CN106244710A - 定性检测hla‑dq基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒 - Google Patents
定性检测hla‑dq基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种定性检测HLA‑DQ基因分型的焦磷酸测序引物对。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物，所述反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记。本发明还涉及一种定性检测HLA‑DQ基因分型的焦磷酸测序试剂盒。所述试剂盒包括扩增引物、PCR反应液、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具有可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种定性检测HLA-DQ基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。
背景技术
肝癌是全世界致死率高居第三的恶性肿瘤，也是中国常见的一种恶性疾病。全球每年约有70万人死于肝癌。肝癌中肝细胞肝癌(HepatoCellular Carcinoma,HCC)最常见，国际癌症研究机构2000年的调查显示，HCC患者中80％与异性肝炎病毒和丙型肝炎病毒有关。病史调查表明，中国的肝癌病人中80％以上都有乙肝病史。根据卫生部发布的数据，中国目前总计有9300万乙肝病人，占全世界乙肝患者总数的三分之一以上。
我国1992年普及乙肝疫苗注射后，肝癌发病率已有所下降。但在之前出生的人，约8％～9％呈乙肝表面抗原(HBsAg)阳性。因此，中国大陆在未来40～50年肝细胞癌仍将是一个重要的公共健康问题。由于原发性肝癌(HCC)患者出现临床表现常属疾病晚期，死亡率高，因此，筛查高危因素用于临床预测乙肝病毒感染的患者并发HCC的风险，有利于疾病的早期发现和治疗。
主要组织相容性复合体(MHC)，参与免疫反应的调节，尤其是T细胞介导的细胞免疫反应。人类MHC主要为人白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)，位于人的6号染色体，分为Ⅰ类和Ⅱ类。MHCⅡ类分子只是在少数细胞中表达，如树突状细胞、B淋巴细胞等，其中最具代表性的为HLA-DR和HLA-DQ抗原。HLA-DR，-DQ通过MHCⅡ类分子限制的T细胞对外来抗原的识别，在介导淋巴细胞活化、抗原递呈等机体免疫应答和免疫调节过程中发挥重要的作用。
全基因组关联研究表明，HLA-DQ基因簇上的SNPs与肝硬化、HBV和HCV引起的HCC风险性相关，尤其是位于与HCC具有生物学相关性的HLA-DQB1基因和HLA-DQA2基因之间的rs9275319位点。
2012年12月，复旦大学遗传学研究所、遗传工程国家重点实验室教授余龙，在《自然·遗传学》(Nature Genetics)杂志上发表的《Genetic variants in STAT4and HLA-DQgenes confer risk of hepatitis B virus–related hepatocellular carcinoma》，确定人的STAT4和HLA-DQ基因是乙肝患者罹患肝癌的关键易感基因。
余龙课题组联系了海内外30个课题组，66位学者开展协作攻关，收集了国内7个地区、总计11799例乙型肝炎患者的血细胞DNA样本。包括5480例有乙肝病变的肝癌病例和6319例有乙肝病史但无肝癌的对照者。运用全基因组关联分析技术比对分析了这两组人群的全基因组序列中近73万个单核苷酸多态位点的等位基因频率，最终在STAT4基因和HLA-DQ基因簇上发现了与乙肝癌变风险显著关联的易感基因位点。
HLA-DQ基因是乙肝患者罹患肝癌的关键易感基因，为人类进一步研究如何降低肝癌发病风险、治疗乙肝和肝癌指出了新的方向。通过检测HLA-DQ基因的分型，筛查肝癌的易感人群，从而提前对易感人群进行相应的综合干预和预防措施，降低肝癌发病风险。因此进行STAT4位点的基因分型检测对于预防乙肝癌变有着非常重要的意义。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测HLA-DQ基因分型的产品。
目前，在现有技术中，采用有“金标准”之称的PCR-直接测序法对HLA-DQ基因进行检测，但该方法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20％以上的肿瘤组织及外周血，对于突变细胞比率小于10％的肿瘤组织及外周血，常规PCR-直接测序法几乎无能为力；此外，该方法还存在成本高、检测周期长及操作繁琐的缺点。
发明内容
为了解决上述方法检测HLA-DQ基因分型过程中存在敏感性不高、检测周期长、操作繁琐及成本高的技术问题，本发明提供一种敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的定性检测HLA-DQ基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。
本发明提供了一种定性检测HLA-DQ基因分型的焦磷酸测序引物对，所述引物对包括：
HLA-DQ正向扩增引物：
5’-AGTAGACCGTCTGCAATCTGAGG-3’(SEQ ID NO.1)；
HLA-DQ反向扩增引物：
5’-CTAGCGGTCTTCCACCCTTCATT-3’(SEQ ID NO.2)；
HLA-DQ测序引物：5’-GTCTGTGGTTGAAGGTC-3’(SEQ ID NO.3)；
其中，所述HLA-DQ反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
本发明还提供了一种定性检测HLA-DQ基因分型的焦磷酸测序试剂盒，所述试剂盒包括：
PCR反应液，所述PCR反应液含有HLA-DQ正向扩增引物：
5’-AGTAGACCGTCTGCAATCTGAGG-3’；
HLA-DQ反向扩增引物：
5’-CTAGCGGTCTTCCACCCTTCATT-3’；
HLA-DQ测序引物：5’-GTCTGTGGTTGAAGGTC-3’；
其中，所述HLA-DQ反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：
HLA-DQ阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的HLA-DQ野生纯合子质粒；
SEQ ID NO.5：
5’-GATAAAAGCAGGCAGAGGACCGTAGAAGGACTAGACTAGCGGTCTTCCACCCTTCATTTTTCTCCCTTGCCAGGGGCTCTGAGACCTTCAACCACAGACTGAAGGCTGCACTGTCAGCTTCCCTACTTTTGAGGTTTTGGGACTCGGACTGGCTTCCTTGCTCCTCAGATTGCAGACGGTCTACTGTGGGACTTCACCTTGTGATCATGTGAGTCAACACGCTTTAATAAACTCCCCTTTATACATACATCTATCATATTAGTTCTATCCCTCTAGATAACCCTGACTAATACACTAGGGAAGTAGCCATTTCGTATTATATTATATTATGCACTATTATATCTGCCACTGCTATATTATTTAGAGTTCTCTTTACTTCTTTCTAGCCAATCTCTTATTACTCAGATCTCTTGTTAAGATTCGTATTTCTTTATATTGATCTTTCTCATTTTACATTACTGTGTGATTTCCTCTCTCTCCTGACTAGACCCAT-3’；
HLA-DQ阳性对照品2，其为所述HLA-DQ野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的HLA-DQ突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
HLA-DQ阳性对照品3，其为插有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的HLA-DQ突变纯合子质粒；
SEQ ID NO.6：
5’-GATAAAAGCAGGCAGAGGACCGTAGAAGGACTAGACTAGCGGTCTTCCACCCTTCATTTTTCTCCCTTGCCAGGGGCTCTGGGACCTTCAACCACAGACTGAAGGCTGCACTGTCAGCTTCCCTACTTTTGAGGTTTTGGGACTCGGACTGGCTTCCTTGCTCCTCAGATTGCAGACGGTCTACTGTGGGACTTCACCTTGTGATCATGTGAGTCAACACGCTTTAATAAACTCCCCTTTATACATACATCTATCATATTAGTTCTATCCCTCTAGATAACCCTGACTAATACACTAGGGAAGTAGCCATTTCGTATTATATTATATTATGCACTATTATATCTGCCACTGCTATATTATTTAGAGTTCTCTTTACTTCTTTCTAGCCAATCTCTTATTACTCAGATCTCTTGTTAAGATTCGTATTTCTTTATATTGATCTTTCTCATTTTACATTACTGTGTGATTTCCTCTCTCTCCTGACTAGACCCAT-3’；
其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述HLA-DQ阳性对照品2中所述HLA-DQ突变纯合子质粒和所述HLA-DQ野生纯合子质粒的数量比为1:1。
在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：质控品(control oligo)和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA(SEQ ID NO.4)；所述空白对照品为超纯水；质控品的序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。
所述PCR反应液中其他组分为常规的10x PCR Buffer、dNTPS和H2O，各组分按常规体积比配置(10x PCR Buffer、dNTPs、H2O和反应液中引物的体积比为5:3:37.5:1)。
所述试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。
本发明还提供了如上所述的引物对在制备用于检测HLA-DQ基因分型的试剂中的应用。
相较于现有技术，本发明提供的定性检测HLA-DQ基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒具有以下有益效果：
一、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测HLA-DQ基因分型时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
二、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测HLA-DQ基因分型时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于突变分析及临床检验；
三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂盒在检测HLA-DQ基因分型时，可以更好的确保检测结果的准确性。
附图说明
图1为临床样品HLA-DQ野生型的焦磷酸测序图；
图2为临床样品HLA-DQ突变杂合型的焦磷酸测序图；
图3为临床样品HLA-DQ突变纯合型的焦磷酸测序图；
图4为临床质控品control oligo的焦磷酸测序图；
图5为临床HLA-DQ空白对照品的焦磷酸测序图；
图6至图8为HLA-DQ多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图6和图7的测序结果不准确，图8的测序结果真实可靠。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：试剂盒的制备
一、引物和探针的设计与合成
针对人HLA-DQ基因选择特异的突变位点，使用PyroMark Assay Design2.0软件，设计引物；其中扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中SEQ ID NO.2的5’端进行生物素标记。
表1.突变位点与类型
| Mutation | Basechange |
| HLA-DQ(rs9275319) | A>G |
扩增序列如表2：
表2.特异性扩增引物及引物序列
二、对照品选择
使用人工合成的一段寡聚核苷酸链TAYGGTTTGCA control oligo为质控品；DNase/RNase-Free水为空白对照品。
三、PCR反应液组成
表3.PCR反应液组成
| 原料名称 | 体积(μL) |
| 10x PCR Buffer | 5 |
| dNTP | 3 |
| HLA-DQ正向扩增引物 | 1 |
| H2O | 37.5 |
| 总体积 | 46.5μL |
实施例2：试剂盒的使用
一、样品检测
溶解引物干粉(引物溶解后有效期为1个月)。按照模板数配制体系：取PCR反应液，加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、TaqDNA聚合酶，分装体系，加入样品DNA、空白对照品或阳性对照品为模板，组成PCR反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。
HLA-DQ体系各主要成分如下：
表4.HLA-DQ体系各主要成分
该体系反应程序如下：
表5.PCR反应程序
扩增完成之后，琼脂糖凝胶检验PCR结果，以进行下一步程序。
二、焦磷酸测序
按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作，主要步骤为：样品的制备和纯化，然后将纯化后的样品加入含有退火液和测序引物的MIX中上机测序。焦磷酸测序仪试剂仓中加入运行程序相应的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。质控品control oligo自带测序引物，最终浓度为0.2μM。
三、结果判断
质控品碱基检出率为100％；空白对照品检出率为0。
四、质控标准
各类对照质控品判断结果如下表：
表6.质控品标准检测结果
五、结果报告：
结果如图1、图2及图3所示，样品结果的判断标准如下：
表9.报告样品检测结果
| 样本检测结果 | 报告结果 | |
| 1 | HLA-DQ(T≥90％，C≤10％) | 野生型 |
| 2 | HLA-DQ(T≤10％，C≥90％) | 突变纯合型 |
| 3 | HLA-DQ(40％≤T≤60％，40％≤C≤60％) | 突变杂合型 |
图1显示的是临床样品检测结果中HLA-DQ的野生型，图2显示的是临床样品检测结果中HLA-DQ的突变杂合型，图3显示的是临床样品检测结果中HLA-DQ的突变纯合型，图4及图5分别显示的是临床检测结果中质控品control oligo及HLA-DQ空白对照品的焦磷酸测序图，图6至图8显示的是设计的HLA-DQ多组引物的焦磷酸测序效果图，其中图8的引物为最佳，是我们产品中选定的HLA-DQ引物。
本发明提供的定性检测HLA-DQ基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒具有以下有益效果：
一、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测HLA-DQ位点时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
二、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测HLA-DQ位点时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于突变分析及临床检验；
三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂盒在检测HLA-DQ位点时，可以更好的确保检测结果的准确性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 长沙三济生物科技有限公司
<120> 定性检测HLA-DQ基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒
<130> 2016
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 493
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<400> 5
gataaaagca ggcagaggac cgtagaagga ctagactagc ggtcttccac ccttcatttt 60
tctcccttgc caggggctct gagaccttca accacagact gaaggctgca ctgtcagctt 120
ccctactttt gaggttttgg gactcggact ggcttccttg ctcctcagat tgcagacggt 180
ctactgtggg acttcacctt gtgatcatgt gagtcaacac gctttaataa actccccttt 240
atacatacat ctatcatatt agttctatcc ctctagataa ccctgactaa tacactaggg 300
aagtagccat ttcgtattat attatattat gcactattat atctgccact gctatattat 360
ttagagttct ctttacttct ttctagccaa tctcttatta ctcagatctc ttgttaagat 420
tcgtatttct ttatattgat ctttctcatt ttacattact gtgtgatttc ctctctctcc 480
tgactagacc cat 493
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tgactagacc cat 493
Claims (7)
1.一种定性检测HLA-DQ基因分型的焦磷酸测序引物对，其特征在于，所述引物对包括：
HLA-DQ正向扩增引物：
5’-AGTAGACCGTCTGCAATCTGAGG-3’；
HLA-DQ反向扩增引物：
5’-CTAGCGGTCTTCCACCCTTCATT-3’；
HLA-DQ测序引物：5’-GTCTGTGGTTGAAGGTC-3’；
其中，所述HLA-DQ反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
2.一种定性检测HLA-DQ基因分型的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
PCR反应液，所述PCR反应液含有HLA-DQ正向扩增引物：
5’-AGTAGACCGTCTGCAATCTGAGG-3’；
HLA-DQ反向扩增引物：
5’-CTAGCGGTCTTCCACCCTTCATT-3’；
HLA-DQ测序引物：5’-GTCTGTGGTTGAAGGTC-3’；
其中，所述HLA-DQ反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
HLA-DQ阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的HLA-DQ野生纯合子质粒；
HLA-DQ阳性对照品2，其为所述HLA-DQ野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的HLA-DQ突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
HLA-DQ阳性对照品3，其为插有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的HLA-DQ突变纯合子质粒；
其中，质粒载体为pMD18-T质粒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述HLA-DQ阳性对照品2中所述HLA-DQ突变纯合子质粒和所述HLA-DQ野生纯合子质粒的数量比为1:1。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：质控品和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为超纯水。
7.权利要求1所述的引物对在制备用于检测HLA-DQ基因分型的试剂中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN201610773305.5A CN106244710A (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 定性检测hla‑dq基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒 |
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2016
- 2016-08-30 CN CN201610773305.5A patent/CN106244710A/zh active Pending
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