CN103820439A - 结核分枝杆菌链霉素耐药相关的新突变位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了结核分枝杆菌链霉素耐药相关的新突变位点及其应用，该新突变位点位于标准株H37Rv基因组第1338631位，即基因间区Rv1194c-Rv1195的第47位碱基，发生的点突变为碱基C突变为A。本发明发现的新突变位点可作为检测靶点应用于结核分枝杆菌链霉素耐药性的检测中，提高结核分枝杆菌耐链霉素的分子检测水平，缩短患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。本发明说明结核菌耐药突变位点也可能发生在非编码区，提示基因间区的碱基突变可能也与耐药相关，也存在耐药生物标志物。本发明为找到新的、更有效的结核病耐药分子标识物提供了一种新思路。

Description

结核分枝杆菌链霉素耐药相关的新突变位点及其应用

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌耐药碱基突变位点的高通量筛选和验证，具体涉及一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变位点的筛查和验证。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。到20 世纪80 年代后期，由于贫困、艾滋病、人口流动和耐药等因素，结核病发病率和死亡率在全球范围内出现快速回升，成为与艾滋病并列的全球性危害最严重的传染病。结核分枝杆菌耐药情况严重，耐药率高达46％，给结核病的预防和治疗构成严峻挑战。

抗结核药物是结核病化学治疗的基础，而结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段。链霉素发现于20 世纪40 年代，是最早出现的有效抗结核的氨基苷类抗生素药物，也是治疗结核病的一线药物之一。链霉素是一种氨基环醇糖苷类抗生素，主要作用于结核分枝杆菌的核糖体，与结核分枝杆菌的核糖体30S 亚单位结合，诱导遗传密码的错配，破坏翻译过程的正常进行，合成结构功能异常的蛋白从而发挥其杀菌作用。链霉素经常单独给药，因此其耐药性发展较快。结核分枝杆菌耐链霉素的主要分子机制是编码小亚基的S12 蛋白的rpsL 基因和编码16S 核糖体RNA 的rrs基因突变，从而抑制药物结合核糖体的能力，造成对链霉素耐药。目前所知的结核分枝杆菌的耐链霉素药的原因，主要是由基因rpsL第43位碱基发生A→G的突变。结核分枝杆菌链霉素耐药性的检测对于正确选择有效的抗结核化疗方案，有效控制耐药性结核分枝杆菌的传播以及控制结核病有极其重要的意义。

目前临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和基因型检测两类，并以前者为主。然而表型检测因为各种原因，如耗时、设备昂贵、有放射性危害或干扰因素多等，难以形成快速高效的筛查手段。相对而言，基因检测更为直接，目前已经使用的基因分析方法有单链构象多态性分析法(SSCP)，限制性片段长度多态性分析法(RFLP)，DNA 测序法，线性探针杂交法，RNA/RNA 错配分析法，以及DNA 阵列( 芯片) 检测等。这些方法主要利用基因rpsL第43位碱基的A→G突变的标准，检测样品结核分枝杆菌是否发生同样的突变，从而快速判断结核分枝杆菌是否具有链霉素耐药性，但仍有许多耐链霉素的结核分枝杆菌不能被检测出来，呈假阴性。

结核病耐药率高是造成结核病疫情难以控制的重要原因，而传统的结核分枝杆菌药敏试验费时长，影响患者诊治，增加耐药株扩散机会，那么有效提高分子生物学方法快速鉴定结核分枝杆菌耐药性的检出率和准确率具有重要意义。较高的结核分枝杆菌链霉素耐药性的检出率，对临床耐药性检测和用药具有指导意义。

发明内容

本发明的目的在于提供结核分枝杆菌链霉素耐药新突变位点。

本发明的另一目的在于提供一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜。

本发明的再一目的在于提供一种结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速筛查法。

本发明所采取的技术方案是：

一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变位点，该突变位点位于标准株H37Rv基因组的第1338631位，即基因间区Rv1194c-Rv1195的第47位，发生的点突变为碱基C替换为A。

一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测链霉素耐药突变基因间区Rv1194c-Rv1195的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO : 1或其碱基互补序列。

一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜，该膜含有用于检测链霉素耐药突变基因间区Rv1194c-Rv1195的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO : 1或其碱基互补序列。

一种结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速筛查法，该方法利用PCR扩增法检测基因间区Rv1194c-Rv1195第多少位的碱基。

本发明的有益效果是：

本发明发现的链霉素耐药突变位点提高了结核分枝杆菌耐链霉素的分子检测水平，阳性检出率在原有的基础上增加了22.22%，能够有效缩短患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。

本发明发现结核菌耐药突变位点不仅发生在编码区，同时也可能发生在非编码区，提示基因间区（IGR）的碱基突变可能也与耐药相关，即IGR区也存在耐药生物标志物。该发明为找到新的、更有效的结核病耐药分子标识物提供了一种新的思路。

附图说明

图1为45株STR耐药的结核分枝杆菌的基因测序结果，A为基因间区Rv1194c-Rv1195（即图中所示的PE13）第47位碱基的测序结果，圆圈中的碱基为发生了突变的碱基，即碱基C突变为A，B、C分别为rpsL基因第43和88位碱基的测序结果，圆圈中的碱基为发生了突变的碱基，即碱基A突变为G。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变位点的筛选：

1）预测与STR耐药相关的碱基突变位点：收集全国的结核分枝杆菌临床菌株161例，进行全基因组测序，通过生物信息学方法，预测与链霉素（STR）耐药相关的碱基突变位点；

2）验证预测的与STR耐药相关的碱基突变位点：收集链霉素单耐药临床菌株45例，设计特异引物，对基因间区Rv1194c-Rv1195序列进行PCR扩增并测序，对测序序列进行比对分析，找到突变率最高的碱基突变位点为基因间区Rv1194c-Rv1195第47位，突变率为11.11%（5株突变）；

3）对比分析基因间区Rv1194c-Rv1195和基因rpsL中与STR耐药相关的碱基突变率：对2）中45株链霉素单耐药菌中的基因rpsL第43和88位（该两个位点已被报道与与结核分枝杆菌的STR耐药性相关）也进行测序，分析发现基因rpsL第43和88位的突变率分别为11.11%（5株突变）和8.89%（4株突变）；有2株STR耐药菌株在基因间区Rv1194c-Rv1195第47位、rpsL第43位中均发生了碱基突变，有1株在基因间区Rv1194c-Rv1195第47位、rpsL第88位中均发生了碱基突变；结果说明基因间区Rv1194c-Rv1195第47位的碱基突变（C突变为A）可以作为结核分枝杆菌STR耐药性检测的靶点。

实施例1：

一、预测与STR耐药相关的碱基突变位点

首先采用deep-sequencing技术，对来自中国的161株结核杆菌进行了全基因组测序，其中有44株敏感菌、94株多重耐药菌（MDR）、23株广泛耐药菌（XDR），并以H37Rv标准结核杆菌株基因组序列为对照进行生物信息学分析，发现了一批与耐药性密切相关的新基因、基因间区（IGR）的单核苷酸多态性（SNP）位点，其中基因间区Rv1194c-Rv1195的单碱基突变位点与链霉素（STR）耐药性具有很高的相关性，其P值为0.002，如表1所示。

表1 基因间区Rv1194c-Rv1195的单碱基突变位点与不同耐药性的相关性

表1中列出了Rv1194c-Rv1195基因间区的单碱基突变位点与INH（异烟肼）、RFP（利福平）、EMB（乙胺丁醇）、STR（链霉素）、CPM（卷曲霉素）、KAN（卡那霉素）、OFX（氧氟沙星）、ETH（乙硫异烟胺）、MDR（多重耐药）和XDR（广泛耐药）耐药性的相关度，其中Rv1194c-Rv1195基因间区的单碱基突变位点与STR耐药性间的P值最低，为0.002，表明基因间区Rv1194c-Rv1195的单碱基突变位点与STR耐药性的相关性最高。

基于上述161株结核杆菌的全基因组测序信息，通过生物信息学方法，预测与STR耐药相关的碱基突变信息如表2所示，一共有5个预测位点，分别为基因间区的第60、118、186、334、364位的碱基。

表2  STR耐药相关的预测碱基位点

二、对预测的与STR耐药相关的碱基位点作进一步验证

对表2的预测结果作进一步验证，另选取广东省临床分离的45株链霉素（STR）耐药的结核分枝杆菌，对基因间区Rv1194c-Rv1195进行PCR扩增、测序并进行序列比对分析，其中扩增基因间区Rv1194c-Rv1195的上下游引物及扩增条件如表3所示。

以H37Rv标准株为对照，对45株STR耐药临床株的基因间区Rv1194c-Rv1195 的PCR测序结果进行分析，有5株在基因间区Rv1194c-Rv1195内发生了相同的碱基突变，突变位点在基因组中的位置（ID）为1338631，发生的点突变为碱基C突变为A，如图1 A所示，该突变率为11.11%（5株突变株）。进一步证明了，预测碱基位点中的ID：1338631位点（即基因间区Rv1194c-Rv1195的第47位）可能与结核分枝杆菌链霉素耐药性相关。

表3  Rv1194c-Rv1195基因间区的扩增引物及扩增条件

三、对比分析基因间区Rv1194c-Rv1195和基因rpsL中与STR耐药相关的碱基突变率

rpsL基因是已报道的与结核分枝杆菌链霉素耐药基因，常应用于结核分枝杆菌链霉素耐药性的检测，其突变主要位于第43位和88位密码子，其中43位密码子突变的发生率最高，该位点位于限制性内切酶MboII识别的序列GAAGGA内，发生碱基A→G的点突变后，使Lys密码子（AAG）突变成精氨酸（Arg）密码子（AGG），酶切位点消失；少数分离株在第88位密码子发生类似的碱基A→G的点突变。

将“二”中所述的45株STR耐药的结核杆菌的rpsL基因也进行测序分析，发现rpsL第43位碱基 (AAG→AGG，Lys→Arg)的突变率为11.11%（5株突变），如图1B所示；rpsL第88位碱基 (AAG→AGG，Lys→Arg)的突变率为8.89%（4株突变），如图1 C所示，这两个位点的总突变率为20%。

根据图1的测序结果可知，有2株STR耐药菌株（S8，S14，）在基因间区Rv1194c-Rv1195第47位、rpsL第43位中均发生了碱基突变，有1株（S18）在基因间区Rv1194c-Rv1195第47位、rpsL第88位中均发生了碱基突变，没有菌株在rpsL第43和88位均发生碱基突变。

如果同时检测基因间区Rv1194c-Rv1195第47位、rpsL第43和88位的三个位点， STR耐药检测准确率达24.4%（11/45），相比只检测rpsL43及rpsL88两个传统位点的准确率20%（9/45）提高了22%。若只检测基因间区Rv1194c-Rv1195第47位，其STR耐药检测准确率与目前最常检测的rpsL第43位的准确率一样为11.1%。

结核分枝杆菌基因间区Rv1194c-Rv1195的野生型基因序列如SEQ ID NO : 4所示，其第47位碱基发生突变后的Rv1194c-Rv1195序列如SEQ ID NO : 5所示。

上述分析结果说明单核苷酸多态性（SNP）位点Rv1194c-Rv1195基因间区第47位碱基位点（即标准株H37Rv基因组的第1338631位碱基位点）可作为结核分枝杆菌STR耐药性分子诊断的一个标志物，有利于提高对具有STR耐药性的结核分枝杆菌的检出率。可应用于以下几个方面：

1）一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测链霉素耐药突变基因间区Rv1194c-Rv1195的特异性寡核苷酸探针，该探针检测的原理利用了Rv1194c-Rv1195第47位的碱基突变与结核分枝杆菌STR耐药性相关，如序列为SEQ ID NO : 1所示或其碱基互补序列所示的特异性寡核苷酸探针。

2）一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜，该检测膜含有用于检测链霉素耐药突变基因间区Rv1194c-Rv1195的特异性寡核苷酸探针，该探针检测的原理利用了Rv1194c-Rv1195第47位碱基的STR耐药突变，如序列为SEQ ID NO : 1所示或其碱基互补序列所示的特异性寡核苷酸探针。

3）一种结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速筛查法，利用PCR扩增含基因间区Rv1194c-Rv1195第47位碱基的序列，再测序验证该位点是否发生相应的碱基突变。

<110>  广东省结核病控制中心

 

<120>  结核分枝杆菌链霉素耐药相关的新突变位点及其应用

 

<130> 

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工探针

 

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<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

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<210>  3

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<212>  DNA

<213>  人工引物

 

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<210>  4

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<212>  DNA

<213>  结核分枝杆菌

 

<400>  4

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<210>  5

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<212>  DNA

<213>  结核分枝杆菌

 

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Claims (4)

1.一种结核分枝杆菌链霉素耐药碱基突变位点，其特征在于：该碱基突变位点位于标准株H37Rv基因组的第1338631位，即基因间区Rv1194c-Rv1195的第47位，发生的点突变为碱基C突变为A。

2.一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有用于检测链霉素耐药突变基因间区Rv1194c-Rv1195的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO : 1或其碱基互补序列。

3.一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜，其特征在于：该膜含有用于检测链霉素耐药突变基因间区Rv1194c-Rv1195的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO : 1或其碱基互补序列。

4.一种结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速筛查法，其特征在于：扩增基因间区Rv1194c-Rv1195中的碱基序列，并检测该基因间区第47位的是否发生碱基突变。

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