CN117448471B - 一种用于检测目标基因的组合及其应用 - Google Patents

一种用于检测目标基因的组合及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117448471B
CN117448471B CN202311805997.3A CN202311805997A CN117448471B CN 117448471 B CN117448471 B CN 117448471B CN 202311805997 A CN202311805997 A CN 202311805997A CN 117448471 B CN117448471 B CN 117448471B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
probe
probes
primer
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311805997.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117448471A (zh
Inventor
张选
王雅琦
张华�
凌云峰
何静
董嘉
陈少威
王占营
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Precigenome Co ltd
Original Assignee
Suzhou Precigenome Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Precigenome Co ltd filed Critical Suzhou Precigenome Co ltd
Priority to CN202311805997.3A priority Critical patent/CN117448471B/zh
Publication of CN117448471A publication Critical patent/CN117448471A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117448471B publication Critical patent/CN117448471B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/21—Haemophilus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/22—Klebsiella
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/385—Pseudomonas aeruginosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/425—Serratia
    • C12R2001/43—Serratia marcescens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/44—Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/44—Staphylococcus
    • C12R2001/445—Staphylococcus aureus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/44—Staphylococcus
    • C12R2001/45—Staphylococcus epidermidis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida
    • C12R2001/725—Candida albicans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida
    • C12R2001/74—Candida tropicalis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及一种用于检测目标基因的组合及其应用。本申请公开了一种用于特异性检测P种目标基因的组合，其中所述组合包括用于对P种基因进行扩增的P对引物以及对P种基因进行杂交的P个探针，利用M种不同荧光基团的N种浓度分别去标记P个探针，P个探针中的每一个探针所携带的荧光基团的种类或者浓度存在不同；所述P种目标基因和所述荧光基团满足以下公式：2≤P≤(MN+M)‑X，M为大于等于2的正整数；N范围1‑3；X范围0‑19。

Description

一种用于检测目标基因的组合及其应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测目标基因的组合及其应用。
背景技术
针对细菌、真菌的传统检测方法，如培养、涂片镜检、抗原检测等普遍存在灵敏度低、漏检率高的问题。另外，培养法耗时久，如采用传统培养加药敏实验，平均约需要57.4小时的诊断时间，远远不能满足脓毒症患者早期诊断和治疗的需求。另外培养法检测率仅为10%左右，并且对于难培养或无法培养的病原体，难以进行准确检测。
基于血培养后进行PCR检测的方法(如BioFire的FilmArray®Blood culture test和Luminex的Verigene®Blood culture test)，具有良好的表现，并已被证明可以缩短优化抗生素方案的时间。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)也可用于血培法后细菌鉴定(如Biomerieux Bruker的Vitekms Biotyper)，对革兰氏阴性菌具有良好的的一致性(90%以上)，但对革兰氏阳性菌的一致性为80%。以上方法仍需要对病原体进行一段时间的培养(4小时以上)，无法在更短的时间提供检测结果，且这些方法依赖于阳性血培养后进行细菌鉴定，为一些不可培养的病原菌留下检测缺口。
无需事先进行血培养培养，通过荧光定量PCR技术直接检测血样中的病原体和耐药性标志物的方法(如Roche LightCycler®SeptiFast，SeeGene MagicPlex® SepsisTest，Abbott Iridica)已推出，但因为它们的灵敏度和特异性达不到临床级别的要求，无法获得广泛的推广使用。
涂片镜检法虽然耗时短，但是对病原体的鉴别依赖医生的经验判断，同时难以区分一些形态相似的微生物。抗原检测操作方便快速，但干扰因素多，假阳性和假阴性难以辨别。
数字PCR(dPCR)被称为继普通PCR、荧光PCR之后的第三代PCR技术，其原理是将一个PCR体系利用有限稀释的方法分割成多个更小的单元，使每个单元最多含有一个目标模板，并对PCR后的各分区以终点荧光的“有”或“无”作为判断标准，再利用泊松分布进行数据分析，从而对标本中的目标基因进行绝对定量。数字PCR以其操作简便、绝对定量、高灵敏度、高特异性等优势，广泛应用于体外诊断肿瘤稀有突变的定量检测、感染病原体的定量检测，食品安全管控中的食源性病原菌定量检测，海关检验检疫对进口农产品进行的转基因丰度测定等各方面。
数字PCR从提取样本核酸到读取检测结果仅需3-4小时，其高灵敏度、高特异性、绝对定量等特点，更能够对感染病原体做出准确鉴别、帮助临床医生及时进行早期诊断；同时，其绝对定量的特点有助于在治疗过程中进行精准的疗效监测，在优化用药种类和剂量等方面均有着极大的应用价值。可用于脓毒症的预防和诊断。其检测对象包括需要进行预防的脓毒症高危人群、有重点部位感染的患者、高度疑似脓毒症的患者、以及确诊脓毒症的各阶段患者等。
发明内容
本申请的目的在于提供特异性检测目标基因的PCR引物对、探针、微流控卡盒、试剂盒、检测体系和检测方法，所述PCR引物对、探针、微流控卡盒、试剂盒、检测体系和检测方法可用于任意PCR检测体系，包括但不限于常规PCR、RL-PCR、RNA-PCR、荧光定量PCR、数字PCR、PCR-酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)，巢式PCR-高分辨率熔解分析(nPCR-HRM)等，优选用于数字PCR。例如，本申请的目的在于提供特异性检测血流感染中多种病原体的PCR引物对、探针、微流控卡盒、试剂盒、检测体系和检测方法。本申请的目的在于提供特异性检测多种不同的耐药基因的PCR引物对、探针、微流控卡盒、试剂盒、检测体系和检测方法。
为达到以上目的，本申请采用如下技术方案：
本申请涉及一种用于特异性检测P种目标基因的组合，其中组合包括用于对P种基因进行扩增的P对引物以及对P种基因进行杂交的P个探针，利用M种不同荧光基团的N种浓度分别去标记P个探针，P个探针中的每一个探针所携带的荧光基团的种类或者浓度存在不同；P种目标基因和所述荧光基团满足以下公式：2≤P≤(MN+M)-X，M为大于等于2的正整数；N范围1-3；X范围0-19。
在一个具体的方式中，其中M为2、3、4、5、6、7或8，N为1、2或3，X为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
在一个具体的方式中，其中对于N种浓度是通过利用任意两种不同的荧光基团的比例来实现的，其中，任意两种不同的荧光基团A和B的比例范围为：A:B为1:(0.25~10)。
在一个具体的方式中，其中目标基因为引起血流感染的病原体基因或耐药基因。
在一个具体的方式中，其中病原体为选自以下的一种或多种病原体：脆弱拟杆菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、头状葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷氏菌、热带念珠菌、新型隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、和/或白色念珠菌、人类疱疹病毒1型、人类α疱疹病毒1型、水痘带状疱疹病毒、单核细胞增生李斯特菌、结核分枝杆菌、人巨细胞病毒、人疱疹病毒5型、人类疱疹病毒2型、人疱疹病毒6型、EB病毒、人类疱疹病毒4型、细小病毒B19、灵长目红细胞细小病毒1型、人类疱疹病毒7型、JC病毒、JC多瘤、人类多瘤病毒2型、伪狂犬病病毒、猪疱疹病毒1型、猪疱疹病毒1、脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌、布氏杆菌、羊布氏杆菌、羊布鲁氏菌、格特隐球菌、哥特隐球、烟曲霉、广州管圆线虫、猪带绦虫、刚地弓形虫、狒狒巴拉姆希阿米巴、腺病毒C亚群1型、腺病毒B亚群4型、人类乳腺腺病毒B、人多瘤病毒1型、梅克尔多元癌细胞病毒、人类多瘤病毒5、细环病毒、中间链球菌、梭杆菌、牙髓卟啉单胞菌、产酸克雷伯菌、猪链球菌、结肠弯曲菌、星座链球菌、变形杆菌、沙门氏菌、普氏菌、米根霉、毛霉、组织胞浆菌、罗伦隐球菌、浅白隐球菌、黄曲霉、梅毒密螺旋体、和恙虫病东方体；或者
耐药基因为选自以下的一种或多种耐药基因：mecA/C、MREJ (MRSA)、vanA/B、KPC、CTX-M、IMP、mcr-1、VIM、NDM、和OXA-48-like。
在一个具体的方式中，其中荧光基团选自FAM、HEX、ROX、CY5、CY5.5、JOE、TET、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、和/或Eclipse。
上述本申请的用于特异性检测P种目标基因的组合，其为数字PCR (dPCR)反应所用的组合。
本申请还涉及一种特异性检测目标基因的数字PCR反应预混液，其中数字PCR反应预混液包含上述本申请的用于特异性检测P种目标基因的组合。
在一个具体的方式中，其中数字PCR反应预混液还包括选自以下的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs、牛血清白蛋白、甘油、甜菜碱、NH4 +、和Mg2+离子。
本申请还涉及一种数字PCR微流控卡盒，其中数字PCR微流控卡盒包括上述本申请的一种特异性检测目标基因的数字PCR反应预混液。
在一个具体的方式中，其中微流控卡盒包括至少一个孔或至少两个孔。
本申请还涉及一种用于检测目标基因的试剂盒，其中试剂盒包括上述本申请的一种特异性检测目标基因的数字PCR反应预混液。
在一个具体的方式中，其述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品、和/或微滴生成油。
在一个具体的方式中，其中试剂盒还包括上述本申请的数字PCR微流控卡盒。
本申请还涉及一种以非疾病诊断为目的的检测目标基因的方法，方法包括以下步骤：
(1)释放待测样本的核酸；
(2)制备数字PCR扩增混合液，其含有步骤(1)提供的待检测样本的核酸、上述本申请的用于特异性检测P种目标基因的组合和/或上述本申请的特异性检测目标基因的数字PCR反应预混液和蒸馏水；
(3)在数字PCR微流控卡盒内制备微滴，并进行PCR扩增反应；
(4)使用数字PCR微流控卡盒读取仪进行微滴PCR扩增反应后的荧光信号读取。
应理解，在本申请范围内，本申请的上述各技术特征和下文中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅不再累述。
本申请取得的有益效果在于提供检测多种目标基因的引物探针组，其中将本申请探针序列的5’端标记有不同颜色和不同浓度的荧光基团，并且通过数字PCR高效扩增各个目标基因的靶序列，实现对每一种待检测目标基因的绝对定量，直接给出反应体系中每种目标基因的每微升拷贝数(CFU/微升)。此外，本申请还提供了应用本申请方法的引物和探针组进行以非疾病诊断为目的的检测目标基因的方法。例如，利用本申请的组合可以检测血流感染中多种病原体，本申请的方法的灵敏度和特异性分别为92.88%和100%，超过现有技术；而且最低检测限为500 cps/ml，远低于现有qPCR技术直接检测血流感染样本的最低检测限。
特别地，1)采用数字PCR检测试剂盒对2-10 mL人外周全血中的病原体微生物核酸进行直接检测，无需7-8h的血培养增菌步骤；2)采用数字PCR引物探针组荧光混色编码技术，实现单孔检测11-300种病原体；3)检测靶标包括但不限于：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒、酵母和耐药基因；4)检测试剂盒含有内参基因，能防止因样本提取质量不足，或PCR扩增反应失败造成的假阴性。
在一个具体实施方式中，检测所涉及的样本类型包括全血、血清、血浆、咽拭子、痰液、尿液、粪便、脑脊液、体液或腹水。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍。
图1A-图1B为1孔中同时进行10重数字PCR扩增检测结果示意图。数字1-10为待测的10种病原体，当血流感染样本中同时存在多重感染时，会在双重，三重及四重位置出现相应阳性液滴。
图2A-图2F为实施例一中利用本申请的引物探针组在2孔中同时对21种病原体加1个内参基因进行检测的结果。图2A为孔1阳性对照FAM&HEX二维图；图2B为孔1阳性对照ROX&Cy5二维图；图2C为孔1阳性对照Cy5.5一维图；图2D为孔2阳性对照FAM&HEX二维图；图2E为孔2阳性对照ROX&Cy5二维图；图2F为孔1阳性对照Cy5.5一维图。注：本设计中，由于Cy5.5荧光通道不与其它通道组成二维图，因此仅展示其一维图，横坐标为不展示的液滴序号，纵坐标为荧光强度。
图3A-图3F为通过调整不同颜色探针的比例，移动阳性液滴团二维图位置的示例，用来阐述不同颜色荧光混色编码实现超多重靶标检测的原理的示意图。图3A表示方框所指液滴团FAM:HEX=1:3，图3B表示方框所指液滴团FAM:HEX=1.8:3，图3C表示图3A和图3B的叠加图，可以比较液滴团的移动情况；图3D表示方框所指液滴团ROX:Cy5=4:1，图3E表示方框所指液滴团ROX:Cy5=5.6:1，图3F表示图3D和图3E的叠加图，可以比较液滴团的移动情况。
图4为利用本申请的试剂盒对21种菌液样本的检测限范围检测结果(图示为金黄色葡萄球菌作为示例)。
图5为特异性测试结果。21种病原体检测试剂盒与115种非目标菌反应，做了3孔重复，3孔均为产生任何阳性液滴团。证明21种病原体检测试剂盒与115种非目标菌无非特异性交叉反应。
图6A-图6C为利用本申请的试剂盒对1例真实病原体阳性样本的检测结果。
图7为利用本申请的试剂盒检测患者痰液样本中表皮葡萄球菌的结果。
图8为利用本申请的试剂盒检测患者脑脊液样本的结果。
图9A-图9D为利用本申请的试剂盒检测患者痰液样本中鲍曼不动杆菌、嗜麦芽假单胞菌、阴沟肠杆菌、和白色念珠菌的结果。
图10A-图10D为利用本申请的试剂盒检测患者咽拭子的结果；图10E-图10H为利用本申请的试剂盒检测患者肛门拭子样本的结果。
图11为利用本申请的试剂盒检测患者尿液样本的结果。
具体实施方式
下面对本申请的具体实施方式进行详细描述，但应当理解，这些实例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下面实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件操作。
除非另有其他明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的成分或组成部分，而并未排除其他成分或其它组成部分。
数字PCR(digital PCR，dPCR)是一种新的绝对定量PCR技术，主要是对PCR反应物进行有限稀释，随后在不同的反应腔室里进行PCR扩增，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度的技术。多重数字PCR反应体系中由于存在多条引物和探针，因此对检测体系中引物探针组合的要求很高。
到目前为止，还没有关于用数字PCR方法高效检测多种混合核酸样品的多重PCR技术的报道。
在一些实施方式中，对P种基因进行扩增的P对引物以及对P种基因进行杂交的P个探针，以及利用M种不同荧光基团的N种浓度分别去标记P个探针，P个探针中的每一个探针所携带的荧光基团的种类或者浓度存在不同，其中P种目标基因和所述荧光基团满足以下公式：2≤P≤(MN+M)-X，M为大于等于2的正整数；N范围1-3；X范围0-19。
优选地，M为2、3、4、5、6、7、8中的任何数值；更优选地，M为2或3。
N例如为1、2或3。
X例如为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19。优选地，X的范围为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。更优选地，X的范围为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
其中，任意两种荧光基团A和B的比例范围为1:(0.25~10)，例如1:0.25、1：0.33、1:0.75、1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.2、1:2.4、1:2.6、1:2.8、1:3、1:3.2、1:3.4、1:3.6、1:3.8、1:4、1:4.2、1:4.4、1:4.6、1:4.8、1:5、1:5.2、1:5.4、1:5.6、1:5.8、1:6、1:6.2、1:6.4、1:6.6、1:6.8、1:7、1:7.2、1:7.4、1:7.6、1:7.8、1:8、1:8.2、1:8.4、1:8.6、1:8.8、1:9、1:9.2、1:9.4、1:9.6、1:9.8、1:10等；
优选地，任意两种荧光基团A和B的比例范围为1:0.25、1:0.33、1:0.75、1:1、1:2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.2、1:2.4、1:2.6、1:2.8、1:3、1:3.2、1:3.4、1:3.6、1:3.8、1:4、1:4.2、1:4.4、1:4.6、1:4.8、1:5、1:5.2、1:5.4、1:5.6、1:5.8、1:6；
在本申请中，A和B表示任意的荧光基团，例如A可以表示FAM、VIC、ROX、Cy5、Cy5.5和/或HEX中的任意一种，B表示与A不同的荧光基团，也可以是FAM、VIC、ROX、Cy5、Cy5.5和/或HEX中的任意一种。
更优选地，2种荧光基团的比例范围为1:0.33、1:0.75、1:1、1:2、1:4。
在本申请的一个实施方式中，当M为4，N为2，X为8时，所鉴定得到的病原体P为12。
在本申请的一个实施方式中，当M为5，N为2，X为8时，所鉴定得到的病原体P为22。
在本申请的另一个实施方式中，当M为6，N为2，X为8时，所鉴定得到的病原体P为34。
在一个具体的方式中，利用M种不同荧光基团的N种浓度分别去标记P个探针，P个探针中的每一个探针所携带的荧光基团的种类或者浓度存在不同是指P个探针中的每一个探针所携带的荧光基团的种类不同，或者P个探针中的每一个探针所携带的荧光基团的浓度不同，或者P个探针中的每一个探针所携带的荧光基团的种类或者浓度均不同。本领域技术人员可以理解，在本申请的核心在于需要利用不同的荧光基团的种类或荧光强度来区分每一种探针，只要能够将它们进行区分并能够通过检测手段进行检测即可。
在一个具体的方式中，在第一种探针上以1:0.33的比例标记A和B两种荧光基团，在第二种探针上以1:0.75的比例标记A和B两种荧光基团，在第三种探针上以1:1的比例标记A和B两种荧光基团，在第四种探针上以1:2的比例标记A和B两种荧光基团，在第五种探针上以1:4的比例标记A和B两种荧光基团。通过调整A和B两种荧光基团的比例，实现不同病原体的检测。
例如，如本申请的实施例二所示，通过调整荧光探针FAM和HEX的比例和荧光探针ROX和Cy5的比例，可以实现检测不同位置处的阳性液滴团。将FAM探针和HEX探针的比例由1:3调整到1.8:3，以及将ROX和Cy5探针的比例由4:1调整到5.6:1，均可实现不同位置阳性液滴团的鉴定。
在一些实施方式中，目的基因可以是任何类型的基因，包括但不限于动物基因、植物基因和/或微生物基因。
优选地，所述微生物基因包括病原体微生物基因。所述病原体微生物包括细菌、真菌、病毒、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)等。
在一些实施方式中，目的基因为引起血流感染的病原体的基因。
在一些实施方式中，目的基因为多种不同的耐药基因。
本申请的组合由于能够有效控制多重探针的数量、利用多种探针的多种不同的浓度来特异性和高效的检测引起血流感染的病原体的基因。
在本申请的一个实施方式中，应用上述引物探针组，通过数字PCR实现1孔中5色荧光同时检测11种病原体，2孔5色荧光同时检测21种病原体和内参，检测范围覆盖临床血流感染中最常见病原体。1孔7色同时检测16种靶标，采用3种荧光混色编码，实现单孔检测超过30重靶标的效果。
在一些实施方式中，本申请通过阴性团、单阳性团、双阳性团、多样性团的相对位置关系来鉴定多种目标基因。其中阴性团、单阳性团、双阳性团、多样性团的定义与划分确定如下：各液滴团在二维图中的位置由两个因素决定：①液滴团中荧光的种类及其组合；②液滴团中荧光的强度。(a)阴性团：不含有任何引物探针可检测的靶DNA的液滴组成的液滴群(团)，即阴性液滴团，在此液滴团中引物探针未发生扩增反应，不产生阳性的强荧光信号，仅发出本底信号强度(其各荧光通道检测到的强度均不为0)，因此该团通常为荧光强度最弱的团。多重PCR阳性对照所产生的二维图中(如图1A-图1B)，阴性团在二维图的位置通常在最左下角。除此之外，另一种确定阴性团位置的方法是，通过阴性对照反应所产生的唯一一团液滴团(即阴性团)来标定其位置；(b)单阳团：在此液滴团中，仅包含单种靶标DNA，因此只能触发其对应的引物探针发生反应，通过控制探针上标记的荧光素种类以及探针浓度，可使该阳性团处于预期的二维图的位置上，即符合预期的(X，Y)坐标值。图1A-图1B中，5个单阳团与阴性团的距离，相对于其它团(指双阳团和多阳团)来看，是距离最短的。每个单阳团由于其对应的探针标记的荧光素种类(及其组合)、浓度不同，因此赋予每个团的(X，Y)值均不同，但特定种类DNA引发的单阳团的位置是固定的；(c)双阳团：含有两个指定靶DNA反应后的液滴组成的团。在这些液滴中，两个靶DNA会各自触发其对应的引物探针发生反应，激活对应的荧光素发出预期的强度，因此该液滴团的荧光情况，实际上是包含本底荧光(即阴性团强度)下，两种靶DNA产生荧光的叠加。如果从阴性团为起点，靶1单阳团为终点，画出一个指向靶1单阳团的矢量，同样再画出阴性团到靶2的矢量箭头，运用矢量合成的“平行四边形法则”或“三角形法则”，将矢量1和2加和，即可获知双阳团的坐标。若靶1的单阳团坐标为(X1，Y1)，靶2的单阳团坐标为(X2，Y2)，阴性团为(X0，Y0)，那么含有靶1、2的双阳团的坐标为((X1-X0)+(X2-X0)+X0)，((Y1-Y0)+(Y2-Y0)+Y0))，即(X1+X2-X0，Y1+Y2-Y0)。因此，在一个二维图内，对于任意两个靶DNA，其阴性团、两个单阳团、对应的双阳团，一定处于平行四边形的四个顶点上；(d)三阳团和多阳团：含有三个或以上指定靶DNA反应后的液滴组成的液滴团。这些团的坐标同样符合矢量合成原则。例如含有靶1，2，3的三阳团，其坐标为(X1+X2+X3-2X0，Y1+Y2+Y3-2Y0)。多(n)阳团的坐标为(X1+X2+……Xn-(n-1)X0，Y1+Y2+……Yn-(n-1)Y0)。
如上所述，本申请通过设计使用的不同的荧光报告基因的个数，控制不同荧光报告基因标记时的浓度比例，即N种浓度的分配方式能够实现阴性团、单阳性团、双阳性团、多样性团的合理配置，从而可以有效地同时实现多种目标基因的快速检测。
本申请的引物和探针可应用于检测目标基因的任意PCR检测体系，包括但不限于常规PCR、RL-PCR、RNA-PCR、荧光定量PCR、数字PCR、PCR-酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)，巢式PCR-高分辨率熔解分析(nPCR-HRM)等。优选将本申请涉及的引物和探针用于荧光定量PCR或数字PCR。最优选将本申请确定的引物和探针用于数字PCR。
本申请中的数字PCR反应预混液含有引物、探针、酶(热启动Taq酶和/或UDG酶)、dNTP、甘油、甜菜碱、NH4 +、Mg2+、牛血清蛋白等。
本申请中的数字PCR扩增混合液与数字PCR反应预混液相比，多了扩增模板(如样本模板、阳性对照或阴性对照)和蒸馏水。
在一些实施方式中，本申请提供了检测目标基因的数字PCR反应预混液，PCR反应预混液包含上述的引物对、上述任意引物对和探针的组合、或上述引物对和任意探针的组合。
在一个具体的实施方式中，本申请以脆弱拟杆菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、头状葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、热带念珠菌、新型隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌这21种病原体的特定核苷酸序列为目标，通过多序列对比与分析，设计了可用于检测上述病原体的多重数字PCR引物和探针，通过对探针的使用浓度不同实现1孔检测多达11-12重数字PCR。同时，还设计了内标引物、内标探针，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果。
为提高筛查血流感染病原体的效率，一方面，本申请提供了采用PCR方法高效筛查血流感染病原体的方法，其中针对脆弱拟杆菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:1所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:2所示；针对表皮葡萄球菌的上游引物的一个实例如SEQID NO:4所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:5所示；针对粪肠球菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:7所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:8所示；针对肺炎链球菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:10所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:11所示；针对鲍曼不动杆菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:13所示，下游引物的一个实例如SEQ IDNO:14所示；针对阴沟肠杆菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:16所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:17所示；针对屎肠球菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:19所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:20所示；针对金黄色葡萄球菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:22所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:23所示；针对肺炎克雷伯菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:25所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:26所示；针对铜绿假单胞菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:28所示，下游引物的一个实例如SEQ IDNO:29所示；针对大肠杆菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:31所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:32所示；针对头状葡萄球菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:34所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:35所示；针对嗜麦芽窄食单胞菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:37所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:38所示；针对流感嗜血杆菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:40所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:41所示；针对粘质沙雷氏菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:43所示，下游引物的一个实例如SEQ IDNO:44所示；针对热带念珠菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:46所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:47所示；针对克柔念珠菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:49所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:50所示；针对近平滑念珠菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:52所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:53所示；针对光滑念珠菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:55所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:56所示；针对白色念珠菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:58所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:59所示；针对新型隐球菌的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:61所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:62所示；针对内参的上游引物的一个实例如SEQ ID NO:64所示，下游引物的一个实例如SEQ ID NO:65所示。
另一方面，本申请提供了可筛查脆弱拟杆菌的探针，所述探针的一个实例如SEQID NO:3所示：5’-CAGTTGTCCAAGTGGCGACG-3’；可筛查表皮葡萄球菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:6所示：5’-TGTGTATCATTATGCCATGAGCTTG-3’；可筛查粪肠球菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:9所示：5’-GGCTTCATCCTAATCTTCAAGACAA-3’；可筛查肺炎链球菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:12所示：5’-TTAGAAAACGTGGGCAGGGAA-3’；可筛查鲍曼不动杆菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:15所示：5’-TCACAACCCGACAACGGTGAGCAA-3’；可筛查阴沟肠杆菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ IDNO:18所示：5’-AACCTTTGCCGACGTTGTCGGTCA-3’；可筛查屎肠球菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:21所示：5’-TTCATCCATTTTGGACTGATGCA-3’；可筛查金黄色葡萄球菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:24所示：5’-TGGCTGAGATGAACTGTTCAGACCC-3’；可筛查肺炎克雷伯菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:27所示：5’-CCGATTGAAAAACGCTCCGGGC-3’；可筛查铜绿假单胞菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ IDNO:30所示：5’-AACACAAACGCACTCGGAAAAATCG-3’；可筛查大肠杆菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:33所示：5’-GCCTGCAGCTTCCATACGCT-3’；可筛查头状葡萄球菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:36所示：5’-ACCTCTTGCGAATAGTTCAGTACTTTC-3’；可筛查嗜麦芽窄食单胞菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:39所示：5’-TCTTGCCTTCGTTCATCAGCTCGT-3’；可筛查流感嗜血杆菌的探针，所述探针的一个实例如SEQID NO:42所示：5’-CAAATATTGAAATTGGGCTTTGACG-3’；可筛查粘质沙雷氏菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:45所示：5’-GCGCGCTGAACTACACCACT-3’；可筛查热带念珠菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:48所示：5’-GGATCATACGTTCCATTTGCTTTA-3’；可筛查克柔念珠菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:51所示：5’-AGCATCTGGCCCTGGCTATAACAC-3’；可筛查近平滑念珠菌的探针，所述探针的一个实例如SEQID NO:54所示：5’-TAACGTATCTGCAGACGTGGCTGC-3’；可筛查光滑念珠菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:57所示：5’-CTGCCGCAAGTCATGGGTTCTTG-3’；可筛查白色念珠菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:60所示：5’-AACAAACTTGCTTTGGCGGTGGG-3’；可筛查新型隐球菌的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:63所示：5’-CCTGTCAGCCCGGCGTAATAAGTT-3’；内参(人)的探针，所述探针的一个实例如SEQ ID NO:66所示：5’-TGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACT-3’。
在一方面，本申请提供了可同时筛查21种病原体的引物和探针的组合，所述引物和探针的组合包括如下序列中的任一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQID NO:64、SEQ ID NO:65、和SEQ ID NO:66。
在一些实施方式中，本申请使用的探针序列的5’端标记有荧光基团，本申请使用的探针序列的3’端标记有荧光淬灭基团。当上述探针位于同一反应体系时，其中筛选不同种类血流感染病原体的荧光基团光谱范围不同。本申请使用的探针序列的荧光基团可以是本领域常用的任何荧光基团，包括但不限于FAM、VIC、ROX、Cy5、和/或HEX；本申请使用的探针序列的荧光淬灭基团可以是本领域常用的任何荧光淬灭基团，包括但不限于BHQ1、BHQ2、BHQ3、和/或Eclipse。
另一方面，本申请使用的各探针及其5’端标记的荧光报告基团和3’端标记的荧光淬灭基团如下：筛选脆弱拟杆菌的探针如SEQ ID NO:3所示，其5’端荧光标记为FAM，3’端荧光标记为BHQ1，即5’-FAM-CAGTTGTCCAAGTGGCGACG-3’-BHQ1；筛选表皮葡萄球菌的探针如SEQ ID NO:6所示，其5’端荧光标记为HEX，3’端荧光标记为BHQ1，即5’-HEX-TGTGTATCATTATGCCATGAGCTTG-3’-BHQ1；筛选粪肠球菌的探针如SEQ ID NO:9所示，其5’端荧光标记为ROX，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-ROX-GGCTTCATCCTAATCTTCAAGACAA-3’-BHQ2；筛选肺炎链球菌的探针如SEQ ID NO:12所示，其5’端荧光标记为Cy5，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-Cy5-TTAGAAAACGTGGGCAGGGAA-3’-BHQ2；筛选鲍曼不动杆菌的探针如SEQ IDNO:15所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1/BHQ2，即5’-FAM-TCACAACCCGACAACGGTGAGCAA-3’-BHQ1、5’-HEX-TCACAACCCGACAACGGTGAGCAA-3’-BHQ2；筛选阴沟肠杆菌的探针如SEQ ID NO:18所示，其5’端荧光标记为HEX，3’端荧光标记为BHQ1，即5’-HEX-AACCTTTGCCGACGTTGTCGGTCA-3’-BHQ1；筛选屎肠球菌的探针如SEQ ID NO:21所示，其5’端荧光标记为ROX，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-ROX-TTCATCCATTTTGGACTGATGCA-3’-BHQ2；筛选金黄色葡萄球菌的探针如SEQ ID NO:24所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-ROX-TGGCTGAGATGAACTGTTCAGACCC-3’-BHQ2、5’-Cy5-TGGCTGAGATGAACTGTTCAGACCC-3’-BHQ2；筛选肺炎克雷伯菌的探针如SEQ ID NO:27所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-ROX-CCGATTGAAAAACGCTCCGGGC-3’-BHQ2、5’-Cy5-CCGATTGAAAAACGCTCCGGGC-3’-BHQ2；筛选铜绿假单胞菌的探针如SEQ ID NO:30所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-ROX-AACACAAACGCACTCGGAAAAATCG-3’-BHQ2、5’-Cy5-AACACAAACGCACTCGGAAAAATCG-3’-BHQ2；筛选大肠杆菌的探针如SEQ ID NO:33所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1，即5’-FAM-GCCTGCAGCTTCCATACGCT-3’-BHQ1、5’-HEX-GCCTGCAGCTTCCATACGCT-3’-BHQ1；筛选头状葡萄球菌的探针如SEQ ID NO:36所示，其5’端荧光标记为FAM，3’端荧光标记为BHQ1，即5’-FAM-ACCTCTTGCGAATAGTTCAGTACTTTC-3’-BHQ1；筛选嗜麦芽窄食单胞菌的探针如SEQ ID NO:39所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-ROX-TCTTGCCTTCGTTCATCAGCTCGT-3’-BHQ2、5’-Cy5-TCTTGCCTTCGTTCATCAGCTCGT-3’-BHQ2；筛选流感嗜血杆菌的探针如SEQ ID NO:42所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-ROX-CAAATATTGAAATTGGGCTTTGACG-3’-BHQ2、5’-Cy5-CAAATATTGAAATTGGGCTTTGACG-3’-BHQ2；筛选粘质沙雷氏菌的探针如SEQ ID NO:45所示，其5’端荧光标记为Cy5.5，3’端荧光标记为BHQ3，即5’-Cy5.5-GCGCGCTGAACTACACCACT-3’-BHQ3；筛选热带念珠菌的探针如SEQ ID NO:48所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1，即5’-FAM-GGATCATACGTTCCATTTGCTTTA-3’-BHQ1、5’-HEX-GGATCATACGTTCCATTTGCTTTA-3’-BHQ1；筛选克柔念珠菌的探针如SEQ ID NO:51所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1，即5’-FAM-AGCATCTGGCCCTGGCTATAACAC-3’-BHQ1、5’-HEX-AGCATCTGGCCCTGGCTATAACAC-3’-BHQ1；筛选近平滑念珠菌的探针如SEQ IDNO:54所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1，即5’-FAM-TAACGTATCTGCAGACGTGGCTGC-3’-BHQ1、5’-HEX-TAACGTATCTGCAGACGTGGCTGC-3’-BHQ1；筛选光滑念珠菌的探针如SEQ ID NO:57所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1，即5’-FAM-CTGCCGCAAGTCATGGGTTCTTG-3’-BHQ1、5’-HEX-CTGCCGCAAGTCATGGGTTCTTG-3’-BHQ1；筛选白色念珠菌的探针如SEQ ID NO:60所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-ROX-AACAAACTTGCTTTGGCGGTGGG-3’-BHQ2、5’-Cy5-AACAAACTTGCTTTGGCGGTGGG-3’-BHQ2；筛选新型隐球菌的探针如SEQ ID NO:63所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2，即5’-ROX-CCTGTCAGCCCGGCGTAATAAGTT-3’-BHQ2、5’-Cy5-CCTGTCAGCCCGGCGTAATAAGTT-3’-BHQ2；内参(人)的探针如SEQ ID NO:66所示，其5’端荧光标记为Cy5.5，3’端荧光标记为BHQ3，即5’-Cy5.5-TGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACT-3’-BHQ3。
在一些实施方式中，本申请提供的数字PCR反应预混液，除了上述引物对、或者上述任意引物对和探针的组合外，其还可以包括选自以下的任意一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs、牛血清白蛋白、甘油、甜菜碱、NH4 +和/或Mg2+离子。
本申请提供了用于检测目标基因的试剂盒，其包括如上涉及的引物对，或如上涉及的任意引物对和探针的组合、或上述引物对和任意探针的组合。本申请的试剂盒还可以包括选自以下的任意一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs、牛血清白蛋白、甘油、甜菜碱、NH4 +、和Mg2+离子。本申请的试剂盒还可以包括阳性对照、和/或阴性对照。
在一些实施方式中，本申请提供了以非疾病诊断为目的的检测目标基因的方法，所述方法包括步骤：
(1)处理待测样品；
待测样品2-10 mL，优选使用5-10ml、6-10ml、7-10ml、8-10ml、9-10ml，最优选使用10ml以提高检出率。使用800转离心10min取上清。分离后的待测样品可于-20℃±5℃保存3年。推荐使用商业化试剂盒提取待测样品中的DNA。DNA提取完毕后，建议立即进行检测，否则最好放置于-20℃以下保存，保存时间不超过3个月。
(2)按表1配制数字PCR扩增混合液，其含有步骤(1)提供的待检测样品.和下述的数字PCR反应预混液；数字PCR反应预混液中正向和反向引物的终浓度分别为50-900 nM，优选50-500 nM，200-500 nM，最优选450 nM；每种探针的终浓度分别为50-800 nM，优选50-500 nM，100-400 nM，最优选250 nM；Mg2+离子的终浓度为0.5-5 mM，优选1-4.5 mM，1.5-4mM，2-3.5 mM，最优选3mM；牛血清白蛋白的终浓度为0.01-1 wt%，优选使用0.02-0.5 wt%，0.03-0.1 wt%，0.04-0.08 wt%，最优选为0.05%；热启动Taq酶(可以为抗体修饰热启动Taq酶，化学修饰热启动Taq酶或适配体修饰热启动Taq酶)终浓度为0.5-10 U/反应，优选为1-5U/f反应，1.5-4 U/反应，2-3.5U/反应，最优为2.5 U/反应；dNTP终浓度为20-300 µM，优选为50-250 µM，100-230µM，150-220µM，最优选为200µM。数字PCR反应预混液中还可以含有UNG酶，其终浓度为0.1-10 U/反应，0.5-5 U/反应，1-2.5 U/反应，1-2 U/反应，最优选1.5U/反应。数字PCR反应预混液的pH值为7-9，优选为pH7.4-8.5，优选为pH 7.8-8.2，最优选为pH 8.0。
本领域技术人员可以理解上述PCR扩增混合液列举的物质和浓度均是示意性的，基于实际体系，本领域技术人员可以进行选择。
表1 数字PCR扩增混合液
。
(3)制备微滴，进行PCR扩增反应；
第一步：制备微滴。在微流控卡盒顶部的方形加油孔内先加入50-100μl液滴生成油，优选70-100μl，最优选为75μl。
第二步：在微流控卡盒顶部的圆形加样孔内加入13-25μl数字PCR扩增混合液(含有扩增的核酸模板，引物探针等)，优选15-25μl，最优选为20μl；
第三步：在数字PCR扩增混合液顶部用移液器加入5-10μl密封油，最优选为10μl。
第四步：将微流控卡盒的顶部加样孔和加油孔，底部的废液孔分别用2张塑料密封盖盖住；将所述装有PCR扩增混合液的微流控卡盒置于PCR扩增仪上，优选SG-2000PCR扩增仪。可以按照表2推荐的扩增程序进行扩增反应：
表2 PCR扩增反应程序的一种示例
。
(4)信号收集
在生物芯片阅读仪(例如Dscanner4-1000，注册证号：苏械注准 20202220818)上选择MUT模式，荧光通道设置FAM、HEX、ROX和Cy5，将高通量数字PCR卡盒(例如微流控卡盒)从PCR扩增仪，优选SG-2000PCR扩增仪(注册证号：苏械注准20202220887)上取出，平稳转移置于生物芯片阅读仪上进行信号收集。
(5)结果分析
点击生物芯片阅读仪上“Analyze”分析实验数据。先查看“Accepted Droplets”≥10000即可进行后续分析。点击“2D Amplitude”查看通道1，通道2，通道3和通道4的2D散点图。根据四组阳性对照，点击2D图来划分出各个区域，每个附图中下方颜色最深的黑色点代表没有扩增模板的液滴，绿色点代表含有FAM标记探针的液滴，蓝色点代表含有HEX标记探针的液滴，橙色点代表含有ROX标记探针的液滴，紫红色点代表含有CY5探针标记的液滴，红色点代表同时含有两组探针标记的液滴。
本申请提供的引物、探针、含有引物探针的数字PCR反应预混液、试剂盒、微流控卡盒均可用于制备检测血流感染中多种病原体的定量检测试剂盒，也可单独或与其它试剂一起用于血流感染中多种病原体的检测中，其中对于血浆样品的处理步骤为：采取外周血样品2-10 mL，优选使用5-10ml、6-10ml、7-10ml、8-10ml、9-10ml，最优选使用10ml以提高检出率。优选使用EDTA抗凝剂，不可使用肝素抗凝剂。在血液离体后2小时内分离血浆，一般不宜超过4小时；血浆体积为0.5-4mL，优选1-4ml、2-4ml、3-4ml、最优选4ml。使用800转离心10min取上清。若不能及时分离血浆，可采用真空采血管室温存储，或使用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管(Streck管)，保存时间不超过3天。分离后的血浆可于-20℃±5℃保存3年。推荐使用商业化试剂盒提取血浆样品中微生物DNA。DNA提取完毕后，建议立即进行检测，否则最好放置于-20℃以下保存，保存时间不超过3个月。
在一些实施方式中，检测所涉及的样本类型还包括全血(也称为血液)、血浆、血清、咽拭子、痰液、尿液、粪便、脑脊液、体液或腹水。
全血检查就是抽取病人的外周血，对全血中的各种血细胞、各种血浆的成分作为整体进行检查。此外，根据需要也可以将血液中的血浆或血清部分作为样本来进行检测。
咽拭子检测是一种医学检测方法，用医用棉签从人体的咽部蘸取少量分泌物，接种于特制培养皿中，然后放置在一个可以控制温度的设备内进行培养的过程。本申请中的咽拭子样品可以是本领域技术人员从临床中直接获取的样本，也可以是进行了一段时间培养后的咽拭子样本，取决于需需要检测的项目。
痰液是肺泡、支气管和气管的分泌物。健康人痰液量很少。正常情况下，支气管黏膜腺体和杯状细胞可以分泌少量黏液，使呼吸道黏膜保持湿润。病理情况下，呼吸道黏膜和肺泡受刺激后黏膜充血水肿，浆液渗出，黏液分泌增多。各种细胞(红细胞、白细胞、吞噬细胞等)、纤维蛋白等渗出物和黏液、吸入的灰尘、某些组织坏死物等混合形成痰液。本申请使用的痰液样本是本领域技术人员通常可以获得样本即可。
尿液和粪便样本也是本领域技术人员通过常规手段可以获得的样本。
脑脊液(Cerebro-Spinal Fluid，CSF)为无色透明的液体，充满在各脑室、蛛网膜下腔和脊髓中央管内。脑脊液由脑室中的脉络丛产生，与血浆和淋巴液的性质相似，略带粘性。脑脊液属于细胞外液。本申请使用的脑脊液样本是本领域技术人员通常可以获得样本即可。
在本申请中体液是指来源于血液、尿液、粪便、浆膜腔液、脑脊液、腹水等多种体液。
本申请中涉及的腹水是指人体腹腔内的液体，可以通过常规手段获取。
为方便起见，将本申请用到的引物和探针的序列总结于下述表格中：
表3 本申请针对21种病原体的引物和探针序列
；
表3续
；
表3续
；
表3续
；
表3续
；
表3续
；
表3续
。
表4 本申请中用到的探针荧光标记的一种示例
；
表4续
。
实施例
实施例一 血流感染中多种病原体的检测试剂盒
本申请开发了用于检测血流感染中21种病原体加1个内参基因的数字PCR法检测试剂盒。上述试剂盒中含有引物和探针混合液1、引物和探针混合液2、数字PCR预混液(数字PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、taq热启动酶混合液、甘油、甜菜碱)、阴性质控品和阳性质控品。
每一个样本需要进行2组检测，利用试剂盒中的引物探针混合液和数字PCR预混液对待测样品进行数字PCR液滴生成和PCR扩增，引物探针混合液体积为2μL，数字PCR预混液体积为10μL，DNA加样量为8μL，总反应体积为20μL。数字PCR扩增的反应体系如表5-6所示：
表5 组1多重数字反应体系
。
表6 组2多重数字反应体系
。
本申请的试剂盒的组分如表7所示。
表7 试剂盒的组成成分
。/>
本申请的试剂盒中设置了内部质控品系统，用于监测样本采集、提取过程，避免假阴性。本申请的试剂盒中设置了阴性质控品和阳性质控品，用于监测样本的数字PCR扩增和芯片阅读，及辅助最终结果的判读，具体步骤如下：
1)释放待测样本的核酸；
2)在微流控芯片的一孔中，以第1)步所得核酸为模板，加入11种病原体引物和荧光标记探针混合物(对应于组1)和数字PCR缓冲液；
3)在微流控芯片的另一孔中，以第1)步所得核酸为模板，加入另外10种病原体引物和荧光标记探针混合物(对应于组2)、内参引物和荧光标记探针混合液、数字PCR缓冲液；
4)在数字PCR扩增仪中进行数字PCR液滴生成和PCR扩增；
向高通量数字PCR芯片中的油孔中加入75μl的油相包裹试剂，试剂孔中加入20μl的扩增混合液，盖上密封盖，置于PCR扩增仪上进行液滴生成和PCR扩增。
按照以下推荐扩增程序进行扩增反应：
。
5)信号收集
以第4)步所得核酸为模板扩增结束后芯片为检测物，通过生物芯片阅读仪进行荧光的检测，通过对每个微滴中荧光的有无和强弱信息对结果进行判读。
结果判读：
结果如图2A-图2F所示，其中在图2A-图2F中，第一孔检测的11种菌，和第二孔检测的10种菌加1个内参的标记如表8所示。
表8
。
若在2维图中，除阴性液滴外，在阳性液滴区域内有阳性液滴，且液滴数大于阈值，则判定该位置对应的菌株检测结果为阳性，检测结果如下表9所示:
表9
。
实施例二 调整探针的比例对不同病原体的检测
图3A-3C显示了如何通过调整FAM和HEX探针的比例，来达到调整热带珠菌阳性液滴团位置的实例。图3A中热带念珠菌阳性液滴团FAM和HEX探针的比例为1:3，所示位置为方框所示。将FAM和HEX探针的比例调整到1.8:3，即增加了FAM探针的浓度，可以看到热带念珠菌移动到了3B中方框所指的位置。图3C展示了把FAM:HEX探针浓度为1:3的热带念珠菌阳性团和FAM:HEX探针浓度为1.8:3的热带念珠菌阳性团叠加，可以清楚的看到通过调整FAM、HEX两种探针的浓度比例可以达到移动阳性液滴团在数字PCR检测2维图中的位置。图3D-图3F显示了如何通过调整ROX和Cy5探针的比例，来达到调整流感嗜血杆菌阳性液滴团位置的实例。图3D显示了流感嗜血杆菌阳性液滴图ROX:Cy5探针比例为4:1，所示位置为方框所示。将ROX:Cy5探针比例调整到5.6:1，即增加了ROX探针的浓度，可以看出在图3E中，流感嗜血杆菌阳性液滴团移动到了新的位置，如方框所示。图3F中将2种不同ROX:Cy5比例的阳性液滴团叠加，可以说明通过调整ROX:Cy5的比例，可以达到移动流感嗜血杆菌阳性液滴团在数字PCR检测2维图中的位置的效果。
实施例三 检测限范围测试
本申请利用脆弱拟杆菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、头状葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、热带念珠菌、新型隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌菌液溶液进行稀释，对本申请的引物和探针组合的检测限范围进行了测试。
(1)菌液稀释
将上述菌液分别进行倍比稀释，稀释为5个浓度的样本(S9: 5×106 、S10：5×105、S11:5×104、S12: 5×103、S13 5×102，S14: 5.0，S15: 0.5，S16: 0拷贝/毫升)，使检测浓度依次分别为4×104、4×103、4×102、4×101、4、0.4、和0拷贝/反应。拷贝/反应的计算公式为：拷贝/毫升x8微升。每个数字PCR反应上样量体积为8微升。
(2)数字PCR液滴形成和扩增
参照实施例一所述反应体系和反应程序进行数字PCR液滴形成和数字PCR扩增。
(3)信号收集
将数字PCR芯片从数字PCR扩增仪中取出，平稳转移置于生物芯片阅读仪上进行信号收集。
(4)结果判读和分析：
根据各个菌株阳性质控品的阴性液滴和阳性液滴之间的中间位置划出阈值线。若阳性液滴数大于阈值，则判定该阳性液滴对应的菌株检测结果为阳性。软件给出阳性液滴对应的拷贝数。以稀释度为横轴，每个稀释度的测量值log为纵轴做线性回归图。
21种菌液样本梯度稀释后的线性范围检测结果如图4所示，由图4所示结果可知，利用本申请的检测试剂盒，从菌液倍比稀释结果计算，其最低检出限为4拷贝/反应。0拷贝/毫升的检测孔未检测出阳性液滴。证明了试剂盒的空白检测限为0拷贝/毫升。
实施例四 精密度测试
本申请利用含有脆弱拟杆菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、头状葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、人葡萄球菌、热带念珠菌、耶氏肺孢子菌、新型隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌的目的片段的质粒，对本申请的引物和探针组合的精密度进行了测试。
检测方法：选择高浓度的质粒混合物(21种靶标病原体的合成质粒混合物，每种病原体浓度约5×106拷贝/ml)，10000倍稀释至约5×102拷贝/ml配制成低浓度样本，按照实施例三操作流程，两个浓度样本连续测定5天，每天分别重复检测4次。计算结果log值的均值、标准差与变异系数CV。检测结果如下：
表10 细菌组CV%
。
表11 真菌组CV%
。
高浓度(5×106拷贝/ml级)CV值介于0.15%-0.43%，平均CV为0.275%
低浓度(5×102拷贝/ml级)CV值介于5.74%-10.89%，平均CV为8.87%。
实施例五 正确度测试
本申请利用脆弱拟杆菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、头状葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、热带念珠菌、新型隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌、内参基因的目的片段的质粒，对本申请的引物和探针组合的正确度进行了测试。
(1)质粒稀释
将上述质粒5×106拷贝/ml的高浓度标准品稀释12个浓度(2/5/10/20/50/100/200/500/1000/2000/5000/10000倍)，使检测浓度依次分别为2.5×106、1×106、5×105、2.5×105、1×105、5×104、2.5×104、1×104、5×103、2.5×103、1×103、5×102拷贝/反应。
(2)数字PCR液滴形成和扩增
参照实施例一所述反应体系和反应程序进行数字PCR液滴形成和数字PCR扩增。
(3)信号收集
将数字PCR芯片从数字PCR扩增仪中取出，平稳转移置于生物芯片阅读仪上进行信号收集。
结果判读和分析：
表12 细菌检测结果
。
表13 真菌检测结果
。
实施例六 特异性检测
本申请选择紫色杆菌、中间链球菌、支气管败血波氏杆菌、粘质沙雷氏菌、远缘链球菌、伊氏李斯特氏菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、咽峡炎链球菌、厌氧消化链球菌、血链球菌、星座链球菌星座亚种、小韦荣球菌、无乳链球菌、无害李斯特菌、纹带棒杆菌、温和气单胞菌、唾液链球菌、豚鼠气单胞菌、土生拉乌尔菌(土生克雷伯菌)、头状葡萄球菌头状亚种、停乳链球菌、藤黄微球菌、宋内氏志贺氏菌、松鼠葡萄球菌、斯氏李斯特氏菌、水生拉恩氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、嗜酸乳杆菌、嗜水气单胞菌、嗜沫凝聚杆菌、嗜肺军团菌亚种、施氏葡萄球菌施氏亚种、施氏假单孢菌、生癌肠杆菌、少动鞘氨醇单胞菌、乳酸奈瑟菌、肉葡萄球菌、日勾维多细菌源菌、犬链球菌、铅黄肠球菌、奇异变形杆菌、栖稻假单胞菌、普通拟杆菌、皮特不动杆菌、皮氏罗尔斯通氏菌、牛链球菌、啮蚀艾肯菌、酿脓链球菌、脑膜炎奈瑟菌、耐久肠球菌、木糖葡萄球菌、莫拉卡他莫拉菌、摩氏摩根菌、门多萨假单胞菌、盲肠肠球菌、马链球菌兽疫亚种、马红球菌、马尔尼菲篮状菌、麻疹孪生球菌、卵形拟杆菌、路邓葡萄球菌、鲁氏不动杆菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、痢疾志贺氏菌、类志贺邻单胞菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、口腔链球菌、抗辐射不动杆菌、科贝肠杆菌、金格杆菌、解没食子酸链球菌、假中间葡萄球菌、霍氏肠杆菌、缓症链球菌、海氏肠球菌、格氏李斯特氏菌、戈登氏链球菌、干燥奈瑟菌、副血链球菌、艰难梭菌、副百日咳博德特氏菌、腐生葡萄球菌、福氏志贺氏菌、弗氏耶尔森菌、蜂房哈夫尼菌、非共生发光杆菌、耳葡萄球菌、恶臭假单胞菌、多形拟杆菌、多噬伯克霍尔德氏菌、多杀性巴氏杆菌、狄氏副拟杆菌、地衣芽孢杆菌、单形拟杆菌、单核增生李斯特菌、痤疮丙酸杆菌、创伤弧菌、成团泛菌、肠炎沙门氏菌、肠结肠炎耶尔森亚种、产酸克雷伯氏菌、产碱假单胞菌、变异链球菌、贝氏动杆菌、贝雷兹不动杆菌、鲍氏志贺氏菌、伴放线放线杆菌、阪崎克罗诺杆菌、百日咳博德特氏菌、鸡肠球菌、产气荚膜梭菌、华氏葡萄球和副流感嗜血杆菌等115株菌株进行交叉反应，这些菌株是与检测靶标病原体核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的病原体菌株。
(1)释放待测菌株的核酸
(2)将用上述菌株提取的核酸进行混合
(3)数字PCR液滴形成和扩增
参照实施例一所述反应体系和反应程序进行数字PCR液滴形成和数字PCR扩增。
(4)信号收集
将数字PCR芯片从数字PCR扩增仪中取出、平稳转移置于生物芯片阅读仪上进行信号收集。
(5)结果判读和分析：
根据各个菌株阳性质控品的阴性液滴和阳性液滴之间的中间位置划出阈值线。若阳性液滴数大于阈值，则判定该阳性液滴对应的菌株检测结果为阳性。软件给出阳性液滴对应的拷贝数。以稀释度为横轴，每个稀释度的测量值log为纵轴做线性回归图。
115个菌株交叉反应的检测结果如图5所示，未曾检测到这115株菌株与试剂盒中的21株病原体引物探针发生交叉反应。图5仅含有阴性液滴团，未检测到和115个菌株交叉反应的任何阳性液滴团。
实施例七 检测试剂盒对1例真实病原体阳性样本的检测实例
参照实施例一的方法对临床样本进行检测。图6A为临床样本检测结果2维图，图6B为阳性质控品的2维图。图6C为将临床样本2维图和阳性质控品2维图叠加比对，进行结果分析。通过叠加比对，可以看到临床样本的左下角的阴性液滴团和阳性质控品的阴性液滴团位置重合。临床样本2维图的阴性液滴团右上角的液滴团和阳性质控品中的肺炎克雷伯菌位置重合，即临床样本检出肺炎克雷伯菌。
实施例八 检测试剂盒对血流患者全血样本检测实例
对获自7例经血培养检测为阳性的染患者样本(确认血流感染)的全血样本进行采血，各采血1.8-2mL，经过核酸提取后，用数字PCR法对21种病原体检测试剂盒进行检测。将血培养的检测结果和利用数字PCR检测试剂盒结果对比，结果如表14所示。通过上述两种方法的盲测对比，可以看出数字PCR血流感染检测试剂盒和血培养检测一致性高。可以在5小时内用2 mL全血快速检测出患者血液中的病原体，避免了血培养需要40-60 ml (2-3套血培养瓶培养)，和数天培养时间的繁琐步骤，提供了一种快速有效的血流感染病原体检测方法。同时血培养因为灵敏度，培养基选择，菌种相互间竞争生长造成抑制，患者提前服用抗生素造成抑制等原因，仅检出1中病原体感染，数字PCR较血培养多检出的病原体显示数字PCR方法有更高的检测灵敏度。
表14 血培养检测与数字PCR检测试剂和盒检测结果比较
。
实施例九 检测试剂盒对感染患者其他样本检测实例
对获自6例有感染临床症状或疑似感染患者样本进行样本采集，样本类型包括尿液、腹水、脑脊液，采集体积3-5ml。痰液约1ml。咽拭子、肛门拭子为常规拭子保存在2ml保存液中。经过核酸提取后，利用实施例一的病原体检测试剂盒通过数字PCR法对21种病原体进行检测。将涂片镜检法的检测结果和利用数字PCR检测试剂盒结果对比，可以看出数字PCR血流感染检测试剂盒和涂片检测一致性高，并且可以准确分辨涂片无法判读的具体菌种类型。
如图7所示，数字PCR结果为表皮葡萄球菌阳性，该病人痰涂片观察有球菌感染，具体哪种球菌无法鉴别，数字PCR具体鉴别出球菌具体类型为表皮葡萄球菌。如图8所示，数字PCR结果和脑脊液涂片法结果都为阴性，2种检测方法结果一致。图9A-图9D表明，通过本申请的试剂盒可以检测患者痰液样本中的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽假单胞菌(属于杆菌一种)、阴沟肠杆菌、白色念珠菌；而痰涂片结果只检测出鲍曼不动杆菌或者杆菌。以上结果说明，涂片法仅根据菌染色后在显微镜下的形态确定有杆菌感染，但是无法准确分别是哪类杆菌感染，而数字PCR可准备鉴别感染的杆菌种类。图10A-图10H显示患者咽拭子和肛门拭子均检出白色念珠菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌阳性。患者肛门拭子检出了屎肠球菌阳性。如图11所示，尿培养显示该患者热带念珠菌感染。

Claims (14)

1. 一种用于特异性检测病原体的PCR引物和探针组合，所述引物和探针由两组引物和探针组成，第一组引物和探针为：特异性扩增头状葡萄球菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:34所示的正向引物、和如SEQ ID NO:35所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:36所示的探针；特异性扩增鲍曼不动杆菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:13所示的正向引物、和如SEQ ID NO:14所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:15所示的探针；特异性扩增热带念珠菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:46所示的正向引物、和如SEQ ID NO:47所示的反向引物，所述探针包含如SEQID NO:48所示的探针；特异性扩增克柔念珠菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQID NO:49所示的正向引物、和如SEQ ID NO:50所示的反向引物，所述探针包含如SEQ IDNO:51所示的探针；特异性扩增表皮葡萄球菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQID NO:4所示的正向引物、和如SEQ ID NO:5所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:6所示的探针；特异性扩增屎肠球菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:19所示的正向引物、和如SEQ ID NO:20所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:21所示的探针；特异性扩增新型隐球菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:61所示的正向引物、和如SEQ ID NO:62所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:63所示的探针；特异性扩增嗜麦芽窄食单胞菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:37所示的正向引物、和如SEQ ID NO:38所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:39所示的探针；特异性扩增肺炎克雷伯菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:25所示的正向引物、和如SEQ ID NO:26所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:27所示的探针；特异性扩增肺炎链球菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:10所示的正向引物、和如SEQ ID NO:11所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:12所示的探针；特异性扩增粘质沙雷氏菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:43所示的正向引物、和如SEQ ID NO:44所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:45所示的探针；
第二组引物和探针为：特异性扩增脆弱拟杆菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、和如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ IDNO:3所示的探针；特异性扩增粪肠球菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:7所示的正向引物、和如SEQ ID NO:8所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:9所示的探针；特异性扩增阴沟肠杆菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:16所示的正向引物、和如SEQ ID NO:17所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:18所示的探针；特异性扩增金黄色葡萄球菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:22所示的正向引物、和如SEQ ID NO:23所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:24所示的探针；特异性扩增铜绿假单胞菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:28所示的正向引物、和如SEQ ID NO:29所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:30所示的探针；特异性扩增大肠杆菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:31所示的正向引物、和如SEQ ID NO:32所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:33所示的探针；特异性扩增流感嗜血杆菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:40所示的正向引物、和如SEQ ID NO:41所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:42所示的探针；特异性扩增近平滑念珠菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:52所示的正向引物、和如SEQ ID NO:53所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:54所示的探针；特异性扩增光滑念珠菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:55所示的正向引物、和如SEQID NO:56所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:57所示的探针；特异性扩增白色念珠菌的PCR引物和探针组合，所述引物包含如SEQ ID NO:58所示的正向引物、和如SEQ IDNO:59所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:60所示的探针。
2.根据权利要求1所述的PCR引物和探针组合，所述探针序列的5’端标记有荧光报告基团，所述探针序列的3’端标记有荧光淬灭基团；当所述探针位于同一反应体系时，其中筛选不同种类病原体的荧光报告基团光谱范围不同。
3.根据权利要求2所述的PCR引物和探针组合，其中所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、Cy5和/或HEX；所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、和/或Eclipse。
4.根据权利要求3所述的PCR引物和探针组合，其中使用的各探针及其5’端标记的荧光报告基团和3’端标记的荧光淬灭基团如下：
筛选脆弱拟杆菌的探针如SEQ ID NO:3所示，其5’端荧光标记为FAM，3’端荧光标记为BHQ1；筛选表皮葡萄球菌的探针如SEQ ID NO:6所示，其5’端荧光标记为HEX，3’端荧光标记为BHQ1；筛选粪肠球菌的探针如SEQ ID NO:9所示，其5’端荧光标记为ROX，3’端荧光标记为BHQ2；筛选肺炎链球菌的探针如SEQ ID NO:12所示，其5’端荧光标记为Cy5，3’端荧光标记为BHQ2；筛选鲍曼不动杆菌的探针如SEQ ID NO:15所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1/BHQ2；筛选阴沟肠杆菌的探针如SEQ ID NO:18所示，其5’端荧光标记为HEX，3’端荧光标记为BHQ1；筛选屎肠球菌的探针如SEQ ID NO:21所示，其5’端荧光标记为ROX，3’端荧光标记为BHQ2；筛选金黄色葡萄球菌的探针如SEQ ID NO:24所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2；筛选肺炎克雷伯菌的探针如SEQ ID NO:27所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2；筛选铜绿假单胞菌的探针如SEQ ID NO:30所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2；筛选大肠杆菌的探针如SEQ IDNO:33所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1；筛选头状葡萄球菌的探针如SEQ ID NO:36所示，其5’端荧光标记为FAM，3’端荧光标记为BHQ1；筛选嗜麦芽窄食单胞菌的探针如SEQ ID NO:39所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2；筛选流感嗜血杆菌的探针如SEQ ID NO:42所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2；筛选粘质沙雷氏菌的探针如SEQ ID NO:45所示，其5’端荧光标记为Cy5.5，3’端荧光标记为BHQ3；筛选热带念珠菌的探针如SEQ ID NO:48所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1；筛选克柔念珠菌的探针如SEQ ID NO:51所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1；筛选近平滑念珠菌的探针如SEQ ID NO:54所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1；筛选光滑念珠菌的探针如SEQ ID NO:57所示，其5’端荧光标记为FAM/HEX，3’端荧光标记为BHQ1；筛选白色念珠菌的探针如SEQ ID NO:60所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2；筛选新型隐球菌的探针如SEQ ID NO:63所示，其5’端荧光标记为ROX/Cy5，3’端荧光标记为BHQ2。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的组合，其为数字PCR (dPCR)反应所用的组合。
6.一种特异性检测目标基因的数字PCR反应预混液，其中所述数字PCR反应预混液包含根据权利要求1-5中任一项所述的组合。
7.根据权利要求6所述的数字PCR反应预混液，其中所述数字PCR反应预混液还包括选自以下的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs、牛血清白蛋白、甘油、甜菜碱、NH4 +、和Mg2+离子。
8.一种数字PCR微流控卡盒，其中所述数字PCR微流控卡盒包括根据权利要求6或权利要求7所述的数字PCR反应预混液。
9.根据权利要求8所述的微流控卡盒，其中所述微流控卡盒包括至少两个孔。
10.一种用于检测目标基因的试剂盒，其中所述试剂盒包括根据权利要求6或权利要求7所述的特异性检测目标基因的数字PCR反应预混液。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品、和/或微滴生成油。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括根据权利要求9所述的数字PCR微流控卡盒。
13.一种以非疾病诊断为目的的检测目标基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)释放待测样本的核酸；
(2)制备数字PCR扩增混合液，其含有步骤(1)提供的待检测样本的核酸、根据权利要求1-5中任一项所述的组合和/或根据权利要求6或权利要求7所述的一种特异性检测目标基因的数字PCR反应预混液；
(3)在数字PCR微流控卡盒内制备微滴，并进行PCR扩增反应；
(4)使用数字PCR微流控卡盒读取仪进行微滴PCR扩增反应后的荧光信号读取。
14.根据权利要求13所述的以非疾病诊断为目的的检测目标基因的方法，所述待测样本选自全血、血清、血浆、咽拭子、痰液、尿液、粪便、脑脊液、体液或腹水。
CN202311805997.3A 2023-12-26 2023-12-26 一种用于检测目标基因的组合及其应用 Active CN117448471B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311805997.3A CN117448471B (zh) 2023-12-26 2023-12-26 一种用于检测目标基因的组合及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311805997.3A CN117448471B (zh) 2023-12-26 2023-12-26 一种用于检测目标基因的组合及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117448471A CN117448471A (zh) 2024-01-26
CN117448471B true CN117448471B (zh) 2024-03-08

Family

ID=89591313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311805997.3A Active CN117448471B (zh) 2023-12-26 2023-12-26 一种用于检测目标基因的组合及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117448471B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588246A (zh) * 2018-04-28 2018-09-28 宁波市鄞州人民医院 一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒
CN113502354A (zh) * 2021-07-14 2021-10-15 中国医学科学院输血研究所 一种用于移植患者感染的病原体检测引物和探针组、试剂盒及应用
CN116004915A (zh) * 2022-11-18 2023-04-25 北京迈基诺基因科技股份有限公司 检测多种病原体的多重pcr引物探针组合及其检测方法
CN116064859A (zh) * 2022-08-31 2023-05-05 领航基因科技（杭州）有限公司 多种病原微生物和耐药基因数字pcr检测的引物探针组及其试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588246A (zh) * 2018-04-28 2018-09-28 宁波市鄞州人民医院 一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒
CN113502354A (zh) * 2021-07-14 2021-10-15 中国医学科学院输血研究所 一种用于移植患者感染的病原体检测引物和探针组、试剂盒及应用
CN116064859A (zh) * 2022-08-31 2023-05-05 领航基因科技（杭州）有限公司 多种病原微生物和耐药基因数字pcr检测的引物探针组及其试剂盒
CN116004915A (zh) * 2022-11-18 2023-04-25 北京迈基诺基因科技股份有限公司 检测多种病原体的多重pcr引物探针组合及其检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN117448471A (zh) 2024-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pincus et al. Yeast identification—past, present, and future methods
US20200318164A1 (en) Method for detecting and characterising a microorganism
Mothershed et al. Nucleic acid-based methods for the detection of bacterial pathogens: present and future considerations for the clinical laboratory
Shepard et al. Multicenter evaluation of the Candida albicans/Candida glabrata peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization method for simultaneous dual-color identification of C. albicans and C. glabrata directly from blood culture bottles
KR101038519B1 (ko) 인체 감염성질환 병원체 감별진단 및 이의 항생제 내성 유무 판별방법, 멀티플렉스 키트 그리고 이를 포함하는 칩
EP2150625B1 (en) Methods, compositions and kits for detection and analysis of antibiotic-resistant bacteria
EP0979312B1 (en) Nucleic acids for detecting aspergillus species
CN113512602B (zh) 血流感染病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用
US8883488B2 (en) Detection of food threat agents and food-borne pathogens
CN113151610B (zh) 中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用
US20130065232A1 (en) Assays and kits for serotyping pseudomonas aeruginosa and oligonucleotide sequences useful in such methods and kits
CN115772518A (zh) 同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物及其应用
EP2014775B1 (en) Method for the detection of bacterial species of the genera Anaplasma/Ehrlichia and Bartonella
US20110287965A1 (en) Methods and compositions to detect clostridium difficile
ZA200607878B (en) Neisseria gonorrhoeae detection
US6013435A (en) Drug resistance screening method using multiplex amplification
CN117448471B (zh) 一种用于检测目标基因的组合及其应用
CN116287356A (zh) 用于多重呼吸道病原菌和耐药基因检测的引物探针组合物、试剂盒
JP2020115793A (ja) 肺炎桿菌及び近縁菌種の遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット
CN112760393B (zh) 泌尿系统感染病原体耐药基因检测体系及其试剂盒和应用
Binstock Molecular biology techniques for identifying dermatophytes and their possible use in diagnosing onychomycosis in human toenail: a review
US20100304371A1 (en) Compositions and methods for detecting mycobacteria
US7718361B2 (en) Quantitative test for bacterial pathogens
Gonzalez et al. Molecular methods for detection of pathogens directly from blood specimens
Burteau et al. Design and validation of a low density array (Nosochip) for the detection and identification of the main pathogenic bacteria and fungi responsible for nosocomial pneumonia

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40099478

Country of ref document: HK