CN102492660B - 乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用。本发明的HBV突变体在乙型肝炎病毒基因组序列第216位和/或第285位发生突变，所述第216位发生的突变为碱基T突变为C，所述第285位发生的突变为碱基G突变为A。这两个突变与乙型肝炎炎症加重密切相关。本发明还提供了检测前述突变的HBV突变扩增试剂盒、试剂盒的使用方法及应用，从而为重型乙肝的临床早期诊断和干预提供帮助，为深入研究HBV基因突变引起的功能改变提供参考依据。

Description

乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及乙型肝炎病毒的新突变、突变扩增试剂盒及应用。
背景技术
目前全球估计有3.5亿慢性乙肝病毒(HBV)携带者，有三分之一的人口感染过HBV。在我国，乙型肝炎是最为严重、最广泛的传染病之一，感染率高达60％，约有1.2亿人携带HBV。乙型肝炎的发病率居传染病首位，死亡数居传染病第三位。
根据临床表现的不同HBV感染可分为多种类型：无症状携带状态，急性自限性肝炎，慢性肝炎，暴发型肝炎(fulminant hepatitits，FH)。母婴传播是HBV的重要传播途径，患者通常处于免疫耐受状态的，对HBV不发生应答，但是往往绝大部分无症状携带者会发生肝炎，甚至有一部分最终发展为FH。乙型肝炎重症化的机制一直未明确，目前认为是由宿主免疫和病毒两方面的作用所致。关于HBV变异和重肝的发生仍存在争议，尚没有一个基因变异可以作为重型乙型肝炎的标志性变异。而且大量的研究表明HBV在病人体内时以准种形式存在的，要研究病毒突变与肝炎的关系，必须考虑到HBV的准种特性。目前大多数研究采用的PCR-克隆-测序的方法研究HBV准种。因此，找到与肝炎加重密切相关的基因位点，将会为HBV的临床早期诊断和干预提供帮助。
发明内容
本发明的目的在于提供与肝炎加重密切相关的乙肝病毒突变体，突变扩增试剂盒，及应用，为HBV的临床早期诊断和干预提供帮助。
本发明一方面公开了一种乙型肝炎病毒(简称乙肝病毒或HBV)突变体，包括乙肝病毒基因组，所述乙型肝炎病毒突变体的突变发生在乙型肝炎病毒基因组序列第216位和/或第285位，所述第216位发生的突变为碱基T突变为C(216T→C)，所述第285位发生的突变为碱基G突变为A(285G→A)。
较优的，所述乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。
进一步的，所述乙肝病毒突变体HBV基因组序列的互补序列上，与基因组第216位对应位点的突变为A突变为G，与基因组第285位对应位点的突变为C突变为T。
较优的，所述乙型肝炎病毒突变体编码的S蛋白与正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位发生突变，第21位氨基酸的突变是由亮氨酸(L)突变为丝氨酸(S)，第44位氨基酸的突变是由甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)。
更优的，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：12。
MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLR
RFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSW
AFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYI(SEQ IDNO：12)
本发明第二方面公开了一种扩增乙肝病毒基因组序列第216位和285位基因片段的HBV突变扩增试剂盒，包括引物、dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH2O，所述引物包括上游引物和下游引物，所述引物特异性扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段。
较优的，所述DAN聚合酶为高保真DNA聚合酶；更优的，所述高保真DNA聚合酶为Prime Star。
较优的，PCR缓冲溶液为5×Prime Star buffer。
较优的，所述上游引物和下游引物序列如下：
本发明试剂盒PCR体系如下：
Figure BDA0000113339580000031
加ddH2O定容至总体积50μL。
较优的，本发明的试剂盒还可以包括DNA提取试剂。
较优的，本发明的HBV突变扩增试剂盒的扩增程序为：预变性94℃3min，然后94℃30s，57℃15s，72℃2min 45个循环，72℃延伸10min。
本发明第三方面公开了一种HBV突变扩增试剂盒的使用方法，步骤如下：
1)DNA模板的制备：抽取外周静脉血并提取HBV基因组作为DNA模板；
2)PCR扩增：通过本发明所述试剂盒，对步骤1)制备的DNA模板按照前述扩增程序进行PCR扩增反应；
3)纯化PCR产物：PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后回收和纯化。
较优的，步骤2)所述的扩增程序为：预变性94℃3min，然后94℃30s，57℃15s，72℃2min 45个循环，72℃延伸10min。
较优的，步骤3)电泳使用的琼脂糖凝胶浓度为1％。
将步骤3)纯化获得的PCR产物通过sanger测序技术或solexa测序技术进行测序，测序结果与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列进行比对，确认该PCR产物对应的乙型肝炎病毒基因组序列第216位和/或285位是否存在本发明所述的突变。
本发明第四方面公开了一种乙型肝炎病毒突变体或HBV突变扩增试剂盒在制备重症乙型肝炎疾病早期诊断及预防试剂中的应用。
本发明第五方面还公开了一种重症乙型肝炎疾病早期诊断及预防的方法，为检测对象血液中是否含有本发明所述的乙型肝炎病毒突变体。
较优的，所述重症乙型肝炎疾病早期诊断及预防的方法，所述检测对象血液中是否含有所述乙型肝炎病毒突变体的步骤如下：
1)DNA模板的制备：抽取检验对象外周静脉血并提取HBV基因组作为DNA模板；
2)PCR扩增：将步骤1)制备的DNA模板加入到PCR反应体系中，扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段；
3)纯化PCR产物：PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后回收和纯化；
4)PCR产物测序：将步骤3)纯化获得的PCR产物通过基因测序技术进行测序；
5)结果分析：将步骤4)的测序结果与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列进行比对，确认PCR产物对应的乙肝病毒基因组序列第216位和/或285位是否存在突变。
更优的，步骤2)中所述的PCR反应体系包括引物、dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH2O；所述引物包括上游引物和下游引物，扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段。
最优的，所述引物序列为SEQ ID NO：8-9。
更优的，所述DAN聚合酶为高保真DNA聚合酶；最优的，所述高保真DNA聚合酶为Prime Star。
更优的，PCR缓冲溶液为5×Prime Star buffer。
更优的，步骤2)中所述的扩增程序为预变性94℃3min，然后94℃30s，57℃15s，72℃2min 45个循环，72℃延伸10min。
更优的，步骤4)中所述的基因测序技术为sanger测序技术或solexa测序技术。
更优的，步骤5)中所述的PCR产物对应的乙肝病毒基因组序列第216位发生的突变为碱基T突变为C，所述的PCR产物对应的乙肝病毒基因组序列第285位发生的突变为碱基G突变为A。
血液中含有本发明所述突变体的检验对象更易发生严重的肝脏炎症。
本发明的乙型肝炎病毒基因组序列第216位的突变(216T→C)和第285位的突变(285G→A)与乙型肝炎炎症加重密切相关。
由于HBV在病人体内是以准种形式存在的，其基因型在人体内有较高突变率，因此本发明运用solexa高通量测序技术检测HBV全基因组，筛选出与肝炎加重密切相关的位点；并且提供了一种HBV突变扩增试剂盒，通过设计的特异性引物对乙肝患者携带的HBV基因组进行扩增，通过基因测序的方法将扩增产物序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11的序列进行比对，检测待测样本中是否存在第216位的T→C突变和/或第285位的G→A突变，从而为重型乙肝的临床早期诊断和干预提供帮助，为深入研究HBV基因突变引起的功能改变提供参考依据。
附图说明
图1：M1为病人HBV 216位点T突变成C，M2为病人HBV216位点T、C并存，WT为病人HBV 216位点未发生突变
图2：M1为病人HBV 285位点G突变成A，M2为病人HBV285位点G、A并存，WT为病人HBV 285位点未发生突变
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
一、重型乙型肝炎患者和慢性乙型肝炎患者血清的收集
收集浙江大学医学院附属第一医院的重型乙型肝炎患者12例、慢性轻度乙型肝炎患者12例的血清样本(患者已通过ALT，AST，TBIL，PT，病毒滴度等指标及临床表现明确诊断患有重型或慢性轻度乙型肝炎)。
二、引物设计
我们从GeneBank下载了616条HBV基因组全序列，根据HBV全基因保守序列，运用primer5.0软件设计三对引物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7)。
三、HBV DNA的提取
50ul血清加等体积核酸抽提液混匀后，置100℃水浴10min，13000r/min离心10min，吸取上清用于PCR扩增。
四、PCR扩增
病人HBV基因的扩增采用TaKaRa公司的Prime Star高保真酶，简要步骤如下：PCR反应总体积50μL，其中模板DNA 2μL，上游引物和下游引物(10uM)各1μL，dNTP(四种dNTP各2.5mM)4μL，5×Prime Star buffer(Mg2+Plus)10μL，Prime Star(5U/ul)0.5μL，ddH2O定容至总体积50μL。循环参数：预变性94℃3min，然后94℃30s，57℃15s，72℃2min 45个循环，72℃10min延伸。产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳后进行回收和纯化。
同时以实验室保存的含HBV1.3倍全序列的表达质粒HBV1.37为模板，扩增上述三段HBV基因片段，产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳后进行回收和纯化，作为高通量测序的质量控制。
五、sanger测序
将纯化的PCR产物进行Sanger测序，并用DNASTAR软件将三个片段拼接成完整的HBV DNA全序列。
六、Solexa高通量测序和数据分析方法
(一)测序方法：将纯化的PCR产物送浙江大学纳米研究院测序，实验过程简单描述如下：1.将基因组DNA打成200bp的小片段，在每个片段的两个末端加上接头(每例样本加一个特异性接头)。2.QIAGEN胶回收试剂盒切胶纯化DNA片段。3.PCR扩增加了接头的DNA片段并纯化。4.用Solexa高通量测序平台检测。
(二)数据分析
(1)测序片段拼接(mapping)
获得每个样本经高通量测序后所得的读序(reads，tags)数据，首先将其正反两个方向的读序数据组合成一个文件，再使用bowtie软件将其拼接成完整的HBV基因组。采用中《公共核酸数据库乙肝病毒全基因组序列概况和中国HBV参照序列的建立》(自然科学进展2008，18(2))所报道的中国HBV基因组标准B型及C型序列作为拼接的参考序列(SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11)，同时在线性基因组的gap前后各取一段序列组合成短片段同时加入参考序列，以保证覆盖在gap上的读序能被正确拼接。参数设置为：seed长度＝30，容许错配数＝3。因为根据高通量测序的原理来看，前面测出来的结果的准确率最高，随着测序长度的增大，准确度减低，因此我们选择前30个碱基进行比对，超过3个突变的序列视为测序质量比较差的序列，予以剔除(即每10个碱基允许1个突变)。
(2)各位点碱基组成差异的统计检验
对每个样本在拼接文件中的读序及其在基因组上的坐标读出，进行统计，得到全基因组所有碱基位置上测得的四种碱基种类的绝对数目。然后利用组合法，将重肝组中的每个样本与轻肝组中的每个样本依次比较。运用卡方检验(Chi-square test)，得出两个样本间在各位点上出现比例具有显著差异的碱基种类(p＜0.001)；在所有的比较对中统计上述信息，对在一半以上的比较对中被检测为有显著的差异，同时没有在任何一个比较对中出现相反的显著性的某位点上碱基比例改变，作为在重肝和轻肝两组间具有显著差异的碱基改变加以保留(以上步骤均使用Python程序语言(www.python.org)编写脚本完成)。
七、实验结果
通过对重型乙型肝炎和慢性乙型肝炎的测序结果进行统计分析，发现2个新的突变位点：216T→C和285G→A。12例重型肝炎病人中有10例存在216T→C突变，9例存在285G→A突变。
通过Solexa高通量测序，检测到在发生216T→C突变的重肝病人中，216T→C突变株的比例为8％-100％；在发生285T→C突变的重肝病人中，285G→A突变株的比例为11％-100％。在12例慢性乙肝患者中仅1例存在216T→C和285G→A双联突变，并且216T→C和285G→A突变株的比例分别为17％和7％。进一步的，本次实验还发现当216T→C突变株比例＜17％，285G→A突变株比例＜11％时，用普通的sanger测序法无法检测到这些突变株，无法对该类病例进行检测。
结果显示，solexa高通量测序技术检测突变的敏感性显著优于普通的sanger测序，可以发现存在于HBV患者中的非优势株，有助于我们更好的研究患者体内的复杂的准种特性。而sanger测序法可靠、准确，且已形成规模化，对于少量的序列来说，仍是最好的选择，因此常被用于PCR产物测序、质粒和细菌人工染色体的末端测序等。
此外，在重型肝炎病人中多数存在216T→C和285G→A突变，这两个位点的突变分别造成了HBV S区氨基酸的改变，如下表所示：
Figure BDA0000113339580000071
因此，乙肝病毒216T→C和285G→A的突变可能与重型肝炎的发病相关，进一步的深入研究将为临床早期干预和诊断提供帮助。
实施例2
一、乙型肝炎患者血清的收集
收集国内多家医院的乙肝病例血清样本，其中重型乙型肝炎患者102例、慢性乙型肝炎轻度患者127例，慢性乙型肝炎中重度患者95例，携带者65例(患者已通过ALT，AST，TBIL，PT，病毒滴度等指标及临床表现明确诊断患有乙型肝炎)。
二、引物设计
我们从GeneBank下载了616条HBV基因组全序列，根据HBV全基因保守序列，运用primer5.0软件设计一对引物(SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9)，用于扩增包括HBV基因组序列第216位和第285位在内的一段基因片段。
三、试剂盒的制备
将上述引物(SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9)与dNTP、5×Prime Starbuffer、Prime Star、ddH2O组装成HBV突变扩增试剂盒。
四、HBV DNA的提取
50ul血清加等体积核酸抽提液混匀后，置100℃水浴10min，13000r/min离心10min。吸取上清用于PCR扩增。
五、PCR扩增
病人HBV基因组的扩增简要步骤如下：PCR反应总体积50ul，其中模板DNA 2ul，引物(10uM)各1ul，dNTP(各2.5mM)4ul，5×Prime Star buffer(Mg2+Plus)10ul，Prime Star(5U/u1)0.5ul，ddH2O定容至总体积50ul。循环参数：预变性94℃3min，然后94℃30s，56℃15s，72℃50s 45个循环，72℃10min延伸。产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳后进行回收和纯化。
六、sanger测序
将纯化的PCR产物按照本领域常规的sanger测序技术进行测序。
七、统计方法  运用非参数秩和检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
八、实验结果
具体实验结果见表1-3。由表1和表2数据可知：在重型肝炎患者中216T→C突变的发生率为45％(46/102)，285G→A突变的发生率为39％(40/102)；慢性中、重度乙型肝炎患者中216T→C位点突变率为23％(22/95)，285G→A突变的发生率为29％(28/95)；慢性轻度乙型肝炎患者中216T→C位点突变率为8％(10/127)，285G→A突变的发生率为5％(6/127)；乙肝携带者中216T→C位点突变率为5％(3/65)，未见285G→A突变。运用非参数秩和检验，对突变样本和未突变样本的肝炎病情进行比较，结果p＜0.001，表明突变病例更易发生严重的肝脏炎症。
表1  216T→C突变在四组乙型肝炎病人中的分布情况
注：非参数秩和检验，对突变组和未突变组的肝炎病情进行比较，结果p小于0.001。
表2 285G→A突变在四组乙型肝炎病人中的分布情况
Figure BDA0000113339580000091
注：非参数秩和检验，对突变组和未突变组的肝炎病情进行比较，结果p小于0.001。
表3 216T→C/285G→A双联突变在四组乙型肝炎中的分布情况
Figure BDA0000113339580000092
注：非参数秩和检验，对突变组和未突变组的肝炎病情进行比较，结果p小于0.001。
由表3可知：216T→C/285G→A双重突变在重型肝炎患者中发生率为31％(32/102)，在慢性中重度肝炎患者中的发生率为16％(15/95)，在慢性轻度肝炎患者中的发生率为4％(5/127)，携带者中发生率为0％，非参数秩和检验，p＜0.001，实验数据表明发生216T＞C/285G＞A双联突变病例更易发生严重的肝脏炎症。
本实验结果显示：216T→C，285G→A突变与肝脏炎症加重密切相关，对其深入研究有助于阐明乙型肝炎重症化的分子机制，对重型肝炎的临床预警有积极意义。
Figure IDA00002883741200011
Figure IDA00002883741200021
Figure IDA00002883741200031
Figure IDA00002883741200041
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Claims (8)

1.一种乙型肝炎病毒突变体在制备重症乙型肝炎疾病早期诊断试剂中的应用，其特征在于，所述乙型肝炎病毒突变体包括乙肝病毒基因组，所述乙型肝炎病毒突变体的突变发生在乙型肝炎病毒基因组序列第216位和/或第285位，所述第216位发生的突变为碱基T突变为C，所述第285位发生的突变为碱基G突变为A，正常乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乙型肝炎病毒突变体编码的S蛋白与正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位发生突变，第21位氨基酸的突变是由亮氨酸突变为丝氨酸，第44位氨基酸的突变是由甘氨酸突变为谷氨酸。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
4.一种扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和285位基因片段的HBV突变扩增试剂盒在制备重症乙型肝炎疾病早期诊断试剂中的应用，所述试剂盒包括引物、dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH2O，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述引物特异性扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段，所述引物序列为SEQ ID NO:8～9。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶为Prime Star。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR缓冲液为5×Prime Star buffer。
8.如权利要求4-7任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为：预变性94℃3min，然后94℃30s，57℃15s，72℃2min，45个循环，72℃延伸10min。
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