CN1769495A - 与肝细胞癌相关的乙型肝炎病毒基因组标志物 - Google Patents

与肝细胞癌相关的乙型肝炎病毒基因组标志物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了预测HBV感染个体发展成肝细胞癌(HCC)的遗传素因的方法。

Description

与肝细胞癌相关的乙型肝炎病毒基因组标志物
发明背景
在世界范围内，有超过3亿人感染乙肝病毒(HBV)。对那些具有高度病毒复制水平的个体来说，由慢性活动型肝炎发展为肝硬化，肝衰竭和肝细胞癌(HCC)是常见的。
慢性HBV感染超过10至20年的自然进程导致20％至50％的患者出现肝硬化，并已证明HBV感染能够发展为肝细胞癌。目前没有关于确定究竟何种乙肝病毒亚型最易诱发肝细胞癌的任何研究，因此至今认为所有的乙肝病毒都具有相同的肝细胞癌形成危险。
值得注意的是，从初次诊断算起，诊断患有肝细胞癌的患者存活期仅有0.9至12.8个月(Takahashi et al.，American Journal of Gastroenterology88：240-243(1993))。采用化疗的方法对肝细胞癌进行治疗的收效甚微，由于在肝中肿瘤的广泛扩散(Trinchet et al.，Presse Medicine 23：831-833(1994))，仅有10％的患者可从手术中获益。因原发肝细胞癌的侵入特性，手术治疗中唯一可行的选择是肝移植(Pichlmayr et al.，Hepatology20：33S-40S(1994))。
发明内容
本发明提供了确定感染乙型肝炎病毒(HBV)个体发展成为肝细胞癌(HCC)遗传素因的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：
(a)确定分离自所述个体的HBV基因组中对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2712位的核苷酸；及
(b)将确定的核苷酸和HCC遗传素因相关的核苷酸进行比较，其中所述HCC遗传素因相关的核苷酸包括：31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A和/或2712G。
在一些实施方案中，所述方法包括：
(a)确定分离自所述个体的B基因型HBV基因组中对应于SEQ IDNO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525或2712位的核苷酸；及
(b)将确定的核苷酸和HCC遗传素因相关的核苷酸进行比较，其中HCC遗传素因相关的核苷酸包括：1165T，1762T，1764A，2525C，2712C，2712A或2712G。
在一些实施方案中，所述方法包括：
(a)确定分离自个体的B基因型HBV基因组中对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸；及
(b)将确定的核苷酸和HCC遗传素因相关的核苷酸进行比较，其中在B基因型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
1762T和1764A和2712A；或
1762T和1764A和2712C；或
1762T和1764A和2712G；或
1762T和1764A和2712T和2525C；或
1762A和1764G和1165T。
在一些实施方案中，所述方法包括确定来自所述个体HBV的基因型。
在一些实施方案中，所述确定步骤包括对侧翼连接有对应于SEQ IDNO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸的HBV基因组进行核苷酸测序。
在一些实施方案中，所述确定步骤包括对至少HBV基因组的部分进行扩增，以产生一种或更多种包括有对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位核苷酸的扩增产物。在一些实施方案中，所述方法包括将所述一种或更多种扩增产物与一种或更多种能与HCC相关核苷酸杂交的探针相接触，只有在所述扩增产物在HCC相关核苷酸位置含有互补核苷酸的条件下，所述探针与所述扩增产物才能进行杂交，所述相关核苷酸为：
1762T和1764A和2712A；或
1762T和1764A和2712C；或
1762T和1764A和2712G；或
1762T和1764A和2712T和2525C；或
1762A和1764G和1165T。
在一些实施方案中，所述杂交是通过线性探针进行的。
在一些实施方案中，所述方法包括：
(a)确定分离自所述个体的C基因型HBV基因组中对应于核苷酸第31，53，312，799，961，1499，1613，1899，2170或2441位的核苷酸；及
(b)对确定的核苷酸和HCC遗传素因相关的核苷酸进行比较，其中该HCC遗传素因相关的核苷酸包括：31C，53C，312C，799G，961G，1499G，1613A，1899A，2170C，2170G或2441C。
在一些实施方案中，所述方法包括：
a)确定来自所述个体C基因型HBV的亚型，其中：
C1亚型包括核苷酸2733A，1856C，1009T和2892T，
C2亚型包括核苷酸2733C，1856T，1009T和2892T，和
C3亚型包括核苷酸2733C，1856C，1009C和2892T；
b1)如果HBV的基因型为C1，则确定对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53和1499位的核苷酸；或
b2)如果HBV的基因型为C2，则确定对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸；及
b3)如果HBV的基因型为C3，则确定对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第312，961，1613，1899位的核苷酸；及
c)将确定的核苷酸和HCC遗传素因相关位置上的核苷酸进行比较，其中在C1亚型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
31C；和/或
53C；和/或
1499G；及
在C2亚型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
2170C；和/或
2170G；和/或
2441C；和/或
799G；及
在C3亚型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
312C；和/或
961G；和/或
1613A；和/或
1899A。
在一些实施方案中，所述确定步骤包括对侧翼连接有对应于SEQ IDNO：1中核苷酸第31，53和1499位的核苷酸的HBV基因组进行核苷酸测序。在一些实施方案中，所述确定步骤包括对侧翼连接有对应于SEQ IDNO：1中核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸的HBV基因组进行核苷酸测序。在一些实施方案中，所述确定步骤包括对至少HBV基因组的部分进行扩增，以产生一种或更多种包含有对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53和1499位的核苷酸的扩增产物。在一些实施方案中，所述确定步骤包括对侧翼连接有对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第312，961，1613和1899位的核苷酸的HBV基因组进行核苷酸测序。
在一些实施方案中，所述确定步骤包括对至少HBV基因组的部分进行扩增，以产生一种或更多种包含有对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸扩增产物。在一些实施方案中，所述确定步骤包括对至少HBV基因组的部分进行扩增，以产生一种或更多种包含有对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第312，961，1613和1899位的核苷酸扩增产物。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述一种或更多种扩增产物与一种或更多种能与HCC相关核苷酸杂交的探针相接触，只有在所述扩增产物在HCC相关核苷酸位置含有互补核苷酸的条件下，所述探针与所述扩增产物才能进行杂交，所述相关核苷酸为：
31C；和/或
53C；和/或
1499G。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述一种或更多种扩增产物与一种或更多种能与HCC相关核苷酸杂交的探针相接触，只有在所述扩增产物在HCC相关核苷酸位置含有互补核苷酸的条件下，所述多种探针与所述扩增产物才能进行杂交，所述相关核苷酸为：
2170G；和/或
2441C；和/或
799G。
在一些实施方案中，所述杂交是通过线性分析法进行的。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述一种或更多种扩增产物与一种或更多种能与HCC相关核苷酸杂交的探针相接触，只有在所述扩增产物在HCC相关核苷酸位置含有互补核苷酸的条件下，所述多种探针与所述扩增产物才能进行杂交，所述相关核苷酸为：
312C；和/或
961G；和/或
1613A；和/或
1899A。
在一些实施方案中，所述杂交是通过线性分析法进行的。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定所述个体HBV的基因型。
在一些实施方案中，所述方法包括
确定HBV的基因型，其中B基因型包括2733C、1856C、1009T和2892T，其中C1基因型包括2733A、1856C、1099T和2892T，C2基因型包括2733C、1856T、1009T和2892T，C3基因型包括2733C、1856C、1009C和2892T；
如果HBV的基因型为B，则确定HBV基因组上对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸；和/或
如果HBV的基因型为C1，则确定HBV基因组上对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31和/或53和/或1499位的核苷酸；和/或
如果HBV的基因型为C2，则确定HBV基因组上对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第2170和/或2441和/或799位的核苷酸；和/或
如果HBV的基因型为C3，则确定HBV基因组上对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第312和/或961和/或1613和/或1899位的核苷酸；和/或
将确定的核苷酸和HCC遗传素因相关的核苷酸进行比较，
其中在B基因型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
1762T和1764A和2712A；或
1762T和1764A和2712C；或
1762T和1764A和2712G；或
1762T和1764A和2712T和2525C；或
1762A和1764G和1165T；
其中在C1基因型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
31C；和/或
53C；和/或
1499G；和
其中在C2基因型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
2170C；和/或
2170G；和/或
2441C；和/或
799G；
其中在C3基因型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
312C；和/或
961G；和/或
1613A；和/或
1899A；
由此确定所述个体发展成为HCC的遗传素因。
本发明还提供了确定与肝细胞癌(HCC)发展有关的HBV分离物的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括：
一种或更多种探针，当其与HBV基因组接触时，如果所述基因组包括至少一种下列对应于SEQ ID NO：1中核苷酸位置的核苷酸时选择性地与所述基因组杂交，所述核苷酸有：
31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1762A，1764A，1764G，1899A，2441C，2170C，2170G，2712A，2712C，2712G或2525C。
在一些实施方案中，所述探针与固体支持物相连。
在一些实施方案中，所述探针选择性地杂交于：
1762T和1764A和2712A；和/或
1762T和1764A和2712C；和/或；
1762T和1764A和2712G；和/或
1762T和1764A和2712T和2525C；和/或
1762A和1764G和1165T。
在一些实施方案中，所述探针选择性地杂交于：
31C；和
53C；和
1499G。
在一些实施方案中，所述探针选择性地杂交于：
2170C；和/或
2170G；和/或
2441C；和/或
799G。
在一些实施方案中，所述探针选择性地杂交于：
312C；和/或
961G；和/或
1613A；和/或
1899A。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于扩增至少HBV基因组的部分的引物。
本发明还提供了计算机可读的介质，该介质用于鉴定HBV序列是否有可能导致HCC发生。在一些实施方案中，所述计算机可读介质包括：
a)接收信息的编码，该信息描述：
对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525或2712位的核苷酸；
b)将在a)中接收的核苷酸和HCC遗传素因相关的核苷酸进行比较的编码；及
c)提供确定导致HCC的HBV遗传素因的编码，
其中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1762A，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C、2712C，2712A或2712G。
定义
当存在所述特定核苷酸(在特定位置)时，当所述探针与所述基因组杂交时，探针与包含特定核苷酸的病毒基因组“选择性地杂交”，但在特定位置上的核苷酸是不同的核苷酸或缺失时则不发生杂交。只有特定的靶DNA中有互补核苷酸时，允许探针和特定DNA分子发生杂交的条件通常是“严谨杂交条件”。
“严谨杂交条件”是这样一种条件，在该条件下探针通常在核酸的复杂的混合物中与其靶标子序列杂交，而不与其他序列杂交，或至少不与在其特定位置不是一种特定核苷酸而是其它核苷酸的其他序列杂交。严谨条件是序列依赖的且在不同情况下情况各异。在较高温度下进行较长序列的特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指导参见Tijssen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(1993)。一般地，在给定离子强度、pH下对特异序列严谨条件的选择通常比热熔温度(Tm)低5℃至10℃。Tm是指在该温度下(给定离子强度、pH和核酸浓度)，50％与靶序列互补的探针和靶序列的杂交达到平衡(当靶序列过量时，在Tm，平衡时有50％的探针被结合)的温度。对于Southern杂交的严谨条件一般是在pH 7.0-9.3之间，盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约为0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，以及对短探针(例如10-50个核苷酸)该温度为至少约30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)该温度至少约为60℃的杂交条件。通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂也能实现严谨条件。对选择性杂交而言，阳性信号至少为背景的两倍，也可为背景杂交的10倍，该背景杂交是在所述目的位置处与另外具有不同核苷酸的核酸序列的杂交。严谨杂交条件的示例如下：50％甲酰胺、5×SSC、1％SDS、42℃孵育，或者是5×SSC、1％SDS、65℃孵育，用0.2×SSC、0.1％SDS、在65℃漂洗，该漂洗可进行5分钟，15分钟，30分钟，60分钟，120分钟或更长的时间。
参考序列(例如SEQ ID NO：1)的特定核苷酸“对应位置处的HBV基因组中核苷酸的确定”是指对分离到的HBV基因组上等同于参考序列所述特定位置处的位置进行确定。本发明确定的变体不限于预测SEQ IDNO：1变体遗传素因的序列，还能应用于任何携带有特定对应核苷酸的HBV株。所以，当HBV分离物的基因组与SEQ ID NO：1不同时(例如发生核苷酸的改变或核苷酸的添加或缺失)，与HCC发生有关的特定核苷酸有可能与其在SEQ ID NO：1上的位置不完全一致。例如，由于在HBV株基因组较前位置有一个核苷酸的插入，对应于SEQ ID NO：1上31C位的核苷酸位置在该特异HBV株中可能发生在32位的核苷酸位置上。尽管如此，通过对两个序列的比对，能很容易地说明HBV株上的32位的核苷酸位置对应于SEQ ID NO：1上的31位的核苷酸位置。如本发明所述，使用诸如BLAST的比对算法能在HBV分离物的基因组中确定对应的核苷酸。
附图简要说明
图1所示为用于扩增HBV基因组区域的引物位置及产生的相对于HBV基因组的扩增片段的位置，在附图底部用直线表示该HBV基因组。
图2A和图2B所示为示例性的B基因型HBV的分离物的基因组(SEQID NO：1)，其包括与HCC发生相关的标记出的核苷酸。
图3A和图3B所示为示例性的C1基因型HBV分离物的基因组(SEQID NO：2)，其包括与HCC发生相关的标记出的核苷酸。
图4A和图4B所示为示例性的C2基因型HBV分离物的基因组(SEQID NO：3)，其包括与HCC发生相关的标记出的核苷酸。
具体实施方案
I.引言
本发明基于这样一种发现，在感染了HBV的个体中，HBV的特定序列变异与肝细胞癌(HCC)的发生相关。特别地，HBV基因组中以下核苷酸的存在与HCC的发生相关：31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A或2712G。据此，本发明提供了通过确定感染患者的HBV变体的核酸序列来确定感染了HBV的患者是否具有HCC的遗传素因。该方法提供包括检测任何与HCC相关的特异性变体的试剂的试剂盒，以及应用本发明方法的计算机可读形式。
II.确定与HCC相关的HBV变体
可采用多种方法来确定对应于SEQ ID NO：1上、核苷酸的第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2721位和/或本发明所述其它位置的核苷酸。
在一些实施方案中，采用核苷酸测序技术对HBV基因组特定位置的核苷酸进行确定。并非是对本发明的限制，核苷酸测序的例子包括链末端测序。参见例如Sanger et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74：5463-5467(1977)；Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，1994))。可在HBV基因组或其片段扩增后进行测序。也可以通过在PCR过程中向扩增子中选择性地掺入抗硼化核酸酶的核苷酸以及对扩增子进行核酸酶消化以产生按大小排列的模板片段对PCR产生的扩增子进行直接测序(Porter et al.，Nucleic Acids Research 25(8)：1611-1617(1997))。或者，也能采用如公开号为2003/0215862的美国专利公开中所描述的显微流态(microfluidic)技术。也可参见公开号为2003/0215862的美国专利公开中所描述的替代测序方法。
也可使用与HBV基因组特定位置核苷酸结合的特异探针来确定HBV基因组中的核苷酸。检测与HCC相关特定核苷酸的探针可用于反向杂交分析形式中，该形式采用固体支持物上不同位置固化的寡核苷酸探针。更特别地是能采用线性探针分析法(LiPA)的方法。该LiPA是在固体支持条片上固化有平行线型寡核苷酸探针的反向杂交分析方法。参见公开号为WO94/12670的PCT申请。在这种分析方法中，可将特异的寡核苷酸固化于膜片上的已知位置并在严格控制的条件下与标记的PCR产物杂交。可以设计不同的探针，使得所述条片上的每一个探针都包含HBV核苷酸序列或其互补序列，但在特定位置含有不同核苷酸。对HBV基因组或其片段进行的扩增，及将扩增产物与一种或更多种特定变体的探针杂交会导致一种所述探针对扩增产物全部或至少优先的杂交，从而提示所扩增的基因组中含有所述特定位置处的核苷酸。使用这种分析方法的杂交条件通常设置为高严谨性条件以至于只有一个探针可与扩增产物相结合。例如，示例性的条件包括例如标准的杂交和洗涤条件(例如，62℃时含有0.1％十二烷基磺酸钠的1×SSC缓冲液)。
HBV的扩增
在对与HCC相关位置的核苷酸进行确定之间就可以对HBV基因组或其部分进行扩增。“扩增”是指导致模板核酸序列拷贝数增加的包括酶反应在内的任何化学反应。扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)(参见美国专利第4,683,195和4,683,202号；PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications(Innis et al.，eds，1990))，链置换扩增(SDA)(Walker，et al.Nucleic Acids Res.20(7)：1691-6(1992)；Walker PCRMethods Appl 3(1)：1-6(1993))，转录介导扩增(Phyffer，et al.，J.Clin.Microbiol.34：834-841(1996)；Vuorinen，et al.，J.Clin.Microbiol.33：1856-1859(1995))，基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton，Nature350(6313)：91-2(1991)，滚环扩增(RCA)(Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)：75-99(1999))；Hatch et al.，Genet.Anal.15(2)：35-40(1999))以及分支的DNA信号扩增(bDNA)(例如参见Iqbal et al.，Mol.Cell Probes13(4)：315-320(1999))。
HBV基因组的扩增部分(随意标记的)可与包括一个或更多HCC相关核苷酸或其互补核苷酸杂交，可使得在目的核苷酸位置对核苷酸的同一性进行确定。可选择地，所述探针可确定非HCC相关核苷酸，使得可通过检测杂交的缺乏来鉴定与HCC有关的HBV变体。
在一些实施方案中，所述基因组的扩增片段包括超过一种HCC相关核苷酸。因此，在一些实施方案中，所述片段就会包括对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2712位的核苷酸的任意组合形式。在一些实施方案中，所述片段包括对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位核苷酸。在一些实施方案中，所述片段包括对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53，312，799，961，1499，1613，1899，2170和2441位核苷酸。
以某些情况下，扩增超过一种的HBV片段。在这样的情况下，所有扩增片段的总和包括对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2712位核苷酸的任意组合。例如，一个片段包括第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764位，另一个片段包括第1899，2170，2441，2525或2712位。在一些实施方案中，所有扩增片段的总和包括对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸位置。在一些实施方案中，所有扩增片段的总和包括对应于SEQ IDNO：1中核苷酸第31，53，312，799，961，1499，1613，1899，2170和2441位的核苷酸位置。
在一些实施方案中，组合使用扩增方法和检测方法，有时在相同的反应容器中，使用可区分HCC相关核苷酸和非HCC相关核苷酸的可检测标记探针来确定HBV寡核苷酸。探针与其互补杂交序列的结合使得用户可在无需将反应容器中的组分去除条件下就可以对特定序列的累积进行定量。通常，根据本发明所述的方法，可使用用于不同探针确定和区分的任何类型的标记。
可采用本领域公知的任意方法对扩增产物的累积进行定量。例如，通过对特定波长光的检测对探针的荧光进行确定。类似的，也可检测连于所述探针的酶反应产生的多种化学产物的累积，例如确定特定波长的吸光度。在另一些实施方案中，通过将其转印在固体支持物上并与可检测标记的核酸探针杂交能够对扩增反应直接进行定量。一旦未结合的探针被洗掉，就可采用本领域所属技术人员公知放射性检测来对探针进行定量。这项技术的其他变化是可使用化学发光方法来鉴定杂交事件。
能够在反应结束之后或“实时地”(即当反应进行时)对扩增产物进行检测。如果对扩增产物的检测是在扩增反应完成后进行的，那么就在扩增反应结束后加入检测试剂(探针)。可选择地，在扩增反应前或反应过程中加入探针，就可以使得在扩增反应完成后或实时地对扩增产物进行检测。由于允许在所述反应的任意给定循环进行检测并因此提供整个反应过程中的产物积累的更多信息，因此实时检测尤其有用。通常使用荧光探针对扩增产物进行实时检测。
一种使用FRET对(pair)检测扩增产物的扩增分析方法为“Taqman”分析，参见Gelfand等人专利号为5,210,015的美国专利和Livak等人专利号为5,538,848的美国专利。该探针是标记有FRET对的单链寡核苷酸。在Taqman分析中，当与靶链杂交时，DNA聚合酶通过对寡核苷酸进行剪切释放出一个或多个核苷酸。该释放过程为分离FRET对的猝光剂标记和荧光团标记提供了方法。
使用FRET对的另一种核酸杂交探针分析如Tyagi等人专利号为5,925,517的美国专利所述，其使用标记的寡核苷酸探针被称为“分子灯塔”。参见Tyagi，S.and Kramer，F.R.，Nature Biotechnology 14：303-308(1996)。分子灯塔探针是这样一种寡核苷酸，在缺乏靶序列的时候，其末端相互杂交在一起；而如果该探针的中部与其靶序列杂交时，其末端相互分开。探针-靶序列杂交体的刚性排除了探针-靶序列杂交体和通过所述末端区域形成的分子间杂交体同时存在的情况。所以，探针发生了构象改变，在这一过程中，通过末端区域形成的较小的杂交体发生解离，同时由于刚性的探针-靶序列杂交体使得该末端区域相互分开。对分子灯塔探针来说，其中部的靶识别序列侧翼连接有臂，在探针不与靶链杂交时其相互杂交形成“发夹”结构，其中靶识别序列(通常是指“探针序列”)是发夹结构的单链环，而该臂序列形成双链茎杂交结构。当探针与靶序列杂交时，也就是说，当靶识别序列与互补的靶序列杂交时，会形成具有相当刚性的螺旋，使得茎杂交结构解开并迫使该臂分离。
本领域所属技术人员应认识到，能够使用大量不同荧光团来标记用于本发明的探针。用于本发明方法和组合物中的荧光团包括荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，羧基四氯荧光素(TET)，NHS-荧光素，5和/或6-羧基荧光素(FAM)，5-(或6-)碘乙酰胺荧光素，5-{[2(和3)-5-(乙酰巯基)-琥珀酰]胺基}荧光素(SAMSA-荧光素)及其他荧光素衍生物，若丹明，丽斯胺若丹明B磺酰氯，德克萨斯红磺酰氯，5和/或6羧基若丹明(ROX)及其他若丹明衍生物，香豆素，7-氨基-甲基-香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素-3乙酸(AMCA)及其他香豆素衍生物，BODIPYTM荧光团，诸如8-甲氧基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐的Cascade BlueTM荧光团，诸如3，6-二磺酸-4-氨基-naphthalimide的金星(Lucifer)黄荧光团、藻胆蛋白衍生物、Alexa氟石染料(来自于Molecular Probes，Eugene，OR)以及其他本领域公知的荧光团。有用荧光团的常用列表参见Hermanson，GT.，BIOCONJUGATETECHNIQUES(Academic Press，San Diego，1996)。所以，反应中使用的每一种探针都能在不同的波长产生荧光且能被单独确定出来而不会与其他探针相互干扰。例如，在反应中使用在特定位置鉴定不同核苷酸的探针时这是非常有用。因此，例如一种波长可提示确定31T的探针结合，而另一含有不同波长的探针则可以鉴定31C。
从检测样本制备HBV
通过在HBV基因内扩增靶区域来确定检测样本中HBV核酸的存在和数量。所以任何认为含有HBV核酸的液态或固态材料都可以成为合适的样本。优选的样本组织包括血浆、血清、全血、血细胞、淋巴液、脑脊液、滑液及其他。
本发明所用“检测样本”是指任何认为含有HBV核酸的液态或固态材料。检测样本可通过诸如例如人的动物的培养细胞或组织样本的生物来源获得。本发明中的样本组织包括且不限于血浆、血清、全血、血细胞、淋巴液、脑脊液、滑液、尿液、唾液和皮肤及其他器官(例如肝活体材料)。
这些样本通常采自于怀疑感染HBV、或者是任何涉及HBV感染的广谱肝脏疾病患者。
从组织样本中能提取到代表HBV目的基因的核酸。多种商业化的核酸纯化试剂盒，例如在本领域所属技术人员公知的QIAmp 96 VirusBioRobot Kit和Qiagen′s BioRobot 9604被用来从样本中提取HBV核酸。
III.HBV基因型的鉴定
本方法还涉及对个体HBV基因型的鉴定。例如，如果在一种基因型而不是另一种基因型中发现有该变异，那么本发明所鉴定的特定核苷酸变异可能具有更强的导致HCC的遗传素因。本文中“基因型”是指从基因组比较推导而来的至少8种HBV的基因型，并将其指定为基因型A到基因型H。参见例如Westland C.Hepatology 36：2-8(2002)；Borchani-Chabchoub I，et a1.，Microbes infect 2：607-12(2000)；Grandjacques C，et al.，J Hepatol 33：430-9(2000)；Kato H，et al.，J VirolMethods 98：153-9(2001)；Ashton-Rickardt PG，et al.，J Med Virol 29：204-14(1989)。所以，通过确定所鉴定的特异位置的核苷酸，该核苷酸只在特异的基因型中出现，就可以确定HBV的基因型。当然，诸如血清学方法的其他方法也是可用的。
在一些实施方案中，可对基因型B或C的HBV的存在与否进行鉴定。在一些实施方案中，基因型B包括2733C，1856C，1009T和2892T。此外，还可以鉴定基因型的亚型。例如，在一些实施方案中，C1亚型的特征为2733A，1856C，T1099T和2892T。在一些实施方案中，C2亚型的特征为2733C，1856T，1009T和2892T。在一些实施方案中，C3亚型的特征为2733C，1856C，1009C和2892T。详细描述见下表：
  2733   1856   1009   2892
  B   C   C   T   T
  C1   A   C   T   T
  C2   C   T   T   T
  C3   C   C   C   T
可通过任意用于核苷酸序列检测方法来鉴定与某种特定基因型相关的核苷酸，包括所有本发明描述的方法(例如扩增、核苷酸测序和/或探针等等)。
IV.将与HCC相关的核苷酸和HBV核苷酸进行比较
可以采用任意方法对来源于个体分离物的核苷酸序列信息和与HCC相关的核苷酸进行比较。
当分离物中的核苷酸序列被确定，就可将该序列与SEQ ID NO：1或其他的HBV基因组序列进行比对从而确定目的特异核苷酸的位置。用于比较的序列比对的方法在本领域中是公知的。最佳的用于比较的序列比对方法可以通过以下实施，例如通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)的本地同源性算法，通过Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性方法的搜寻，通过(GAP，BESTFIT，FASTA和威斯康星遗传软件包中TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)这些算法的计算机执行，或者通过手工比对和肉眼检查(例如参见Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.1995 supplement))。
一个适合于序列比对及确定序列一致性和序列相似性百分率的例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分别在Altschul et al.，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述。用本发明的参数，可用BLAST和BLAST2.0来确定最佳的比对。由国立生物信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)免费提供进行BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过鉴定在查询序列中长度为W的短字节来定义高分值的序列对(HSP)，当在数据库序列中与具有相同长度的字节进行比对时，该高分值序列对要么匹配要么满足正值域值T。T是指相邻字节分值域(上述的Altschul et al.，)。这些初始的相邻字节的击中作为种子发挥作用，用来启动发现包含它们的更长HSPs的搜寻。字节击中沿着每一条序列的两个方向进行延伸直到累积的比对数值得以增加。对核苷酸序列来说，累积的数值由参数M(一对匹配的残基的奖励分数，总是大于0)和N(对不匹配残基的惩罚分数，总是小于0)来进行计算。对氨基酸序列来说，使用评分矩阵来计算累计分数。在每一方向上字节击中延伸的停止有以下几种情况：积累的比对分数从其最大达到值降低了X；由于一个或更多负分数的残基比对，使得积累分数达到零或更低；或者已达到任一序列的末端。BLAST算法中的参数W、T和X确定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字节(W)长11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较的默认值，并且通常用于关闭复杂性过滤。
参照第一EcoRI剪切位点(GAA CTCC)的第一C，其在HBV基因组中经常出现，在全部本申请中提供目的核苷酸的位置。该第一“C”就是SEQ ID NO：1中的位置1。从而在将目的序列与SEQ ID NO：1比对之后，目的序列上的特定核苷酸就可以被指定位置，该位置相对于与SEQ IDNO：1比对中的对应位置。
下列任意核苷酸的存在提示HCC的遗传素因：31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A或2712G。尽管本领域所属技术人员应理解，算法的任何数目可用来预测HCC发生的遗传素因，如实施例所述，但是采用下列算法可获得特别好的敏感性和特异性。
对B基因型HBV来说，以下核苷酸的存在提示HCC的遗传素因，所述核苷酸为：
1762T和1764A和2712A；或
1762T和1764A和2712C；或
1762T和1764A和2712G；或
1762T和1764A和2712T和2525C；或
1762A和1764G和1165T。
对C1基因型的HBV来说，以下核苷酸的存在提示HCC的遗传素因，所述核苷酸为：
31C；和/或
53C；和/或
1499G。
对C2基因型的HBV来说，以下核苷酸的存在提示HCC的遗传素因，所述核苷酸为：
2170C；和/或
2170G；和/或
2441C；和/或
799G。
对C3基因型的HBV来说，以下核苷酸的存在提示HCC的遗传素因，所述核苷酸为：
312C；和/或
961G；和/或
1613A；和/或
1899A。
在本发明的一些实施方案中，将上述所列算法应用于计算机可读的形式是非常有用的。实施本发明所描述的任何功能的编码可被数码计算机执行并可被储存于任何适于计算机阅读的介质中。计算机可读的介质的例子包括磁盘、电盘或光盘、磁带、记忆棒、芯片等等。实施本发明所描述的任何功能的编码可采用任意适于计算机编程的语言进行编写，包括例如Fortran、C、C++等等。使用诸如Java等目的定向编程语言可以创建图形用户界面及实施图形用户界面的功能。
V.鉴定具有HCC遗传素因个体的优越性
HCC普查的传统方法是对感染人员血清的α-胎蛋白水平进行检测(例如，参见Liaw Y F et al.，Gastroenterology，30：263-267(1986)；ColomboM.et al.，N.Engl.J.Med.，325：675-680(1991)；Oka H.et al.，Hepatology12：680-687(1990)或对病人进行腹部超声波扫描。其他诊断HCC的方法还有检测去甲基(des)-γ-羧基凝集素(Chan C Y et al.J Hepatol.13：21-24(1991)；Weitz I C et al.，Hepatology 18：990-997(1993))。HCC的另一个标记是TGF-1β。例如，参见美国专利公开第2004/0121414号。
然而，由于缺乏关于哪个患者对HCC有遗传素因的的信息，因此有必要在常规水平对每个感染HBV的患者进行筛查以尽早确诊HCC。然而然而，如果太多的人都感染了HBV，且可对个体进行筛查的资源有限，不可能进行所有必要的筛查。通过指明哪些个体需要初始的HCC信号的深入筛查而哪些个体不需要接受这种深入的筛查，本发明解决了这个问题。所以，本发明提供对携带引起HCC遗传素因的HBV的那些个体的检测，并随后对这些个体在常规水平进一步检查HCC的存在，以及随意地、仅在极少数情况下或从来都不对那些缺乏HCC有关的HBV变异体的个体进行检查。
VI.试剂盒
本发明的特征在于包括本发明方法所必需成分(通常以一种非混合形式)以及装有这些成分的试剂盒组分(包装材料，使用这些成分和/或方法的指导，一个或更多容器(反应管、柱等))的试剂盒。本发明的试剂盒包括在HBV基因组中确定以下任意或更多核苷酸变异体的试剂，这些核苷酸变异体有：31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A和/或2712G。例如，本发明的试剂盒包括本发明的用于确定与HCC相关核苷酸变异体的引物和/或探针的组合。随意地，试剂盒可含有扩增的试剂，包括但不仅限于诸如Taq聚合酶的热稳定聚合酶、核苷酸、缓冲液等等。
实施例
我们的目标是从HBV的DNA序列中发现HCC病例的遗传标志物。换句话说，我们建立了基于HBV DNA的癌症预测分类模型。已有一些分类模型被应用于DNA数据集的分类，包括自然贝叶斯模型(
Figure A20051009867400281
Bayes)、决定树模型(Decision Tree)、神经网络模型(Neural Networks)和使用进化算法学习规则(Rule Learning Using Evolutionary Algorithm)模型。实验结果表明使用进化算法学习规则性能最好。在本部分中，我们展示的是采用使用进化算法学习规则模型对肝癌和正常病例HBV的DNA进行分类的结果。
实验方法
在每一次实验中，随机选取90％的样本作为教练组，而剩余的10％样本则形成了检验组。对每一个数据集来说，重复10次实验。
在医疗诊断和疾病预测问题中，算法或模型的性能好坏不仅是由准确性，还是由敏感性和特异性进行判断的。在通常情况下，敏感性在医疗诊断中比特异性和准确性更为重要，因为医生和患者都不情愿对患有疾病的患者漏诊。可以采取额外的诊断和检测来确认他们的预测并排除起初的假阳性诊断。
我们采取了所有这三种检测手段来对我们的模型进行评估。
Figure A20051009867400291
Figure A20051009867400292
Figure A20051009867400293
真阳性是指患有该疾病且具有阳性检测结果的所有患者数量，而真阴性是指未患病且检测结果为阴性的所有患者数量。假阳性是指未患病而检测结果却为阳性的所有患者数量，而假阴性是指患病而检测结果却为阴性的所有患者数量，假阴性是最不期望发生的事件。
结果
数据描述
将B基因型和C基因型的数据分别进行分析。每种基因型或C亚型的患者比例如表2所示。“CON”的指“对照组”，即未患HCC。
表2
数据集 对照组 HCC 总数  ％
B 49 37 86  43.8776
C1 10 16 26  13.2653
C2 18 22 40  20.4082
C3 19 25 44  22.4490
总计 96 100 196  100
B基因型
B基因型HBV标志物的详细描述如表3所示。
表3.B基因型HCC的HBV标志物
标志物 正常值 HCC-相关值
1762，1764 AG TA
1165 C T
2712 T C(A，G)
2525 A，T C
B基因型的基于应用数据纯净过程的分类规则如下所述：
如果在B基因型中出现1762A、1764G和1165T，那么就有可能发生HCC。
如果在B基因型中出现1762T、1764A和2712A，2712C或2712G，那么就有可能发生HCC。
如果在B基因型中出现1762A、1764A、2712T和2525C，那么就有可能发生HCC。
B基因型数据集的实验结果如表4所示。
表4.预测HCC的B基因型HBV数据集结果
结果 教练组(STD) 检验组(STD)
敏感性 0.75029(0.05361) 0.75(0.16667)
特异性 0.68(0.06215) 0.66(0.13499)
准确性 0.7093(0.02615) 0.70(0.07499)
C1亚组
Cl亚组标志物的详细描述如表5所示。
表5.C1亚组的HCC相关标志物
标志物 正常值 HCC-相关值
31 T C
53 T C
1499 A G
C1亚组的基于应用数据纯净过程的分类规则如下所述：
如果在C1基因型中出现31C或53C或1499G，那么就有可能发生HCC。
C1亚组的实验结果如表6所示。
表6.预测HCC的C1基因型HBV数据集结果
结果 教练组(STD) 检验组(STD)
敏感性 0.80769(0.04054) 0.75(0.26252)
特异性 0.7875(0.06038) 0.7(0.48305)
准确性 0.8(0.03012) 0.7333(0.21082)
C2亚组
C2亚组标志物的详细描述如表7所示。
表7.C2亚组的HCC相关标志物
标志物 正常值 HCC-相关值
2170 T C，G
2441 T C
799 A G
C2亚组的基于应用数据纯净过程的分类规则如下所述：
如果在C2基因型中出现2170C或2170G或2441C或799G，那么就有可能发生HCC。
C2亚组的实验结果如表8所示。
表8.预测HCC的C2基因型数据集结果
结果 教练组(STD) 检验组(STD)
敏感性 0.84706(0.06323) 0.85(0.24152)
特异性 0.97857(0.0345) 1(0.00000)
准确性 0.90645(0.0355) 0.925(0.12076)
C3亚组的基于应用数据纯净过程的分类规则如下所述：
如果在C3基因型中出现C312或G961或A1613或A1899，那么就有可能发生HCC。
C3亚组的实验结果如表9所示。
表9.预测HCC的C3基因型数据集结果
结果 教练组(STD) 检验组(STD)
敏感性 0.75(0.0044) 0.77(0.22)
特异性 0.81(0.0040) 0.80(0.26)
准确性 0.77(0.0024) 0.78(0.18)
患者与方法
患者
对100例患有肝细胞癌(HCC)的慢性乙肝患者和100例年龄匹配的患有慢性乙肝但未患肝细胞癌的对照患者的残留血清样本进行研究。包括了从1999年7月到2001年，连续到威尔士王子医院联合肝细胞瘤诊所就诊(Joint Hepatoma Clinic，Prince of Wales Hospital)、并被确诊为携带有阳性HBsAg的HCC患者。通过对有500μg/l或更高的血清α-胎蛋白(AFP)的肝组织块的组织学或放射检查对HCC进行确诊。抗-HCV阳性或有酗酒史的患者排除在外。在联合肝细胞瘤诊所，在对所取血清样本用于试验研究知情同意的条件下对患者进行常规血清样本采集。对参加患者的相关医疗信息进行了可追溯地收集。
自1997年12月后，在肝炎诊所预期随访的大量的慢性乙肝患者中鉴定出年纪匹配对照患者。患有其他原因引起的肝炎或患有包括自己免疫性肝病、原发性胆汁肝硬化、威尔逊氏病和血色素沉积症的肝硬化患者也被排除在外。在初次问诊时，采用腹部超声波对预先存在的HCC进行排除。每6个月对患者进行预期随访，如果有临床指征随诊应更频繁，监测肝生化、HBeAg和抗HBe水平以及α-胎蛋白水平。一旦α-胎蛋白的水平高于50μg/l或有超过20μg/l的上升趋势，就采用腹部超声波、计算机X线断层摄影术、肝血管造影和/或肝脏活组织检查来对HCC进行确诊。对具有正常α-胎蛋白水平的患者，每1到2年进行一次腹部超声波检查。
实验室方法
DNA的提取
按照制造商提供的说明书采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，CA，USA)提取血清病毒DNA。
HBV DNA的扩增
为了获得全长的HBV DNA序列，采用长距离半巢式PCR来扩增三段相互重叠的片段(A、B和C)。这些PCR片段对于HBV基因组图谱的相对位置如图1所示，表1中为PCR引物的核酸序列。
表1.用于对HBV DNA进行扩增和测序的引物序列
  名称   核酸序列(5’→3’)   核酸位置   方向
  用于PCR的引物
  P1P2P3aP4P5P6aP7aP8aP9a   TTTTTCACCTCTGCCTAATCACCCTAGAAAATTGAGAGAAGTCCCACTGCATGGCCTGAGGATGGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTTGACATACTTTCCATTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGGTTGATAAGATAGGGGCATTTGGTGG   1821-1841262-2833193-32132801-2824979-9973070-3090300-318714-7342299-2325   正向反向反向正向反向正向正向正向反向
  用于测序的引物
  S1S2S3S4S5S6S7S8S9   CTCCGGAACATTGTTCACCTAAGGTGGGAAACTTTACTGGGCGCTGACGCAACCCCCACTGGTCGCATGGAGACCACCGTGAGGCAAAAACGAGAGTAACTCGGGTCGTCCGCGGGATTCAGGACATACTTTCCAATCAATAGGGAAGATGAGGCATAGCAGCAGGCATGCTGTAGCTCTTGTTCC   2031-20502469-24901186-12051604-16231940-19591441-1460970-991411-4332831-2850   正向正向正向正向反向反向反向反向反向
a这些引物也可于测序
片段A
对片段A进行扩增时，将5μl提取的DNA加入到50mM KCl、1.5mMMgCl2、10mM Tris-HCl、200μM每一种dNTP、1.25单位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)、1.5单位pfu DNA聚合酶(Promega)、以及10pmol引物P1和P2中，终体积50μl进行PCR。PCR的反应条件为95℃变性5分钟，然后扩增10个循环(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，2.5分钟)，再扩增30个循环(94℃，36秒；50℃，36秒；72℃，2.5分钟)，最后在72℃延伸7分钟。
对这些PCR产物再进行半巢式PCR扩增。将1μl上述PCR产物加入到50mM KCl、1.5mM MgCl2，、10mM Tris-HCl、200μM每一种dNTP、2.5单位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)和10pmol引物P1和P3中，终体积为50μl进行PCR。PCR反应条件为95℃变性5分钟，然后扩增10个循环(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，2分钟)，再扩增30个循环(94℃，36秒；52℃，36秒；72℃，2分钟)，最后在72℃延伸7分钟。通过在1X TBE缓冲液中对含有溴化乙碇的1％琼脂糖凝胶进行电泳来对PCR产物的质量和数量进行检测。
片段B
对片段B进行扩增时，将5μl提取的DNA加入到50mM KCl、1.5mMMgCl2、10mM Tris-HCl、200μM每一种dNTP、1.25单位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)、1.5单位pfu DNA聚合酶(Promega)，以及10pmol引物P4和P5中，终体积50μl进行PCR。PCR的反应条件为95℃变性5分钟，然后扩增10个循环(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，90秒)，再扩增30个循环(94℃，36秒；50℃，36秒；72℃，90秒)，最后在72℃延伸7分钟。
对这些PCR产物再进行半巢式PCR扩增。将1μl上述PCR产物加入到50mM KCl、1.5mM MgCl2，、10mM Tris-HCl、200μM每一种dNTP、2.5单位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)和10pmol引物P5和P6中，终体积为50μl进行PCR。PCR反应条件为95℃变性5分钟，然后扩增10个循环(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，90秒)，再扩增30个循环(94℃，36秒；52℃，36秒；72℃，90秒)，最后在72℃延伸7分钟。通过1×TBE缓冲液在含有溴化乙碇的1％琼脂糖凝胶上进行电泳来对PCR产物的质量和数量进行检测。
片段C
对片段C进行扩增时，将5μl提取的DNA加入到50mM KCl、1.5mMMgCl2、10mM Tris-HCl、200μM每一种dNTP、1.25单位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)、1.5单位pfu DNA聚合酶(Promega)，以及10pmol引物P7和P9中，终体积50μl进行PCR。PCR的反应条件为95℃变性5分钟，然后扩增10个循环(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，2分15秒)，再扩增30个循环(94℃，36秒；50℃，36秒；72℃，2分15秒)，最后在72℃延伸7分钟。
对这些PCR产物再进行半巢式PCR扩增。将1μl上述PCR产物加入到50mM KCl、1.5mM MgCl2，、10mM Tris-HCl、200μM每一种dNTP、2.5单位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)和10pmol引物P8和P9中，终体积为50μl进行PCR。PCR反应条件为95℃变性5分钟，然后扩增10个循环(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，1分50秒)，再扩增30个循环(94℃，36秒；52℃，36秒；72℃，1分50秒)，最后在72℃延伸7分钟。通过1×TBE缓冲液在含有溴化乙碇的1％琼脂糖凝胶上进行电泳来对PCR产物的质量和数量进行检测。
DNA测序
使用MegaBACE的循环测序试剂盒DYEnamic ET染料终止基因(Cycling Sequencing Kit DYEnamic ET Dye terminator)对所有半巢式PCR产物(正链和负链)进行直接测序。
对三个HBV DNA片段进行测序的引物序列(引物序列如表1所列)如下：
片段A：S1，S2，P3，S9
片段B：P6，P7，S7，S8
片段C：P8，S3，S4，P9，S5，S6
取1微升未纯化的PCR产物作为循环测序的DNA模板。将其加入到8μl DYEnamic ET试剂预混物和10pmol引物中，终体积为20μl进行测序反应。对测序反应混合物进行95℃起始变性2分钟，然后以95℃，25秒；52℃，30秒；60℃，60秒扩增30个循环。
使用乙醇沉淀的反应后清洗的方法对测序产物进行纯化。在每个反应管中加入2μl 7.5M的乙酸胺和2.5倍体积(55μl)的100％乙醇，使得乙醇的终浓度为75％。然后在14℃4000rpm离心30分钟。再采用短暂的倒置旋转(500rpm 1分钟)将上清液去除。将DNA沉淀用100μl的70％乙醇洗一遍。然后在14℃4000rpm离心30分钟，并采用短暂的倒置旋转(500rpm 1分钟)将上清液去除。空气干燥DNA沉淀并用10μl上样缓冲液重悬(70％甲酰胺和1mM EDTA)。在使用MegaBACE 1000 DNA测序仪进行凝胶电泳分析之前，样品保存于4℃。
应当理解，本发明所描述的实施例和实施方案仅为说明目的。本领域所属技术人员根据其教导，能够进行多种改进和变化。这些改进和变化应符合本申请的实质，涵盖于所附权利要求的范围内。本申请引用的所有出版物、专利和专利申请均全部引入作为参考。

Claims (32)

1.确定感染乙型肝炎病毒的个体发展成肝细胞癌(HCC)的遗传素因的方法，该方法包括：
确定分离自所述个体的HBV基因组中对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2712位的核苷酸；及
将确定的核苷酸和导致HCC的遗传素因相关的核苷酸进行比较，其中所述导致HCC的遗传素因相关的核苷酸包括：31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A和/或2712G。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法包括：
确定分离自所述个体的B基因型HBV基因组中对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525或2712位的核苷酸；及
将确定的核苷酸和导致HCC的遗传素因相关的核苷酸进行比较，其中所述导致HCC的遗传素因相关的核苷酸包括：1165T，1762T，1764A，2525C，2712C，2712A或2712G。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法包括：
确定分离自所述个体的B基因型HBV基因组中对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸；及
将确定的核苷酸和导致HCC的遗传素因相关的核苷酸进行比较，其中所述在B基因型中导致HCC的遗传素因相关的核苷酸包括：
1762T和1764A和2712A；或
1762T和1764A和2712C；或
1762T和1764A和2712G；或
1762T和1764A和2712T和2525C；或
1762A和1764G和1165T。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述确定步骤包括对侧翼连接有对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸的HBV基因组进行核苷酸测序。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述确定步骤包括对至少HBV基因组的部分进行扩增，以产生一种或更多种包括对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸的扩增产物。
6.如权利要求5所述的方法，包括将所述一种或更多种扩增产物与一种或更多种能与HCC相关核苷酸杂交的探针相接触，只有在所述扩增产物在HCC相关核苷酸位置含有互补核苷酸的条件下，所述探针与所述扩增产物才能进行杂交，所述相关核苷酸为：
1762T和1764A和2712A；或
1762T和1764A和2712C；或
1762T和1764A和2712G；或
1762T和1764A和2712T和2525C；或
1762A和1764G和1165T。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述杂交是以线性探针分析法进行的。
8.如权利要求3所述的方法，还包括确定来自于所述个体的HBV基因型。
9.如权利要求1所述的方法，所述方法包括：
确定分离自所述个体的C基因型HBV基因组中对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53，312，799，961，1499，1613，1899，2170或2441位的核苷酸；及
将确定的核苷酸和导致HCC的遗传素因相关的核苷酸进行比较，其中所述导致HCC的遗传素因相关的核苷酸包括：31C，53C，312C，799G，961G，1499G，1613A，1899A，2170C，2170G或2441C。
10.如权利要求9所述的方法，所述方法包括：
a)确定来自所述个体C基因型HBV的亚型，其中：
C1亚型包括的核苷酸为2733A，1856C，1009T和2892T，
C2亚型包括的核苷酸为2733C，1856T，1009T和2892T，和
C3亚型包括的核苷酸为2733C，1856C，1009C和2892T；
b1)如果HBV的基因型为C1，则确定对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53和1499位的核苷酸；或
b2)如果HBV的基因型为C2，则确定对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸；及
b3)如果HBV的基因型为C3，则确定对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第312，961，1613，1899位的核苷酸；及
c)将确定的核苷酸和导致HCC遗传素因相关的核苷酸在所述相关位置上进行比较，其中在C1亚型中导致HCC的遗传素因相关的所述核苷酸包括：
31C；和/或
53C；和/或
1499G；及
C2亚型中导致HCC的遗传素因相关的所述核苷酸包括：
2170C；和/或
2170G；和/或
2441C；和/或
799G；及
C3亚型中导致HCC的遗传素因相关的所述核苷酸包括：
312C；和/或
961G；和/或
1613A；和/或
1899A。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述确定步骤包括对侧翼连接有对应于SEQ ID NO：1上核苷酸第31，53和1499位的核苷酸的HBV基因组进行核苷酸测序。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述确定步骤包括对侧翼连接有对应于SEQ ID NO：1上核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸的HBV基因组进行核苷酸测序。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述确定步骤包括对侧翼连接有对应于SEQ ID NO：1上核苷酸第312，961，1613和1899位的核苷酸的HBV基因组进行核苷酸测序。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述确定步骤包括对至少HBV基因组的部分进行扩增，以产生一种或更多种包含有对应于SEQ ID NO：1上核苷酸第31，53和1499位核苷酸的扩增产物。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述确定步骤包括对至少HBV基因组的部分进行扩增，以产生一种或更多种包含有对应于SEQ ID NO：1上核苷酸第799，2441和2170位核苷酸的扩增产物。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述确定步骤包括对至少HBV基因组的部分进行扩增，以产生一种或更多种包含有对应于SEQ ID NO：1上核苷酸第312，961，1613和1899位核苷酸的扩增产物。
17.如权利要求14所述的方法，包括将所述一种或更多种扩增产物与一种或更多种能与HCC相关核苷酸杂交的探针相接触，只有在所述扩增产物在HCC相关核苷酸位置含有互补核苷酸的条件下，所述探针与所述扩增产物才能进行杂交，所述相关核苷酸为：
31C；和/或
53C；和/或
1499G。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述杂交是以线性探针分析法进行的。
19.如权利要求14所述的方法，包括将所述一种或更多种扩增产物与一种或更多种能与HCC相关核苷酸杂交的探针相接触，只有在所述扩增产物在HCC相关核苷酸位置含有互补核苷酸的条件下，所述多种探针与所述扩增产物才能进行杂交，所述相关核苷酸为：
2170C；和/或
2170G；和/或
2441C；和/或
799G。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述杂交是以线性探针分析法进行的。
21.如权利要求14所述的方法，包括将所述一种或更多种扩增产物与一种或更多种能与HCC相关核苷酸杂交的探针相接触，只有在所述扩增产物在HCC相关核苷酸位置含有互补核苷酸的条件下，所述多种探针与所述扩增产物才能进行杂交，所述相关核苷酸为：
312C；和/或
961G；和/或
1613A；和/或
1899A。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述杂交是以线性探针分析法进行的。
23.如权利要求10所述的方法，还包括确定所述个体HBV的基因型。
24.如权利要求1所述的方法，所述方法包括
确定HBV的基因型，其中B基因型包括2733C、1856C、1009T和2892T，其中C1基因型包含2733A、1856C、099T和2892T，C2基因型包含2733C、1856T、1009T和2892T，C3基因型包含2733C、1856C、1009C和2892T；
如果HBV的基因型为B，则确定HBV基因组上对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸；和/或
如果HBV的基因型为C1，则确定HBV基因组上对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31和/或53和/或1499位的核苷酸；和/或
如果HBV的基因型为C2，则确定HBV基因组上对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第2170和/或2441和/或799位的核苷酸；和/或
如果HBV的基因型为C3，则确定HBV基因组上对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第312和/或961和/或1613和/或1899位的核苷酸；及
将确定后的核苷酸和导致HCC遗传素因相关的核苷酸进行比较，
其中在B基因型中导致HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
1762T和1764A和2712A；或
1762T和1764A和2712C；或
1762T和1764A和2712G；或
1762T和1764A和2712T和2525C；或
1762A和1764G和1165T；
其中在C1基因型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
31C；和/或
53C；和/或
1499G；和
其中在C2基因型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
2170C；和/或
2170G；和/或
2441C；和/或
799G；
其中在C3基因型中与HCC遗传素因相关的核苷酸包括：
312C；和/或
961G；和/或
1613A；和/或
1899A；
由此确定所述个体发展成为HCC的遗传素因。
25.确定与肝细胞癌(HCC)发展有关的HBV分离物的试剂盒，包括：
一种或更多种探针，当其与HBV基因组接触时，如果所述基因组包括至少一种下列对应于SEQ ID NO：1中核苷酸位置的核苷酸时会选择性地与所述基因组杂交，所述核苷酸是：
31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1762A，1764A，1764G，1899A，2441C，2170C，2170G，2712A，2712C，2712G或2525C。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述探针与固体支持物相连。
27.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述探针选择性地杂交于：
1762T和1764A和2712A；和/或
1762T和1764A和2712C；和/或；
1762T和1764A和2712G；和/或
1762T和1764A和2712T和2525C；和/或
1762A和1764G和1165T。
28.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述探针选择性地杂交于：
31C；和
53C；和
1499G。
29.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述探针选择性地杂交于：
2170C；和/或
2170G；和/或
2441C；和/或
799G。
30.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述探针选择性地杂交于：
312C；和/或
961G；和/或
1613A；和/或
1899A。
31.如权利要求25所述的试剂盒，还包括对至少HBV基因组的部分进行扩增的引物。
32.计算机可读的介质，包括
a)接收信息的编码，该信息描述：
对应于SEQ ID NO：1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525或2712位的核苷酸；
b)将在a)中接收的核苷酸和导致HCC的遗传素因相关的核苷酸进行比较的编码；及
c)提供确定导致HCC的HBV遗传素因的编码，
其中导致HCC的遗传素因相关的核苷酸包括：31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1762A，1764A，1764G，1899A，2441C，2170C，2170G，2712A，2712C，2712G或2525C。
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