CN106191239A - 一种实时荧光pcr检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒 - Google Patents
一种实时荧光pcr检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106191239A CN106191239A CN201610539450.7A CN201610539450A CN106191239A CN 106191239 A CN106191239 A CN 106191239A CN 201610539450 A CN201610539450 A CN 201610539450A CN 106191239 A CN106191239 A CN 106191239A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- probe
- detection
- primer
- seqidno
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域,公开了一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒,采用Taqman‑MGB探针实时荧光PCR法,分别针对肺炎支原体特异性P1基因、23S rRNA基因耐药突变基因(2063A/G,2064A/G)、内标(int)核酸设计引物和荧光标记探针,通过PCR反应检测荧光信号,扩增曲线结合CT值判断检测结果,通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点,能够对咽拭子样本中的肺炎支原体及耐药突变位点进行快速、准确检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,尤其涉及一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma Pneumoniae,MP)是造成儿童、老年人呼吸道感染的主要病原体,也是引起社区获得性肺炎的常见病原体。主要引起肺炎以及气管炎、支气管炎、哮喘等临床症状和一些严重的临床并发症。大环内酯类抗生素是目前治疗肺炎支原体肺炎的首选药物,抗生素滥用导致MP耐药性不断升高。
培养法是检测肺炎支原体的金标准,一旦检出,即可确诊。但其缺点在于需要的时间长,一般培养需2周左右,生长条件苛刻,当标本中MP数量少、培养基营养标准不够或操作方法不当时,就会出现假阴性结果;ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点,应用于肺炎支原体,可检测IgM和IgG抗体,方法敏感,特异性高,是诊断肺炎支原体感染实用可靠的手段。肺炎支原体感染后可产生特异性的IgM、IgG类抗体,其中IgM类抗体出现最早,检测MP-IgM可作为早期感染的诊断指标,但重症感染及再感染者可能无此抗体产生。
发明内容
本发明提供一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒,解决现有技术中培养法是检测肺炎支原体耗时长、生长条件苛刻、检测结果不准确的技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物和探针,检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示,检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示;检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示,检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示;检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示;检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO:12~13所示,检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示。
一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的方法,包括:
样本核酸制备,以获得核酸模板;
分别针对肺炎支原体特异性P1基因、2063(A/G)基因、2064(A/G)基因、内标基因int设计特异性引物和荧光标记探针,其中,检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示,检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示;检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示,检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示;检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示;检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO:12~13所示,检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示;
取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中,分别加入核酸抽提液充分混匀,并进行加热和离心处理,取上清液用于荧光PCR检测;
配置酶试剂,其中,所述酶试剂由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成;
将P1基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀,进行离心混匀;将2063(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀,进行离心处理;将2064(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀,进行离心处理
分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中,取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液和内标加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中,进行荧光PCR扩增,反应条件为:37℃×2min,94℃×2min,循环1次;93℃×15s,60℃×30s,循环40次;单点荧光检测在60℃,并在此采集荧光信号,所述内标为含有内标int基因片段的质粒;
对于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因,采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增,对于int基因,采用荧光PCR仪上的VIC通道进行扩增,通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒,包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、内标、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒,其中,所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、P1基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成;所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2063(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成;所述第三引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2064(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成。
其中,检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示,检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示;检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示,检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示;检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示;检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO:12~13所示,检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示。
本发明的有益效果为:采用Taqman-MGB探针实时荧光PCR法,分别针对肺炎支原体特异性P1基因、23S rRNA基因耐药突变基因(2063A/G,2064A/G)、内标核酸设计引物和荧光标记探针,通过PCR反应检测荧光信号,扩增曲线结合CT值判断检测结果,通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点,能够对咽拭子样本中的肺炎支原体及耐药突变位点进行快速、准确检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例四的肺炎支原体感染样本的荧光定量PCR曲线图;
图2为本发明实施例四的2063(A/G)突变阳性样本的荧光定量PCR曲线图;
图3为本发明实施例四的2064(A/G)突变阳性样本的荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例一
本发明实施例提供了一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物和探针,检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示,检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示;检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示,检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示;检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示;检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO:12~13所示,检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示;
其中,P1基因设计的特异性引物的序列如下:
上游引物P-P1-F:5’-TAAGTTCGTTGGTAGGGAAC-3’
下游引物P-P1-R:5’-CAACCTGAACTTAGTAGCGCAA-3’
针对P1基因的TaqMan荧光标记探针序列如下:
T-P1:5’-FAM-ATGGGTGATACCGCT-MGB-3’
针对2063(A/G)基因设计的特异性引物的序列如下:
上游引物P-23S-F:5’-ATCCAGGTACGGGTGAAGAC-3’
下游引物P-23S-R:5’-CGCATCAACAAGTCCTAGCGAA-3’
针对2063(A/G)基因的TaqMan荧光标记探针序列如下:
T-2063(A/G):5’-FAM-CGGGACGGGAAGAC-MGB-3’
针对2064(A/G)基因的特异性引物与2063(A/G)基因的特异性引物相同,针对2064(A/G)基因的TaqMan荧光标记探针序列如下:
T-2064(A/G):5’-FAM-GACGGAGAGACCCC-MGB-3’
int基因设计的特异性引物的序列如下:
上游引物P-int-F:5’-CCACACGACTCTCGGCAAC-3’
下游引物P-int-R:5’-TCGATGGTTCACGGGATTCT-3’
针对int基因的TaqMan荧光标记探针序列如下:
T-int:5’-VIC-CTCGGCTCTCGCATC-MGB-3’
P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM,3’端标记MGB基团;int基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为VIC,3’端标记MGB基团。
实施例二
本发明实施例中又提供了一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的方法,包括:
步骤101、样本核酸制备,以获得核酸模板;
步骤102、分别针对肺炎支原体特异性P1基因、2063(A/G)基因、2064(A/G)基因、内标基因int设计特异性引物和荧光标记探针;
其中,检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示,检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示;检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示,检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示;检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示;检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO:12~13所示,检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示;
本发明实施例中的内标基因(internal amplification control,int),是鉴别仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素或样本中存在抑制物等造成的结果不理想的原因。水稻核糖体DNA内转录间隔区ITS1基因与目的基因同源性极低,可以选取该基因片段作为内标。对P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因序列进行同源性比对,选取保守片段分别设计针对这3个基因的特异性引物和荧光标记探针。
步骤103、取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中,分别加入核酸抽提液充分混匀,并进行加热和离心处理,取上清液用于荧光PCR检测;
步骤104、配置酶试剂;
其中,所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成;
步骤105、将P1基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀,进行离心混匀;将2063(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀,进行离心处理;将2064(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀,进行离心处理;
步骤106、分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中,取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液和内标加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中,进行荧光PCR扩增;
其中,反应条件为:37℃×2min,94℃×2min,循环1次;93℃×15s,60℃×30s,循环40次;单点荧光检测在60℃,并在此采集荧光信号,所述内标为含有内标int基因片段的质粒;
步骤107、对于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因,采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增,对于int基因,采用荧光PCR仪上的VIC通道进行扩增,通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
其中,检测结果根据CT值进行判定,仪器FAM通道CT栏显示Undet.同时VIC通道CT值≤35,表示检测样品低于检测限,报告为阴性;待检样品在FAM通道、VIC通道CT值均≤35,检测结果报告为阳性;待检样品FAM通道CT显示在35~40之间,VIC通道CT值≤35,需重复测定,FAM通道CT显示仍在35~40之间,且扩增曲线呈S型,则判断为阳性;若扩增结果为一直线,则判断为阴性。
本发明采用Taqman探针实时荧光PCR方法。NCBI blast同源性比对肺炎支原体特异性P1基因、耐药突变位点2063(A/G)、2064(A/G)、内标int基因,选取P1、2063(A/G)、2064(A/G)、int基因保守片段设计引物和荧光标记探针。P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因探针5’端标记FAM荧光素为荧光报告基团(用R表示),3’端标记MGB基团(用Q表示);int基因设计的探针5’端标记VIC荧光素为荧光报告基团(用R表示),3’端标记MGB基团(用Q表示),Q基团能在近距离吸收R基团发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时,探针先与模板结合,随后引物模板结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团吸收,仪器检测不到荧光信号;当反应进行到延伸阶段时,Taq DNA聚合酶5’→3’外切酶将探针降解,探针上的R基团游离出来,Q基团无法吸收R基团发出的的荧光信号,检测器能检测到荧光信号。随着PCR反应的进行,PCR产物的增加与荧光信号的增长呈现对应关系。通过荧光信号增长曲线,实现目的基因的检测。
实施例三
本发明实施例提供了一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒,包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、内标、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒,其中,所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、P1基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成;所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2063(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成;所述第三引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2064(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成。
其中,检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示,检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示;检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示,检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示;检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示;检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO:12~13所示,检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示。
所述核酸抽提液由3%(M/V)Chelex-100、1%(V/V)Tris-HCl,1M,pH9.0组成。
所述第一引物探针混合液、所述第二引物探针混合液和所述第三引物探针混合液分别由2μL 10×PCR Buffer、2μL25mmol/LMgCl2、3.4μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.8μL 10μmol/L目的基因引物、0.2μL 10μmol/L目的基因探针、0.4μL 10μmol/L内标基因引物、0.2μL10μmol/L内标基因探针和5.75μL灭菌纯化水组成。
PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和1U/μL UNG酶按体积比3∶2比例混合组成。
PCR扩增的条件为:37℃×2min,94℃×2min,循环1次;93℃×15s,60℃×30s,循环40次;单点荧光检测在60℃,对于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因,采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增,对于int基因,采用荧光PCR仪上的VIC通道进行扩增。
所述阳性对照品为含有灭活的E-P1、E-23S(2063A/G)、E-23S(2064A/G)菌的混合液,菌浓度为105CFU/mL;阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液,菌浓度为105CFU/mL,其中,E-P1为含有P1基因片段的工程菌,E-23S(2063A/G)为含有23S(2063A/G)基因片段的工程菌,E-23S(2064A/G)为含有23S(2064A/G)基因片段的工程菌。
本试剂盒具有准确率高,临床试验结果与DNA测序结果总符合率99%以上;特异性强,与咽拭子中常见致病菌肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、衣原体均无交叉反应;灵敏度高,按照质粒拷贝数确定的最低检测限为103copies/mL,按照菌培养法确定的最低检测限为103CFU/mL。本产品用于体外定性检测人咽拭子样本中肺炎支原体特异性P1基因及耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因。为临床确定肺炎支原体感染及其耐药突变提供辅助诊断方法,为临床医生用药提供参考。
实施例四
本实施例结合具体检测案例说明本发明的具体应用方式,首先收集人痰液和咽拭子样,采用发明实施例三中提供的试剂盒进行检测,统计结果符合率。
1、样本核酸制备
(1)痰液:取痰液加入2倍体积的4%NaOH(自备),摇匀,室温下放置30min液化,12,000rpm 5min。沉淀加无菌生理盐水1mL打匀,12,000rpm 5min;去尽上清,沉淀中直接加入50μL核酸抽提液,充分混匀,98℃ 10min(误差不超过1min)。12,000rpm 5min,取上清2μL做PCR反应。
(2)咽拭子:取1mL样本,12,000rpm 2min;弃去上清,沉淀中直接加入50μL核酸抽提液,充分混匀,98℃ 10min(误差不超过1min)。12,000rpm 5min,取上清2μL做PCR反应。
2、对照品准备
取阳性对照品、阴性对照品各50μL分别置于1.5mL(或0.5mL)离心管中(冻存试剂融化后振荡混匀10sec),分别加入核酸抽提液50μL充分混匀,98℃ 10min,然后12,000rpm5min,取上清2μL做PCR反应。
3、酶试剂配制
取n×16μL肺炎支原体P1基因PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合,振荡混匀数秒,3000rpm离心混匀数秒;取n×16μL 23S核糖体RNA基因耐药突变(2063A/G)PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合,振荡混匀数秒,3000rpm离心混匀数秒;取n×16μL 23S核糖体RNA基因耐药突变(2064A/G)PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合,振荡混匀数秒,3000rpm离心混匀数秒。
4、加样
分别取上述混合液16μL置于PCR管中,然后将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各2μL分别加入各个已有混合液的PCR管中,同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品PCR管中加入2μL内标,盖好管盖,立即进行荧光PCR扩增反应。
5、PCR扩增
反应管置于定量荧光PCR仪上,推荐循环参数设置:
37℃×2min,94℃×2min,循环1次;93℃×15sec,60℃×30s,循环40次;单点荧光检测在60℃,反应体系为20μL。
荧光通道检测选择:P1基因、2063(A/G)、2064(A/G)选用FAM通道,内标基因选用VIC通道。
6、结果判定
检测结束后,基线调整取6-15个循环的荧光信号,阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。仪器FAM通道CT栏显示Undet.同时VIC通道CT值≤35,表示检测样品低于检测限,报告为阴性;待检样品在FAM通道、VIC通道CT值均≤35,检测结果报告为阳性;待检样品FAM通道CT显示在35~40之间,VIC通道CT值≤35,需重复测定,FAM通道CT显示仍在35~40之间,且扩增曲线呈S型,则判断为阳性;若扩增结果为一直线,则判断为阴性。
7、检测结果检验
本发明的检测结果与细菌培养鉴定与药敏试验结果一致,荧光PCR检测结果如图1-3所示,图1为肺炎支原体感染样本的荧光定量PCR曲线图,可见随着PCR反应的进行,P1基因对应的PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系,可判断P1基因为阳性,2063(A/G)基因和2064(A/G)基因为阴性。图2为2063(A/G)突变阳性样本的荧光定量PCR曲线图,可判断P1基因和2063(A/G)基因均为阳性,2064(A/G)基因为阴性。图3为2064(A/G)突变阳性样本的荧光定量PCR曲线图,可判断P1基因和2064(A/G)基因均为阳性,2063(A/G)基因为阴性。
以上对本发明进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (9)
1.一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物和探针,其特征在于,检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示,检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示;检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示,检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示;检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示;检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO:12~13所示,检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示。
2.根据权利要求1所述的实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物和探针,其特征在于,P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM,3’端标记MGB基团;int基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为VIC,3’端标记MGB基团。
3.一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的方法,其特征在于,包括:
样本核酸制备,以获得核酸模板;
分别针对肺炎支原体特异性P1基因、2063(A/G)基因、2064(A/G)基因、内标基因int设计特异性引物和荧光标记探针,其中,检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示,检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示;检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示,检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示;检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示;检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO:12~13所示,检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示;
取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中,分别加入核酸抽提液充分混匀,并进行加热和离心处理,取上清液用于荧光PCR检测;
配置酶试剂,其中,所述酶试剂由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成;
将P1基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀,进行离心混匀;将2063(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀,进行离心处理;将2064(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀,进行离心处理;
分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中,取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液和内标加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中,进行荧光PCR扩增,反应条件为:37℃×2min,94℃×2min,循环1次;93℃×15s,60℃×30s,循环40次;单点荧光检测在60℃,并在此采集荧光信号,所述内标为含有内标int基因片段的质粒;
对于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因,采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增,对于int基因,采用荧光PCR仪上的VIC通道进行扩增,通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
4.一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒,其特征在于,包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、内标、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒,其中,所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、P1基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上下游引物及一条荧光标记探针组成;所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2063(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上下游引物及一条荧光标记探针组成;所述第三引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2064(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上下游引物及一条荧光标记探针组成。
其中,检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示,检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示;检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示,检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示;检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示;检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO:12~13所示,检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示。
5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒,其特征在于,所述核酸抽提液由3%(M/V)Chelex-100、1%(V/V)Tris-HCI,1M,pH9.0组成。
6.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒,其特征在于,所述第一引物探针混合液、所述第二引物探针混合液和所述第三引物探针混合液分别由2μL 10×PCR Buffer、2μL 25mmol/L MgCl2、3.4μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.8μL 10μmol/L目的基因引物、0.2μL 10μmol/L目的基因、0.4μL 10μmol/L内标引物及0.2μL 10μmol/L内标探针和5.75μL灭菌纯化水组成。
7.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒,其特征在于,PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和1U/μL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)按体积比3∶2比例混合组成。
8.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒,其特征在于,PCR扩增的条件为:37℃×2min,94℃×2min,循环1次;93℃×15s,60℃×30s,循环40次;单点荧光检测在60℃,对于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因,采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增,对于int基因,采用荧光PCR仪上的VIC通道进行扩增。
9.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒,其特征在于,所述阳性对照品为含有灭活的E-P1、E-23S(2063A/G)、E-23S(2064A/G)菌的混合液,菌浓度为105CFU/mL;阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液,菌浓度为105CFU/mL,其中,E-P1为含有P1基因片段的工程菌,E-23S(2063A/G)为含有23S(2063A/G)基因片段的工程菌,E-23S(2064A/G)为含有23S(2064A/G)基因片段的工程菌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610539450.7A CN106191239A (zh) | 2016-07-11 | 2016-07-11 | 一种实时荧光pcr检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610539450.7A CN106191239A (zh) | 2016-07-11 | 2016-07-11 | 一种实时荧光pcr检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106191239A true CN106191239A (zh) | 2016-12-07 |
Family
ID=57473223
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610539450.7A Pending CN106191239A (zh) | 2016-07-11 | 2016-07-11 | 一种实时荧光pcr检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106191239A (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107254524A (zh) * | 2017-06-22 | 2017-10-17 | 中国人民解放军第三〇七医院 | 一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法和试剂盒 |
WO2020177398A1 (zh) * | 2019-03-01 | 2020-09-10 | 苏州点晶生物科技有限公司 | 肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒 |
CN112458194A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-03-09 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种肺炎支原体及其耐药突变的引物探针组合及检测试剂盒 |
CN113373250A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-09-10 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法 |
CN113462794A (zh) * | 2020-03-31 | 2021-10-01 | 东洋纺株式会社 | 用于检测肺炎支原体核酸及其有无耐药基因变异的试剂盒及检测方法 |
CN113684287A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-11-23 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种检测肺炎支原体的引物探针组、pcr试剂及试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104630328A (zh) * | 2013-11-08 | 2015-05-20 | 江苏默乐生物科技有限公司 | 肺炎支原体23S rRNA 2064位点A:G突变检测特异性引物和探针 |
CN104630329A (zh) * | 2013-11-08 | 2015-05-20 | 江苏默乐生物科技有限公司 | 肺炎支原体23S rRNA 2063位点A:G突变检测特异性引物和探针 |
CN105624285A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-06-01 | 江苏和创生物科技有限公司 | 肺炎支原体荧光pcr检测试剂盒 |
-
2016
- 2016-07-11 CN CN201610539450.7A patent/CN106191239A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104630328A (zh) * | 2013-11-08 | 2015-05-20 | 江苏默乐生物科技有限公司 | 肺炎支原体23S rRNA 2064位点A:G突变检测特异性引物和探针 |
CN104630329A (zh) * | 2013-11-08 | 2015-05-20 | 江苏默乐生物科技有限公司 | 肺炎支原体23S rRNA 2063位点A:G突变检测特异性引物和探针 |
CN105624285A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-06-01 | 江苏和创生物科技有限公司 | 肺炎支原体荧光pcr检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
刘杨: "肺炎支原体耐药性及耐药机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库.医药卫生科技辑》 * |
童大跃等: "《法医物证学》", 31 December 2014, 广州:中山大学出版社 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107254524A (zh) * | 2017-06-22 | 2017-10-17 | 中国人民解放军第三〇七医院 | 一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法和试剂盒 |
WO2020177398A1 (zh) * | 2019-03-01 | 2020-09-10 | 苏州点晶生物科技有限公司 | 肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒 |
CN113462794A (zh) * | 2020-03-31 | 2021-10-01 | 东洋纺株式会社 | 用于检测肺炎支原体核酸及其有无耐药基因变异的试剂盒及检测方法 |
CN112458194A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-03-09 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种肺炎支原体及其耐药突变的引物探针组合及检测试剂盒 |
CN112458194B (zh) * | 2020-12-18 | 2023-11-03 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种肺炎支原体及其耐药突变的引物探针组合及检测试剂盒 |
CN113373250A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-09-10 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法 |
CN113373250B (zh) * | 2021-07-14 | 2023-03-07 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法 |
CN113684287A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-11-23 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种检测肺炎支原体的引物探针组、pcr试剂及试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106191239A (zh) | 一种实时荧光pcr检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒 | |
CN106222248A (zh) | 一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
CN103667514B (zh) | 一种人白介素28b基因多态性荧光pcr检测试剂盒 | |
CN105950772A (zh) | 一种检测肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
CN105018648A (zh) | 一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用 | |
WO2022089550A1 (en) | Novel compositions and methods for coronavirus detection | |
CN110229919B (zh) | 用于检测牛支原体的组合物、试剂盒和方法 | |
CN111349720A (zh) | 用于检测呼吸道感染病毒的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 | |
Alvarado et al. | Molecular characterization of avian infectious bronchitis virus strains isolated in Colombia during 2003 | |
CN109517927A (zh) | 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用 | |
CN107841568A (zh) | 一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
CN107058632A (zh) | 一种多重pcr检测三种腹泻病毒用试剂盒及其检测方法 | |
CN108315429A (zh) | 基于囊泡检测eml4-alk融合基因的引物和试剂盒 | |
CN101117646A (zh) | 检测人泌尿生殖道病原体的引物、探针及方法 | |
CN105907890A (zh) | 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法 | |
CN108588246A (zh) | 一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
CN115044688A (zh) | 用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂及试剂盒 | |
CN109439800B (zh) | 检测hiv-1基因pr区和rt区基因突变的试剂盒及方法 | |
CN105950773A (zh) | 一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
TWI377255B (en) | Nucleic acid detection | |
Li et al. | Visual and rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method | |
CN109762932A (zh) | 鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用 | |
CN108411014A (zh) | 鉴别a型和b型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量pcr的引物和探针以及检测方法 | |
CN110257539B (zh) | 用于检测绵羊肺炎支原体的组合物、试剂盒和方法 | |
CN106636447A (zh) | 幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变检测试剂盒和检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161207 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |