CN113373250A - 一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及耐药突变的检测技术领域，具体涉及一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法。具体制备工艺为：材料准备、TaqMan‑MGB多重荧光探针法、rpsL基因测序及药敏试验。本发明方法应用TaqMan‑MGB多重荧光探针法对鼠疫菌链霉素耐药位点rpsL基因突变的检测，检测结果与测序验证、药敏试验表型结果一致，结果证明MGB荧光探针法对鼠疫菌rpsL128位密码子为“G”的链霉素耐药突变菌株以及有rpsL128位密码子为“A”的链霉素敏感株具备准确的检出效果。该方法操作简便，敏感性高，结果及药敏试验和一代测序法确定的链霉素耐药/敏感结果完全一致。在人间鼠疫发生时能够快速检测由于链霉素耐药位点rpsL基因突变引起鼠疫菌株耐药，为鼠疫疫情应急处置提供科学依据。

Description

一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法
技术领域
本发明涉及耐药突变的检测技术领域，具体涉及一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法。
背景技术
鼠疫是一种烈性传染病，在人类历史上引起了3次鼠疫大流行，在我国传染病中位居甲类。链霉素是治疗鼠疫的首选药物，其临床治疗地位仍无可替代。鉴于国内外鼠疫菌耐链霉素菌株的发现，给全世界敲响了警钟，如果耐药鼠疫菌株引起人间鼠疫，以其快速的传播速度、超强的毒力和传染性，在治疗失败的情况下，后果将不堪设想。因此，对鼠疫菌进行系统的抗生素耐药性监测势在必行。
根据前期对我国300株鼠疫菌抗菌药物最低抑菌浓度的测定，发现1株耐链霉素鼠疫菌株(S19960127)，该菌株是1996年中国西藏自治区山南地区发生的一次鼠疫暴发期间，从一名肺鼠疫病人体内分离出的鼠疫菌。对该菌株进行全基因组测序，发现其链霉素耐药性是由于rpsL(编码核糖体S12蛋白)的突变，rpsL基因128bp位点的碱基突变(rpsL128：A>G)，导致核糖体S12蛋白在43位点由赖氨酸(K)替代了精氨酸(R)所致。细菌耐药监测结果是抗菌药物合理应用的数据支持，鉴于我国鼠疫流行态势仍对人民的生产生活构成严重的威胁，全面了解我国鼠疫菌对于rpsL基因点突变引起的耐链霉素情况，对鼠疫的临床指导用药具有现实意义。
发明内容
基于上述技术问题，本发明针对我国鼠疫菌rpsL基因点突变引起的鼠疫菌耐链霉素情况，基于TaqMan-MGB多重荧光探针法(简称MGB荧光探针法)检测我国鼠疫菌链霉素耐药位点rpsL基因的突变情况。目的是提供一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法。
本发明保护一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法，具体步骤包括如下：
步骤1，材料准备：被试菌株选自鼠疫自然疫源地分离的鼠疫菌，用苯酚-氯仿混合提取法提取DNA，备用；
步骤2，TaqMan-MGB多重荧光探针法：PCR体系含TransStart Probe qPCRSuperMix 10ul，0.1umol/L基因靶核苷酸-F和rpsL基因靶核苷酸-R各1ul，0.1umol/LProbe1-鼠疫菌FAM和Probe2-耐药鼠疫菌VIC各1ul，DNA模板1ul，去离子水4～6ul，每个反应最终体积16～24ul；反应条件：90～98℃预变性4～8min；92～97℃变性12～17s，45～62℃延伸23～40s，扩增35～45个循环；
步骤3，rpsL基因测序：以步骤1中被试菌株DNA为模板，用引物对rpsL-F和rpsL-R常规PCR扩增，PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后进行双向测序，测序结果用DNASTAR软件进行比对；
步骤4，药敏试验：采用纸片琼脂扩散法和琼脂稀释法分别检测鼠疫菌对链霉素的耐药性，以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株。
进一步的，步骤1所述菌株由青海省地方病预防控制所保存。
进一步的，步骤2所述DNA模板的浓度为10ng/uL、4ng/uL、2ng/uL、1ng/uL。
进一步的，步骤2所述去离子水5ul，每个反应最终体积20ul；反应条件：94℃预变性5min；95℃变性15s，58℃延伸30s，扩增40个循环；
进一步的，步骤3所述MGB探针序列引物信息为：
rpsL-F：ATGGCAACGATTAACCAG；
rpsL-R：TTAAGCCTTTGGCTTCTTC，产物长度375bp；
rpsL基因靶核苷酸-F：CCGCAGAAACGTGGTGTATG；
rpsL基因靶核苷酸-R：CACACGGCAAACTTTACGCA，产物长度84bp；
Probe1-鼠疫菌FAM：CACTCCGAAAAAA-MGB；
Probe2-耐药鼠疫菌VIC：CCACTCCGAGAAAA-MGB。
其中，所述纸片琼脂扩散法和琼脂稀释法由美国临床实验室标准化委员会NCCLS推荐。
所述TransStart Probe qPCR SuperMix购自全式金生物技术有限公司。
所述PCR产物用PCR产物纯化试剂盒购自北京诺博莱德科技有限公司。
所述MGB探针及引物由上海辉睿生物科技有限公司合成。
所述循环采用实时荧光定量PCR仪进行，购自美国赛默飞世尔科技有限公司。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
本发明方法应用TaqMan-MGB多重荧光探针法对鼠疫菌链霉素耐药位点rpsL基因突变的检测，检测结果与测序验证、药敏试验表型结果一致，结果证明MGB荧光探针法对鼠疫菌rpsL128位密码子为“G”的链霉素耐药突变菌株以及有rpsL128位密码子为“A”的链霉素敏感株具备准确的检出效果。该方法操作简便，敏感性高，结果及药敏试验和一代测序法确定的链霉素耐药/敏感结果完全一致。在人间鼠疫发生时能够快速检测由于链霉素耐药位点rpsL基因突变引起鼠疫菌株耐药，为鼠疫疫情应急处置提供科学依据。
附图说明
图1为本发明方法检测的Probe2-耐药鼠疫菌VIC的荧光检测曲线示意图；
图2为本发明方法检测的Probe1-鼠疫菌FAM的荧光检测曲线示意图；
图3为本发明方法检测的FAM和VIC的荧光检测曲线示意图；
图4为本发明方法检测的鼠疫菌rpsL和耐药菌株rpsL基因比对结果示意图；
图5为药敏纸片法对耐药鼠疫菌的链霉素药敏结果。
其中，图5中1为耐链霉素鼠疫菌(抑菌环直径＝0)；2为鼠疫菌141(抑菌环直径＝27.7mm)；3为ATCC25922(抑菌环直径＝26.1mm)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例采用青海省地方病预防控制所保存的选自我国11个鼠疫自然疫源地分离的1000株鼠疫菌(包括前期研究链霉素最低抑菌浓度测定的300株鼠疫菌)，做为本发明方法的检测对象。
本实施例主要试剂及仪器：TransStart Probe qPCR SuperMix购自全式金生物技术有限公司；PCR产物纯化试剂盒购自北京诺博莱德科技有限公司；MGB荧光探针及引物由上海辉睿生物科技有限公司合成，引物序列见表1。实时荧光定量PCR仪购自美国赛默飞世尔科技有限公司。
表1 MGB探针序列及引物信息
Figure BDA0003163016380000051
一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法，具体步骤包括如下：
步骤1，材料准备：被试菌株选自鼠疫自然疫源地分离的鼠疫菌，用苯酚-氯仿混合提取法提取DNA，备用；
步骤2，TaqMan-MGB多重荧光探针法：PCR体系含TransStart Probe qPCRSuperMix 10ul，0.1umol/L基因靶核苷酸-F和rpsL基因靶核苷酸-R各1ul，0.1umol/LProbe1-鼠疫菌FAM和Probe2-耐药鼠疫菌VIC各1ul，DNA模板1ul，其中所述DNA模板的浓度为10ng/uL、4ng/uL、2ng/uL、1ng/uL；去离子水5ul，每个反应最终体积20ul；反应条件：94℃预变性5min；95℃变性15s，58℃延伸30s，扩增40个循环；
步骤3，rpsL基因测序：以步骤1中被试菌株DNA为模板，用引物对rpsL-F和rpsL-R常规PCR扩增，PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后进行双向测序，测序结果用DNASTAR软件进行比对；
步骤4，药敏试验：采用纸片琼脂扩散法和琼脂稀释法分别检测鼠疫菌对链霉素的耐药性，以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株。
结果显示：
(1)被试菌株检测
被试菌株中FAM阳性为999株，对应检测rpsL(128：A)，RFU峰值>1000，阴性<200；VIC阳性的为1株，对应检测rpsL(128：G)，RFU峰值>2000，阴性<200。
Probe2-耐药鼠疫菌VIC的荧光检测曲线显示，24个样本的检测结果：A曲线为检测的耐药鼠疫菌株rpsL(128：G)，(相对荧光单位)RFU峰值>1000；B曲线为阴性对照；C曲线为其它菌株，RFU峰值<200(详见附图1)。
Probe1-鼠疫菌FAM的荧光检测曲线显示，24个样本的检测结果：A曲线为检测的耐药鼠疫菌株rpsL(128：G)，B曲线为阴性对照，RFU峰值<200；C曲线为其它菌株，RFU峰值>2000(详见附图2)。
FAM和VIC的荧光检测曲线显示，A曲线为检测的耐药鼠疫菌株rpsL(128：G)，RFU峰值>1000；B曲线为阴性对照，RFU峰值<200；C曲线为其它菌株，RFU峰值>2000(详见附图3)。
(2)测序验证
被试菌株的rpsL经PCR扩增，用试剂盒纯化后由生工生物工程有限公司进行双向测序，结果为1株耐药鼠疫菌株rpsL128位密码子为“G”，其余鼠疫菌株rpsL128位密码子为“A”，比对结果详见附图4。
(3)药敏试验
药敏纸片法结果显示，鼠疫菌株对链霉素高度敏感，抑菌环直径大于19mm，1株耐药鼠疫菌株对链霉素耐药，药敏纸片法无抑菌圈，1号平皿为耐链霉素鼠疫菌(抑菌环直径为0)，2号平皿为对照菌株鼠疫菌141(抑菌环直径为27.7mm)，3号平皿为质控菌株ATCC25922(抑菌环直径为25.1mm)(详见附图5)。
(4)鼠疫菌DNA样本浓度
鼠疫菌DNA样本浓度为10ng/μL、4ng/μL、2ng/μL、1ng/μL均可检出对应基因型，故提出符合性能要求、方面灵敏的结论。
实施例2
一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法，具体步骤包括如下：
步骤1，材料准备：被试菌株选自鼠疫自然疫源地分离的鼠疫菌，用苯酚-氯仿混合提取法提取DNA，备用；
步骤2，TaqMan-MGB多重荧光探针法：PCR体系含TransStart Probe qPCRSuperMix 10ul，0.1umol/L基因靶核苷酸-F和rpsL基因靶核苷酸-R各1ul，0.1umol/LProbe1-鼠疫菌FAM和Probe2-耐药鼠疫菌VIC各1ul，DNA模板1ul，其中所述DNA模板的浓度为10ng/uL、4ng/uL、2ng/uL、1ng/uL；去离子水4ul，每个反应最终体积16ul；反应条件：90℃预变性8min；92℃变性17s，45℃延伸40s，扩增45个循环；
步骤3，rpsL基因测序：以步骤1中被试菌株DNA为模板，用引物对rpsL-F和rpsL-R常规PCR扩增，PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后进行双向测序，测序结果用DNASTAR软件进行比对；
步骤4，药敏试验：采用纸片琼脂扩散法和琼脂稀释法分别检测鼠疫菌对链霉素的耐药性，以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株。
实施例3
一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法，具体步骤包括如下：
步骤1，材料准备：被试菌株选自鼠疫自然疫源地分离的鼠疫菌，用苯酚-氯仿混合提取法提取DNA，备用；
步骤2，TaqMan-MGB多重荧光探针法：PCR体系含TransStart Probe qPCRSuperMix 10ul，0.1umol/L基因靶核苷酸-F和rpsL基因靶核苷酸-R各1ul，0.1umol/LProbe1-鼠疫菌FAM和Probe2-耐药鼠疫菌VIC各1ul，DNA模板1ul，其中所述DNA模板的浓度为10ng/uL、4ng/uL、2ng/uL、1ng/uL；去离子水6ul，每个反应最终体积24ul；反应条件：98℃预变性4min；97℃变性12s，62℃延伸23s，扩增35个循环；
步骤3，rpsL基因测序：以步骤1中被试菌株DNA为模板，用引物对rpsL-F和rpsL-R常规PCR扩增，PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后进行双向测序，测序结果用DNASTAR软件进行比对；
步骤4，药敏试验：采用纸片琼脂扩散法和琼脂稀释法分别检测鼠疫菌对链霉素的耐药性，以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法，其特征在于，具体步骤包括如下：
步骤1，材料准备：被试菌株选自鼠疫自然疫源地分离的鼠疫菌，用苯酚-氯仿混合提取法提取DNA，备用；
步骤2，TaqMan-MGB多重荧光探针法：PCR体系含TransStart Probe qPCR SuperMix10ul，0.1umol/L基因靶核苷酸-F和rpsL基因靶核苷酸-R各1ul，0.1umol/L Probe1-鼠疫菌FAM和Probe2-耐药鼠疫菌VIC各1ul，DNA模板1ul，去离子水4～6ul，每个反应最终体积16～24ul；反应条件：90～98℃预变性4～8min；92～97℃变性12～17s，45～62℃延伸23～40s，扩增35～45个循环；
步骤3，rpsL基因测序：以步骤1中被试菌株DNA为模板，用引物对rpsL-F和rpsL-R常规PCR扩增，PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后进行双向测序，测序结果用DNASTAR软件进行比对；
步骤4，药敏试验：采用纸片琼脂扩散法和琼脂稀释法分别检测鼠疫菌对链霉素的耐药性，以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株。
2.根据权利要求1所述的一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法，其特征在于，步骤1所述菌株由青海省地方病预防控制所保存。
3.根据权利要求1所述的一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法，其特征在于，步骤2所述DNA模板的浓度为10ng/uL、4ng/uL、2ng/uL、1ng/uL。
4.根据权利要求1所述的一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法，其特征在于，步骤2所述去离子水5ul，每个反应最终体积20ul；反应条件：94℃预变性5min；95℃变性15s，58℃延伸30s，扩增40个循环。
5.根据权利要求1所述的一种检测鼠疫菌链霉素耐药基因突变位点的方法，其特征在于，步骤3所述MGB探针序列引物信息为：
rpsL-F：ATGGCAACGATTAACCAG；
rpsL-R：TTAAGCCTTTGGCTTCTTC，产物长度375bp；
rpsL基因靶核苷酸-F：CCGCAGAAACGTGGTGTATG；
rpsL基因靶核苷酸-R：CACACGGCAAACTTTACGCA，产物长度84bp；
Probe1-鼠疫菌FAM：CACTCCGAAAAAA-MGB；
Probe2-耐药鼠疫菌VIC：CCACTCCGAGAAAA-MGB。
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