CN108048563A - 一种基于snp位点对人营养素缺乏风险评估的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于SNP位点对人营养素缺乏风险评估的方法，命名为INRAS法(Individual nutrients deficiency risk assessment based on SNP)。该方法将针对一个人的N个SNP位点或针对一个SNP位点的N个人作为一个实验单元，研究对象为人营养素代谢能力相关的SNP位点，根据位点信息进行引物设计及合成；然后从人的血液中提取出DNA进行PCR扩增，再通过荧光扫描仪得到检测结果，最后采用风险评估模型对结果进行分析。本发明基于SNP位点的循证纳入依据建立的风险评估模型，可实现基于SNP位点对人体各种营养素缺乏风险准确和系统的评估；基于人群营养素生化指标临界值建立的风险评估动态模型，可实现基于SNP位点对人群各种营养素缺乏风险准确和系统的动态评估。
Description
技术领域
本发明属于人体营养素评估技术领域，具体涉及一种基于SNP位点对人营养素缺乏风险评估的方法，又称为INRAS法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,是人类基因组计划走向应用的重要步骤，可用于营养素代谢能力高危群体的发现。继限制性酶切片断长度多态性和短串联重复序列之后，单核苷酸多态性位点(SNP)以遗传标记密度高、稳定性高、分型检测易于实现自动化的特点成为第3代多态性标记，在遗传诊断，遗传风险评估和连锁不平衡图谱和遗传关联分析等人类基因组学研究领域显示了强大的应用前景。人体存在营养素利用能力个体化遗传特征，通过研究导致功能和表型改变的编码区和调控区的个体化SNP信息，可以基于SNP方面对个体化营养素缺乏风险进行评估和干预，通过我国人群SNP基因分型检测以及基于正常人群和缺乏人群为病例对照的SNP与营养素缺乏风险关联性分析，可以建立我国SNP基因型频率分布特征，获得与营养素缺乏风险高度关联的SNP位点公共数据库，从而实现基于我国SNP地域和人群差异特征的精准营养干预，这方面目前在我国呈现空白状态。
目前针对SNP的检测技术包括适用于高通量测序的基因重测序技术，适用于中通量的基于单碱基延伸原理的Sequenom MassARRAY检测技术，适用于低通量的以Taqman探针法为代表的核酸外切酶检测法。基因重测序技术对专业水平的要求较高，成本较高,不利于产业化推广，只适用于高通量测序；飞行质谱检测设备昂贵，只针对受过培训的技术人员开放，并且由于多重PCR体系导致有的位点无法进行检测；Taqman技术价格昂贵，不利于产业化。
Taqman法利用Taq DNA聚合酶5’核酸外切酶的活性，当等位基因特异性探针与目的DNA片段完全匹配时可形成稳定的双链结构，聚合酶将Taqman探针切碎，荧光基团和淬灭基团的空间分离造成荧光基团脱离淬灭基团的功能范围而发光。如果探针有一个位置与目的DNA片段不匹配(如多态位点处)，形成不稳定双链结构。DNA聚合酶会推动探针关闭，不改变FRET状态，反应过程中观察不到荧光信号。Taqman法利用了在完全匹配和单碱基失配之间稳定性的差异，这种差异很微小，探针设计不良可能导致假阳性信号，需要大量优化来获得最优探针，这很大程度上取决于专业人员的经验，双标记荧光探针设计难度和成本高成为该方法的一大瓶颈。
Seqenom MassARRAY法融合了SBE法和质谱法，基于精确测量分子量进行基因分型。SBE法立足于DNA的合成特性，DNA聚合酶从5’到3’延伸DNA链，需要一个模板链导入核苷酸；延伸引物的3’碱基与模板必须严格的配对。如果3’碱基与模板不匹配，延伸工作将无法启动。如果3’碱基没有-OH，延伸工作也将无法继续。SBE法是引物只能延伸一个碱基，这需要反应体系中的三磷酸核苷酸具有特殊的结构，如不具有3-OH(ddNTP)，SNP多态位点处于延伸引物的下一个碱基处。在DNA聚合酶的作用下，候选终止核苷酸(ddNTP)与多态位点的碱基互补，引物发生一个碱基的扩增。在操作流程上，该方法涉及常规PCR扩增、底物去除和单碱基延伸三大步骤，化学试剂种类繁多，运行时间长，需要专业人员设计引物，操作设备和分析结果，所以不利于实现自动化。
本发明介绍一种基于荧光共振能量转移机制与DNA聚合酶对3’端的精准识别机制完成对SNP的高通量基因分型检测原理的一种新基因分型及评估方法，分型过程需要三种组分：(1)待检测DNA样本；(2)PCR扩增反应中的引物，包括两条带有不同等位基因不同通用序列尾巴的特异性上游引物，一条通用下游引物；(3)PCR缓冲体系，包含Taq DNA聚合酶，dNTP以及两条带有不同荧光标记物的人为设计的通用荧光引物，并使之形成两条互补链，在淬灭剂作用下荧光标记物不发光。该分型方式非常灵活，可以在96孔板，384孔板和1536孔板中进行，通过一步PCR反应即可得到检测结果，灵活的多模块平台，简单的操作步骤和试剂成分可实现灵活的高中低通量选择，最低的成本控制和最短的检测周期三者完美组合，再通过模型分析判断人体(人群)各种营养素缺乏风险评估的方法，又称为INRAS法，打破国内空白局面。
发明内容
本发明的第一个目的是完成SNP位点检测所需引物的设计，第二个目的是提供一种高中低通量检测SNP的方法，第三个目的是建立风险评估模型，最终实现高通量、准确、快速、低成本的基于SNP位点对人体各种营养素缺乏风险评估的方法，从而指导个体化健康管理，延缓甚至阻止疾病的发生。
一种基于SNP位点对人营养素缺乏风险评估的方法，按照如下步骤进行：
(1)针对一个人的(1-1536)×N个SNP位点或针对一个SNP位点的(1-1536)×N个人作为一个单元，作为人体营养素代谢能力相关的SNP位点的统计对象；
(2)根据位点信息进行引物设计及合成；
(3)从人的血液中提取出DNA，进行PCR扩增，再通过荧光扫描仪得到检测结果，最后采用风险评估模型对结果进行分析，给出基于SNP位点对人营养素缺乏风险进行评估的结果。
所述N的取值范围为1-1010。
所述风险评估模型为：
首先建立纳入SNP位点的评分依据，SNP位点与人体各种营养素缺乏风险的关联性由强到弱分为三个级别，一级，二级和三级。Meta分析作为循证一级证据，针对个体检测出的对应基因型权重为0.3(f1)，GWAS作为循证二级证据，针对个体检测出的对应基因型权重为0.2(f2)；人群SNP位点关联性分析相关科研文献作为循证三级证据，针对个体检检测出的对应基因型权重为0.1(f3)。
纳入权重的思想对SNP位点对应的Meta结果进行分析，针对世界范围内的人群和中国人群(或亚洲人群)的Meta分析结果均显示显著关联性的SNP位点的权重为0.3，针对中国(或亚洲人群)人群的Meta分析结果显示显著关联性但针对世界范围内的人群显示非关联性的SNP位点的权重为0.2，针对世界范围内的人群的Meta分析结果显示显著关联性但针对中国人群(或亚洲人群)显示非关联性的SNP位点的权重为0.1。该权重思想在Meta分析相关的SNP分数计算过程中纳入分析。
计算出针对A营养素的多种SNP位点的突变型、杂合型和野生型的总分，根据权重的思想计算各种基因型所占分数，具体公式为X基因型＝n1*fi+n2*f2+n3*f3，(n1代表一级证据中纳入的SNP位点数量，n2代表二级证据中纳入的SNP位点数量，n3代表三级证据中纳入的SNP位点数量)，X总＝X突变型+X杂合型+X野生型，然后求得各种基因型分数在总分中的百分比A％基因型，比较百分比大小，如果A％突变型位居首位则判定该个体基于SNP位点对该种营养素缺乏风险评估结果为高级风险；如果A％杂合型位居首位则判定为中级风险；如果A％野生型位居首位则判定为低级风险。
基于SNP位点对人多种营养素缺乏风险进行评估时，将A营养素相关的SNP位点数量记为N1，B营养素相关的SNP位点数量记为N2，C营养素相关的SNP位点数量记为N3，依次类推。依据前文所述，我们对基于SNP位点对人的A营养素进行风险评估的百分比结果分别记为A％野生型，A％杂合型和A％突变型，对B营养素记为B％野生型，B％杂合型和B％突变型，依次类推。再次引入权重的思想，多种营养素各种基因型对应的分数计算公式为X基因型＝(A％基因型*N1+B％基因型*N2+C％基因型*N3+……)/(N1+N2+N3+……)。比较X突变型，X杂合型和X野生型的大小，如果X突变型位居首位则判定该个体基于SNP位点对该种营养素缺乏风险评估结果为高级风险；如果X杂合型位居首位则判定为中级风险；如果X野生型位居首位则判定为低级风险。
所述风险评估模型为：
首先根据人体某种营养素生化指标临界值将人群对该种营养素的利用情况分为正常、缺乏和过高。然后不断纳入不同区域不同时间和数量的人群进行该营养素相关生化指标和所有报道过的与该营养素相关联或不相关联的SNP位点检测结果。将生化指标正常的人作为对照组，在对照组中确定某个SNP位点的突变型个数；将生化指标缺乏或过高的人作为试验组，在试验组中确定该SNP位点的突变型个数。比如某个SNP位点突变基因型为AA，杂合基因型为Aa，保护基因型为aa，分别采用AA vs aa，AA+Aa vs aa，Aa vs aa，A vs a的模型设计不断将不同的人群的关联分析结果纳入，经过时间的积累和人群数量的不断扩大动态的观察该SNP位点与相关营养素的关联性强弱，从而实现多种SNP位点与相关营养素关联型强弱的验证，可实现基于SNP位点对不同区域不同人群各种营养素缺乏风险准确和系统的动态评估，并且不断动态绘制全国范围内与人群各种营养素关联强度大的SNP位点不同基因频率的分布特征。结合当地的环境因素、饮食结构，生化检测结果，现有的SNP位点动态关联性强弱四种调查和检测指标做出该地区人群各种营养素缺乏风险评估的结果，并提出基于地域化人群特定化的营养干预政策。
所述引物如为：
rs1801133
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGG3’(SEQ IDNO:1)；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGA3’(SEQID NO:2)；
通用下游引物3’CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA5’(SEQ ID NO:3)；
rs1801131
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA GGAGGAGCTGACCAGTGAAGA3’(SEQ IDNO:4)；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT GGAGGAGCTGACCAGTGAAGC3’(SEQIDNO:5)；
通用下游引物3’GGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT5’(SEQ ID NO:6)；
rs1805087
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGGA3’(SEQ ID NO:7)；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT GAAGAATATGAAGATATTAGACAGGG3’(SEQID NO:8)；
通用下游引物3’TCTACCACTTACCTTGAGAGACTCATAAT5’(SEQ ID NO:9)；
rs1051266
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA GAAGCAAAGGTAGCACACGAGGT3’(SEQ IDNO:10)；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT AGCAAAGGTAGCACACGAGGC3’(SEQ IDNO:11)；
通用下游引物3’GACCCCGAGCTCCGGTCCT5’(SEQ ID NO:12)；
rs1801394
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA CATGTACCACAGCTTGCTCACAT3’(SEQ IDNO:13)；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT CATGTACCACAGCTTGCTCACAC3’(SEQ IDNO:14)；
通用下游引物3’AGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT5’(SEQ ID NO:15)；
荧光通用引物序列为：
FAM:5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA3’(SEQ ID NO:16)；
淬灭剂1：3’GTTGCTGACCAAGTTCTAGCT5’(SEQ ID NO:17)；
VIC:5’CAACGACGGAGTGTTGATATT3’(SEQ ID NO:18)；
淬灭剂2：3’GTTGCTGCCTCACAACTATAA5’(SEQ ID NO:19)。
本发明的有益效果：本发明引物的设计合成方面将荧光标记序列和引物序列进行了分离，从而实现了带有荧光标记的序列可以长久保存，不受引物活性及不同SNP位点所在目的基因序列不同的干扰，达到前所未有的低成本。采用了两种引物设计模式，一种是上游引物为两条特定性引物，下游引物为一条通用引物；一种是上游引物为一条通用引物，下游引物为两条特定性引物。两种模式下避免了一种模式下由于某些基因序列的客观性造成无法检测的方法局限问题。检测平台可实现针对一个人的(1-1536)×N个SNP位点或针对一个位点的(1-1536)×N个人的灵活选择，作为一个实验单元包含了硬件、软件、试剂、耗材四位一体的整体解决方案，无需拼凑样品即可随到随检，具有操作简单、价格合理、定制灵活和延展性强等优点。方法建立过程中检测结果与飞行质谱检测结果进行比对，保证了方法的准确性。另外，针对每个位点设计独立的反应孔，解决了多重PCR存在的引物设计困难及扩增效率和准确性低等问题。通过聚类分析原理对结果进行解读，实现了简单快捷的结果分析。基于SNP位点的循证纳入依据建立的风险评估模型，可实现基于SNP位点对人体各种营养素缺乏风险准确和系统的评估。基于人群营养素生化指标临界值建立的风险评估动态模型，可实现基于SNP位点对人群各种营养素缺乏风险准确和系统的动态评估。
附图说明
图1为PCR扫描结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1人体DNA的提取和质量控制
采用DNA提取试剂盒或盐析法根据使用说明书从血液或其他组织中提取出人体DNA，采用DNA检测仪或(和)琼脂糖凝胶电泳法检测对DNA样本进行质量控制。
实施例2SNP位点引物的设计和合成
第一种引物混合液包含2条特定上游引物和一条通用的下游引物，荧光物质混合液包含两条带有荧光基团的引物。引物混合液中SNP位点位于上游引物3’端末端最后一个碱基，两条特定上游引物5’端的标签序列不同，PCR扩增期间，两条特定引物竞争性结合。荧光物质混合液中两条带有荧光基团的引物与引物混合液中两条特定上游引物5’标签序列分别互补，PCR反应前,荧光基团(FAM或VIC)不发荧光，检测不到信号，PCR过程中，合成出与上游引物完全互补的序列，荧光引物可以与上游引物完全互补的DNA序列结合，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光检测到信号。
第二种引物混合液包含一条通用的上游引物和2条特定下游引物，荧光物质混合液包含两条带有荧光基团的引物。引物混合液中SNP位点位于下游引物3’端末端最后一个碱基，两条特定下游引物5’端的标签序列不同，PCR扩增期间，两条特定引物竞争性结合。荧光物质混合液中两条带有荧光基团的引物与引物混合液中两条特定下游引物5’标签序列分别互补，PCR反应前,荧光基团不发荧光，检测不到信号，PCR过程中，合成出与下游引物完全互补的序列，荧光引物可以与下游引物完全互补的DNA序列结合，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光检测到信号。引物设计好后，交由基因合成公司进行合成。
所述引物如为：
rs1801133
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGG3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGA3’；
通用下游引物3’CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA5’；
rs1801131
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA GGAGGAGCTGACCAGTGAAGA3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT GGAGGAGCTGACCAGTGAAGC3’；
通用下游引物3’GGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT5’；
rs1805087
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGGA3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT GAAGAATATGAAGATATTAGACAGGG3’；
通用下游引物3’TCTACCACTTACCTTGAGAGACTCATAAT5’；
rs1051266
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA GAAGCAAAGGTAGCACACGAGGT3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT AGCAAAGGTAGCACACGAGGC3’；
通用下游引物3’GACCCCGAGCTCCGGTCCT5’；
rs1801394
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA CATGTACCACAGCTTGCTCACAT3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT CATGTACCACAGCTTGCTCACAC3’；
通用下游引物3’AGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT5’；
荧光通用引物序列为：
FAM:5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA3’；
淬灭剂1：3’GTTGCTGACCAAGTTCTAGCT5’；
VIC:5’CAACGACGGAGTGTTGATATT3’；
淬灭剂2：3’GTTGCTGCCTCACAACTATAA5’。
实施例3SNP位点引物的设计和合成
1.在芯片或孔板的每个孔上采用手工或自动点样仪预点引物或DNA。
2.在芯片进样孔或孔板的每个孔上注入预混液
预混液包括4μl浓度为2.5-50ng/μl的DNA或引物混合液，荧光物质混合液10μl，超纯水6μl。所有成分使用前均需涡旋，混合均匀，随后将反应预混液从通过手工方式从芯片进样孔或自动点样仪加入到芯片或孔板中。针对96孔板，384孔板和1536孔板，每个独立的反应孔的体积为10μl,5μl和1μl。
3.封膜，离心
将模块进行封膜并离心。手动或热封膜仪和(或)激光封膜仪对每种型号的孔板进行封膜并离心。
4.PCR扩增
采用两步法进行扩增：第一步变性，94℃，15min，1个循环；第二步退火94℃,20sec,61-55℃,1min,10个循环，降温过程中每个循环降0.6℃,逐步降低退火温度以提高PCR反应的特定性。第三步延伸，94℃,20sec,55℃,1min,26cycles进行标准PCR程序。
5.扫描芯片或孔板，读取和分析数据，如图1所示，分型相同的信号点聚集成团，左上角代表一种纯合基因型，右下角代表一种纯合基因型，中间代表杂合型，深灰色信号点为背景空白对照。每个信号点代表一个样品，一个信号点能提取三组有效数据，根据三组数据判断样品在该位点的实际分型结果。
实施例4从5个SNP位点方面对人体叶酸缺乏风险评估模型的建立
对来自A，B和C三个人的三份血样进行SNP检测，每份血样都进行了以下五个位点的检测：rs 1801133,rs1801131,rs1801394,rs1805087和rs1051266。根据SNP循证纳入依据，以上五个位点均有Meta分析材料支持突变位点对人体叶酸代谢能力有影响，所以以上五个位点与人体叶酸缺乏风险的关联强度为一级。
A的SNP检测结果如下：
从百分比可以看出，杂合型>风险型>野生型，个体A对叶酸的缺乏风险为中级。
B的SNP检测结果如下：
| rs号 | 基因位点名称 | 野生型 | 杂合型 | 风险型 |
| rs 1801133 | MTHFR C677T | 0.3 | ||
| rs1801131 | MTHFR A1298C | 0.3 | ||
| rs1805087 | MTR A2756G | 0.3 | ||
| rs1051266 | RFC1A80G | 0.3 | ||
| rs1801394 | MTRR A66G | 0.3 | ||
| 总分 | 0 | 0.6 | 0.9 | |
| 百分比 | 0 | 40％ | 60％ |
从百分比可以看出，风险型>杂合型>野生型，个体B对叶酸的缺乏风险为高级。
C的SNP检测结果如下：
| rs号 | 基因位点名称 | 野生型 | 杂合型 | 风险型 |
| rs 1801133 | MTHFR C677T | 0.3 | ||
| rs1801131 | MTHFR A1298C | 0.3 | ||
| rs1805087 | MTR A2756G | 0.3 | ||
| rs1051266 | RFC1A80G | |||
| rs1801394 | MTRR A66G | 0.3 | ||
| 总分 | 0.9 | 0.3 | 0 | |
| 百分比 | 75％ | 25％ | 0 |
从百分比可以看出，野生型>杂合型>风险型，个体C对叶酸的缺乏风险为低级。
实例5从SNP位点rs 1801133方面对准备怀孕妇女叶酸缺乏风险建立评估模型
以表一中叶酸生化指标临界值为标准将采集到的准备怀孕妇女rs1801133SNP检测结果分为病例组和对照组，其中CC基因型为野生型，CT基因型为杂合型，TT基因型为突变型。
表一准备怀孕妇女叶酸不足的判定
以表二和表三中样本量结构模式将研究项目一和研究项目二的数据分别进行整理。
表二rs1801133病例对照完整的样本量结构
n表示纳入的第几项研究
表三rs1801133病例对照完整的显性基因模型结构
经过卡方检验，项目1和2均符合哈代-温伯格平衡定律，表明样本均来自同一孟德尔群体。然后采用RevMan软件对表四中rs1801133多态性数据资料进行统计分析，分别得到了项目1，项目2，合并项目1和2的OR值及95％置信区间，从而获得了携带TT基因型的准备怀孕妇女人群的叶酸缺乏风险较高，其风险关联系数分别为携带CC基因型的准备怀孕妇女人群的2.23倍，2.34倍和2.28倍。
表四rs1801133多态性数据资料
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心营养与健康所
<120> 一种基于SNP位点对人营养素缺乏风险评估的方法
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacgactgg ttcaagatcg aaaagctgcg tgatgatgaa atcgg 45
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacgacgga gtgttgatat tgaaaagctg cgtgatgatg aaatcga 47
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgacctgaa gcacttgaag gagaa 25
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caacgactgg ttcaagatcg aggaggagct gaccagtgaa ga 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caacgacgga gtgttgatat tggaggagct gaccagtgaa gc 42
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtaaagaac gaagacttca aagacactt 29
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacgactgg ttcaagatcg aatggaagaa tatgaagata ttagacagga 50
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caacgacgga gtgttgatat tgaagaatat gaagatatta gacaggg 47
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctaccactt accttgagag actcataat 29
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caacgactgg ttcaagatcg agaagcaaag gtagcacacg aggt 44
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caacgacgga gtgttgatat tagcaaaggt agcacacgag gc 42
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaccccgagc tccggtcct 19
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caacgactgg ttcaagatcg acatgtacca cagcttgctc acat 44
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caacgacgga gtgttgatat tcatgtacca cagcttgctc acac 44
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggcaaaggc catcgcagaa gaaat 25
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caacgactgg ttcaagatcg a 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttgctgacc aagttctagc t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caacgacgga gtgttgatat t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gttgctgcct cacaactata a 21
Claims (5)
1.一种基于SNP位点对人营养素缺乏风险评估的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)针对一个人的(1-1536)×N个SNP位点或针对一个SNP位点的(1-1536)×N个人作为一个单元，作为人体营养素代谢能力相关的SNP位点的统计对象；
(2)根据位点信息进行引物设计及合成；
(3)从人的血液中提取出DNA，进行PCR扩增，再通过荧光扫描仪得到检测结果，最后采用风险评估模型对结果进行分析，给出基于SNP位点对人营养素缺乏风险进行评估的结果。
2.根据权利要求1所述基于SNP位点对人营养素缺乏风险评估的方法，其特征在于，所述N的取值范围为1-1010。
3.根据权利要求1所述从SNP位点对人营养素缺乏风险评估的方法，其特征在于，所述风险评估模型为：
首先建立纳入SNP位点的评分依据，SNP位点与人体各种营养素缺乏风险的关联性由强到弱分为三个级别，一级，二级和三级，Meta分析作为循证一级证据，针对个体检测出的对应基因型分数为3分(f1)，GWAS作为循证二级证据，针对个体检测出的对应基因型分数为2分(f2)；人群SNP位点关联性分析相关科研文献作为循证三级证据，针对个体检检测出的对应基因型分数为1分(f3)；
纳入权重对SNP位点对应的Meta结果进行分析，针对世界范围内的人群的Meta分析结果显示显著关联性的SNP位点的权重为0.3，针对中国或亚洲人群的Meta分析结果显示显著关联性但针对世界范围内的人群显示非关联性的SNP位点的权重为0.2，针对世界范围内的人群的Meta分析结果显示显著关联性但针对中国人群或亚洲人群显示非关联性的SNP位点的权重为0.1；该权重在Meta分析相关的SNP分数计算过程中纳入分析；
计算出针对A营养素的多种SNP位点的突变型、杂合型和野生型的总分，各种基因型所占分数计算公式为X基因型＝n1*fi+n2*f2+n3*f3，，其中，n1代表一级证据中纳入的SNP位点数量，n2代表二级证据中纳入的SNP位点数量，n3代表三级证据中纳入的SNP位点数量，X总＝X突变型+X杂合型+X野生型，然后求得各种基因型分数在总分中的百分比A％基因型，比较百分比大小，如果A％突变型位居首位则判定该个体基于SNP位点对该种营养素缺乏风险评估结果为高级风险；如果A％杂合型位居首位则判定为中级风险；如果A％野生型位居首位则判定为低级风险；
基于SNP位点对人多种营养素缺乏风险进行评估时，将A营养素相关的SNP位点数量记为N1，B营养素相关的SNP位点数量记为N2，C营养素相关的SNP位点数量记为N3，依次类推，对基于SNP位点对人的A营养素进行风险评估的百分比结果分别记为A％野生型，A％杂合型和A％突变型，对B营养素记为B％野生型，B％杂合型和B％突变型，依次类推，再次引入权重，多种营养素各种基因型对应的分数计算公式为X基因型＝(A％基因型*N1+B％基因型*N2+C％基因型*N3+……)/(N1+N2+N3+……)。比较X突变型，X杂合型和X野生型的大小，如果X突变型位居首位则判定该个体基于SNP位点对该种营养素缺乏风险评估结果为高级风险；如果X杂合型位居首位则判定为中级风险；如果X野生型位居首位则判定为低级风险。
4.根据权利要求1所述从SNP位点对人营养素缺乏风险评估的方法，其特征在于，所述风险评估模型为：
首先根据人体某种营养素生化指标临界值将人群对该种营养素的利用情况分为正常、缺乏和过高；然后不断纳入不同区域不同时间和数量的人群进行该营养素相关生化指标和所有报道过的与该营养素相关联或不相关联的SNP位点检测结果；将生化指标正常的人作为对照组，在对照组中确定某个SNP位点的突变型个数；将生化指标缺乏或过高的人作为试验组，在试验组中确定该SNP位点的突变型个数；比如某个SNP位点突变基因型为AA，杂合基因型为Aa，保护基因型为aa，分别采用AA vs aa，AA+Aa vs aa，Aa vs aa，A vs a的模型设计不断将不同的人群的关联分析结果纳入，经过时间的积累和人群数量的不断扩大动态的观察该SNP位点与相关营养素的关联型强弱，从而实现多种SNP位点与相关营养素关联性强弱的验证，可实现基于SNP位点对不同区域不同人群各种营养素缺乏风险准确和系统的动态评估，并且不断动态绘制全国范围内与人群各种营养素关联强度大的SNP位点不同基因频率的分布特征，结合当地的环境因素、饮食结构，生化检测结果，现有的SNP位点动态关联性强弱四种调查和检测指标做出该地区人群各种营养素缺乏风险评估的结果，并提出基于地域化人群特定化的营养干预政策。
5.根据权利要求1所述从SNP位点对人营养素缺乏风险评估的方法，其特征在于，所述引物如为：
rs1801133
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGG3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGA3’；
通用下游引物3’CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA5’；
rs1801131
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA GGAGGAGCTGACCAGTGAAGA3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT GGAGGAGCTGACCAGTGAAGC3’；
通用下游引物3’GGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT5’；
rs1805087
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGGA3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT GAAGAATATGAAGATATTAGACAGGG3’；
通用下游引物3’TCTACCACTTACCTTGAGAGACTCATAAT5’；
rs1051266
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA GAAGCAAAGGTAGCACACGAGGT3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT AGCAAAGGTAGCACACGAGGC3’；
通用下游引物3’GACCCCGAGCTCCGGTCCT5’；
rs1801394
特定上游引物-5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA CATGTACCACAGCTTGCTCACAT3’；
特定上游引物-5’CAACGACGGAGTGTTGATATT CATGTACCACAGCTTGCTCACAC3’；
通用下游引物3’AGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT5’；
荧光通用引物序列为：
FAM:5’CAACGACTGGTTCAAGATCGA3’；
淬灭剂1：3’GTTGCTGACCAAGTTCTAGCT5’；
VIC:5’CAACGACGGAGTGTTGATATT3’；
淬灭剂2：3’GTTGCTGCCTCACAACTATAA5’。
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