CN108085408B - 快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒 - Google Patents
快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108085408B CN108085408B CN201711427510.7A CN201711427510A CN108085408B CN 108085408 B CN108085408 B CN 108085408B CN 201711427510 A CN201711427510 A CN 201711427510A CN 108085408 B CN108085408 B CN 108085408B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- primer
- fam
- hex
- kinds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的引物和探针，包括针对12种病原体的特异性引物和探针，如SEQ ID NO.1～36所示。本发明还公开了快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒，包括上述针对12种病原体的特异性引物和探针。本发明通过12种细菌病原体各自的基因组进行生物信息学分析，筛选出了各自的保守基因序列，设计了针对12种病原体的引物探针，然后通过双标记两两组合，最终实现6管PCR反应同时上机检测12种细菌病原体，并且12种细菌病原体的最低检测限均不低于10copie/μl，大大降低了工作量，节约了原材料的同时还提高了检测效率，为早期中枢神经系统感染筛查提供了良好的指导用药。
Description
技术领域
本发明涉及快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒。
背景技术
细菌性中枢神经系统感染病原体种类繁多，其中最常见的是大肠埃希杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、化脓链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌和屎肠球菌等12种。传统的病原体检测方法是血清学检测，该方法灵敏度不高，无法检测出脑脊液种微量的病原体。病原体的核酸检测可以实现高灵敏检测出脑脊液种的细菌病原体，但是在CFDA注册的核酸检测产品中只有金黄色葡萄球菌和人结核分枝杆菌，无法满足细菌性中枢系统感染病原核酸鉴定的需求。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的探针，及核酸检测试剂盒。本发明选择细菌性中枢神经系统感染最常见的12种病原体进行检测，通过6 管qPCR同时上机检测，可以准确的鉴定出每种微量感染的细菌病原体。
本发明是通过以下技术方案实现的：
快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的引物和探针，包括针对12种病原体的特异性引物和探针，具体的引物、探针的序列如下：
(1)结核分枝杆菌：上游引物：5'CCAATAGACCTCATCGGGC 3'；
下游引物：5'CGGTCAAGAAGAAGTACGGC 3'；
探针：5'FAM CGAAGCCGAACCCGAACGTC BQ1 3’；
(2)屎肠球菌：上游引物：5'GATTGCCTGAAGATAGTATCCCA 3'；
下游引物：5'CTTCATACAAATAAAGTCCTTCAGG 3'；
探针：5'HEX TGTGCTGTAGGTCCTGCTGCATTACG BQ2 3'；
(3)肺炎链球菌：上游引物：5'TGAATATAGCAGTAATTGGTTTGGG 3'；
下游引物：5'TCGCAAAAAAACTTCATAAGCTC 3'；
探针：5'FAM ATGTTGGGCTGGCCTACGCGTT BQ1 3’；
(4)化脓杆菌：上游引物：5'TGGGCAGCTGACTATGTGTC 3'；
下游引物：5'AGGAAATATTCCCGCACAAA 3'；
探针：5'HEX GCCTCAAAATGCTACTCTTGTCACTGG BQ2 3'；
(5)脑膜奈瑟氏菌：上游引物：5'TGAGTTCGATTTCGATGCAC 3'；
下游引物：5'TGAACCTTGTAGCGCAGATG 3'；
探针：5'FAM TCAGGCGGCAAACTTCGGAT BQ1 3’；
(6)表皮葡萄球菌：上游引物：5'TCCGACAAAATGGAGATGTGTAT 3’；
下游引物：5'CGCCAATAGCTAACACTGCAT 3’；
探针：5'HEX AGTGGGATGCGCTGACGTTCAG BQ2 3’；
(7)粪肠球菌：上游引物：5'GCTGCGCACGGAAATAGTA 3’；
下游引物：5'CGCCATTCTCTTCATTCACTT 3’；
探针：5'FAM TGCCACCGAAAGAAGCTTTGCG BQ1 3’；
(8)流感嗜血杆菌：上游引物：5'CTGTAGCCGTTGCTTGCAT 3’；
下游引物：5'GCAACCAGTGAAGTGCAAAA 3’；
探针：5'HEX TGCTCGTTTTTCTTGCTCAATCAACA BQ2 3’；
(9)大肠杆菌：上游引物：5’TATCTACAGCCCGCATCGTT 3’；
下游引物：5’GTGACTTTATGCGGCGAACT 3’；
探针：5’FAM GTCGGGGTCGCCGTCAACGC BQ1 3’；
(10)铜绿假单胞菌：上游引物：5'GGAGATCGACATGGCATACG 3'；
下游引物：5'AGGTGGCGTTGCGGATG 3'；
探针：5'HEX GGAARCTGTGAACGCATGGT BQ2 3'；
(11)无乳链球菌：上游引物：5'GAAGCAACTGCCAAGGAATC 3’；
下游引物：5'ATCATTTTACCCGCAGCTTG 3’；
探针：5'FAM TGCACTGGGATATGAAGAAACGCCA BQ1 3’；
(12)金黄色葡萄球菌：上游引物：5'TGGTTTTATTGGGTCGCATT 3’；
下游引物：5'GGTTTCTCAACCGACTCAGC 3’；
探针：5'HEX TTTGGCTGACGATCATGTGTTTGAA BQ2 3’。
上述引物、探针的核苷酸序列如表1所示，如SEQ ID NO.1～36所示。
进一步地，针对12种病原体的特异性引物和探针，通过双标记两两组合，共分为6组，探针采用荧光标记，6种使用FAM标记，6种使用HEX标记。
更进一步地，分为以下6组：结核分枝杆菌(FAM)和屎肠球菌(HEX)的引物、探针；肺炎链球菌(FAM)和化脓杆菌(HEX)的引物、探针；脑膜奈瑟氏菌(FAM)和表皮葡萄球菌(HEX)的引物、探针；粪肠球菌(FAM)和流感嗜血杆菌(HEX)的引物、探针；大肠杆菌(FAM)和铜绿假单胞菌(HEX)的引物、探针；无乳链球菌(FAM)和金黄色葡萄球菌(HEX)的引物、探针；详见表1。
表1
一种快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒，包括上述探针，以及用于核酸检测的试剂，比如buffer混合液、热启动taq酶、UNG酶、dUTPS(dATP/dGTP/dCTP/dTTP)。
进一步地，所述核酸检测试剂盒，包括反应液A和反应液B；其中，反应液A包括A1、A2、A3、A4、A5和A6；A1的成分是结核分枝杆菌(FAM)和屎肠球菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液；A2的成分是：肺炎链球菌(FAM)和化脓杆菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液；A3的成分是：脑膜奈瑟氏菌(FAM)和表皮葡萄球菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液；A4的成分是：粪肠球菌(FAM)和流感嗜血杆菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液；A5的成分是：大肠杆菌(FAM)和铜绿假单胞菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液；A6的成分是：无乳链球菌(FAM)和金黄色葡萄球菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液。反应液B的成分是热启动taq酶、UNG酶和dUTPS (dATP/dGTP/dCTP/dTTP)。在进行样品检测时，只需要把反应液A分别和反应液B(反应液B 相应地分为6组)进行混合，然后加入核酸样本即可上机检测。可适用的荧光定量PCR仪器有ABI7500系列和LC480系列，上机程序为42℃，15min；95℃，5min；94℃，15s，55℃45s， 45个循环；37℃60s。
本发明通过12种细菌病原体各自的基因组进行生物信息学分析，筛选出了各自的保守基因序列，设计了针对12种病原体的引物探针，其中6种细菌病原体使用FAM标记，6种细菌病原体使用HEX标记，然后通过双标记两两组合，最终实现6管PCR反应同时上机检测12种细菌病原体，并且12种细菌病原体的最低检测限均不低于10copie/μl。本发明可以实现12 种细菌病原体的超灵敏检测，为早期中枢神经系统感染筛查提供了良好的指导用药，同时本发明实现了1管PCR反应检测两种细菌病原体，并且实现了6管PCR反应以同样的上机程序进行检测，大大降低了工作量，节约了原材料的同时还提高了检测效率。
附图说明
图1：结核分枝杆菌(FAM)和屎肠球菌(HEX)灵敏度实验图。
图2：肺炎链球菌(FAM)和化脓杆菌(HEX)灵敏度实验图。
图3：脑膜奈瑟氏菌(FAM)和表皮葡萄球菌灵敏度实验图。
图4：粪肠球菌(FAM)和流感嗜血杆菌(HEX)灵敏度实验图。
图5：大肠杆菌(FAM)和铜绿假单胞菌(HEX)灵敏度实验图。
图6：无乳链球菌(FAM)和金黄色葡萄球菌(HEX)灵敏度实验图。
图7：结核分枝杆菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图8：屎肠球菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图9：肺炎链球菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图10：化脓杆菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图11：脑膜奈瑟氏菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图12：表皮葡萄球菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图13：粪肠球菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图14：流感嗜血杆菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图15：大肠杆菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图16：铜绿假单胞菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图17：无乳链球菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图18：金黄色葡萄球菌的10倍梯度浓度核酸检测实验图，左为本发明，右为其它引物探针。
图19：结核分枝杆菌(FAM)和屎肠球菌(HEX)最低检测限实验图。
图20：肺炎链球菌(FAM)和化脓杆菌(HEX)最低检测限实验图。
图21：脑膜奈瑟氏菌(FAM)和表皮葡萄球菌最低检测限实验图。
图22：粪肠球菌(FAM)和流感嗜血杆菌(HEX)最低检测限实验图。
图23：大肠杆菌(FAM)和铜绿假单胞菌(HEX)最低检测限实验图。
图24：无乳链球菌(FAM)和金黄色葡萄球菌(HEX)最低检测限实验图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1 引物、探针、核酸检测试剂盒
通过12种细菌病原体各自的基因组进行生物信息学分析，筛选出了各自的保守基因序列，设计了针对12种病原体的引物探针，其中6种细菌病原体使用FAM标记，6种细菌病原体使用HEX标记，然后通过双标记两两组合，具体序列及分组情况如表1所示。
核酸检测试剂盒，包括反应液A和反应液B；其中，反应液A包括A1、A2、A3、A4、A5 和A6；A1的成分是结核分枝杆菌(FAM)和屎肠球菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液；A2的成分是：肺炎链球菌(FAM)和化脓杆菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液； A3的成分是：脑膜奈瑟氏菌(FAM)和表皮葡萄球菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液；A4的成分是：粪肠球菌(FAM)和流感嗜血杆菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液；A5的成分是：大肠杆菌(FAM)和铜绿假单胞菌(HEX)的引物、探针，以及buffer混合液；A6的成分是：无乳链球菌(FAM)和金黄色葡萄球菌(HEX)的引物、探针，以及buffer 混合液。反应液B的成分是热启动taq酶、UNG酶和dUTPS(dATP/dGTP/dCTP/dTTP)。在进行样品检测时，只需要把反应液A分别和反应液B(反应液B相应地分为6组)进行混合，然后加入核酸样本即可上机检测。可适用的荧光定量PCR仪器有ABI7500系列和LC480系列，上机程序为42℃，15min；95℃，5min；94℃，15s，55℃45s，45个循环；37℃60s。
实施例2 灵敏度实验
配制反应液A：A1、A2、A3、A4、A5和A6，反应液B：B1、B2、B3、B4、B5和B6。依次将A、B液进行混合，然后分别加入各自体系对应的样本核酸，样本核酸浓度分别为105copies/ μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl。结果：12种细菌在最低浓度10copies/μl均有扩增曲线，如图1～6所示。
实施例3 对比试验
配制反应液A：A1、A2、A3、A4、A5和A6，反应液B：B1、B2、B3、B4、B5和B6。依次将A、B液进行混合，并用其它细菌对应的引物探针配制体系，然后分别加入各自体系对应的样本核酸5μl，样本核酸浓度分别为105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、 102copies/μl、10copies/μl，共同上机检测。结果如图7～18所示。12种细菌用本发明的体系在5个梯度浓度下均可以检测到，用其它引物探针的体系在10copies/μl均检测不到，甚至102copies/μl浓度下部分细菌检测效果也不太好，其效果远不如本发明的检测效果，本发明的检测灵敏度要比其它引物探针高10倍以上。
实施例4 最低检测限实验
配制反应液A：A1、A2、A3、A4、A5和A6，反应液B：B1、B2、B3、B4、B5和B6。依次将A、B液进行混合，，然后分别加入各自体系对应的样本核酸(10copies/μl)，多孔重复。结果如图19～24所示,，结果显示，12种细菌均可以检测到。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。
序列表
<110> 银丰基因科技有限公司
银丰生物工程集团有限公司
<120> 快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒
<141> 2017-12-26
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccaatagacc tcatcgggc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cggtcaagaa gaagtacggc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgaagccgaa cccgaacgtc 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gattgcctga agatagtatc cca 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cttcatacaa ataaagtcct tcagg 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgtgctgtag gtcctgctgc attacg 26
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgaatatagc agtaattggt ttggg 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tcgcaaaaaa acttcataag ctc 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atgttgggct ggcctacgcg tt 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tgggcagctg actatgtgtc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
aggaaatatt cccgcacaaa 20
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gcctcaaaat gctactcttg tcactgg 27
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
tgagttcgat ttcgatgcac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tgaaccttgt agcgcagatg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tcaggcggca aacttcggat 20
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tccgacaaaa tggagatgtg tat 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cgccaatagc taacactgca t 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
agtgggatgc gctgacgttc ag 22
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gctgcgcacg gaaatagta 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
cgccattctc ttcattcact t 21
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
tgccaccgaa agaagctttg cg 22
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
ctgtagccgt tgcttgcat 19
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gcaaccagtg aagtgcaaaa 20
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
tgctcgtttt tcttgctcaa tcaaca 26
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
tatctacagc ccgcatcgtt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
gtgactttat gcggcgaact 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
gtcggggtcg ccgtcaacgc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
ggagatcgac atggcatacg 20
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
aggtggcgtt gcggatg 17
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
ggaarctgtg aacgcatggt 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
gaagcaactg ccaaggaatc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
atcattttac ccgcagcttg 20
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
tgcactggga tatgaagaaa cgcca 25
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
tggttttatt gggtcgcatt 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
ggtttctcaa ccgactcagc 20
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
tttggctgac gatcatgtgt ttgaa 25
Claims (7)
1.快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的引物和探针，其特征在于：包括针对12种病原体的特异性引物和探针，具体的引物、探针的序列如下：
(1)结核分枝杆菌：上游引物：5'CCAATAGACCTCATCGGGC 3'；
下游引物：5'CGGTCAAGAAGAAGTACGGC 3'；
探针：5'FAM-CGAAGCCGAACCCGAACGTC-BHQ1 3’；
(2)屎肠球菌：上游引物：5'GATTGCCTGAAGATAGTATCCCA 3'；
下游引物：5'CTTCATACAAATAAAGTCCTTCAGG 3'；
探针：5'HEX-TGTGCTGTAGGTCCTGCTGCATTACG-BHQ2 3'；
(3)肺炎链球菌：上游引物：5'TGAATATAGCAGTAATTGGTTTGGG 3'；
下游引物：5'TCGCAAAAAAACTTCATAAGCTC 3'；
探针：5'FAM-ATGTTGGGCTGGCCTACGCGTT-BHQ1 3’；
(4)化脓杆菌：上游引物：5'TGGGCAGCTGACTATGTGTC 3'；
下游引物：5'AGGAAATATTCCCGCACAAA 3'；
探针：5'HEX-GCCTCAAAATGCTACTCTTGTCACTGG-BHQ2 3'；
(5)脑膜奈瑟氏菌：上游引物：5'TGAGTTCGATTTCGATGCAC 3'；
下游引物：5'TGAACCTTGTAGCGCAGATG 3'；
探针：5'FAM-TCAGGCGGCAAACTTCGGAT-BHQ1 3’；
(6)表皮葡萄球菌：上游引物：5'TCCGACAAAATGGAGATGTGTAT 3’；
下游引物：5'CGCCAATAGCTAACACTGCAT 3’；
探针：5'HEX-AGTGGGATGCGCTGACGTTCAG-BHQ2 3’；
(7)粪肠球菌：上游引物：5'GCTGCGCACGGAAATAGTA 3’；
下游引物：5'CGCCATTCTCTTCATTCACTT 3’；
探针：5'FAM-TGCCACCGAAAGAAGCTTTGCG-BHQ1 3’；
(8)流感嗜血杆菌：上游引物：5'CTGTAGCCGTTGCTTGCAT 3’；
下游引物：5'GCAACCAGTGAAGTGCAAAA 3’；
探针：5'HEX-TGCTCGTTTTTCTTGCTCAATCAACA-BHQ2 3’；
(9)大肠杆菌：上游引物：5’TATCTACAGCCCGCATCGTT 3’；
下游引物：5’GTGACTTTATGCGGCGAACT 3’；
探针：5’FAM-GTCGGGGTCGCCGTCAACGC-BHQ1 3’；
(10)铜绿假单胞菌：上游引物：5'GGAGATCGACATGGCATACG 3'；
下游引物：5'AGGTGGCGTTGCGGATG 3'；
探针：5'HEX-GGAARCTGTGAACGCATGGT-BHQ2 3'；
(11)无乳链球菌：上游引物：5'GAAGCAACTGCCAAGGAATC 3’；
下游引物：5'ATCATTTTACCCGCAGCTTG 3’；
探针：5'FAM-TGCACTGGGATATGAAGAAACGCCA-BHQ1 3’；
(12)金黄色葡萄球菌：上游引物：5'TGGTTTTATTGGGTCGCATT 3’；
下游引物：5'GGTTTCTCAACCGACTCAGC 3’；
探针：5'HEX-TTTGGCTGACGATCATGTGTTTGAA-BHQ2 3’。
2.根据权利要求1所述的快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的引物和探针，其特征在于：所述针对12种病原体的特异性引物和探针，通过双标记两两组合，共分为6组，探针采用荧光标记，6种使用FAM标记，6种使用HEX标记。
3.根据权利要求2所述的快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的引物和探针，其特征在于：分为以下6组：结核分枝杆菌和屎肠球菌的引物、探针；肺炎链球菌和化脓杆菌的引物、探针；脑膜奈瑟氏菌和表皮葡萄球菌的引物、探针；粪肠球菌和流感嗜血杆菌的引物、探针；大肠杆菌和铜绿假单胞菌的引物、探针；无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的引物、探针；其中，结核分枝杆菌、肺炎链球菌、脑膜奈瑟氏菌、粪肠球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的探针使用FAM标记；屎肠球菌、化脓杆菌、表皮葡萄球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的探针使用HEX标记。
4.一种快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2或3所述的探针。
5.根据权利要求4所述的快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括用于核酸检测的试剂。
6.根据权利要求5所述的快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述用于核酸检测的试剂包括buffer混合液、热启动taq酶、UNG酶、dUTPS。
7.根据权利要求4或5或6所述的快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述核酸检测试剂盒，包括反应液A和反应液B；其中，反应液A包括A1、A2、A3、A4、A5和A6；A1的成分是结核分枝杆菌和屎肠球菌的引物、探针，以及buffer混合液；A2的成分是：肺炎链球菌和化脓杆菌的引物、探针，以及buffer混合液；A3的成分是：脑膜奈瑟氏菌和表皮葡萄球菌的引物、探针，以及buffer混合液；A4的成分是：粪肠球菌和流感嗜血杆菌的引物、探针，以及buffer混合液；A5的成分是：大肠杆菌和铜绿假单胞菌的引物、探针，以及buffer混合液；A6的成分是：无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的引物、探针，以及buffer混合液；反应液B的成分是热启动taq酶、UNG酶和dUTPS；其中，结核分枝杆菌、肺炎链球菌、脑膜奈瑟氏菌、粪肠球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的探针使用FAM标记；屎肠球菌、化脓杆菌、表皮葡萄球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的探针使用HEX标记。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711427510.7A CN108085408B (zh) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | 快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711427510.7A CN108085408B (zh) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | 快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108085408A CN108085408A (zh) | 2018-05-29 |
| CN108085408B true CN108085408B (zh) | 2019-09-20 |
Family
ID=62179447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711427510.7A Active CN108085408B (zh) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | 快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108085408B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109657731A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-19 | 长沙理工大学 | 一种微滴数字pcr仪抗干扰分类方法 |
| CN111763767A (zh) * | 2020-06-04 | 2020-10-13 | 上海捷诺生物科技有限公司 | 中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103074448A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-01 | 海尔施生物医药股份有限公司 | 一种同步检测二十三种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法 |
| CN105734164A (zh) * | 2016-05-06 | 2016-07-06 | 苏州大学 | 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒 |
-
2017
- 2017-12-26 CN CN201711427510.7A patent/CN108085408B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103074448A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-01 | 海尔施生物医药股份有限公司 | 一种同步检测二十三种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法 |
| CN105734164A (zh) * | 2016-05-06 | 2016-07-06 | 苏州大学 | 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Rapid detection of eight causative pathogens for the diagnosis of bacterial meningitis by real-time PCR;Naoko Chiba等;《J Infect Chemother》;20091231;第92-98页 * |
| 细菌性中枢神经系统感染的实验室诊断研究进展;曹敬荣等;《中华实验和临床感染病杂志》;20160228;第13-16页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108085408A (zh) | 2018-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105734164B (zh) | 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒 | |
| CN102618655B (zh) | 一种检测肺炎支原体的lamp试剂盒 | |
| CN104087654B (zh) | 沙门氏菌及其五种血清型的多重pcr鉴定试剂盒 | |
| CN102002522B (zh) | 一种检测肺炎支原体耐药突变的方法 | |
| CN108085408B (zh) | 快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的核酸检测试剂盒 | |
| CN106399542A (zh) | 一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒 | |
| CN108588246A (zh) | 一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
| CN101570780B (zh) | 肉制品中布氏菌检测试剂盒及检测方法 | |
| CN103993090B (zh) | 对普罗威登斯菌o31，o41，o42，o43和o50特异的核苷酸及其应用 | |
| Ragheb et al. | The application of uniplex, duplex, and multiplex PCR for the absence of specified microorganism testing of pharmaceutical excipients and drug products | |
| CN102108400B (zh) | 一种鉴定双歧杆菌的方法 | |
| CN108384782B (zh) | 检测引发血流感染病原体的成套试剂和试剂盒 | |
| Gabriel et al. | High-resolution melting analysis for rapid detection of linezolid resistance (mediated by G2576T mutation) in Staphylococcus epidermidis | |
| CN104830848A (zh) | 一种用于结核分枝杆菌检测的反向斑点杂交试剂盒及其使用方法 | |
| CN103642901B (zh) | 脑膜炎奈瑟氏菌z群的特异性检测用引物探针组合和试剂盒 | |
| EP2834369B1 (en) | Compositions and methods for detection of mycobacterium avium paratuberculosis | |
| US9334542B2 (en) | Compositions and methods for detection of microorganisms of the Mycobacterium avium complex excluding Mycobacterium avium paratuberculosis | |
| CN102808025A (zh) | 水牛乳及其乳制品中奶牛乳源掺入的双重聚合酶链式反应检测方法 | |
| CN107937584B (zh) | 一种肉品沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法 | |
| CN102199669B (zh) | 辅助检测ndm-1基因的专用引物及其应用 | |
| CN110129459A (zh) | 一种用于检测眼内液中5种革兰氏阳性细菌的lamp引物组合及应用 | |
| CN101624625B (zh) | 食品中常见弯曲菌检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN104031994A (zh) | 可视化病原检测芯片及其制备方法和应用 | |
| US20180340214A1 (en) | Quantitative multiplex polymerase chain reaction in two reactions | |
| CN110512013B (zh) | 一种应用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yang Haixing Inventor after: Xu Ming Inventor after: Duan Wenyuan Inventor after: Yang Xudong Inventor after: Chen Shoulin Inventor after: Xu Xiaodan Inventor after: Chang Qingyun Inventor after: Zhang Qianqian Inventor after: Liu Jinxiu Inventor after: Liu Changsheng Inventor before: Yang Haixing Inventor before: Duan Wenyuan Inventor before: Yang Xudong Inventor before: Chen Shoulin Inventor before: Xu Xiaodan Inventor before: Chang Qingyun Inventor before: Zhang Qianqian Inventor before: Liu Jinxiu |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |