CN106939334A - 一种孕妇血浆中胎儿dna含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种孕妇血浆中胎儿DNA含量的检测方法，基于母亲和胎儿基因组中有差异的插入/缺失SNP位点，通过多重荧光PCR扩增以及毛细管电泳分离，对孕妇基因组和血浆DNA中多个SNP位点同时进行多重荧光PCR，产物通过毛细管电泳分离。选取在孕妇基因组中为纯合而胎儿为杂合的SNP位点，利用参照样本对毛细管电泳检测结果进行峰高校正，用孕妇基因组DNA对检测背景进行校正，从而对血浆DNA中多个SNP位点的2个等位基因片段进行定量分析，得出胎儿DNA在母亲血浆DNA中所占的比例。本发明对多个SNP位点进行高通量检测，具有简单快速、低成本、高精确性的特点，在无创产前诊断等领域将会有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生命科学技术领域，具体而言，涉及一种孕妇血浆中胎儿DNA含量的检测方法。
背景技术
随着对遗传病分子基础认识的不断深入，检测特异基因突变的技术能力不断提高，为发展以DNA检测为基础的无创产前检测提供了理论和技术基础。1997年Lo等利用聚合酶链式反应(PCR)首次发现在孕妇血浆中存在胎儿DNA，不久其他学者也证实了胎儿游离DNA(cffDNA)的存在，并指出其潜在的临床应用价值。胎儿游离DNA被认为是来源于胎盘滋养层细胞的溶解或是从自然凋亡的胎儿细胞中释放出来的。Lo的团队发现59％孕妇在孕5-8周时血浆中即能检测到胎儿游离DNA，在孕7-16周时明显升高，并随孕周增加。这为无创产前检测提供了一种新途径。无创产前基因检测的最大难点在于胎儿DNA仅占血浆中游离DNA的10％左右。如果可以正确区分胎儿游离DNA并测定它在孕妇血浆DNA中占的比例，将极大提高检测准确性，避免因为胎儿比例过低而导致的假阴性结果。从母血中检测胎儿DNA比例最直接的方法是寻找具有显著差异性的遗传学标记，如母体DNA中缺少的Y染色体特异性位点、父源性多态位点或表观遗传学标记。现将主要的几种方法简述如下：
1、基于Y染色体上的遗传学标记的胎儿游离DNA比例测定方法：
由于女性的性染色体为XX型，所以母体中不存在Y染色体，也不存在Y染色体特有的基因序列。基于该原理，当孕妇胎儿为男性时，母体血浆DNA中可检出微量的Y染色体特有的DNA序列，通过对这些DNA序列检测定量可以得到胎儿游离DNA在母血中占的比例。该方法主要针对Y染色体上特有的DNA序列如Y染色体性别决定区域(Y-chromosomal sexdetermining region,SRY)等设计扩增引物，采用高精确度的定量检测方法，如数字PCR(Digital PCR)等确切计数出初始模板DNA分子的数量，从而测定母血中的胎儿游离DNA所占比例。该方法的缺陷在于Y染色体只存在于男性胎儿中，因此Y染色体特异性位点只适用于男性胎儿的检测，而且当胎儿存在Y染色体非整倍体异常时会导致检测结果不准确。
2、基于单核苷酸多态性的检测方法：
该方法主要是通过被检测胎儿DNA上的单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism,SNP)来鉴别。例如，2010年Ghanta等通过测定21号染色体上几个临近的高度杂合的串联SNP(Tandem SNP)位点的等位基因来测定胎儿21号染色体的游离DNA比例，并用于诊断唐氏综合征。一个串联SNP是指两个相距不超过100个碱基的SNP位点，这两个SNP在分析中作为同一个单位统一分析。该方法通过高保真PCR和循环温度毛细管电泳(CyclingTemperature Capillary Electrophoresis,CTCE)来分析和比较来源于孕妇口腔拭子或淋巴细胞中的DNA(不含胎儿游离DNA)和孕妇血浆中的DNA(含有胎儿游离DNA)，从而判定父母和胎儿的单倍体型。当在一个特定的串联SNP位点上母亲是杂合子，父亲存在第三种单倍型时，这个串联SNP位点就可以通过定量比较母源单倍型和父源单倍型来计算单倍型比率(Haplotype Ratio)，从而得到胎儿游离DNA的比例。虽然该方法敏感性和特异性较高，但其缺陷在于需预先筛选合适的串联SNP位点，不同样本合适位点不同，每个位点需单独检测，实验过程长以及操作繁琐，因此限制了其临床使用。
近年来还发展了基于高通量测序平台的胎儿游离DNA比例测定方法。需要选择特定的SNP位点，在该位点上母亲是纯合的，而胎儿是杂合的，这样的位点被视为有效SNP位点(Informative SNP)。高通量测序可以进行SNP分型并找到大量的有效SNP位点。在每一个SNP位点上，非母源的等位基因被称为“胎儿特异性等位基因”，而另一等位基因称为“共享等位基因”。从这些等位基因差异，可以算出胎儿游离DNA比例。该方法的缺陷在于操作流程复杂，必须使用高通量测序平台，增加了检测成本。
3、基于胎儿特异性表观遗传学标记的检测方法：
表观遗传学是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变。DNA甲基化是最重要的基因表观修饰方法之一。2002年，Poon等检测出母体和胎儿DNA序列甲基化差异，首次将表观遗传学标记物用于胎儿游离DNA比例的测定和无创产前筛查。目前，差异性甲基化位点的发现主要集中于染色体13，18，21和性染色体上，目的是为了获得可适用于检测常见染色体非整倍体的甲基化标记。2010年Tong等人通过甲基化特异性限制性内切酶酶切和数字PCR，分析位于21号染色体上的母婴差异性甲基化位点。21号染色体的拷贝数由EGG(epigenetic-genetic)染色体剂量计算方法，使用21号染色体和Y染色体上胎儿特异性甲基化的HLCS基因启动子区域和ZFY位点来检测21三体，取得了良好检测效果。此外，同样基于EGG，通过18号染色体上的胎儿特异甲基化位点VAPA-APCDD1和Y染色体上的ZFY，使用HinPII和HpaII对样本酶解后经数字PCR定量，可以检测胎儿18号染色体游离DNA的比例并对18三体进行诊断。这些方法的不足之处在于只适用于男胎，且依赖于甲基化特异性限制性内切酶的酶切反应效率，同时必须在专门的数字PCR平台上进行检测。
发明内容
为了克服现有基于表观遗传学特征的检测技术需要表观遗传学特异性位点的限制以及高通量测序检测技术耗时长、操作复杂、费用昂贵的缺陷，本发明旨在提供一种孕妇血浆中胎儿DNA含量的检测方法，在母亲基因组DNA可以获得时，可以精确计算胎儿DNA的比例；在母亲基因组DNA无法获得时，也可以对胎儿DNA比例进行估算。具有简单快速、低成本、高精确性等特点，在无创产前诊断等领域将会有广泛的应用前景。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
1.一种孕妇血浆中胎儿DNA含量的检测方法，包括如下步骤(母亲基因组DNA可获得)：
步骤1)从人类基因组中选取五个以上高频的插入/缺失SNP位点，即目标SNP位点，且要求所述目标SNP位点的两个等位基因(allele)之间存在2个乃至更多碱基的插入/缺失差异；
步骤2)针对所述目标SNP位点，设计单轮或两轮PCR反应体系以及相对应的多重PCR引物，用于同时扩增所有所述目标SNP位点；所述目标SNP位点的被扩增区域长度在40-200bp之间，优选80-120bp；其中，
单轮PCR反应的引物设计方法如下：
一条引物的5’端带有荧光基团，每条引物的3’端序列与所述目标SNP位点所在区域核苷酸序列互补；反应引物中至少一条引物具有1-200个核苷酸的填充序列；所述荧光基团是选自下组的荧光染料：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、PET、荧光素、FITC、IRD-700/800、TAZ、SID、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄；
两轮PCR反应的引物设计方法如下：
第一轮PCR反应的引物中的每条引物的3’端序列与所述目标SNP位点所在区域核苷酸序列互补，5’端带有通用DNA序列；所述第一轮PCR反应的引物中至少一条引物具有1-200个核苷酸的填充序列；
第二轮PCR反应的引物中的一条引物在5’端带有荧光基团，3’端核苷酸序列与通用DNA序列相同，用于在所述第一轮PCR反应的扩增产物上添加荧光标记；所述荧光基团是选自下组的荧光染料：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、PET、荧光素、FITC、IRD-700/800、TAZ、SID、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄；所述第二轮PCR反应的引物中至少一条引物具有1-200个核苷酸的填充序列；
由于所述目标SNP位点的两个等位基因之间存在2个乃至更多碱基的插入/缺失差异，因此对应的PCR扩增产物的长度也会有2个乃至更多碱基的差异；此外，所述两轮PCR反应体系中，还要求同种荧光标记的不同PCR引物对应的扩增产物的长度有至少2个乃至更多碱基的差异，以至于扩增产物在毛细管电泳分析中任意两个同种荧光标记的扩增产物条带不重叠；
步骤3)从要检测的母亲血液细胞中提取DNA，即不含胎儿DNA的母亲基因组DNA；从血浆中提取DNA，即含有胎儿DNA的待测DNA；
步骤4)引入多个正常人的参照基因组DNA样本，使得在每个所述目标SNP位点有大于5个参照样本的基因型为杂合；所述参照基因组DNA样本为后续的检测提供峰高/面积校正信息，在相同的实验条件下只需要使用一次；
步骤5)使用步骤2)中的所述第一轮PCR反应的引物，对所述母亲基因组DNA、所述待测DNA和所述参照基因组DNA样本分别进行PCR反应扩增；得到的扩增产物再使用所述第二轮PCR反应的引物进行加荧光PCR反应；
步骤6)PCR反应后得到的扩增产物，通过变性毛细管电泳将不同长度的扩增产物分开，得到每个扩增产物的位置信息、荧光种类和强度；对每个母亲基因组DNA样本在每个所述目标SNP位点，计算短allele(A1)与长allele(A2)的峰高比值，若该比值<0.05，则基因型为A2/A2；若比值>20，则基因型为A1/A1；若比值在0.5与2.0之间，则基因型判定为A1/A2；
步骤7)针对每个待测DNA样本，选取其母亲基因组中所有基因型为纯合的目标SNP位点(A1/A1或A2/A2)；当所述参照基因组DNA样本在所述目标SNP位点基因型为杂合时，计算所述目标SNP位点的A1、A2两个allele对应的扩增产物的的荧光峰高或面积比，得到所述SNP位点的参照值；具体计算过程为：k＝F2/F1；
其中，F1、F2分别表示所述参照基因组DNA在所述SNP位点的短allele(A1)、长allele(A2)的峰高或面积，k为所述目标SNP位点的参照值；
步骤8)在所述待测DNA中，若一个所述目标SNP位点母亲的基因型为A1/A1，则计算胎儿DNA比例的公式为：2×(F2/k)/(F1+F2/k)；
若一个所述目标SNP位点母亲的基因型为A2/A2，则计算胎儿DNA比例的公式为：2×(F1×k)/(F1×k+F2)；
其中，F1、F2分别表示所述待测DNA在所述SNP位点的短allele(A1)、长allele(A2)的峰高或面积，k为所述参照基因组DNA在所述目标SNP位点按照步骤7)计算得到的参照值的中位数；
步骤9)选取步骤8)计算结果≥2％的数据进行分析统计，若符合该条件的数值数目＝1，则胎儿DNA比例为“无法判定”；若符合该条件的数值数目＝2，且变异系数CV(CV＝标准差SD/平均值)<20％，则胎儿比例为平均值，否则为“无法判定”；若符合该条件的数值数目≥3，则计算中位数(M)和标准差(SD)，去掉M±2SD之外的数值，若剩余数值数目＝1，则胎儿DNA比例为“无法判定”；若剩余数值数目＝2且CV<20％则胎儿比例为中位数，否则为“无法判定”；若剩余数值数目>2则重新计算中位数(M)和标准差(SD)，去掉M±2SD之外的数值，重复这一操作直至所有数值都在M±2SD范围之内，计算变异系数CV，若CV<10％则胎儿DNA比例为平均值；若CV≥10％则胎儿DNA比例为中位数。
2.一种孕妇血浆中胎儿DNA含量的检测方法，包括如下步骤(母亲基因组DNA无法获得)：
步骤1)从人类基因组中选取五个以上高频的插入/缺失SNP位点，即目标SNP位点，且要求所述目标SNP位点的两个等位基因(allele)之间存在2个乃至更多碱基的插入/缺失差异；
步骤2)针对所述目标SNP位点，设计单轮或两轮PCR反应体系以及相对应的多重PCR引物，用于同时扩增所有所述目标SNP位点；所述目标SNP位点的被扩增区域长度在40-200bp之间，优选80-120bp；其中，
单轮PCR反应的引物设计方法如下：
一条引物的5’端带有荧光基团，每条引物的3’端序列与所述目标SNP位点所在区域核苷酸序列互补；反应引物中至少一条引物具有1-200个核苷酸的填充序列；所述荧光基团是选自下组的荧光染料：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、PET、荧光素、FITC、IRD-700/800、TAZ、SID、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄；
两轮PCR反应的引物设计方法如下：
第一轮PCR反应的引物中的每条引物的3’端序列与所述目标SNP位点所在区域核苷酸序列互补，5’端带有通用DNA序列；所述第一轮PCR反应的引物中至少一条引物具有1-200个核苷酸的填充序列；
第二轮PCR反应的引物中的一条引物在5’端带有荧光基团，3’端核苷酸序列与通用DNA序列相同，用于在所述第一轮PCR反应的扩增产物上添加荧光标记；所述荧光基团是选自下组的荧光染料：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、PET、荧光素、FITC、IRD-700/800、TAZ、SID、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄；所述第二轮PCR反应的引物中至少一条引物具有1-200个核苷酸的填充序列；
由于所述目标SNP位点的两个等位基因之间存在2个乃至更多碱基的插入/缺失差异，因此对应的PCR扩增产物的长度也会有2个乃至更多碱基的差异；此外，所述两轮PCR反应体系中，还要求同种荧光标记的不同PCR引物对应的扩增产物的长度有至少2个乃至更多碱基的差异，以至于扩增产物在毛细管电泳分析中任意两个同种荧光标记的扩增产物条带不重叠；
步骤3)从母亲血浆中提取DNA，即含有胎儿DNA的待测DNA；
步骤4)引入多个正常人的参照基因组DNA样本，使得在每个所述目标SNP位点有大于5个参照样本的基因型为杂合；所述参照基因组DNA样本为后续的检测提供峰高/面积校正信息，在相同的实验条件下只需要使用一次；
步骤5)使用步骤2)中的所述第一轮PCR反应的引物，对所述待测DNA和所述参照基因组DNA样本分别进行PCR反应扩增；得到的扩增产物再使用所述第二轮PC反应的R引物进行加荧光PCR反应；
步骤6)PCR反应后得到的扩增产物，通过变性毛细管电泳将不同长度的扩增产物分开，得到每个扩增产物的位置信息、荧光种类和强度；
步骤7)针对每个所述SNP位点，当所述参照基因组DNA样本在所述目标SNP位点基因型为杂合时，计算所述目标SNP位点的短allele(A1)、长allele(A2)两个等位基因对应的扩增产物的的荧光峰高或面积比，得到所述SNP位点的参照值；具体计算过程为：
k＝F2/F1；
其中，F1、F2分别表示所述SNP位点的短allele(A1)、长allele(A2)的峰高或面积，k为所述目标SNP位点的参照值；
步骤8)在所述待测DNA中，若所述目标SNP位点的A1>A2，则计算胎儿DNA比例的公式为：2×(F2/k)/(F1+F2/k)；
若一个所述目标SNP位点的A2>A1,则计算胎儿DNA比例的公式为：2×(F1×k)/(F1×k+F2)；
其中，F1、F2分别表示所述待测DNA在所述SNP位点的短allele(A1)、长allele(A2)的峰高或面积，k为所述参照基因组DNA在所述目标SNP位点按照步骤7)计算得到的参照值的中位数；
步骤9)选取步骤8)计算结果在2％和30％之间(包含2％和30％)的数值进行分析统计，若符合该条件的数值数目>2则计算中位数(M)和标准差(SD)，去除M±2SD之外的数值，若剩余数值数目≤2则胎儿DNA比例为“无法判定”；若剩余数值数目>2则重新计算中位数(M)和标准差(SD)，去除M±2SD之外的数值，重复这一操作直至所有数值都在M±2SD范围之内，计算变异系数CV，若CV<10％则胎儿DNA比例为平均值；若CV≥10％则胎儿DNA比例为中位数。
本发明是在认真总结现有技术中各种母体血浆中胎儿游离DNA检测方法的优缺点的基础上再经过自主创新后开发成功的，它克服了现有基于表观遗传学特征的检测技术需要表观遗传学特异性位点的限制以及高通量测序检测技术耗时长、操作复杂、费用昂贵的缺陷，是一种简单快速、低成本、高精确性的胎儿游离DNA检测技术，在无创产前诊断等领域将会有广泛的应用前景。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、快速检测：在选取特定的目标SNP位点并设计对应的多重荧光PCR引物后，只要将待测DNA与参照DNA分别进行两轮PCR反应，然后将产物直接通过毛细管荧光电泳仪分离即可。相比现有的胎儿DNA比例检测技术，本发明不再需要对DNA样本进行甲基化处理或高通量测序，整个检测耗时只需4个小时；此外，参照DNA为后续的样本检测提供校正信息，针对相同的实验条件(引物序列、实验仪器等)只需要在第一次实验中使用。
2、操作简便：本发明只需进行多重荧光PCR扩增反应后即可使用毛细管电泳仪进行自动检测，与现有其他检测方法相比，不需要复杂的DNA处理和检测流程，易于建立标准化的实验操作流程。
3、多个位点同时检测：由于本发明采用了多重PCR体系，使得一个反应通常可以同时扩增至少12个目标SNP位点；同时采用多色荧光和填充序列，使得多个位点的扩增产物可以在一次毛细管电泳中被同时分离，检测通量大大提高。
4、高精确性：由于目标SNP位点的两个等位基因的核苷酸序列之间仅有几个碱基差别，这两个模板的扩增效率将体现高度一致性，因此最后的扩增产物真实的反应了初始模板浓度比例。此外，本发明选取多个目标SNP位点进行同时检测，对多次测量取平均值或中位数，显著减少单个位点波动造成的结果不准确。且使用参照DNA和母亲基因组DNA对数据进行多重校正，对母体血浆DNA中胎儿游离DNA比例的检测非常准确，在无创产前诊断领域的应用具有很大潜力。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照专利说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明胎儿游离DNA比例测定整体原理图；
图2为本发明实施例反应中得到的实际峰图；
图3为本发明实施例的检测结果与实际结果一致性分析图。
具体实施方式
下面就参考附图、表格和结合实施例，来详细说明本发明。
参见图1所示，图1表述了本发明胎儿游离DNA比例测定整体原理。
本发明的实施例选取了人群中高频的插入/缺失SNP位点42个，另外增加了1个Amelo性别鉴定位点，用于检测孕妇血浆中是否存在Y染色体(男性胎儿)。目标SNP位点信息、PCR扩增长度、最终产物长度、毛细管电泳位置和所有产物的荧光标记见表1。
此外，选取了24个正常人基因组DNA参照样本用于计算位点峰高校正值k；本实施例中第一轮PCR反应所使用的正向引物序列见序列表的SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:43，所使用的反向引物序列见序列表的SEQ ID NO.:44至SEQ ID NO.:86；第二轮加荧光PCR反应使用的引物序列和荧光标记见序列表的SEQ ID NO.:87至SEQ ID NO.:92。
表1目标SNP位点信息表
一、检测样本
以超声波打碎的混合DNA(男性胎儿基因组DNA+母亲基因组DNA)制成胎儿比例分别为0％、2％、4％、8％和16％的待测样本。其中胎儿比例为0％的样本即为母亲基因组DNA。本实验主要需要以下试剂：ddH2O，10×PCR buffer(Takara，R007WZ)，MgCl2，dNTP，Taq DNA聚合酶(Takara，R007WZ)，PCR引物混合液。
二、检测方法
取总量为5ng的5种待测样本和24例参照样本进行真空抽干待用。
以抽干待用的待测样本和参照样本为模板，进行第一轮PCR反应扩增，反应体系(10μL)如下：
| 组分 | 体积(μl) | 终浓度 |
| 10×Takara buffer | 1 | 1X |
| MgCl2 | 0.6 | 3mM |
| dNTP mix | 1.2 | 0.3mM |
| 引物混合液 | 1 | 0.05uM |
| Taq DNA聚合酶 | 0.1 | 0.05U/L |
| DNA样本干粉 | N/A | 0.5ng/L |
| ddH2O | 6.1 | N/A |
第一轮PCR反应条件如下：95℃2min；6个循环扩增(94℃20s，65℃-1℃/循环40s和72℃90s)；12个循环扩增(94℃20s，60℃40s和72℃90s)，72℃延伸2min，4℃保存；
取1μL第一轮PCR反应的扩增产物用ddH2O稀释100倍后取1μL做为模板进行第二轮加荧光PCR反应。第二轮加荧光PCR反应(20μL)配置如下：
第二轮PCR反应条件如下：95℃2min；9个循环扩增(94℃20s，62℃-0.5℃/循环40s和72℃90s)；20个循环扩增(94℃20s，57℃40s和72℃90s)，68℃延伸30min，4℃保存；
取1μL第二轮加荧光PCR反应的产物用ddH2O稀释20倍，然后取1μL加入到8.9μLL的Hi-DiTM甲酰胺(ABI)和0.1μL的LIZ500分子内标(ABI)中，95℃5min变性后，置于3130XL测序仪上进行毛细管电泳。得到的电泳结果用GeneMapper4.0软件进行数据分析，读取位置、荧光和峰高数值。反应中得到的实际峰图如图2所示。
三、数据分析
1、利用参照样本计算峰高校正值k
在43个目标SNP位点中，选取在母亲基因组中为纯合而在胎儿DNA中为杂合的位点作为有效目标位点。在本实施例中，有效目标SNP位点共7个(包含性别检测位点Amelo)。参照样本中这7个SNP位点的峰高数据如表2所示。其中，H1和H2分别代表Allele1和Allele2的峰高，所有参照样本在有效目标SNP位点基因型为杂合的情况下，其峰高比(H2/H1)的中位数即为该目标SNP位点的峰高校正值k。
表2峰高校正值k计算结果
2、待测样本目标SNP位点峰高
待测样本7个有效SNP位点原始峰高的数据如表3。
表3待测样本目标SNP位点峰高
3、利用母亲基因组DNA进行背景校正
对于实验中不含胎儿DNA的样本(胎儿比例配置为0％)而言，目标SNP位点若基因型为纯合，则扩增片段毛细管电泳结果应该只显示一个峰值，在实验中若该位点出现杂峰，可根据母亲基因组DNA对待测样本的检测结果进行背景校正。具体方法为，若母亲Allele2为纯合子且母亲Allele1有背景峰，则检测样本的Allele1需要进行背景校正，校正后的值为检测样本的H1-检测样本的H2×(母亲样本的H1/母亲样本的H2)；若母亲Allele1为纯合子且母亲Allele2有背景峰，则检测样本的Allele2需要进行背景校正，校正后的值为检测样本的H2-检测样本的H1*(母亲样本的H2/母亲样本的H1)；若母亲纯合子无背景峰，则无需进行校正，直接进入后续计算。计算结果见表4。
表4背景校正后的峰高数据结
4、胎儿比例计算
根据参照样本目标SNP位点峰高计算所得的K值，计算待测样本的胎儿DNA含量，计算公式如下：若母亲Allele 2纯合，胎儿杂合，则胎儿DNA比例＝H1×k×2/(H1×k+H2)；若母亲Allele 1纯合，胎儿杂合，则胎儿DNA比例＝H2/k×2/(H1+H2/k)。对于单个样本所有目标SNP位点的计算结果，剔除计算结果<2％的数据后，如果剩余位点<2，则胎儿比例不能确定；如果剩余位点＝2，则计算CV值(标准差/平均值)，如果CV<20％，则胎儿比例为平均数，否则为“不能确定”；如果剩余位点≥3，则计算中位数(M)和标准差(SD)，剔除M±2SD之外的数值，再次统计CV，若CV<10％，则胎儿比例为平均数，否则胎儿比例为中位数。计算结果如表5。
表5待测样本胎儿比例计算结果
5、待测样本检测结果与实际结果一致性分析
以检测结果为纵坐标，实际胎儿比例为横坐标作图，如图3所示。
四、结论
实验得到的胎儿比例计算数值与实际数值的线性关系R2＝0.998，结果表明检测结果与实际结果的相关性很高，本发明可用于孕妇血浆胎儿DNA含量的检测。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天昊生物医药科技（苏州）有限公司
<120> 一种孕妇血浆中胎儿DNA含量的检测方法
<160> 92
<170> PatentIn version 3.5
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cc 62
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cttccctaga gcgggtgatt ttacaatgct acgaatgccc acaat 45
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gtttcttgct tccctagagc gggtgattt 29
<210> 92
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 92
gtttcttcga cgatacgacg atacgacgat acgacgatac gacgatcatt tagcgttgcg 60
actggat 67
Claims (2)
1.一种孕妇血浆中胎儿DNA含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)从人类基因组中选取五个以上高频的插入/缺失SNP位点，即目标SNP位点，且要求所述目标SNP位点的两个等位基因(allele)之间存在2个乃至更多碱基的插入/缺失差异；
步骤2)针对所述目标SNP位点，设计单轮或两轮PCR反应体系以及相对应的多重PCR引物，用于同时扩增所有所述目标SNP位点；所述目标SNP位点的被扩增区域长度在40-200bp之间，优选80-120bp；其中，
单轮PCR反应的引物设计方法如下：
一条引物的5’端带有荧光基团，每条引物的3’端序列与所述目标SNP位点所在区域核苷酸序列互补；反应引物中至少一条引物具有1-200个核苷酸的填充序列；
两轮PCR反应的引物设计方法如下：
第一轮PCR反应的引物中的每条引物的3’端序列与所述目标SNP位点所在区域核苷酸序列互补，5’端带有通用DNA序列；所述第一轮PCR反应的引物中至少一条引物具有1-200个核苷酸的填充序列；
第二轮PCR反应的引物中的一条引物在5’端带有荧光基团，3’端核苷酸序列与通用DNA序列相同，用于在所述第一轮PCR反应的扩增产物上添加荧光标记；所述第二轮PCR反应的引物中至少一条引物具有1-200个核苷酸的填充序列；
由于所述目标SNP位点的两个等位基因之间存在2个乃至更多碱基的插入/缺失差异，因此对应的PCR扩增产物的长度也会有2个乃至更多碱基的差异；此外，所述两轮PCR反应体系中，还要求同种荧光标记的不同PCR引物对应的扩增产物的长度有至少2个乃至更多碱基的差异，以至于扩增产物在毛细管电泳分析中任意两个同种荧光标记的扩增产物条带不重叠；
步骤3)从要检测的母亲血液细胞中提取DNA，即不含胎儿DNA的母亲基因组DNA；从血浆中提取DNA，即含有胎儿DNA的待测DNA；
步骤4)引入多个正常人的参照基因组DNA样本，使得在每个所述目标SNP位点有大于5个参照样本的基因型为杂合；所述参照基因组DNA样本为后续的检测提供峰高/面积校正信息，在相同的实验条件下只需要使用一次；
步骤5)使用步骤2)中的所述第一轮PCR反应的引物，对所述母亲基因组DNA、所述待测DNA和所述参照基因组DNA样本分别进行PCR反应扩增；得到的扩增产物再使用所述第二轮PCR反应的引物进行加荧光PCR反应；
步骤6)PCR反应后得到的扩增产物，通过变性毛细管电泳将不同长度的扩增产物分开，得到每个扩增产物的位置信息、荧光种类和强度；在母亲基因组DNA可以获得时，对每个母亲基因组DNA样本在每个所述目标SNP位点，计算短allele(A1)与长allele(A2)的峰高比值，若该比值<0.05，则基因型为A2/A2；若比值>20，则基因型为A1/A1；若比值在0.5与2.0之间，则基因型判定为A1/A2；
步骤7)针对每个待测DNA样本，对所有所述目标SNP位点，当所述参照基因组DNA样本在所述目标SNP位点基因型为杂合时，计算所述目标SNP位点的短allele(A1)、长allele(A2)两个等位基因对应的扩增产物的的荧光峰高或面积比，得到所述SNP位点的参照值；具体计算过程为：
k＝F2/F1；
其中，F1、F2分别表示所述参照基因组DNA在所述SNP位点的短allele(A1)、长allele(A2)的峰高或面积，k为所述目标SNP位点的参照值；
步骤8)在所述待测DNA中，当母亲基因组DNA可以获得时，若一个所述目标SNP位点母亲的基因型为A1/A1，则计算胎儿DNA比例的公式为：2×(F2/k)/(F1+F2/k)；
若一个所述目标SNP位点母亲的基因型为A2/A2，则计算胎儿DNA比例的公式为：2×(F1×k)/(F1×k+F2)；
当母亲基因组DNA无法获得时，在所述待测DNA中，若所述目标SNP位点的A1>A2，则计算胎儿DNA比例的公式为：2×(F2/k)/(F1+F2/k)；
若一个所述目标SNP位点的A2>A1,则计算胎儿DNA比例的公式为：2×(F1×k)/(F1×k+F2)；
其中，F1、F2分别表示所述待测DNA在所述SNP位点的短allele(A1)、长allele(A2)的峰高或面积，k为所述参照基因组DNA在所述目标SNP位点按照步骤7)计算得到的参照值的中位数；
步骤9)当母亲基因组DNA可以获得时，选取步骤8)计算结果≥2％的数据进行分析统计，若符合该条件的数值数目＝1，则胎儿DNA比例为“无法判定”；若符合该条件的数值数目＝2，且变异系数CV＝标准差SD/平均值<20％，则胎儿比例为平均值，否则为“无法判定”；若符合该条件的数值数目≥3，则计算中位数(M)和标准差(SD)，去掉M±2SD之外的数值，若剩余数值数目＝1，则胎儿DNA比例为“无法判定”；若剩余数值数目＝2且CV<20％则胎儿比例为中位数，否则为“无法判定”；若剩余数值数目>2则重新计算中位数(M)和标准差(SD)，去掉M±2SD之外的数值，重复这一操作直至所有数值都在M±2SD范围之内，计算变异系数CV，若CV<10％则胎儿DNA比例为平均值；若CV≥10％则胎儿DNA比例为中位数；
当母亲基因组DNA无法获得时，选取步骤8)计算结果在2％和30％之间的数值进行分析统计，若符合该条件的数值数目>2则计算中位数(M)和标准差(SD)，去除M±2SD之外的数值，若剩余数值数目≤2则胎儿DNA比例为“无法判定”；若剩余数值数目>2则重新计算中位数(M)和标准差(SD)，去除M±2SD之外的数值，重复这一操作直至所有数值都在M±2SD范围之内，计算变异系数CV，若CV<10％则胎儿DNA比例为平均值；若CV≥10％则胎儿DNA比例为中位数。
2.根据权利要求1所述的孕妇血浆中胎儿DNA含量的检测方法，其特征在于，步骤2)中的所述荧光基团选自于以下的荧光染料：FAM、VIC、NED、PET、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄。
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