伸3min；95℃ 变性30s，55℃退火 30s，72℃ 延伸45s，共25个循环；最后72℃延伸7min。利用本发明试剂盒对临床标本的检测结果见图3，泳道1是B型链球菌，泳道2为金黄色葡萄球菌，泳道3～6为肺炎链球菌，N为阴性对照，M为DNA标准分子量（目的带大小依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000bp），检测结果均通过扩增产物测序进一步确认。共检测出六例标本，其中四例标本临床培养阴性，两例与临床培养一致。结果表明利用本发明公开的细菌性脑膜炎的多重PCR检测试剂盒可检测出临床培养阴性标本，说明本发明的试剂盒检测敏感性高于临床细菌培养方法，可用于临床检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州大学
<120>一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒
<160>15
<210> 1
<211>17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ATGGTCGTCATCTTCTC 17
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ATGGTCGTCATCTTCTCTTGGCGGTTACTCTGTTGCT 37
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ATGGTCGTCATCTTCTCTGCAGGTTTTTCTTCACCGT 37
<210> 4
<211>37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ATGGTCGTCATCTTCTCAATCTCTGCCTCACTGCCAT 37
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ATGGTCGTCATCTTCTCAATCTCTGCCTCACTGCCAT 37
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ATGGTCGTCATCTTCTCGAACAGATTTGCCTCAAGTCGG 39
<210> 7
<211>38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ATGGTCGTCATCTTCTCTAAACTGCTCACGGCTAATGC 38
<210>8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400>8
ATGGTCGTCATCTTCTCCATCACAAACAGATAACGGCG 38
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ATGGTCGTCATCTTCTCCTTTAGCCAAGCCTTGACGAA 38
<210> 10
<211>39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ATGGTCGTCATCTTCTCGATGACGAAATGGCTTACAGTG 39
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400>11
ATGGTCGTCATCTTCTCAGCAACGTATCCTCCAGAGT 37
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400>12
ATGGTCGTCATCTTCTCCTAGTGGCTGGTGCATTGTT 37
<210> 13
<211>39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ATGGTCGTCATCTTCTCGATTGTAGCTCTATCAGTTGGT 39
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
AGCGGGAAATCGTGCGTGA 19
<210>15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400>15
AGTGAGGACCCTGGATGTGA 20

Claims (4)

1.一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，包括公共引物、针对细菌性脑膜炎病原体的嵌合引物对，还包括Taq 聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水、阳性对照引物对；所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1；所述针对细菌性脑膜炎病原体的嵌合引物对如下核苷酸序列所示：
进行PCR反应时，采用两步退火温度法，第一步退火温度高于第二步退火温度8～10℃；进行PCR反应时，针对细菌性脑膜炎感染病原体的每条嵌合引物的终浓度为10nM；进行PCR反应时，公共引物的终浓度为2000nM。
2.根据权利要求1所述检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照引物对的序列为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15。
3.权利要求1所述检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒在细菌性脑膜炎感染病原体的多重PCR扩增中的应用，所述应用不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，所述应用包括以下步骤，以细菌性脑膜炎感染病原体基因为靶标序列，用嵌合引物进行第一次多重PCR扩增，产生公共引物末端的PCR产物；然后以公共引物末端的PCR产物为模板，用公共引物进行第二次多重PCR扩增；即完成细菌性脑膜炎感染病原体的多重PCR扩增；所述第一次多重PCR扩增的退火温度高于第二次多重PCR扩增的退火温度8～10 ℃。
4.根据权利要求3所述的应用，所述应用不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于：多重PCR扩增采用25μL反应体系；第一次多重PCR扩增为10个循环，每条嵌合引物的终浓度为10nM，退火温度为63.5℃；第二次多重PCR扩增为25个循环，公共引物的终浓度为2000nM，退火温度为55℃。
CN201610296666.5A 2016-05-06 2016-05-06 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒 Active CN105734164B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610296666.5A CN105734164B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610296666.5A CN105734164B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105734164A CN105734164A (zh) 2016-07-06
CN105734164B true CN105734164B (zh) 2019-05-17

Family

ID=56288212

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610296666.5A Active CN105734164B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105734164B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106995841B (zh) * 2017-03-20 2020-10-09 苏州大学 一种转基因大豆检测用多重pcr试剂盒及检测方法
CN106868218B (zh) * 2017-03-30 2020-06-23 苏州大学 用于病毒性脑炎快速诊断的多重pcr试剂盒
CN108085408B (zh) * 2017-12-26 2019-09-20 银丰基因科技有限公司 快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒
BR102018003245A2 (pt) * 2018-02-20 2019-09-10 Fundação Oswaldo Cruz oligonucleotídeo, conjunto de oligonucleotídeos, método para detecção simultânea de neisseria meningitidis, streptococcus pneumoniae e haemophilus influenzae, e, kit.
CN111269995B (zh) * 2018-12-04 2023-12-26 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法
CN110512008B (zh) * 2019-06-20 2022-04-15 苏州大学 检测常见十一种食源性致病菌的多重pcr试剂盒及其应用
CN110904253A (zh) * 2019-12-18 2020-03-24 上海伯杰医疗科技有限公司 脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法
CN111455115A (zh) * 2020-05-27 2020-07-28 宁波海尔施基因科技有限公司 一种基于rt-pcr及毛细电泳的同步检测19种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1548545A (zh) * 2003-05-14 2004-11-24 宇 王 一种用于多靶序列pcr检测的公共引物及其对多靶核酸序列进行pcr扩增的方法
CN101558168A (zh) * 2006-10-03 2009-10-14 国立大学法人岐阜大学 利用DnaJ基因的细菌检测及其应用
CN102352411A (zh) * 2011-09-29 2012-02-15 苏州大学 一种多重pcr扩增方法及试剂盒
CN104293962A (zh) * 2014-10-20 2015-01-21 苏州大学 一种筛选公共引物的方法
CN105473737A (zh) * 2013-07-25 2016-04-06 基因德信 用于检测细菌污染的方法和组合物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1548545A (zh) * 2003-05-14 2004-11-24 宇 王 一种用于多靶序列pcr检测的公共引物及其对多靶核酸序列进行pcr扩增的方法
CN101558168A (zh) * 2006-10-03 2009-10-14 国立大学法人岐阜大学 利用DnaJ基因的细菌检测及其应用
CN102352411A (zh) * 2011-09-29 2012-02-15 苏州大学 一种多重pcr扩增方法及试剂盒
CN105473737A (zh) * 2013-07-25 2016-04-06 基因德信 用于检测细菌污染的方法和组合物
CN104293962A (zh) * 2014-10-20 2015-01-21 苏州大学 一种筛选公共引物的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PCR 技术在脑脊液病原菌诊断中的应用;刘毅等;《国外医学临床生物化学与检验学分册》;20021231;第23卷(第6期);第337-339页 *
一种高效筛选公共引物的方法;陈英等;《中国血液流变学杂志》;20160131;第26卷(第1期);第1-5页 *
细菌性脑膜炎多重聚合酶链反应检测方法的研究;任红宇等;《中国疫苗和免疫》;20100228;第16卷(第1期);摘要、第48页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105734164A (zh) 2016-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105734164B (zh) 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒
Barken et al. Advances in nucleic acid-based diagnostics of bacterial infections
ES2399054T3 (es) Métodos para simplificar ácidos nucleicos microbianos mediante modificación química de citosinas
CN107686863A (zh) 环介导等温扩增技术检测三种泌尿生殖道支原体的方法
Liu et al. Visual diagnostic of Helicobacter pylori based on a cascade amplification of PCR and G-quadruplex DNAzyme as a color label
JP2013520186A (ja) 緑膿菌の血清型決定のためのアッセイ法およびキット、ならびにそのような方法およびキットにおいて有用なオリゴヌクレオチド配列
CN104334745A (zh) 用于核酸检测的pcr和环介导的等温扩增的组合技术
Derzelle et al. Use of high-resolution melting and melting temperature-shift assays for specific detection and identification of Bacillus anthracis based on single nucleotide discrimination
US20120088680A1 (en) Real-time pcr assays for rapid detection and differentiation of the clostridium botulinum toxin genes a, b, e, and f
CN105567802A (zh) 肺炎衣原体荧光pcr检测试剂盒
CN108411014A (zh) 鉴别a型和b型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量pcr的引物和探针以及检测方法
CN109680087B (zh) 一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重pcr检测方法及其引物组
CN115976238B (zh) 一种包含15种支原体qPCR快速检测试剂盒及其使用方法和应用
RU2684314C2 (ru) Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер в формате реального времени
CN105624285A (zh) 肺炎支原体荧光pcr检测试剂盒
JP2010512728A (ja) Ｂｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの高度に病原性のｓｔ−１７クローンの迅速な検出
Wang et al. A CRISPR-Cas12a-based platform facilitates the detection and serotyping of Streptococcus suis serotype 2
JP4648023B2 (ja) ジャガイモそうか病原因菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子若しくは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するための新規プライマー対、及びそれらを用いたジャガイモそうか病原因菌種の検出・識別方法
CN103509790A (zh) 利用单管巢式实时聚合酶链反应(pcr)的改良结核菌诊断方法
Manome et al. Quantification of potato common scab pathogens in soil by quantitative competitive PCR with fluorescent quenching‐based probes
CN101092645B (zh) 诊断性传染病致病原的新颖方法
CN104774960A (zh) 应用双重高分辨率熔解曲线技术检测巴尔通体的方法
US20220396828A1 (en) Method of determining the presence of a hyper-virulent clostridioides difficile strain of the b1/nap1/027 group in a sample
CN103642901A (zh) 脑膜炎奈瑟氏菌z群的特异性检测用引物探针组合和试剂盒
Xu et al. Single-tube Multiplex Nested PCR System for Efficient Detection of Pathogenic Microorganisms in SPF Rodents

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20201125

Address after: No.463, Yindu District, Shanghai

Patentee after: SHANGHAI GENEODX BIOTECH CO.,LTD.

Address before: 215123 No. 199 benevolence Road, Suzhou Industrial Park, Jiangsu, Suzhou

Patentee before: SOOCHOW University

CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: 200030, 1st Floor, Building 3, No. 218 Yindu Road, Xuhui District, Shanghai

Patentee after: Shanghai Jienuo Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 200030 floor 1, building 3, No. 466, Yindu Road, Xuhui District, Shanghai

Patentee before: SHANGHAI GENEODX BIOTECH CO.,LTD.