CN108588246A - 一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒，本发明通过采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对鲍曼不动杆菌bfs、绿脓杆菌toxR、念珠菌ITS、曲霉菌mot1、表皮葡萄球菌se2313、军团菌mip、肺炎支原体23S、肺炎衣原体Cpn0308基因，设计引物、探针、PCR检测混合液，选用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对多种下呼吸道特异性基因进行快速、准确检测。

Description

一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒。
背景技术
下呼吸道感染是指终末气道，肺泡和肺间质的炎症，可由疾病微生物、理化因素，免疫损伤、过敏及药物所致。细菌性下呼吸道感染是最常见的下呼吸道感染，也是最常见的感染性疾病之一，其中临床常见的下呼吸道细菌有鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌、念珠菌、曲霉菌、表皮葡萄球菌、军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体。日常所讲的下呼吸道感染主要是指细菌性感染引起的下呼吸道感染，在抗生素应用以前，细菌性下呼吸道感染对儿童及老年人额健康威胁极大，抗生素的出现及发展曾一度使下呼吸道感染病死率明显下降，但近年来，尽管应用强有力的抗生素和有效的疫苗，下呼吸道感染总的病死率不再降低，甚至有所上升。
发明内容
本发明提供一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒，解决现有技术中无有效的烟曲霉特异性基因ITS检测方法的技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物和探针，检测鲍曼不动杆菌bfs的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测鲍曼不动杆菌bfs的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
一种检测下呼吸道细菌特异性基因的方法，其特征在于，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对鲍曼不动杆菌bfs、绿脓杆菌toxR、念珠菌ITS、曲霉菌mot1、表皮葡萄球菌se2313、军团菌mip、肺炎支原体23S、肺炎衣原体Cpn0308基因设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测鲍曼不动杆菌bfs的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测鲍曼不动杆菌bfs的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示；
分别针对鲍曼不动杆菌bfs、绿脓杆菌toxR、念珠菌ITS、曲霉菌mot1、表皮葡萄球菌se2313、军团菌mip、肺炎支原体23S、肺炎衣原体Cpn0308基因，配置反应混合液；
分别取所述混合液36μL置于PCR管中，并将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品，盖好管盖，进行荧光PCR扩增反应，并进行结果判定。
一种检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、第四引物探针混合液、第五引物探针混合液、第六引物探针混合液、第七引物探针混合液、第八引物探针混合液、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，第一引物探针混合液包括检测鲍曼不动杆菌bfs的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测鲍曼不动杆菌bfs的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；第二引物探针混合液包括检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；第三引物探针混合液包括检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；第四引物探针混合液包括检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；第五引物探针混合液检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；第六引物探针混合液检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；第七引物探针混合液包括检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；第七引物探针混合液检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
本发明的有益效果：采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对对鲍曼不动杆菌bfs、绿脓杆菌toxR、念珠菌ITS、曲霉菌mot1、表皮葡萄球菌se2313、军团菌mip、肺炎支原体23S、肺炎衣原体Cpn0308基因，设计引物、探针、PCR检测混合液，选用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对多种下呼吸道特异性基因进行快速、准确检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例真菌感染样本的荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例一
本发明实施例提供了一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物和探针，其特征在于，检测鲍曼不动杆菌bfs的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测鲍曼不动杆菌bfs的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
其中，
(1)鲍曼不动杆菌bfs设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-bfs-F：5’-CAAACGCGTATAGCCATTAACTACAA-3’ 26bp
下游引物P-bfs-R：5’-CATTGCCTGTACAACCTAAAAAGTTATC-3’ 28bp
针对bfs的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-bfs：5’-FAM-TATCTAAGGTTAATCCGCCCCCCAACACA-TAMRA-3’ 29bp
(2)绿脓杆菌toxR设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-toxR-F：5’-TGCGAACGACGGATTCG-3’ 17bp
下游引物P-toxR-R：5’-GAGCTTGCTGCCGACCAA-3’ 18bp
针对toxR的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-toxR：5’-FAM-CTCTTCGCCCATGGCATCTATGCG-MGB-3’ 24bp
(3)念珠菌ITS设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-ITS-F：5’-CGGAGGGCATGCCTGTT-3’ 17bp
下游引物P-ITS-R：5’-TTCAAGCAAACCCAAGTCGTATT-3’ 23bp
针对ITS的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-ITS 5’-FAM-TCGTTTCTCCCTCAAACCGCTGGG-TAMRA-3’ 24bp
(4)曲霉菌mot1设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-mot1-F：5’-GACAGGGCCGGTATCATGTT-3’ 21bp
下游引物P-mot1-R：5’-GCGCGGACCCCATACAG-3’ 18bp
针对mot1的TaqMan荧光标记探针序列如下：
mot1：5’-FAM-CGCATTCTCAATCGATCCAAGGGACC-TAMRA-3’ 28bp
(5)表皮葡萄球菌se2313设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-Se2313-F：5’-GCGTCATGCCTTTATTTGAAGA-3’ 22bp
下游引物P-Se2313-R：5’-GGTTCGAGACAGTATAGTGATTGATTTG-3’ 28bp
针对Se2313的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-Se2313：5’-FAM-TGTGCCCAAATCACATCCACTAGCTATGAC-TAMRA-3’ 30bp
(6)军团菌mip设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-mip-F：5’-CCAGTGGCCTGCAATATAAAGTT-3’ 23bp
下游引物P-mip-R：5’-TTCAACCGTCACCGTATCTGAT-3’ 22bp
针对mip的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-mip：5’-FAM-AAGGAACGGGCATCAAGCCTTCCA-TAMRA-3’ 24bp
(7)肺炎支原体23S设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-23S-F：5’-CGAATGTGATTCCGTGTGTAGTG-3’ 23bp
下游引物P-23S-R：5’-GCAAGCCCTACAACCCCTATC-3’ 21bp
针对23S的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-23S：5’-FAM-CGAAAGCGGAACAGGCCAAACTTATCA-TAMRA-3’ 27bp
(8)肺炎衣原体Cpn0308设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-Cpn0308-F：5‘-CAAGCTAGAACAGCGGAGTTGA-3′ 22bp
下游引物P-Cpn0308-R：5’-TTTTGCTTCTGGACAGTTGCA-3′ 21bp
针对Cpn0308的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-Cpn03085'-FAM-CTCAATGAAATGATATCTGCGCCGGC-TAMRA-3′ 27bp
16S、toxR、ITS、mot1、Se2313、mip、23S、Cpn0308基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为TAMRA。
实施例二
实施例二提供了一种检测下呼吸道细菌特异性基因的方法，其特征在于，包括：
步骤201、样本核酸制备，以获得核酸模板；
步骤202、分别针对鲍曼不动杆菌bfs、绿脓杆菌toxR、念珠菌ITS、曲霉菌mot1、表皮葡萄球菌se2313、军团菌mip、肺炎支原体23S、肺炎衣原体Cpn0308基因设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测鲍曼不动杆菌bfs的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测鲍曼不动杆菌bfs的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示；
步骤203、分别针对鲍曼不动杆菌bfs、绿脓杆菌toxR、念珠菌ITS、曲霉菌mot1、表皮葡萄球菌se2313、军团菌mip、肺炎支原体23S、肺炎衣原体Cpn0308基因，配置反应混合液；
步骤204、分别取所述混合液36μL置于PCR管中，并将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品，盖好管盖，进行荧光PCR扩增反应，并进行结果判定。
其中，酶组成的确定，具体如下：
酶由Taq DNA聚合酶(简称Taq酶)和UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)组成，将5U/μLTaq酶和2U/μL UNG酶按体积比3∶1比例混合。
阴、阳性对照品，具体如下：
阳性对照品为含有灭活的E-16S(含有鲍曼不动杆菌bfs基因片段的工程菌)、E-toxR(含有toxR基因片段的工程菌)、E-ITS(含有ITS基因片段的工程菌)、E-mot1(含有mot1基因片段的工程菌)、E-Se2313(含有嗜麦芽寡氧单胞菌16S基因片段的工程菌)、E-mip(含有mip基因片段的工程茵)、E-23S(含有23S基因片段的工程菌)、E-Cpn0308(含有Cpn0308基因片段的工程菌)菌混合液，菌浓度105CFU/mL。阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度105CFU/mL。
PCR反应程序为37℃ 2min，94℃ 2min，1循环；93℃ 15s，60℃ 60s，40循环。检测通道选择：16S、toxR、ITS、mot1、Se2313、mip、23S、Cpn0308基因选用荧光PCR仪上的FAM通道，适用机型为ABI StepOnePlus荧光PCR仪、ABI 7500荧光PCR仪。
仪器FAM通道CT栏显示Undet.表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品在FAM通道，检测结果报告为阳性；待检样品FAM通道CT显示在35～40之间且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。
本发明使用的试剂、反应体系、反应程序经过一系列实验优化后，具有很强的PCR扩增能力、更高的扩增效率。本试剂盒具有准确率高、特异性强、灵敏度高、检测速度快的优点。本方法用于体外定性检测人痰液样本中分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、枸橼酸菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌，临床医生可以根据不同的检测结果分别用药，对临床医生合理用药具有一定的指导作用。
实施例三
本发明实施例三提供了一种检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、第四引物探针混合液、第五引物探针混合液、第六引物探针混合液、第七引物探针混合液、第八引物探针混合液、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，第一引物探针混合液包括检测鲍曼不动杆菌bfs的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测鲍曼不动杆菌bfs的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；第二引物探针混合液包括检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；第三引物探针混合液包括检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；第四引物探针混合液包括检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；第五引物探针混合液检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；第六引物探针混合液检测枸橼酸茵基因特异性基因mip的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；第七引物探针混合液包括检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；第七引物探针混合液检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
其中，第一引物探针混合液由n×36μL鲍曼不动杆菌bfs PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第二引物探针混合液由n×36μL金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第三引物探针混合液由n×36μL检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第四引物探针混合液由n×36μL肺炎链球菌基因特异性基因mot1 PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第五引物探针混合液由n×36μL嗜麦芽寡养单胞茵基因特异性基因Se2313 PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第六引物探针混合液由n×36μL枸橼酸菌基因特异性基因mipPCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第七引物探针混合液由n×36μL阴沟肠杆菌基因特异性基因23S PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第八引物探针混合液由n×36μL流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308 PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成。
PCR反应酶系由Taq DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶组成，将5U/μLTaq酶和2U/μLUNG酶按体积比3∶1比例混合混合组成。
PCR扩增的条件为：37℃ 2min，94℃ 2min，1循环；93℃ 15s，60℃ 60秒，40循环。
所述阳性对照品为含有灭活的鲍曼不动杆菌bfs基因片段的工程菌、toxR基因片段的工程菌、ITS基因片段的工程菌、mot1基因片段的工程菌、嗜麦芽寡氧单胞菌16S基因片段的工程菌、mip基因片段的工程菌、23S基因片段的工程菌、Cpn0308基因片段的工程菌的混合液，菌浓度105CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度105CFU/mL。
实施例四
本实施例结合具体检测案例说明本发明的具体应用方式，首先收集人痰液和咽拭子样本，采用发明实施例三中提供的试剂盒进行检测，统计结果符合率。
收集临床样本，经细菌培养鉴定法确定为多重耐药菌感染，采用本方法进行检测，统计结果符合率。
1、样本核酸制备
(1)痰液：取痰液加入2倍体积的4％NaOH(自备)，摇匀，室温下放置30min液化，12,000rpm 5min。沉淀加无菌生理盐水1mL打匀，12,000rpm 5min；去尽上清，沉淀中直接加入50μL核酸抽提液，充分混匀，98℃ 10min(误差不超过1min)。12,000rpm 5min，取上清2μL做PCR反应。
(2)对照品：取阳性对照品、阴性对照品各50μL分别置于1.5mL(或0.5mL)离心管中(冻存试剂融化后振荡混匀10sec)，分别加入核酸抽提液100μL充分混匀，98℃ 10min，然后12,000rpm 5min，取上清4μL做PCR反应。
2、试剂配制
取n×36μL分枝杆菌(16S)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL金黄色葡萄球菌(toxR)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL肺炎克雷伯菌(ITS)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL肺炎链球菌(mot1)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL嗜麦芽寡氧单胞菌(Se2313)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL枸橼酸杆菌(mip)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL阴沟肠杆菌(23S)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热茵DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL流感嗜血杆菌(Cpn0308)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒。
3、加样
分别取上述混合液36μL置于PCR管中，然后将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品，盖好管盖，立即进行荧光PCR扩增反应。
4、PCR扩增
反应管置于荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：
37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15sec，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为40μL。
荧光通道检测选择：16S、toxR、ITS、mot1、Se2313、mip、23S、Cpn0308基因选用FAM通道。
5、结果判定
检测结果根据CT值进行判定，仪器FAM通道CT栏显示Undet，表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品在FAM通道CT值均≤35，检测结果报告为阳性；待检样品FAM通道CT显示在35～40之间且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。
6、检测结果
本方法与细菌培养鉴定与药敏试验结果一致。
以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物和探针，其特征在于，检测鲍曼不动杆菌bfs的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测鲍曼不动杆菌bfs的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
2.根据权利要求1所述的检测下呼吸道细菌特异性基因的引物和探针，其特征在于，16S、toxR、ITS、mot1、Se2313、mip、23S、Cpn0308基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为TAMRA。
3.一种检测下呼吸道细菌特异性基因的方法，其特征在于，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对鲍曼不动杆菌bfs、绿脓杆菌toxR、念珠菌ITS、曲霉菌mot1、表皮葡萄球菌se2313、军团菌mip、肺炎支原体23S、肺炎衣原体Cpn0308基因设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测鲍曼不动杆菌bfs的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测鲍曼不动杆菌bfs的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示；
分别针对鲍曼不动杆菌bfs、绿脓杆菌toxR、念珠菌ITS、曲霉菌mot1、表皮葡萄球菌se2313、军团菌mip、肺炎支原体23S、肺炎衣原体Cpn0308基因，配置反应混合液；
分别取所述混合液36μL置于PCR管中，并将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品，盖好管盖，进行荧光PCR扩增反应，并进行结果判定。
4.一种检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、第四引物探针混合液、第五引物探针混合液、第六引物探针混合液、第七引物探针混合液、第八引物探针混合液、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，第一引物探针混合液包括检测鲍曼不动杆菌bfs的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测鲍曼不动杆菌bfs的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；第二引物探针混合液包括检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；第三引物探针混合液包括检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；第四引物探针混合液包括检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因mot1的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；第五引物探针混合液检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；第六引物探针混合液检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因mip的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；第七引物探针混合液包括检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因23S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；第七引物探针混合液检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
5.根据权利要求4所述的检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，第一引物探针混合液由n×36μL鲍曼不动杆菌bfs PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第二引物探针混合液由n×36μL金黄色葡萄球菌基因特异性基因toxR PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第三引物探针混合液由n×36μL检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因ITS PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第四引物探针混合液由n×36μL肺炎链球菌基因特异性基因mot1 PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第五引物探针混合液由n×36μL嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Se2313 PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第六引物探针混合液由n×36μL枸橼酸菌基因特异性基因mip PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第七引物探针混合液由n×36μL阴沟肠杆菌基因特异性基因23S PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第八引物探针混合液由n×36μL流感嗜血杆菌基因特异性基因Cpn0308PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成。
6.根据权利要求4所述的检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，PCR反应酶系由Taq DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶组成，将5U/μL Taq酶和2U/μL UNG酶按体积比3∶1比例混合混合组成。
7.根据权利要求4所述的检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的条件为：37℃2min，94℃2min，1循环；93℃15s，60℃60秒，40循环。
8.根据权利要求4所述的检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有灭活的鲍曼不动杆菌bfs基因片段的工程菌、toxR基因片段的工程菌、ITS基因片段的工程菌、mot1基因片段的工程菌、嗜麦芽寡氧单胞菌16S基因片段的工程菌、mip基因片段的工程菌、23S基因片段的工程菌、Cpn0308基因片段的工程菌的混合液，菌浓度105CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度105CFU/mL。
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