CN111051532B - 用于慢性乙型肝炎的生物标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于CHB患者或健康对照中富集的OTU评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的方法。本发明还提供了一种基于这些OTU监测患有肝病或慢性乙型肝炎的受试者对疾病治疗或饮食干预的反应的方法。
Description
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围的流行病负担，到2005年，估计有2.4亿患者患有慢性乙型肝炎(CHB)疾病(1)。CHB增加了发生肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)的风险，据估计后两者每年在全球分别导致310,000和340,000例死亡(2)。迫切需要系统策略，以继续监测和预防CHB患者中严重肝衰竭的进程(3)。
据报道，HBV感染与肠道菌群的菌群失调有关，其包括门静脉内细菌转移和内毒素负荷的增加，导致肝脏Toll样受体(TLR)和NOD样受体(NLR)的活化。TLR/NLR通过诱导包括核因子κB(NF-κB)转录途径的信号级联和加速诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞因子来激活宿主全身的促炎症反应，这也对肝脏组织产生不利影响以参与慢性炎症和肝病的发程(4-7)。反之，肝脏代谢产物(例如胆汁酸)也通过肝门和胆汁分泌系统的显著影响肠道菌群的构建(8)。在不存在肠道菌群的情况下，保护无菌小鼠免受病毒性肝病的侵袭(9)。在人类患者中，可以在不同的分类学水平上观察到肠道菌群失调。Lu等人报道了HBV感染患者的双歧杆菌(Bifidobacteria)/肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(B/E)比率显著降低，表明肠道的微生物定殖抗性受损(10)。Xu等人还进行了物种级别的研究，以揭示在相同的双歧杆菌属中，具有潜在益处的物种在HBV患者中显著减少，而机会致病性物种则显著增加(11)。通过益生元疗法改变肠道菌群的组成，可以减轻乙型和丙型肝炎患者的内毒素血症(12)。上面的研究表明，改变的肠道菌群通过诱导内毒素血浆水平和促进炎症以提供对感染的肝脏组织的二次打击，从而在肝病中发挥重要作用。
然而，关于CHB患者的已发表研究依赖于对16S rRNA基因的定量PCR，这需要针对每个目的属或种专门设计的PCR引物，因此在肠道失调的通量和概述方面存在局限性。随着测序技术和多组学策略的快速发展，有必要深入了解CHB患者的肠道微生物组的详细组成和功能变化及其对肝衰竭进程的影响。
发明内容
本申请使用Illumina MiSeq高通量测序平台来揭示患有肝病(特别是慢性乙型肝炎(CHB))的患者中肠道微生物组的变化。结果，发现多种OTU(操作分类单位)在CHB患者或健康对照中富集。这些OTU可以用作生物标记物，以高效、准确且患者友好地表征肝病，尤其是慢性乙型肝炎。
在一方面，本发明提供了一种评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的方法，其包括以下步骤：
a)收集受试者的粪便样品；
b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTU ID No.:1-12的每个参考OTU的丰度；
c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTU ID No.:1-3的丰度之和/3–OTU ID No.:4-12的丰度之和/9；和
d)如果GDI接近或高于预定水平，则确定受试者患有肝病或慢性乙型肝炎或处于患肝病或慢性乙型肝炎的风险中，
其中，OTU ID No.:1-12分别包含SEQ ID No:1-12所示的核酸序列。
在一些实施方案中，步骤b)中的DNA分析包括以下步骤：获得粪便样品中微生物的系统发生信息基因的序列，并将获得的序列与SEQ ID No:1-12所示的核酸序列进行比对。
在一些实施方案中，所述系统发生信息基因是16s rRNA基因。在优选的实施方案中，所述系统发育信息基因是16S rRNA的V3-V4。
在一些实施方案中，获得微生物的系统发生信息基因的序列包括以下步骤：获得样品中微生物的系统发生信息基因的原始序列读段，并处理所述原始序列读段以获得合格序列。
在一些实施方案中，通过基于PCR的高通量测序技术获得微生物的系统发生信息基因的原始序列读段。在一些实施方案中，原始序列读段是通过使用IlluminaTM测序仪的Illumina测序获得。
在一些实施方案中，原始序列读段的处理包括序列合并、错误校正和质量控制。
在一些实施方案中，序列合并包括序列组合以提供完整的序列。在一些实施方案中，错误校正包括错误序列的校正。在一些实施方案中，质量控制包括去除引物、修整3'末端序列直到达到质量阈值为20的第一核苷酸、去除短序列、去除嵌合体、去除不能与SILVA细菌参考数据库中16S rRNA的高变区V3-V4比对的序列以及去除与人类基因组或不属于细菌的基因组比对的序列。在一些实施方案中，被去除的短序列为400bp或更少。在一些实施方案中，使用UCHIME(19)从头算法，使用丰富序列(abundant sequence)作为参照去除嵌合体。
在一些实施方案中，随机挑选10000个合格序列用于步骤b)中的比对。
在一些实施方案中，使用在比对中与SEQ ID No.:1-12具有97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％同一性的序列来确定每个参考OTU的丰度。
在一些实施方案中，所述预定水平约为-61.5。
在另一方面，本发明提供了一种用于监测患有肝病或慢性乙型肝炎的受试者对疾病治疗或饮食干预的反应的方法，其包括以下步骤：
a)在疾病治疗或饮食干预之前和疾病治疗或饮食干预期间收集受试者的粪便样品；
b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTU ID No.:1-12的每个参考OTU的丰度；
c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTU ID No.:1-3的丰度之和/3–OTU ID No.:4-12的丰度之和/9；和
d)如果在疾病治疗或饮食干预期间GDI降低，则确定受试者对疾病治疗或饮食干预产生积极反应，
其中，OTU ID No.:1-12分别包含SEQ ID No:1-12所示的核酸序列。
在一些实施方案中，步骤b)中的DNA分析包括以下步骤：获得粪便样品中微生物的系统发生信息基因的序列，并将获得的序列与SEQ ID No:1-12所示的核酸序列进行比对。
在一些实施方案中，所述系统发生信息基因是16s rRNA基因。在优选的实施方案中，所述系统发生信息基因是16S rRNA的V3-V4。
在一些实施方案中，获得微生物的系统发生信息基因的序列包括以下步骤：获得样品中微生物的系统发生信息基因的原始序列读段，并处理所述原始序列读段以获得合格序列。
在一些实施方案中，通过基于PCR的高通量测序技术获得微生物的系统发生信息基因的原始序列读段。在一些实施方案中，原始序列读段是通过使用IlluminaTM测序仪进行Illumina测序获得。
在一些实施方案中，原始序列读段的处理包括序列合并、错误校正和质量控制。
在一些实施方案中，序列合并包括序列组合以提供完整的序列。在一些实施方案中，错误校正包括错误序列的校正。在一些实施方案中，质量控制包括去除引物、修整3'末端序列直到达到质量阈值为20的第一核苷酸、去除短序列、去除嵌合体、去除不能与SILVA细菌参考数据库中16S rRNA的高变区V3-V4比对的序列以及去除与人类基因组或不属于细菌的基因组比对的序列。在一些实施方案中，被去除的短序列为400bp或更少。在一些实施方案中，使用UCHIME(19)从头算法，使用丰富序列作为参照去除嵌合体。
在一些实施方案中，随机挑选10000个合格序列用于步骤b)中的比对。
在一些实施方案中，使用在比对中与SEQ ID No.:1-12具有97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％同一性的序列来确定每个参考OTU的丰度。
在一些实施方案中，当在疾病治疗或饮食干预期间GDI变得接近或低于预定水平时，确定受试者对疾病治疗或饮食干预产生积极反应。在一些实施方案中，所述预定水平约为-61.5。
根据下面的详细描述和实施例，本公开的其他特征和优点将变得显而易见，所述详细描述和实施例不应被解释为限制性的。本申请通篇中引用的所有参考文献、Genbank条目、专利和公开的专利申请的内容以引用的方式明确地纳入本文中。
附图说明
图1示出了基于OUT分布的主成分分析(PCA)图。PCA图示出了训练和测试队列完全混合，它们的肠道菌群组成没有显著差异(p＝0.9，PERMANOVA检验)。
图2示出了基于OUT分布的线性判别分析(LDA)图。LDA图示出了CHB组与对照组之间的明显分离(p<0.01，PERMANOVA检验)。
图3示出了为训练和测试队列建立的接收者操作特征曲线。ROC下的留一法(leave-one-out)交叉验证面积(AUC)达到0.87(CHB对比健康对照，95％置信区间：0.78-0.95)(A)。在测试队列中也计算了GDI的ROC，其中AUC也保持0.82(95％置信区间：0.70-0.94)(B)。
具体实施方式
为了可以更容易地理解本公开，在此定义了某些术语。在整个详细说明中阐述了其他定义。
术语“操作分类单位”或“OTU”是指用于对密切相关的个体的组进行分类的操作定义。换言之，OTU是通过特定的分类学标记基因的DNA序列相似性分组的(未培育或未知)生物体的群(cluster)。尽管使用不同的算法或阈值时可以计算出不同的OTU，但Schmidt等人的最新研究证明在生境和几种OTU聚类方法中，微生物OTU通常是生态上一致的。
本文使用的术语“丰度”是指与一个特定OTU相对应的序列的拷贝数。
术语“生物标志物”是指某些生物学状态或状况的可测量的指示物。本文使用的生物标志物是OTU，其丰度数据可以指示肠道菌群失调或肝病。
术语“肝病”是指任何肝病，包括酒精相关的肝病、非酒精性脂肪肝病、肝炎、血色素沉着病和原发性胆汁性肝硬化。在优选的实施方案中，肝病是指慢性乙型肝炎。
术语“慢性乙型肝炎”或“CHB”是指由乙型肝炎病毒导致的持续至少六个月的肝脏炎症。对于患有CHB的患者，血液测试会检测出异常高的肝酶，例如谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)，和/或检测出HBs或HBV DNA。
术语“肠道菌群失调”是指胃肠道中的微生物失衡或适应不良。据报道，肠道菌群失调与疾病有关，例如牙周病、炎症性肠病、慢性疲劳综合症、肥胖症、癌症、细菌性阴道病和结肠炎。
术语“肠道菌群失调指数”或“GDI”是指通过LEfSe鉴定的疾病特异性OTU的定量变化而计算的指数。它是肠道菌群的菌群失调的简单指标。对于每个样本，GDI计算如下：
其中，OTUp和OTUh分别是指在患者和健康对照中富集的OTU的丰度，而P和H分别是指在患者和健康对照中富集的OTU的数量。
本文使用的术语“接收者操作特性曲线”或“ROC曲线”是指举例说明了二进制分类器系统在其辨别阈值变化时的诊断能力的点图。ROC曲线是通过在各种阈值设置下将真阳性率相对于假阳性率作图而绘制的。真阳性率也称为检测的灵敏度、召回(recall)或概率。假阳性率也称为错误警报的后果(fall-out)或概率，可以将其计算为(1-特异性)。因此，ROC曲线是作为后果的函数的灵敏度。
术语“尤登(Youden)指数”是指真阳性率和假阳性率之差。最大化该指数可以从ROC曲线中找到独立于患病率的最佳临界点。该指数以图形方式表示为机会线上方的高度。
本文所用的术语“在ROC曲线下的区域”或“AUC”用于指示将被测试组分为患有或未患所讨论的疾病的测试的准确性。
序列可以根据彼此之间的相似性进行聚类，并且基于研究者设定的相似性阈值(通常为97％相似性)定义操作分类单位。通常，OTU是基于相似的16S rRNA序列。也可以根据一些其他的系统发生信息基因序列(例如18S rRNA和ITS)来定义OTU。
在本发明中，通过扫描整个肠道微生物组，已经发现几种OTU普遍分布在来自CHB患者或对照的样品中，并且还与肝病特别是CHB相关。在这些OTU中，有些在患者中富集，而有些在健康对照中富集。受试者中这些OTU的丰度可用于评估受试者中肝病(特别是慢性乙型肝炎)的存在或发生风险。或者，这些OTU的丰度变化可用于监测患有肝病(特别是慢性乙型肝炎)的患者对疾病治疗或饮食干预的反应。两种方法都可以高效、准确且患者友好的方式进行。
本发明提供了一种评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的方法，其包括以下步骤：
a)收集受试者的粪便样品；
b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTU ID No.:1-12的每个参考OTU的丰度；
c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTU ID No.:1-3的丰度之和/3-OTU ID No.:4-12的丰度之和/9；和
d)如果GDI接近或高于预定水平，则确定受试者患有肝病或慢性乙型肝炎或处于患肝病或慢性乙型肝炎的风险中。
本发明还提供了一种监测患有肝病或慢性乙型肝炎的受试者对疾病治疗或饮食干预的反应的方法，其包括以下步骤：
a)在疾病治疗或饮食干预之前和疾病治疗或饮食干预期间收集受试者的粪便样品；
b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTU ID No.:1-12的每个参考OTU的丰度；
c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTU ID No.:1-3的丰度之和/3–OTU ID No.:4-12的丰度之和/9；和
d)如果在疾病治疗或饮食干预期间GDI降低，则确定受试者对疾病治疗或饮食干预产生积极反应。
可以基于微生物的系统发生信息基因(例如16S rRNA和18S rRNA)来定义和鉴定OTU。在本发明的一些实施方案中，基于16S rRNA，优选地基于16S rRNA的V3-V4，来定义和鉴定OTU。来自OTU ID No.:1-12的16S rRNA的V3-V4的部分或全部的核酸序列分别在SEQID No.:1-12中示出。
为了确定本发明的每个参考OTU的丰度，可以使用本领域公知的任何方法。在一些实施方案中，可以将从粪便样品获得的微生物的系统发生信息基因的序列与SEQ ID No.:1-12中示出的核酸序列进行比对，以确定每种参考OTU的存在和/或丰度。使用在比对中与SEQ ID No.:1-12具有95％或更高、96％或更高、97％或更多、98％或更多、99％或更多或100％同一性的序列来确定每个参考OTU的丰度。
获得微生物的系统发生信息基因的序列包括以下步骤：获得样品中微生物的系统发生信息基因的原始序列读段，并处理该原始序列读段以获得合格序列。
系统发生信息基因的原始序列读段可以通过本领域已知的任何方法获得。在一些实施方案中，微生物的系统发生信息基因的原始序列读段是通过基于PCR的高通量测序技术获得。在一些实施方案中，微生物的系统发生信息基因的原始序列读段是通过使用IlluminaTM测序仪进行的Illumina测序获得。
在比对之前，可以处理获得的原始序列读段以获得合格序列。原始序列读段的处理可以包括本领域已知的序列合并、错误校正和质量控制。
在质量控制之后，可以随机挑选一部分合格序列进行比对，以避免不平衡的测序工作的偏差。在一些实施方案中，每个样品挑出10000个合格序列用于比对。
在步骤b)中确定的OTU的丰度用于计算肠道菌群失调指数(GDI)。对于每个粪便样本，GDI计算如下：
其中，OTUp和OTUh分别是指在患者和健康对照中富集的OTU的丰度，而P和H分别是指在患者和健康对照中富集的OTU的数量。在本发明中，发现三种OTU(OTU ID No.:1-3)在CHB患者中富集，而发现九种OTU(OTU ID No.:4-12)在健康对照中富集。在这方面，在步骤c)中，GDI＝OTU ID No.:1-3的丰度之和/3-OTU ID No.:4-12的丰度之和/9。
在用于评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的方法中，如果GDI接近或高于预定水平，则确定受试者患有慢性乙型肝炎或处于患慢性乙型肝炎的风险中。
可以根据实验室或临床数据设置预定水平。即使预先确定水平，医院或医生也可以根据受试者的年龄、性别、身体状况等进行调整。
在本发明的优选的实施方案中，预定水平为约-61.5。该特定水平是基于如图2中所示的接收者操作特性曲线确定的，该曲线是使用以下实施例中所述的数据绘制的。如上文所述，接收者操作特性曲线是示出了二进制分类器系统在其辨别阈值变化时的诊断能力的点图。尤登指数是指真阳性率和假阳性率之差。尤登指数通常与接收者操作特性(ROC)分析结合使用。对ROC曲线的所有点定义该指数，并且当诊断测试给出数字结果而不是二分式结果时，该指数的最大值可用作选择最佳截止点的标准。因此，在本发明中，当尤登指数达到最大值时，GDI指数为-61.5。
对于监测患有慢性乙型肝炎的受试者对疾病治疗或饮食干预的反应的方法，在一些实施方案中，在疾病治疗或饮食干预期间，当GDI接近或低于预定水平时，确定受试者对疾病治疗或饮食干预产生积极反应。预定水平也优选地为约-61.5，其是基于如图2中所示的ROC曲线和尤登指数确定。
在本发明中，已发现肠道菌群的菌群失调与肝病的发病有关。在另一方面，据报道饮食干预改变了肠道菌群。例如，增加T2DM患者的膳食纤维摄入可以获得改善的血糖控制。因此，饮食干预可能有助于恢复肠道菌群平衡，从而减轻肝病的症状。
实施例
患者和方法
患者
总共招募232名受试者，并且如先前所述进行身体检查(13,14)。在这些受试者中，a)基于在六个月内检测的至少两次血液样本中的ALT水平升高(高于正常范围的上限)，且存在可检测的乙型肝炎表面(HBs)抗原和/或HBV DNA，诊断出206名CHB患者；以及b)健康志愿者被采样为健康对照。排除患有肝硬化、HCC或其他末期疾病(dread disease)的患者。
将182名受试者(12名健康受试者和170名CHB)分配到训练队列中，以描述肝病中肠道菌群的菌群失调。将其余50名受试者(14名健康受试者和36名CHB)分配到测试队列中，用于验证观察到的菌群失调模式。表1示出了这两个队列的一些详细信息。
表1.患者特征
定量结果表示为中位数，将第一和第三个四分位数放入括号中。
缩写：AST，天冬氨酸转氨酶；ALT，丙氨酸转氨酶；GGT，γ-谷氨酰转肽酶；ALB，白蛋白；BA，胆汁酸；TBIL，总胆红素；DBIL，直接胆红素；IDBIL，间接胆红素。
粪便样品收集和微生物DNA提取
在医学检查期间从受试者收集粪便样品，并立即在-80℃下冷冻。从粪便样品中提取DNA并使用Omega凝胶提取试剂盒(D2501-01，OMEGA Bio-Tek，中国台湾)进行纯化。
测序程序
如http://res.illumina.com/documents/products/appnotes/16s-metagenomic-library-prep-guide.pdf中所述(进行以下修改)，通过Illumina MiSeq对来自16S rRNA基因的高变区V3-V4扩增子进行测序。在扩增过程中，铂Pfx DNA聚合酶(C11708021，Invitrogen，美国)用于两个步骤。扩增子PCR(16S rRNA V3-V4区域的扩增)的PCR循环减少到21，以减少PCR偏差。按照方案完成了指数PCR和PCR产物的纯化。使用的引物是：S-D-Bact-0341-b-S-17，
5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'和S-D-Bact-0785-a-A-21，
5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'(15)。使用2×300bp的配对末端测序对扩增子进行测序。
将序列聚类为操作分类单位(OTU)
使用moira v1.1.0进行序列合并、错误校正和质量控制(16)。之后将PCR引物截短。序列的长度限制为>400bp。QC序列被去复制为独特序列，并使用mothur中“align.seqs”命令(18)与SILVA细菌参考数据库(17)进行比对。通过去除未能正确比对的序列来优化比对空间，以确保所有剩余序列在SILVA参考比对的同一区域重叠。它们是按样本划分的，并使用UCHIME(19)从头算法，使用丰富序列作为参照来检查嵌合体。非嵌合序列根据RDP分类器训练集v9的mothur格式化版本进行分类(20)，并进一步滤出非细菌序列。最终的合格序列被稀疏到每个样品10,000个，以避免不平衡测序工作的偏差。通过减少丰度对合格的独特序列进行分类，并保留单项物(singleton)。然后通过UPARSE选出非嵌合OTU代表序列，其相似性阈值为97％(21)。通过使用USEARCH(22)全局比对算法将合格序列映射到获得的OTU来完成OTU表。
共丰度组(CAG)的构建
考虑了在10个以上受试者中普遍分布的OTU。通过SparCC计算它们在受试者之间的丰度配对关联(23)。将相关性转换为相关距离(1-相关系数)，然后使用Ward聚类算法进行聚类。通过PERMANOVA检验(排列数＝9,999)在最高聚类水平上确定共丰度组的数量，组间距离显著高于组内距离(p<0.01)。每个CAG的丰度由该组内OTU的累积丰度定义。Cytoscape v3.3.0显示了OTU之间的强相关性(|r|>0.3，p<0.01)(24)。
统计学分析
R中的vegan(25)程序包使用置换多元方差分析(PERMANOVA)检验。通过LEfSev1.0实现了线性判别分析(LDA)效应量(LEfSe)方法(26)。ROC曲线是通过R中的pROC(27)程序包进行计算。使用mixOmics v6.1.0(28)R程序包进行稀疏偏最小二乘法(sPLS)分析。多重比较的p值是通过错误发现率(FDR)算法进行调整。
实施例1：肠道菌群概述
在配对末端合并、错误校正和质量过滤流程之后，将合格序列稀疏化为每个样品10,000个序列，并在97％相似性阈值水平上聚类成886个从头OTU。基于OTU分布的主成分分析(PCA)图示出了，训练和测试队列完全混合(图1)及其肠道菌群的组成没有显著差异(p＝0.9，PERMANOVA检验)。肠道菌群的OTU丰富度和系统发生多样性在组间没有显著差异。相反，基于OTU分布的LDA图示出了CHB组与对照组之间有清晰的分离(图2，p<0.01，PERMANOVA检验)。CHB患者表现出肠道菌群组成的全身性菌群失调。
实施例2：在OTU水平的疾病特异性肠道菌群失调
在训练队列(n＝183)中，本发明人使用线性判别分析效应量(LEfSe)来识别与健康对照相比的疾病特异性OTU。对于CHB，检测到60种out显著增加或减少，其中12种OTU普遍分布在超过50个样本中(表2)。在CHB患者中富集的3种OTU属于梭菌属(Clostridium)XI和巨单胞菌属(Megamonas)，而在健康对照中富集的9种OTU则属于丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、另枝菌属(Alistipes)、巴那斯拉菌属(Barnesiella)和毛螺菌科(Lachnopiraceae)的未分类属。
表2.通过线性判别分析效应量(LEfSe)方法确定的疾病特异性OTU
根据上文确定的疾病特异性和普遍的OTU计算肠道菌群失调指数(GDI)，以评估此类生物标记物的临床应用。患者中CHB特异性GDI显著高于健康对照(p<0.01，Wilcoxon检验)。根据GDI建立接收者操作特性曲线(ROC)，ROC下的留一法交叉验证面积(AUC)达到0.87(CHB对比健康对照，95％置信区间：0.78-0.95)(图3A)。
在测试队列中也计算了GDI的ROC，其中AUC也维持在0.82(95％置信区间：0.70-0.94)(图3B)，表明CHB患者的肠道菌群失调很强。
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<130> CP1170893P-CN/CB
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 401
<212> DNA
<213> 梭菌属XI种(Clostridium XI sp.)
<400> 1
tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcaa cgccgcgtga gcgatgaagg 60
ccttcgggtc gtaaagctct gtcctcaagg aagataatga cggtacttga ggaggaagcc 120
ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg ggctagcgtt atccggattt 180
actgggcgta aagggtgcgt aggcggtctt ttaagtcagg agtgaaaggc tacggctcaa 240
ccgtagtaag ctcttgaaac tggaggactt gagtgcagga gaggagagtg gaattcctag 300
tgtagcggtg aaatgcgtag atattaggag gaacaccagt agcgaaggcg gctctctgga 360
ctgtaactga cgctgaggca cgaaagcgtg gggagcaaac a 401
<210> 2
<211> 427
<212> DNA
<213> 巨单胞菌属种(Megamonas sp.)
<400> 2
tggggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgcgtga acgatgaagg 60
tcttaggatc gtaaagttct gttgttaggg acgaagggta agaatcataa taaggttttt 120
atttgacggt acctaacgag gaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 180
gtaggcggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gagcgcaggc gggaaactaa 240
gcggatctta aaagtgcggg gctcaacccc gtgatggggt ccgaactggt tttcttgagt 300
gcaggagagg aaagcggaat tcccagtgta gcggtgaaat gcgtagatat tgggaagaac 360
accagtggcg aaggcggctt tctggactgt aactgacgct gaggctcgaa agctagggta 420
gcgaacg 427
<210> 3
<211> 427
<212> DNA
<213> 巨单胞菌属种
<400> 3
tggggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgcgtga acgatgaagg 60
tcttaggatc gtaaagttct gttgttaggg acgaaggata aggattataa tacagtcttt 120
gtttgacggt acctaacgag gaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 180
gtaggcggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gagcgcaggc gggaaactaa 240
gcggatctta aaagtgcggg gctcaacccc gtgatggggt ccgaactggt tttcttgagt 300
gcaggagagg aaagcggaat tcccagtgta gcggtgaaat gcgtagatat tgggaagaac 360
accagtggcg aaggcggctt tctggactgt aactgacgct gatgctcgaa agtgtgggta 420
tcaaaca 427
<210> 4
<211> 422
<212> DNA
<213> 拟杆菌属种(Bacteroides sp.)
<400> 4
tgaggaatat tggtcaatgg acgagagtct gaaccagcca agtagcgtga aggatgactg 60
ccctatgggt tgtaaacttc ttttatacgg gaataaagtg aggcacgtgt gcctttttgt 120
atgtaccgta tgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga 180
tccgagcgtt atccggattt attgggttta aagggagcgt aggcggacgc ttaagtcagt 240
tgtgaaagtt tgcggctcaa ccgtaaaatt gcagttgata ctgggtgtct tgagtacagt 300
agaggcaggc ggaattcgtg gtgtagcggt gaaatgctta gatatcacga agaactccga 360
ttgcgaaggc agcttgctgg actgtaactg acgctgatgc tcgaaagtgt gggtatcaaa 420
ca 422
<210> 5
<211> 422
<212> DNA
<213> 拟杆菌属种
<400> 5
tgaggaatat tggtcaatgg gcggaagcct gaaccagcca agtagcgtga aggatgactg 60
ccctatgggt tgtaaacttc ttttataggg gaataaaatg agccacgtgt ggctttttgt 120
atgtacccta tgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga 180
tccgagcgtt atccggattt attgggttta aagggagcgt aggtggacat gtaagtcagt 240
tgtgaaagtt tgcggctcaa ccgtaaaatt gcagttgata ctgtgtgtct tgagtacagt 300
agaggtgggc ggaattcgtg gtgtagcggt gaaatgctta gatatcacga agaactccga 360
ttgcgaaggc agctcactgg actgttactg acactgaggc tcgaaagtgt gggtatcaaa 420
ca 422
<210> 6
<211> 402
<212> DNA
<213> 未分类的毛螺菌科种(Lachnospiraceae sp.)
<400> 6
tggggaatat tgcacaatgg gggaaaccct gatgcagcga cgccgcgtga gcgaagaagt 60
atttcggtat gtaaagctct atcagcaggg aagataatga cggtacctga ctaagaagct 120
ccggctaaat acgtgccagc agccgcggta atacgtatgg agcaagcgtt atccggattt 180
actgggtgta aagggagcgt agacggcagg gcaagtctga tgtgaaaacc cggggctcaa 240
ccccgggact gcattggaaa ctgtccggct ggagtgcagg agaggtaagt ggaattccta 300
gtgtagcggt gaaatgcgta gatattagga ggaacaccag tggcgaaggc ggcttactgg 360
actgtaactg acgttgaggc tcgaaagcgt ggggagcaaa ca 402
<210> 7
<211> 402
<212> DNA
<213> 未分类的毛螺菌科种
<400> 7
tggggaatat tgcacaatgg gggaaaccct gatgcagcga cgccgcgtga gtgaagaagt 60
atttcggtat gtaaagctct atcagcaggg aagataatga cggtacctga ctaagaagcc 120
ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg ggcaagcgtt atccggattt 180
actgggtgta aagggtgcgt aggtggcaag gcaagtcaga tgtgaaagcc cggggctcaa 240
ccccggtact gcatttgaaa ctgtctggct agagtgcagg agaggtaagc ggaattccta 300
gtgtagcggt gaaatgcgta gatattagga ggaacaccag tggcgaaggc ggcttactgg 360
actgtaactg acactgaggc acgaaagcgt ggggagcaaa ca 402
<210> 8
<211> 422
<212> DNA
<213> 巴那斯拉菌属种(Barnesiella sp.)
<400> 8
tgaggaatat tggtcaatgg tcggcagact gaaccagcca agtcgcgtga gggaagacgg 60
ccctacgggt tgtaaacctc ttttgtcgga gagtaaagtg cgctacgcgt agcgtattgc 120
aagtatccga agaaaaagca tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga 180
tgcgagcgtt atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggcacg ccaagtcagc 240
ggtgaaattt ccgggctcaa cccggactgt gccgttgaaa ctggcgagct agagtgcaca 300
agaggcaggc ggaatgcgtg gtgtagcggt gaaatgcata gatatcacgc agaaccccga 360
ttgcgaaggc agcctgctag ggtgcgacag acgctgaggc acgaaagcgt gggtatcgaa 420
ca 422
<210> 9
<211> 421
<212> DNA
<213> 丁酸单胞菌属种(Butyricimonas sp.)
<400> 9
tgaggaatat tggtcaatgg gcgagagcct gaaccagcca agtcgcgtga gggaagaatg 60
gtctatggcc tgtaaacctc ttttgtcaag gaagaataag cggcacgagt gccaccttgc 120
cagtacttga cgaataagca tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggggga 180
tgcgagcgtt atccggattt attgggttta aagggcgcgt aggcgggacg gcaagtcagc 240
ggtaaaagac tgcagctaaa ctgtagcacg ccgttgaaac tgtcgacctg gagacgagac 300
gagggaggcg gaacaagtga agtagcggtg aaatgcatag atatcacttg gaaccccgat 360
agcgaaggca gcttcccagg ctcggtctga cgctgatgcg cgagagcgtg ggtagcgaac 420
a 421
<210> 10
<211> 422
<212> DNA
<213> 副拟杆菌属种(Parabacteroides sp.)
<400> 10
tgaggaatat tggtcaatgg ccgagaggct gaaccagcca agtcgcgtga gggatgaagg 60
ttctatggat cgtaaacctc ttttataagg gaataaagtg cgggacgtgt cccgttttgt 120
atgtacctta tgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga 180
tccgagcgtt atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggcctt ttaagtcagc 240
ggtgaaagtc tgtggctcaa ccatagaatt gccgttgaaa ctggggggct tgagtatgtt 300
tgaggcaggc ggaatgcgtg gtgtagcggt gaaatgcata gatatcacgc agaaccccga 360
ttgcgaaggc agcctgccaa gccattactg acgctgatgc acgaaagcgt ggggatcaaa 420
ca 422
<210> 11
<211> 422
<212> DNA
<213> 另枝菌属种(Alistipes sp.)
<400> 11
tgaggaatat tggtcaatgg acggaagtct gaaccagcca tgccgcgtgc aggaagacgg 60
ctctatgagt tgtaaactgc ttttgtacga gggtaaacgc agatacgtgt atctgcctga 120
aagtatcgta cgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga 180
tccaagcgtt atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggttta gtaagtcagc 240
ggtgaaattt tggtgcttaa caccaaacgt gccgttgata ctgctgggct agagagtagt 300
tgcggtaggc ggaatgtatg gtgtagcggt gaaatgctta gagatcatac agaacaccga 360
ttgcgaaggc agcttaccaa actatatctg acgttgaggc acgaaagcgt ggggagcaaa 420
ca 422
<210> 12
<211> 422
<212> DNA
<213> 另枝菌属种
<400> 12
tgaggaatat tggtcaatgg acgcaagtct gaaccagcca tgccgcgtgc aggatgaagg 60
tgctatgcat tgtaaactgc ttttgtacga gggtaaattc agatacgtgt atctgtttga 120
aagtatcgta cgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga 180
tccgagcgtt atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggtttg ataagttaga 240
ggtgaaagct cgatgctcaa catcgaaatt gcctctgata ctgtcagact agagtgtagt 300
tgcggaaggc ggaatgtgtg gtgtagcggt gaaatgctta gatatcacac agaacaccga 360
ttgcgaaggc agctttccaa gctattactg acgctgaggc acgaaagcgt gggtagcgaa 420
ca 422
Claims (6)
1.OTU用于制备一种评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的检测试剂的用途，其中评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的方法包括以下步骤：
a)收集受试者的粪便样品；
b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTU ID No.:1-12的每个参考OTU的丰度；
c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTU ID No.:1-3丰度之和/3–OTU ID No.:4-12丰度之和/9；和
d)如果GDI接近或高于预定水平，则确定受试者患有肝病或慢性乙型肝炎或处于患肝病或慢性乙型肝炎的风险中，其中所述预定水平是-61.5；
其中，OTU ID No.:1-12的核酸序列分别在SEQ ID No:1-12中示出；
其中，步骤b)中确定选自OTU ID No.:1-12的每个参考OTU的丰度包括：
将序列聚类为操作分类单位(OTU)
使用moira v1.1.0进行序列合并、错误校正和质量控制；之后将PCR引物截短；序列的长度限制为>400bp；QC序列被去复制为独特序列，并使用mothur中“align.seqs”命令与SILVA细菌参考数据库进行比对；通过去除未能正确比对的序列来优化比对空间，以确保所有剩余序列在SILVA参考比对的同一区域重叠；它们是按样本划分的，并使用UCHIME从头算法，使用丰富序列作为参照来检查嵌合体；非嵌合序列根据RDP分类器训练集v9的mothur格式化版本进行分类，并进一步滤出非细菌序列；最终的合格序列被稀疏到每个样品10,000个，以避免不平衡测序工作的偏差；通过减少丰度对合格的独特序列进行分类，并保留单项物(singleton)；然后通过UPARSE选出非嵌合OTU代表序列，其相似性阈值为97％；通过使用USEARCH全局比对算法将合格序列映射到获得的OTU来完成OTU表；
共丰度组(CAG)的构建
考虑了在10个以上受试者中普遍分布的OTU；通过SparCC计算它们在受试者之间的丰度配对关联；将相关性转换为相关距离，所述相关距离为1-相关系数，然后使用Ward聚类算法进行聚类；通过排列数＝9,999的PERMANOVA检验在最高聚类水平上确定共丰度组的数量，组间距离显著高于组内距离，其p<0.01；每个CAG的丰度由该组内OTU的累积丰度定义；Cytoscape v3.3.0显示了OTU之间的强相关性，其|r|>0.3，p<0.01；
统计学分析
R中的vegan程序包使用置换多元方差分析(PERMANOVA)检验；通过LEfSev1.0实现了线性判别分析(LDA)效应量(LEfSe)方法；ROC曲线是通过R中的pROC程序包进行计算；使用mixOmics v6.1.0R程序包进行稀疏偏最小二乘法(sPLS)分析；多重比较的p值是通过错误发现率(FDR)算法进行调整。
2.OTU用于制备一种监测患有肝病或慢性乙型肝炎的受试者对疾病治疗或饮食干预的反应的检测试剂的用途，其中监测患有肝病或慢性乙型肝炎的受试者对疾病治疗或饮食干预的反应的方法包括以下步骤：
a)在疾病治疗之前和疾病治疗期间收集受试者的粪便样品；
b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTU ID No.:1-12的每个参考OTU的丰度；
c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTU ID No.:1-3丰度之和/3–OTU ID No.:4-12丰度之和/9；和
d)如果在疾病治疗或饮食干预期间GDI变得接近或低于-61.5，则确定受试者对所述疾病治疗或饮食干预产生积极反应，
其中，OTU ID No.:1-12的核酸序列分别在SEQ ID No:1-12中示出；
其中，步骤b)中确定选自OTU ID No.:1-12的每个参考OTU的丰度包括：
将序列聚类为操作分类单位(OTU)
使用moira v1.1.0进行序列合并、错误校正和质量控制；之后将PCR引物截短；序列的长度限制为>400bp；QC序列被去复制为独特序列，并使用mothur中“align.seqs”命令与SILVA细菌参考数据库进行比对；通过去除未能正确比对的序列来优化比对空间，以确保所有剩余序列在SILVA参考比对的同一区域重叠；它们是按样本划分的，并使用UCHIME从头算法，使用丰富序列作为参照来检查嵌合体；非嵌合序列根据RDP分类器训练集v9的mothur格式化版本进行分类，并进一步滤出非细菌序列；最终的合格序列被稀疏到每个样品10,000个，以避免不平衡测序工作的偏差；通过减少丰度对合格的独特序列进行分类，并保留单项物(singleton)；然后通过UPARSE选出非嵌合OTU代表序列，其相似性阈值为97％；通过使用USEARCH全局比对算法将合格序列映射到获得的OTU来完成OTU表；
共丰度组(CAG)的构建
考虑了在10个以上受试者中普遍分布的OTU；通过SparCC计算它们在受试者之间的丰度配对关联；将相关性转换为相关距离，所述相关距离为1-相关系数，然后使用Ward聚类算法进行聚类；通过排列数＝9,999的PERMANOVA检验在最高聚类水平上确定共丰度组的数量，组间距离显著高于组内距离，其p<0.01；每个CAG的丰度由该组内OTU的累积丰度定义；Cytoscape v3.3.0显示了OTU之间的强相关性，其|r|>0.3，p<0.01；
统计学分析
R中的vegan程序包使用置换多元方差分析(PERMANOVA)检验；通过LEfSev1.0实现了线性判别分析(LDA)效应量(LEfSe)方法；ROC曲线是通过R中的pROC程序包进行计算；使用mixOmics v6.1.0R程序包进行稀疏偏最小二乘法(sPLS)分析；多重比较的p值是通过错误发现率(FDR)算法进行调整。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中使用在比对中与SEQ IDNo.:1-12具有大于97％同一性的序列来确定每个参考OTU的丰度。
4.根据权利要求3所述的用途，其中使用在比对中与SEQ ID No.:1-12具有98％或更高同一性的序列来确定每个参考OTU的丰度。
5.根据权利要求4所述的用途，其中使用在比对中与SEQ ID No.:1-12具有99％或更高同一性的序列来确定每个参考OTU的丰度。
6.根据权利要求5所述的用途，其中使用在比对中与SEQ ID No.:1-12具有100％同一性的序列来确定每个参考OTU的丰度。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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