CN102212619A - 乙型肝炎病毒前c/c区变异及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乙型肝炎病毒前C/C区变异及其用途。具体地，本发明公开了检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒前C/C区变异的试剂或试剂盒。本发明还公开了体外检测核酸样品中乙型肝炎病毒前C/C区变异的方法。本发明的研究表明，乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2159、2189、和/或2203位的碱基的突变与肝癌的发生密切相关，可作为肝癌预测/肝癌早期辅助诊断的分子标志物。

Description

乙型肝炎病毒前C/C区变异及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及乙型肝炎病毒前C/C区变异。基于这些变异情况，本发明提供了可用于肝癌预测以及早期(辅助性)诊断的检测试剂或试剂盒。

背景技术

原发性肝细胞肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，已占居民肿瘤死亡的第二位。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是导致我国肝癌发生的首要原因。我国约有HBV表面抗原(HBsAg)携带者1.2亿，他们中相当部分的慢性肝炎患者，经10～20年的发展会进入肝硬化状态，而肝硬化患者中每十年即有30～50％的人将演变成肝癌。近年来，随着乙肝疫苗的普遍应用，我国儿童中肝炎的发病得到了很好的控制。但在那些已经感染了乙肝病毒的人群中，肝癌的发病率和死亡率却仍然呈上升趋势。

江苏启东是世界著名肝癌(HCC)高发区。据1978-2002年统计资料，男性肝癌的发病率为92.7/10万，女性肝癌的发病率为27.8/10万，是邻近上海地区的两倍。HBV感染和黄曲霉毒素暴露是导致启东肝癌发生的两大主要原因。启东HBsAg阳性者肝癌的发病率较HBsAg阴性者高12倍以上。虽然日益增多的研究表明，HBV的生物学特性(包括基因型、病毒载量及基因变异等)与病毒感染后的临床进展密切相关，但至今有关启东肝癌高发区HBV流行毒株的基因组特征及变异与肝癌的关系还研究甚少。

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科，其DNA为部分环状双链DNA，约有3200碱基对，由正链和负链构成。负链有4个开放读码区(ORF)，分别为前S/S区，前C/C区，P区和X区，分别编码乙肝病毒包膜蛋白、核心蛋白(HBcAg)/E抗原(HBeAg)、x蛋白以及DNA聚合酶。

由于HBV复制过程中有一独特的逆转录过程，故较其它DNA病毒更易发生自然突变。随着HBV长期持续性感染，病毒基因组突变逐渐累积，在逃避宿主免疫的同时加重对肝细胞的损伤。HBV核心启动子区(BCP)以及前C区等突变，都曾被报道与严重的肝脏病变相关。因此，应用HBV基因组的突变作为肝癌高危的早期预警标志物，成为近年人们关注的热点问题之一。

随着对HBV与肝癌关系研究的深入，到目前为止，人们发现了许多与肝癌发生密切相关的突变位点。

HBV的前C基因及C基因共享同一个读码框(前C/C区，nt.1814-2452)，根据不同的起始密码子，分别编码HBeAg以及HBcAg。由于HBeAg的起始密码子在前C基因，故前C基因变异会直接影响HBeAg的表达及分泌；而C基因编码的HBcAg可通过诱导病毒特异的细胞毒T淋巴细胞(CTL)作用及通过旁路机制辅助HBV包膜特异性的B细胞产生抗ms中和抗体从而使机体完成对病毒的清除，因此C基因的某些突变则可致使病毒逃避机体免疫清除而持续感染损伤肝细胞。

G1896A是HBV前C/C区最常见的突变类型，它可造成的前C蛋白翻译终止从而使HBeAg合成受阻。除此之外，前C基因的其他位点如1856、1862等位点突变也曾被报道可降低前C蛋白信号肽断裂而影响HBeAg的合成。Ehata等通过对HBV慢性感染者的研究，最早提出了该区C基因氨基酸84-101位(nt.2150-2203)的变异与患者肝脏损伤相关。之后，其他研究者证实了这一发现，并进一步补充阐述了C基因某些突变与HBV感染后机体免疫清除间的关系。然而，迄今为止，世界范围内关于HBV前C/C区变异与肝癌关系的研究却甚少。

由于癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤(如肝癌)，目前人们已越来越关注肿瘤的早期诊断和预后，尽管目前本领域已经发现了一些位点的突变与肝癌有关，然而还有必要作进一步研究，从而为肝癌的诊断、分型或预后提供更详尽的依据，进一步提高诊断、分型或预后的准确性。

综上所述，本领域迫切需要开发新的可用于肝癌预测以及早期(辅助性)诊断的检测试剂或试剂盒。

发明内容

本发明的目的就是提供新的可用于肝癌预测以及早期(辅助性)诊断的检测试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒用于检测核酸样品中是否存在特定的乙型肝炎病毒前C/C区变异。

本发明的另一目的在于提供体外检测核酸样品中特定的乙型肝炎病毒前C/C区变异的方法。

在本发明的第一方面，提供一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒前C/C区变异的试剂盒，它包括：

容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列的引物；和/或

容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列结合的探针；或

容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：

容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列的引物；和/或

容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列结合的探针；或

容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：

容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列的引物；和/或

容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列结合的探针；或

容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：

容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列的引物；和/或

容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列结合的探针；或

容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列的限制性内切酶。

在另一优选例中，上述各试剂盒中同时包括了①容器，以及装于所述容器的特异性扩增的引物；和②容器，以及装于所述容器的与含突变位点的序列结合的探针。

在另一优选例中，所述的乙型肝炎病毒的基因型是B基因型或C基因型。

在另一优选例中，所述的乙型肝炎病毒前C/C区核苷酸位置编号基于GenBank登录号为GU434374的乙型肝炎病毒全基因序列。

在另一优选例中，所述的引物是具有SEQ ID NO：15-16所示序列的引物对。

在另一优选例中，所述的探针具有选自SEQ ID NO：18、20、22、和24中任一所示的序列。

在本发明的第二方面，提供一种体外(优选非诊断性地)检测核酸样品中乙型肝炎病毒前C/C区变异的方法，所述的方法包括以下步骤：

检测该核酸样品的乙型肝炎病毒前C/C区，并与野生型的乙型肝炎病毒前C/C区比较，存在选自以下变异形式就表明该个体乙型肝炎病毒前C/C区存在核苷酸变异：

乙型肝炎病毒前C/C区第1899位，G→A。

在另一优选例中，所述的变异形式还包括选自下组的一种或多种：

乙型肝炎病毒前C/C区第2159位，A→G；

乙型肝炎病毒前C/C区第2189位，A→C；或

乙型肝炎病毒前C/C区第2203位，G→W。

在本发明的第三方面，提供了一种乙型肝炎病毒前C/C区核苷酸序列的用途，它被用于制备肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂或试剂盒。

在本发明的第四方面，提供了一种SEQ ID NO：1-24所述的引物和/或探针或其组合的用途，它(或它们)被用作肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂；或者用于制备肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂盒。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本研究筛选阶段检测的55条HBV全基因序列基因分型结果。其中，以A-H起始命名的为GenBank上下来的分型标准株；以Qidong起始命名的为检测标本，●为肝癌样品，○为肝炎样品。“Qidong”表示启东。

具体实施方式

本发明人通过大规模地对肝癌高发区乙型肝炎及肝癌发病人群进行研究，首次揭示乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2159、2189、和/或2203位碱基的突变(HBV前C/C区1899位G→A、2159位A→G突变、2189位A→C突变以及2203位G→W突变)与肝癌的发生密切相关。因此，可将该这些位点的变异作为肝癌易感性标志，从而设计特异性检测所述突变位点的试剂或试剂盒。在此基础上完成了本发明。

本发明人自1992年起，建立了一个用于肿瘤病因学研究的前瞻性队列，共计1,638人。此队列中慢性肝炎符合2000年《病毒性肝炎防治方案》诊断标准。队列含HBsAg(+)患者852例(其中男性776例，女性76例)，HBsAg(-)患者786例(男性723例，女性63例)。迄今为止，队列中累计发生肝癌189例，其中HBsAg(+)患者中有170例发生肝癌。队列成员每年随访一次，留有完整的随访资料和系列血样，长达15年。对该队列成员的研究首次发现，乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2189、2203、2159位突变在肝癌患者中的比例显著高于慢性肝炎患者。

如本文所用，术语“乙型肝炎病毒前C/C区”指乙型肝炎病毒前C/C区，其核苷酸序列为GenBank登录号GU434374所示乙型肝炎病毒序列的核苷酸第1814-2452位。以C基因型为例，野生型的乙型肝炎病毒前C/C区如SEQ IDNO：25(C基因型)和SEQ ID NO：26(B基因型)所示。

如本文所用，术语“肝癌相关的乙型肝炎病毒前C/C区变异”指乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2189、2203、和/或2159位突变，尤其是第1899位G→A(简写为G1899A)；第2159位A→G(简写为A2159G)；第2189位A→C(简写为A2189C)和/或第2203位G→W(简写为G2203W)。应理解，所述的变异可以是一个位点的突变，也可以是2、3或4个位点的突变的组合。

基于本发明人的新发现，可以将乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2189、2203、2159位的相关突变作为标志，从而：从乙型肝炎病毒阳性的人群中分离出对于肝癌易感性的人群，或作为肝癌疾病的鉴别诊断、和/或易感性分析的辅助性工具；早期评估相关人群肝癌患病风险。

例如，可从乙型肝炎病毒阳性患者人群中分离出乙型肝炎病毒前C/C区第第1899、2189、2203、2159位发生突变的人群，作为肝癌的高发人群，从而达到早期监测早期预防的目的。

此外，还可通过进一步检测乙型肝炎病毒前C/C区其它位点的突变情况来评估肝癌易感性。本发明人的研究发现，乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2159、2189、和/或2203位的突变结合可提高肝癌发生的可能性。所述突变(G1899A、A2159G、A2189C和/或G2203W)在肝癌患者中的发生比例显著高于慢性肝炎患者中的比例。

基于本发明人的上述发现，可采用各种技术来检测乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2159、2189、和/或2203位的碱基的突变情况，这些技术均包含在本发明中。例如，对相关位点进行序列测定，从而判断是否发生变异。

在检测相关位点的变异时，检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此可用例如Western印迹法间接判断基因有无突变。

此外，可用相关位点特异的引物进行聚合酶链反应(PCR)来进行体外鉴定；或者可根据相关位点设计可特异性结合的探针来进行体外鉴定；或者可利用特异性的限制性内切酶来进行体外鉴定。

作为一种可选的方式，还可采用基于PCR技术的单碱基延伸技术来检测变异位点，其原理是设计一条引物，位于待测变异位点的上游，并且该引物的3′端距离变异位点一个碱基。加入不同荧光标记的ddNTP进行反应，只有当加入的ddNTP与变异位点碱基互补时，引物才得以延伸。可通过检测延伸碱基所发出的荧光来判断变异的类型。

本发明还提供了用于在分析物中检测是否含有所述变异位点的试剂。所述的试剂例如是：对相关突变位点特异的引物；对相关突变位点特异的探针；或对相关突变位点特异的限制性内切酶。

本发明还提供了用于在分析物中检测是否含有所述变异位点的试剂盒，该试剂盒包括：

装在适当容器中的、用于特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列的引物；或

与乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列结合的探针；或

可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列的限制性内切酶。

更佳的，所述试剂盒中还包括：

装在适当容器中的、用于特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列的引物；或

与乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列结合的探针；或

可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列的限制性内切酶。

更佳的，所述试剂盒中还包括：

装在适当容器中的、用于特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列的引物；或

与乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列结合的探针；或

可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列的限制性内切酶。

更佳的，所述试剂盒中还包括：

装在适当容器中的、用于特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列的引物；或

与乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列结合的探针；或

可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列的限制性内切酶。

当所述试剂盒中含有针对多于一个位点变异情况的检测试剂时，检测或评估的准确性可能提高。

作为本发明的可选择的方式，所述的试剂盒中可包括：特异性与乙型肝炎病毒前C/C区发生G1899A、A2159G、A2189C和/或G2203W突变的基因产物结合且不结合于相关位点未突变的基因产物的抗体。更优选的，所述试剂盒中还包括常规的可用于检测抗原抗体结合状况的试剂。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件等。

本发明的主要优点在于：

(1)通过大规模地对乙型肝炎或肝癌发病人群进行研究，发现并证实肝癌发生相关的新的变异位点，研究病例多，准确性高。

(2)首次针对新的变异位点，设计出特异性的检测试剂和试剂盒，为早期评估相关人群肝癌患病风险提供了新的途径。

(3)基于早期检测结果，对于携带新的变异位点的乙型肝炎病毒携带者个体，可采取加强随访和复查等手段，以便能够尽早确诊和治疗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料和方法

病人和标本

1研究对象：

本研究筛选阶段中所使用的血清样品来自启东肿瘤医院。

在初步的乙型肝炎病毒肝癌相关变异筛选中，共选取了55份病人样品，其中20份来自于肝癌患者，35份来自于慢性肝炎患者。两组间年龄、基因型分布均无显著差异[年龄，肝癌组43.57±9.92岁  vs.慢性肝炎组37.19±10.76岁，P＝0.074；基因型分布(B基因型：基因型)，肝癌组2：18vs.慢性肝炎组6：29，P＝0.696]。

本研究验证阶段中所使用的血清样本来自1992年起在启东肝癌高发现场建立了一个用于肿瘤病因学研究的前瞻性队列。其中HBsAg阳性成员852名，配以年龄、性别相近、居所相邻的HBsAg阴性成员786名，共计1638人。队列成员每年随访一次，留有完整的随访资料，血清每年收集一次，于-40℃保存。

本研究验证阶段中的病人血清样品均取自于此队列HBsAg阳性组。慢性肝炎患者诊断符合2000年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》标准；肝癌诊断符合2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会通过的的《原发性肝癌的临床诊断与分期》标准。

在验证阶段的病例-对照研究中，选取了206份病人样品，其中103份来自于肝癌患者，103份来自于慢性肝炎患者，两组的年龄、性别比率及HBV基因型分布均无显著性差异(表1)。研究对象的性别比率符合我国肝癌发病性别比(男∶女约为4-5∶1)；研究对象的HBV基因型分布符合肝癌高发区HBV流行情况，为研究的准确性奠定了基础。

在验证阶段的纵向调查研究中，选取了5位肝癌确诊当年伴有G1899A和/或A2159G和/或A2189C的患者样品进行研究，每一患者诊断肝癌前2到8年的血清中至少有2份血清样品可供研究。

本研究的试剂盒应用阶段所使用的随访病人血清样品来自上海大华医院。在回顾性研究中，共选取了100份病人样品，其中50份来自肝炎患者，50份来自慢性肝炎患者。

本研究的试剂盒应用阶段所使用的200名HBsAg阳性随访病人血清样品，来自上海大华医院。

本研究中的样品的采集都获得了病人或研究对象的同意。

表1验证研究中的肝癌和慢性肝炎患者临床情况及基本病毒学参数

	HCC(n＝103)	CH(n＝103)	P值
				年龄	50.58±10.44	48.54±10.14	0.157
性别，男	89(86.4％)	89(86.4％)	1.000
				B基因型	7(6.8％)	5(4.9％)	0.552
C基因型	90(87.4％)	88(85.4％)	0.684
				其他基因型	6(5.8％)	10(9.7％)	0.298

其中，HCC表示肝癌；CH表示慢性肝炎。

2血清HBV DNA的抽提：

采用经典的蛋白酶消化/酚-氯仿-异戊醇抽提法提取血清中HBV DNA。取血清100μl加入400μl裂解液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％SDS，蛋白酶K 120μg/μl)50℃消化4h后加等体积酚-氯仿-异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提一次，8000r/min离心15min，上清液中加1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。70％乙醇洗沉淀一次，沉淀挥干后重悬于30μl含20μg/ml的RNA酶A无菌水中。

3HBV全基因序列的扩增与测序(供HBV全基因筛选肝癌相关变异)：

以抽提好的HBV DNA为模板扩增HBV全基因序列，正向引物为FF1，反向引物为FR1(表2)。将PCR产物克隆入T载体，应用T载体通用引物m13+47/m13-48及HBV特异性引物HBV3096F/HBV2415F/HBV786R/HBV1329R(表2)对HBV全基因序列进行测序。PCR反应体积为50μl，含1×PCR缓冲液(MgCl₂1.5mM)，dNTP 0.2mM，正、反向引物各0.2μM，血清HBV DNA 1μl，LA Taq 1U(日本Takara公司)。扩增经预变性94℃3min后，进入35个循环程序：94℃30sec/65℃30min/72℃3.5min，最后72℃延链7min。PCR产物经AxyPrep试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)纯化后，送全自动测序(上海联合基因有限公司)。

4HBV前C/C区核苷酸第1824-2275位的扩增(供验证HBV前C/C区肝癌相关位点)：

以抽提好的HBV DNA为模板，采用半巢式PCR的方法扩增HBV前C区/C区nt.1824-2275。第一轮，正向引物为Pre-C F1，反向引物为HBV2433R；第二轮，正向引物序列与第一轮正向引物相同，反向引物为Pre-C R2(见表2)。PCR反应体积为25μl，各成分终浓度为：PCR缓冲液1×(MgCl₂1.5mmol/L)，dNTP 0.2mmol/L，正、反引物各0.4μmol/L，血清HBV DNA 2μl，TakaRa LA Taq 1U(日本TaKaRa公司)。半巢式PCR2轮扩增条件相同，均采用热启动PCR，经预变性94℃3min后，进入循环程序：94℃30sec/60℃30sec/72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物经AxyPrep试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)纯化后，送全自动测序(上海联合基因有限公司)。

表2寡核苷酸引物

引物	序列	核苷酸位点	SEQ ID NO：
				FF1	5’-CTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTC-3’	1820-1845	1
FR1	5’-AAAAAGTTGCATGGTGCTGGTGAAC-3’	1825-1802	2
				m13+47	5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’	位于T-载体	3
m13-48	5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’	位于T-载体	4
				HBV3096F	5’-CATATTGACAACAGTGCCAG-3’	3096-3115	5
HBV2415F	5’-GTCGCAGAAGATCTCAAT-3’	2415-2432	6
				HBV786R	5’-GGACTCAAGATGTTGTACAG-3’	786-767	7
HBV1329R	5’-ACCGATAAGTGTCGCTCCAG-3’	1329-1310	8
				Pre-C F1	5’-TTCACCTCTGCCTAATCATCTC-3’	1824-1845	9
HBV2433R	5’-GATTGAGATCTTCTGCGACGC-3’	2433-2413	10
				Pre-C R2	5’-CCACACTCCAAAAGACACCAAA-3’	2275-2254	11
HB1	5’-GCCAAGTGTTTGCTGACGC-3’	1177-1195	12
				HBV1796R	5’-CAATTTATGCCTACAGCCTCC-3’	1796-1776	13
HBxF2	5’-CCGATCCATACTGCGGAACT-3’	1261-1280	14

5HBV基因型的鉴定：

以抽提好的HBV DNA为模板，采用半巢式PCR的方法扩增HBV X区nt.1261-1796核苷酸序列。第一轮，正向引物为HB1，反向引物为HBV1796R；第二轮，正向引物为HBxF2，反向引物与第一轮反向引物相同(见表2)。通过将PCR产物序列与标准序列X区序列的比较，确定HBV基因型。标准株GenBank登录号：

基因型A：AB116087，AB116088，AB116093

基因型B：FJ562259，FJ562254，FJ562253，FJ562260

基因型C：AB241109，AB241110，X75656，X75665，AB042282，D50520，FJ562332；EU939580，FJ562258，FJ562340，FJ562269，FJ562271，FJ562270

基因型D：AB090270，AB116266，AF280817，AF121239，EF103285

基因型E：AB106564，AB032431，AB091255

基因型F：X69798，AB036910，AF223965

基因型G：AF405706，AB064310，AF160501

基因型H：AY090454，AY090457，AY090460

用MEGA4.1软件构建系统进化树。

6统计分析：应用软件SPSS12.0，通过t检验、卡方检验、Fisher’s确切概率法对实验数据进行处理和统计学分析。所有分析均采用双侧检验，P值小于0.05为具有统计学意义。

实施例1

乙肝病毒全基因筛选肝癌相关位点

首先从整体范围内筛选与肝癌高发相关的HBV突变位点。

55条全基因序列(包括20例肝癌及35例非肝癌)分型结果如图1所示。在所检测的20例肝癌中，C型和B型分别占18例(90.0％)和2例(10.0％)；在35例非肝癌中，C型和B型分别占29例(82.9％)和6例(17.1％)。经统计学分析，B2、C2基因型在所检测的肝癌组及非肝癌组中分布无差异(P＝0.696)。同时，说明B基因型及C基因型HBV为主要流行株，符合我国肝癌高发区HBV流行情况，为研究的准确性奠定了基础。

筛选结果如表3所示：除了人们所常关注的前S/S区及X区，本发明人首次筛选出了位于HBV前C/C区肝癌相关突变位点：1899位G→A突变、2159位A→G突变、2189位A→C突变以及2203位G→W突变，这些变异在肝癌组中的发生率显著高于肝炎组(P值依次为0.001、0.020、0.001、0.001)，提示HBV前C/C区这四个位点突变与肝癌高发相关。

表3乙肝病毒全基因筛选HCC相关位点

突变	氨基酸改变	总计(n＝55)	HCC(n＝20)	CH(n＝35)	P值
						前S/S区
preS2-起始密码子	M 1 V/T/I	4(7.3％)	4(20.0％)	0(0.0％)	0.014
						T53C	F 22 L	5(9.1％)	5(25.0％)	0(0.0％)	0.004

T766A	S 204 R	3(5.5％)	3(15.0％)	0(0.0％)	0.043
						X区
G1613A	NS	13(23.6％)	10(50.0％)	3(8.6％)	0.001
						C1653T	H 94 Y	12(21.8％)	11(55.5％)	1(2.9％)	0.000
T1753C	I 127 T	5(9.1％)	4(20.0％)	1(2.9％)	0.053
						A1762T	K 130 M	25(45.5％)	16(80.0％)	9(25.7％)	0.000
G1764A	V 131 I	30(54.5％)	19(95.0％)	11(31.4％)	0.000
						前C/C区
G1896A	W 28 Stop	5(9.1％)	3(15.0％)	2(5.7％)	0.342
						G1899A	G 29 D	6(10.9％)	6(30.0％)	0(0.0％)	0.001
A2159G	S 87 G	6(10.9％)	5(25.0％)	1(2.9％)	0.020
						A2189C	I 97 L	9(16.4％)	8(40.0％)	1(2.9％)	0.001
G2203W	NS	6(10.9％)	6(30.0％)	0(0.0％)	0.001

其中，HCC表示肝癌；CH表示慢性肝炎。

实施例2

于肝癌高发区验证HBV前C/C区肝癌相关变异

在本实施例中，本发明人对中国启东肝癌高发区对筛选结果进行了进一步验证。

在此肝癌高发区的研究验证了实施例1的筛选结果，验证结果如表4所示。

前C基因的1899位G→A突变，在肝癌组中的发生率显著高于肝炎组(肝癌30.1％vs.肝炎5.8％，P＜0.001)。同时，C基因的2159位A→G突变(肝癌37.9％vs.肝炎23.3％，P＝0.023)，2189位A→C突变(肝癌48.5％vs.22.3％，P＜0.001)以及2203位G→W突变(肝癌9.7％vs.肝炎1.0％，P＝0.005)也被证实确实与肝癌高度相关。另外，还发现2159与2189位突变常以偶联形式出现。

另外该区域最为人们所关注的突变G1896A，其总突变率为43.7％，且有意思的是G1896A突变在肝炎组的发生率反而更高，但在两组间未见显著性差异(肝癌38.8％vs.肝炎48.5％，P＝0.160)，与肝癌高发无关。

上述结果证实了HBV全基因筛选结果，

表4肝癌及肝炎患者HBV前C/C区变异情况

其中，HCC表示肝细胞癌；CH表示慢性肝炎；OR表示比数比，OR大于1为危险因素；CI表示置信区间。

实施例3

肝癌患者HBV前C/C区变异的纵向观察

大多数关于HBV基因突变和肝癌发生关系的研究所涉及的病人样品仅取自其肝癌诊断之后。而基于18年管理完善的肝癌高发区病人队列，本发明人在病例-对照研究的基础上，进一步检测了肝癌诊断前后不同年份血清标本中HBV前C/C区突变情况。由于G2203W总突变病例较少，故仅选取了5位确诊当年伴有相对高突变率的G1899A和/或A2159G和/或A2189C的患者系列血清进行研究。

肝癌患者HBV前C/C区变异的纵向观察结果如表4所示。第2159位与2189位常偶联突变，多在癌前6-8年(#3，#4)即可被观察到，但也可在癌前2-5年(#5)才出现；而1899位突变则多在癌前较短的2-5年内出现，5位病人中仅有#5在癌前6-8年可观察到此位点突变。上述结果说明，G1899A、A2159G和A2189C等前C/C区突变既非感染时即获得、也非肝癌可被诊断后才发生，而是在癌前逐渐演变、被筛选出来。

这些结果提示：在癌前2-5年、甚至更早即可通过检测HBV突变情况初步预测未来肝癌发生。

表4.肝癌患者HBV前C/C区变异的纵向观察

其中，○-○-○表示1899-2159-2189；○表示野生型序列，●表示突变。

结合筛选结果、病例-对照验证结果与相关纵向研究结果说明：HBV前C/C区G1899A、A2159G、A2189C以及G2203W突变，可以成为新的有意义的肝癌预测/早期诊断分子标志物，通过HBV前C/C区变异检测及筛查可为肝癌早诊提供服务。

实施例4检测试剂盒

一.引物及试剂盒

根据HBV前C/C区1899位、2159位、2189位以及2203位突变，设计如下引物：

正向(SEQ ID NO：15)：

5’biotin-AAGCCTCCAAGCTGTGCCTT-3’(nt.1866-1885)

反向(SEQ ID NO：16)：

5’biotin-GATTGAGATCTTCTGCGACGC-3’(nt.2433-2413)

采用常规的PCR技术，利用上述引物来扩增受试核酸样品，通过常规的凝胶电泳确定是否获得PCR产物。结果发现，所述引物可特异性地扩增出突变位点相关序列，准确性高。

将上述引物置于适当的容器中，用于制备试剂盒。

二.探针及试剂盒

根据HBV前C/C区第1899、2159、2189以及2203位突变的序列，设计如下探针：

①1899位：

野生(SEQ ID NO：17)：GGCTTTRGGGCATGGACAT(nt.1890-1905)

突变(SEQ ID NO：18)：GGCTTTRGGACATGGACAT(nt.1890-1905)

②2159位：

野生(SEQ ID NO：19)：TTAGTAGTCAGCTATGTCAA(nt.2150-2169)

突变(SEQ ID NO：20)：TTAGTAGTCGGCTATGTCAA(nt.2150-2169)

③2189位；

野生(SEQ ID NO：21)：GGGYCTAAAAATCAGACAACT(nt.2179-2199)

突变(SEQ ID NO：22)：GGGYCTAAAACTCAGACAACT(nt.2179-2199)

④2203位：

野生(SEQ ID NO：23)：GACAACTAYTGTGGTTTCACA(nt.2193-2213)

突变(SEQ ID NO：24)：GACAACTAYTWTGGTTTCACA(nt.2193-2213)

(注：R＝A/G，Y＝C/T，W＝A/T)

将所述探针点样于硝酸纤维膜。将生物素标记的PCR扩增产物与固定在硝酸纤维膜上的特异性寡核苷酸探针杂交。杂交后，未能杂交的DNA从检测条上被洗脱。加入标记有碱性磷酸酶的链霉抗生物素蛋白(链亲和素)，与杂交产物上标记的生物素结合。经底物BCIP/NBT作用，在相应的特异性探针位置，显现紫色/棕色沉淀条带。

经验证，经过本发明人设计的特定探针对于B基因型及C基因型HBV均具有非常优异的特异性，检测的准确性高。

上述探针或点样了探针的芯片可置于适当的容器中，制备试剂盒。

野生型的C基因型乙型肝炎病毒前C/C区序列如下：

ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACC CGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTTTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCAGCTCTGTA TCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCCATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGG GTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACA

野生型的B基因型乙型肝炎病毒前C/C区序列如下：

ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGTCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG  (SEQ ID NO：26)

本发明的上述各突变位点在SEQ ID NO：25和26中位置如下：

	SEQ ID NO：25和26中位置
		1899位	86位
2189位	376位
		2203位	390位
2159位	346位

实施例5

试剂盒的应用和验证

在本实施例中，采用实施例4中制备的试剂盒，对独立于上述纵向研究队列之外的200名HBsAg阳性患者进行了随访5年的前瞻性研究。基线水平血清样品中前C/C区1899位、2159位、2189位以及2203位出现1种突变者归为高危组，无突变者为对照组。

结果：高危组85人中5年内累计发生肝癌9人(10.6％)，对照组115人中5年内累计发生肝癌4人(3.5％)。高危组肝癌发生率显著高于对照组(RR：3.29；95％ CI：0.98-11.06；P＜0.05)，约为对照组3倍，更远远高于我国人的肝癌发病率(男性38.9例/十万人；女性14.5例/十万人)。

这表明，本发明首次揭示的这些肝癌相关的乙型肝炎病毒前C/C区变异可用于肝癌预测以及早期(辅助性)诊断的检测。并且，基于这些检测结果，可对于高危组加强随访，以便尽早确诊和治疗。

讨论：

HBV慢性感染是导致肝癌发生的主要危险因素之一。近年来，HBV病毒学相关因素如基因型、病毒载量、X区及前S/S区突变等被报道与肝癌高发相关。

本发明通过HBV全基因筛选发现乙型肝炎病毒前C/C区1899位G→A、2159位A→G突变、2189位A→C突变以及2203位G→W突变与肝癌的发生密切相关。并于肝癌高发区大样本量的人群中验证了筛选结果。在以往的研究中，仅有少量研究组关注前C/C区突变与肝癌的关系。然而，这些研究却未曾全面、以大样本量为基础探讨肝癌发生的主要人群，即以成人为主的人群HBV前C/C区突变与肝癌的关系。本发明很好的补充了这一内容，并于肝癌高发区验证了新的肝癌相关位点。

另外，本发明基于维护良好的启东肝癌高发区前瞻性队列，对1899位、2159位、2189位以及2203位突变变化进行纵向观察，发现这些突变既非感染时即获得、也非肝癌可被诊断后才发生，而是在癌前逐渐演变、被筛选出来。这提示，在癌前2-5年、甚至更早即可通过检测HBV突变情况初步预测未来肝癌发生。于是，应用本发明的试剂盒，对另外200例病人进行了随访研究。每位患者随访5年，以基线水平血清样品中前C/C区1899位、2159位、2189位以及2203位出现1种突变者归为高危组。结果显示，高危组肝癌发生率显著高于对照组(RR：3.29；95％ CI：0.98-11.06；P＜0.05)。因此，在日后可对发生前C/C区肝癌相关位点突变的病人加强随访，以便尽早确诊和治疗。

迄今为止，乙型肝炎病毒根据全基因序列分析可分为A-H八个基因型别。Zeng等曾对我国9省市1096例HBV感染者的病毒基因型进行过分子流行病学的调查，结果显示A、B、C、D基因型所占比例分别为1％、41％、53％和4％。夏国良等也曾对我国湖南、广西、河南和河北4省(区)25个县(市)的280例慢性HBV携带者进行过型别鉴定，结果B、C和D型分别占29.3％、67.9％和2.9％。提示我国乙型肝炎病毒流行株以B基因型及C基因型为主。本发明试剂盒涵盖了我国主要流行株，对于B基因型及C基因型HBV均具有非常优异的特异性，检测的准确性高。

综上所述，本发明人研究结果显示，HBV前C/C区1899位、2159位、2189位以及2203位突变与肝癌发生有关，可有效地用于肝癌的预测和早期辅助性检测。基于检测结果，可加强对存在相关突变病人的随访，以便尽早确诊和治疗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市肿瘤研究所

 

<120>乙型肝炎病毒前C/C区变异及其用途

 

<130>101133 1CNCN

 

<160>26

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>1

ctttttcacc tctgcctaat catctc                                            26

 

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>2

aaaaagttgc atggtgctgg tgaac                                             25

 

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>3

cgccagggtt ttcccagtca cgac                                              24

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>4

agcggataac aatttcacac agg                                                23

 

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>5

catattgaca acagtgccag                                                    20

 

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>6

gtcgcagaag atctcaat                                                      18

 

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>7

ggactcaaga tgttgtacag                                                    20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>8

accgataagt gtcgctccag                                                    20

 

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>9

ttcacctctg cctaatcatc tc                                                 22

 

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>10

gattgagatc ttctgcgacg c                                                  21

 

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>11

ccacactcca aaagacacca aa                                                 22

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>12

gccaagtgtt tgctgacgc                                                    19

 

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>13

caatttatgc ctacagcctc c                                                 21

 

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>14

ccgatccata ctgcggaact                                                   20

 

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>15

aagcctccaa gctgtgcctt                                                20

 

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>16

gattgagatc ttctgcgacg c                                              21

 

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

 

<400>17

ggctttrggg catggacat                                                 19

 

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

 

<400>18

ggctttrgga catggacat                                                 19

 

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

<400>19

ttagtagtca gctatgtcaa                                            20

 

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

 

<400>20

ttagtagtcg gctatgtcaa                                            20

 

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

 

<400>21

gggyctaaaa atcagacaac t                                          21

 

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

 

<400>22

gggyctaaaa ctcagacaac t                                          21

 

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

<400>23

gacaactayt gtggtttcac a                                            21

 

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

 

<400>24

gacaactayt wtggtttcac a                                            21

 

<210>25

<211>639

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

 

<400>25

atgcaacttt ttcacctctg cctaatcatc tcatgttcat gtcctactgt tcaagcctcc  60

aagctgtgcc ttgggtggct ttggggcatg gacattgacc cgtataaaga atttggagct  120

tctgtggagt tactctcttt tttgccttct gacttttttc cttctattcg agatctcctc  180

gacaccgcct cagctctgta tcgggaggcc ttagagtctc cggaacattg ttcacctcac  240

catacagcac tcaggcaagc cattctgtgt tggggtgagt tgatgaatct ggccacctgg  300

gtgggaagta atttggaaga cccagcatcc agggaattag tagtcagcta tgtcaatgtt  360

aatatgggcc taaaaatcag acaactactg tggtttcaca tctcctgtct tacttttgga  420

agagaaactg ttcttgagta tttggtgtct tttggagtgt ggattcgcac tcctcctgct  480

tacagaccac caaatgcccc tatcttatca acacttccgg aaactactgt tgttagacga  540

cgaggcaggt cccctagaag aagaactccc tcgcctcgca gacgaaggtc tcaatcgccg  600

cgtcgcagaa gatctcaatc tcgggaatct caatgttag                         639

 

<210>26

<211>639

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

<400>26

atgcaacttt ttcacctctg cctaatcatc tcatgttcat gtcctactgt tcaagcctcc    60

aagctgtgcc ttgggtggct ttggggcatg gacattgacc cgtataaaga atttggagct    120

tctgtggagt tactctcttt tttgccttct gacttctttc cttctattcg agatctcctc    180

gacaccgcct ctgctctgta tcgggaggcc ttagagtctc cggaacattg ttcacctcac    240

catacggcac tcaggcaagc tattctgtgt tggggtgagt tgatgaatct agccacctgg    300

gtgggaagta atttggaaga tccagcatcc agggaattag tagtcagcta tgtcaacgtt    360

aatatgggtc taaaaatcag acaactattg tggtttcaca tttcctgtct tacttttggg    420

agagaaactg ttcttgaata tttggtgtct tttggagtgt ggattcgcac tcctcctgca    480

tatagaccac caaatgcccc tatcttatca acacttccgg aaactactgt tgttagacga    540

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cgtcgcagaa gatctcaatc tcgggaatct caatgttag                           639

Claims (10)

1.一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒前C/C区变异的试剂盒，其特征在于，它包括：

容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列的引物；和/或

容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列结合的探针；或

容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列的限制性内切酶。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列的引物；和/或

容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列结合的探针；或

容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列的限制性内切酶。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列的引物；和/或

容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列结合的探针；或

容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列的限制性内切酶。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列的引物；和/或

容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序 列结合的探针；或

容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列的限制性内切酶。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒的基因型是B基因型或C基因型。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物是具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示序列的引物对。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的探针具有选自SEQ IDNO：18、20、22、和24中任一所示的序列。

8.一种体外检测核酸样品中乙型肝炎病毒前C/C区变异的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

检测该核酸样品的乙型肝炎病毒前C/C区，并与野生型的乙型肝炎病毒前C/C区比较，存在选自以下变异形式就表明该个体乙型肝炎病毒前C/C区存在核苷酸变异：

乙型肝炎病毒前C/C区第1899位，G→A。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的变异形式还包括选自下组的一种或多种：

乙型肝炎病毒前C/C区第2159位，A→G；

乙型肝炎病毒前C/C区第2189位，A→C；或

乙型肝炎病毒前C/C区第2203位，G→W。

10.一种乙型肝炎病毒前C/C区核苷酸序列的用途，其特征在于，用于制备肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂或试剂盒。 

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