CN101323877B - 检测21号染色体和性染色体数目异常的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种早期筛查21—三体和性染色体数目异常的试剂盒。该试剂盒利用定量荧光多重聚合酶链反应技术,分别以21-三体和性染色体上特异的遗传位点进行荧光引物七重复合扩增,根据扩增产物剂量的差异分析染色体数目异常,达到检测临床样品中21号染色体和性染色体数目异常的目的。
Description
所属领域
本发明涉及检测临床样品中21号染色体和性染色体数目异常的试剂盒,特别是涉及以定量荧光多重聚合酶链反应技术早期筛查21—三体和性染色体数目异常的的试剂盒。
发明背景
21-三体综合征又称为唐氏综合征(DS)。新生儿唐氏综合征的发生率约为1/800。据估计,我国目前大约有60万以上的DS患儿出生,即平均每20分钟就有一个DS患儿出生。DS发生率随母亲生育年龄的增高而增高,尤其当母亲年龄大于35岁时,发生率明显增高。临床上,生育期的高龄妇女(年龄在35岁以上的妇女),卵巢受到各种有害物质和射线的影响,导致遗传物质发生突变的机会增多。遗传物质的载体——染色体在细胞分裂过程中发生不分离现象,致使其所生育的子女痴呆和畸形的发生率明显增高。这样的胎儿体内21号染色体不分离,结果造成3条21染色体和单条21号染色体胚胎。几乎所有的单体胚胎和大部分三体胚胎在妊娠发生早期发生流产,其中仅有小部分21三体胎儿可以顺利度过妊娠生产,并产出先天性愚型儿。
性染色体多倍体遗传病包括Klinefelter综合征,XYY综合征,多X综合征等。Klinefelter等人首先报道并命名了Klinefelter综合征。Jacob等人证实,Klinefelter综合征病人的核型为47,XXY,发病原因是多了一条X染色体,因此也将该本病称为XXY综合征。该病发生率相当高,其中在男性新生儿中约占1/1000~2/1000,在身高180CM以上的男性中占1/260,在精神病或刑事收容所中占1/100,在不育的男性中占1/10,在精神病男性患者中可高达2%-3%。
为了提高人口质量,优生优育,必须对高龄孕妇(特别是大于35岁的孕妇)的胎儿进行产前筛查,以防止染色体异常患儿的出生。
染色体核型分析技术是检测染色体异常的“金标准”,但核型分析在很大程度上要依赖于细胞样品的质量。如果样本细胞量小或被污染,则很难或不能得出结果。目前,国内外广泛采用孕妇血清标记物来大面积筛查DS胎儿。由于DS胎儿的孕妇血清甲胎蛋白(AFP)和雌三醇(uE3)低于平均水平,而绒毛膜促性腺激素(HCG)高于平均水平,因此,利用“三联筛查”方法对妊娠期(孕15~21周)孕妇进行这三项指标的检测。该方法检出率为48%~83%,假阳性 率约为5%。而针对性染色体异常目前还没有有效的产前筛查方法。
定量荧光多重PCR技术(quantitative fluorescence multiplex polymerase chain reaction,QF-multiplex PCR)是应用一对以上的荧光标记引物同时扩增模板的不同区域,然后对扩增产物进行电泳,分析并计算出每一个等位基因所代表的扩增量。Mansfield等人应用STR位点(short tandem repeat,短串联重复序列)进行QF-PCR,成功地检测了21、18和X三体综合征。随后,科学家们应用扩增STR的QF-PCR技术对各种不同来源的样本如羊水、绒毛活检和胎儿血等进行了21-三体综合征的分析。
1995年后,人们开始联合多个染色体上的特异性STR位点同时对21-三体、18-三体、13-三体XY染色体异常进行分析。与现有的核型分析技术相比,该方法缩短了分析时间、高通量、所需要的细胞数少、可以同时分析父亲DNA及母亲DNA,而且还可用于胚胎种植前诊断。
本发明人应用定量荧光多重PCR技术,选择21号染色体和性染色体特异性STR位点进行多重扩增,结合毛细管电泳进行精确定量,建立一种可以快速准确筛查的21—三体和性染色体数目异常的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种试剂盒,以多重定量荧光PCR(QF-PCR)扩增染色体特异性的STR位点,并根据扩增产物剂量的差异分析染色体数目异常,该试剂盒包括:(1)一个七重复合扩增体系,以扩增染色体特异性的STR位点;(2)针对一组特异性染色体的的STR位点进行检测和分析;(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量,特征在于其中所使用的荧光染料标记的上游和下游寡核苷酸引物分别是:
针对D21S1435位点的是:5’-AGAGCCCCATTCCCCTCTC-3’(SEQ ID NO:1)和
5’-TCAgTgCCATCAAGAAAAATGA-3’(SEQ ID NO:2);
针对D21S11位点的是,5’-GTCTGTTATGGGACTTTTCT-3’(SEQ ID NO:3)和
5’-TTGTATTAGTCAATGTGAGA-3’(SEQ ID NO:4);
针对D21S1411位点的是:5’-CCAGCCTTCTAAATATTCAT-3’(SEQ ID NO:5)和
5’-AGATAGAACGGATAGAAAAT-3’(SEQ ID NO:6);
针对AMXY位点的是:5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’(SEQ ID NO:7)和
5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’(SEQ ID NO:8);
针对DXS981位点的是:5’-TCTTCTCTCCACTTTTCAGAGT-3’(SEQ ID NO:9)和
5’-GCTAAAAACTTGGAATGATATA-3’(SEQ ID NO:10);
针对DXS6809位点的是:5’-GCTTTAGGCTGATGTGAGGA-3’(SEQ ID NO:11)和
5’-GGGCATGACTAGATTATGTAG-3’(SEQ ID NO:12);
针对X22位点位点的是:ACATAGTGATTCTGCCAGGA-3’(SEQ ID NO:13)和
5’-GGGCTCTTTCAATCTGAACA-3’(SEQ ID NO:14)。
根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的多重扩增体系是七重复合扩增体系,分别针对D21S1435位点、D21S11位点、D21S1411位点、AMXY位点、DXS981位点、DXS6809位点和X22位点位点。
根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的生物样品是可疑染色体数目异常的临床样品。本试剂盒旨在检测所说可疑临床样本的染色体数目异常是指21号染色体和性染色体数目异常,包括但不只限于21号染色体和性染色体数目异常等疾病。细胞样本可以来源于人体各种组织和体液。用来检测染色体数目异常的染色体DNA来自人体血细胞或体细胞的DNA。例如,DNA样本可以来自外周血,脐血,羊水,绒毛细胞,以及孕妇体内游离的胎儿DNA。
根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的染色体数目异常是指人体21号染色体和性染色体数目异常。
根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的21号染色体和性染色体数目异常是指21号染色体三体和性染色体单体或者性染色体多倍体,选用21号染色体和性染色体上特异性的遗传标记位点,其中在21号染色体上的位点为D21S1435、D21S11、D21S1411,在性染色体上的位点为AMXY、DXS981、DXS6809和X22位。
简单地说,本发明的试剂盒包括一个混合多种成分的PCR反应体系;选择来源于真核细胞的DNA作为模板;在相互配对的引物中,至少有1对以上的扩增引物。其中一条互补到真核细胞DNA目的序列的5’-端,另一条互补于真核细胞DNA目的序列的3’-端;而且PCR缓冲液和扩增反应需要的蛋白酶必须能够进行扩增反应。
根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的七重复合扩增体系可以对至少一个DNA片段进行扩增,优选扩增七个DNA片段,扩增反应的循环数是15-35循环。
根据本发明的一个优选实施方案,七重复合扩增体系可以同时扩增至少两个染色体特异性STR位点,其中优选6个STR位点,包括D21S11,D21S1435,D21S1411,DXS981,DXS6809,X22和一个AMXY基因片段进行七重复合扩增,STR位点核心重复序列长度为4-5核苷酸序列片段。七重复合扩增体系的扩增产物由两个或者两个以上的DNA扩增片段构成,扩增产物的量同各自位点的起始浓度成正比例。
根据本发明的一个优选实施方案,可以用电泳的方法对扩增片段进行分离和分析,其中优选用毛细管电泳法分离七重复合扩增的产物片段。
根据本发明的一个优选实施方案,可以用荧光染料标记扩增引物。标记引物进行复合扩增后,可以用扩增产物的累计荧光值定量分析染色体特异性STR位点扩增产物的基因剂量。
根据本发明的一个优选实施方案,可以根据STR位点扩增产物等位基因的数目和等位基因扩增产物的相对浓度来分析所选染色体的数目是否存在异常。
根据本发明的一个优选实施方案,针对染色体遗传标记STR位点进行多重复合扩增。选用的STR位点是存在于胚胎或者胎儿细胞的遗传物质,在人群中存在多态性,核心重复单位为4-5个核苷酸,所扩增的产物片段在50-1000bp之间,优选在100-500bp之间。应用复合扩增体系对STR位点进行多重扩增,检测STR位点等位基因数目的差别和基因剂量的差别,为染色体数目异常性疾病的分析提供依据。
根据本发明的一个优选实施方案,可以至少用一个STR位点D21S1435或D21S11或D21S1411位点来分析21号染色体三体综合征,优选D21S1435、D21S11和D21S1411位点两个或者两个以上进行联合检测。扩增产物通过凝胶电泳的方法进行分离并定量,特别是毛细管电泳的方法进行分离并相对定量。
根据本发明的一个优选实施方案,可以至少用一个STR位点XS981或DXS6809或X22,和(或)XY染色体共有的牙釉蛋白基因AMXY来分析性染色体数目异常,优选XS981、DXS6809、X22和AMXY四个位点进行两个或者两个以上进行联合检测。扩增产物通过凝胶电泳的方法进行分离并定量,特别是毛细管电泳的方法进行分离并相对定量。
根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的核酸扩增体系包括:制备一个混合多种成分在单个eppendorf管内的PCR反应体系;选择来源于真核细胞的DNA作为模板;至少有1对以上的扩增引物,在相互配对的引物中,其中一条互补到真核细胞DNA目的序列的5’-端,一条互补到真核细胞DNA目的序列的3’-端;PCR缓冲液和扩增反应需要的蛋白酶必须能够进行扩增反应。
根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的多重扩增系统是七重复合聚合酶链反应系统,可以至少扩增一个DNA片段,优选同时扩增七个DNA片段,扩增反应的循环数通常为15-35个循环。
根据本发明的一个优选实施方案,七重复合扩增体系可以同时扩增两个或者两个以上的染色体特异性DNA片段,包括STR位点但不限于STR位点,也可以对其他DNA片段进行复合扩增。扩增产物由两个或者两个以上的DNA片段构成,产物的量同各自位点的起始浓度成正比例。
本发明中检测样品中染色体数目存在异常的试剂盒包括(1)提供包括(a)待检样品、(b)可热启动的耐热DNA聚合酶和(c)2-脱氧核苷三磷酸(dNTPs)的扩增反应体系,以 及包括能够与待检位点双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的荧光标记的正向引物,和能够与待检STR位点双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物;(2)通过一次聚合酶链反应扩增所说的多个靶多核苷酸目的片段;(3)多重复合扩增后应用电泳的方法,检测各位点不同的等位基因片段大小和数目,分析累计产物发出的荧光量来检测靶多核苷酸的存在和相对量。
根据本发明的一个优选实施方案,可以使用合成的特异性引物扩增染色体特异性STR位点,这些引物同STR位点两侧毗邻的特异性区域进行杂交,扩增的特定区域可以保证是特定染色体上的STR位点被扩增。可以使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物,并可用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化,然后进行氨解处理。
根据本发明的一个优选实施方案,可以应用荧光染料、生物素、放射性同位素、稀土金属元素等标记引物进行多重复合扩增,用于扩增后产物的分离,优选应用荧光染料标记。可以使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物,并可用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化,然后进行氨解处理。氨解处理后分别在引物5’端标记荧光发生基团,包括6-FAM或者HEX但不限于这些荧光染料发光基团。以FPLC层析法纯化荧光标记的引物,然后可以使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物。
根据本发明的一个优选实施方案,根据复合扩增产物片段大小来分析样本中STR数目和剂量变化。任何可以分离核酸片段大小的方法例如过滤,高效液相色谱,电泳,亲和收集等方法均可用于本发明。根据本发明的一个优选实施方案,通过凝胶电泳的方法进行分离并定量,优选使用毛细管电泳法分离染色体特异性STR位点。
根据本发明的一个优选实施方案,可以根据引物扩增产物的累计荧光值定量检测染色体特异性STR位点扩增产物的相对量,并通过计算每个STR位点扩增产物的数目和每个STR位点扩增相对剂量来分析所选染色体的是否存在染色体数目异常。
本发明提供一种使用多重定量荧光PCR技术(QF-PCR)检测21-三体和性染色体数目异常的试剂盒,该试剂盒包括PCR反应液1管(约800μl/管)、引物混合物1管(约200μl/管)、Taq酶1管(约25μl/管)、21三体阳性标准品1管(约25ul/管)、性染色体异常阳性标准品1管(约25μl/管)、阴性对照1管(约25μl/管)。特征在于其中使用的引物混合物包括针对D21S1435位点的引物:5’-AGAGCCCCATTCCCCTCTC-3’(SEQ ID NO:1)和5’-TCAgTgCCATCAAGAAAAATGA-3’(SEQ ID NO:2);针对D21S11位点的引物:5’-GTCTGTTATGGGACTTTTCT-3’(SEQ ID NO:3)和5’-TTGTATTAGTCAATGTGAGA-3’(SEQ ID NO:4);针对D21S1411位点的引物:5’-CCAGCCTTCTAAATATTCAT-3’(SEQ ID NO:5)和5’-AGATAGAACGGATAGAAAAT-3’(SEQ IDNO:6);针对AMXY位点的引物:5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’(SEQ ID NO:7)和 5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’(SEQ ID NO:8);针对DXS981位点的引物:5’-TCTTCTCTCCACTTTTCAGAGT-3’(SEQ ID NO:9)和5’-GCTAAAAACTTGGAATGATATA-3’(SEQ IDNO:10);针对DXS6809位点的引物:5’-GCTTTAGGCTGATGTGAGGA-3’(SEQ ID NO:11)和5’-GGGCATGACTAGATTATGTAG-3’(SEQ ID NO:12);针对X22位点的引物:5’-ACATAGTGATTCTGCCAGGA-3’(SEQ ID NO:13)和5’-GGGCTCTTTCAATCTGAACA-3’(SEQ IDNO:14)。引物工作浓度范围为0.05μM-10.0μM,优选范围为0.1μM-1.8μM。
根据本发明的一个优选实施方案,所说的引物的5'端使用荧光发光基团标记的。
值得特别说明的是,本试剂盒采用一个七重的复合扩增体系,可以同时包括性染色体STR位点和21号染色体在内的等七个DNA片段。通过体系优化,可以对正常样本中所选的七个位点进行均衡扩增,也可以对异常样本中可能存在的21-三体和(或)性染色体异常同时进行分析和筛查。为了确保本发明试剂盒的准确性,我们还应用细胞株提取的DNA作为阳性参考品。借助这些额外标准品,使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测,以进一步验证本发明试剂盒的检测精确度和准确性,并作为生产本发明试剂盒的附加的质量控制标准。
附图说明
图1图2显示两个正常样本多重扩增产物的电泳图。图1显示一个正常男性样本扩增电泳图。图2显示一个正常女性样本扩增电泳图。
图3图4显示两个21-三体异常样本多重扩增产物的电泳图。其中图3显示一个女性21-三体样本扩增电泳图。图4显示一个男性21-三体样本扩增电泳图。
图5显示一个XXY异常样本的多重扩增产物的电泳图。
图6显示一个Turn综合征样本多重扩增产物的电泳图。
具体实施方式
实施例1:检测试剂盒及其使用
(1)制备包括下列组成成分的试剂盒:PCR反应液1管(800μl/管)、引物混合物1管(200μl/管)、Taq酶1管(25μl/管)、21三体阳性标准品1管(25ul/管)、性染色体异常阳性标准品1管(25μl/管)、阴性对照1管(25μl/管)。
(2)标本采集、运送和保存:
1.标本采集:标本为血液,羊水,绒毛组织。血液为常规取静脉血2ml或者胎儿脐带血0.5-1ml,EDTA抗凝处理;经穿刺获羊水2-5ml或者绒毛组织两条。
2.保存:可立即检测,4℃保存一周,-20℃保存期可达一年。
3.运输:标本运送应采用0℃冰壶。
(3)检测步骤和结果分析:
DNA提取建议使用Qiagen DNA提取试剂盒。
羊水DNA提取:4℃1000g离心1.5ml羊水10分钟,去掉上清。加入200μl冰预冷的1×PBS溶液重悬沉淀。接下来按照Qiagen Blood Protocol说明书进行,直到最后一步。加入100μl AE溶液或者蒸馏水到QIAamp spin column,室温温育至少5分钟。室温6000g离心1分钟收集DNA溶液。
脐血、静脉血或者绒毛组织按照Qiagen Blood Protocol说明书进行,最后收集到200μl DNA溶液。
QF-PCR操作步骤:
1、对于每一个PCR反应体系,混合以下成分到总体积为25ul。设置阴阳性对照。
2、PCR反应条件:93℃预变性4分钟,然后93℃1分钟,58℃1分钟,72℃1分钟,共26个循环;最后60℃45分钟。
扩增产物电泳
对于每一个分析,1ul PCR产物和13.5ul Hi-DiTM formamide、0.5ul GeneScan ROX-500Sizestandard混合。95℃加热变性混合物5分钟。放置冰上至少1分钟。瞬时离心混合物。上样ABI310/ABI3100遗传分析仪,然后应用软件进行结果分析。结果图谱如图1,图2,图3,图4,图5,图6所示。其中图1,图2为正常男性和正常女性的结果分析图谱。
实施例2:通过QF-PCR扩增21号染色体上的STR位点检测21-三体综合征
来自供体的血样、羊水或绒毛组织按照Qiagen DNA提取试剂盒的标准程序进行DNA提取纯化。每个样本DNA溶液的浓度用TE buffer(5mM Tris-HCl pH8.0,1mM EDTA pH8.0)调整到20-40ng/μl。应用试剂盒中提供的引物混合物,PCR缓冲液体系和Taq酶按照试剂盒检测规程进行扩增反应并上样分析。扩增反应同时扩增D21S11,D21S1435,D21S1411,AMXY, DXS981,DXS6809,X22等七个位点,上样结果的分析图谱如图3,图4。如图所示,21号染色体上的三个位点D21S11,D21S1435和D21S1411扩增分析位点的基因型,在为21-三体综合征时可形成1:1:1的峰(面积)或者2:1的荧光峰(面积),纯合子时为单荧光峰(面积)不能提供遗传信息。因此可以快速检测21-三体综合征。反应同时检测性染色体上的遗传位点(基因),但是所有位点均为1:1的荧光峰或者为单峰,不能提供诊断性染色体异常的遗传信息。
实施例3:通过QF-PCR扩增性染色体上的遗传位点检测Klinefelter综合征
来自供体的血样、羊水或绒毛组织按照Qiagen DNA提取试剂盒的标准程序进行DNA提取纯化。每个样本DNA溶液的浓度用TE buffer(5mM Tris-HCl pH8.0,1mM EDTApH8.0)调整到20-40ng/μl。应用试剂盒中提供的引物混合物,PCR缓冲液体系和Taq酶按照试剂盒检测规程进行扩增反应并上样分析。扩增反应同时扩增D21S11,D21S1435,D21S1411,AMXY,DXS981,DXS6809,X22等七个位点,上样结果的分析图谱如图5。如图所示,21号染色体上的三个位点D21S11,D21S1435和D21S1411扩增分析位点的基因型,形成杂合子1:1的荧光峰(面积)或者纯合子时为单荧光峰(面积),不能提供遗传信息。性染色体上的遗传位点AMXY,X22形成2:1的荧光峰(面积),表示X染色体上基因剂量是Y染色体上的两倍,而X染色体上的位点DXS981和DXS6809形成1:1的荧光峰(面积),表明有两条X染色体的存在,联合分析可以快速检测Klinefelter综合征。
实施例4:通过QF-PCR扩增性染色体上的遗传位点检测Turner综合征
来自供体的血样、羊水或绒毛组织按照Qiagen DNA提取试剂盒的标准程序进行DNA提取纯化。每个样本DNA溶液的浓度用TE buffer(5mM Tris-HCl pH8.0,1mM EDTApH8.0)调整到20-40ng/μl。应用试剂盒中提供的引物混合物,PCR缓冲液体系和Taq酶按照试剂盒检测规程进行扩增反应并上样分析。扩增反应同时扩增D21S11,D21S1435,D21S1411,AMXY,DXS981,DXS6809,X22等七个位点,上样结果的分析图谱如图6。如图所示,21号染色体上的三个位点D21S11,D21S1435和D21S1411扩增分析位点的基因型,形成杂合子1:1的荧光峰(面积)或者纯合子时为单荧光峰(面积),不能提供遗传信息。性染色体上的遗传位点AMXY,X22,DXS981和DXS6809都形成单荧光峰(面积)。结合患者临床症状联合分析可以快速检测超雌综合征。
序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
<120>检测21号染色体和性染色体数目异常的方法及试剂盒
<140>
<141>
<160>14
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的引物。
<400>1
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的引物。
<400>2
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>3
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>4
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>5
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>6
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>7
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>8
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>9
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>10
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>11
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>12
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>13
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的探针。
<400>14
Claims (3)
1.一种用于检测人21-三体和性染色体数目异常的试剂盒,包括:(1)一个七重复合扩增体系,以扩增染色体特异性的STR位点;(2)针对一组特异性染色体的STR位点进行检测和分析;(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量,其特征在于所使用的荧光染料标记的上游和下游寡核苷酸引物分别是:
针对D21S1435位点的是:5’-AGAGCCCCATTCCCCTCTC-3’(SEQ ID NO:1)和5’-TCAgTgCCATCAAGAAAAATGA-3’(SEQ ID NO:2);
针对D21S11位点的是,5’-GTCTGTTATGGGACTTTTCT-3’(SEQ ID NO:3)和5’-TTGTATTAGTCAATGTGAGA-3’(SEQ ID NO:4);
针对D21S1411位点的是:5’-CCAGCCTTCTAAATATTCAT-3’(SEQ ID NO:5)和5’-AGATAGAACGGATAGAAAAT-3’(SEQ ID NO:6);
针对AMXY位点的是:5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’(SEQ ID NO:7)和5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’(SEQ ID NO:8);
针对DXS981位点的是:5’-TCTTCTCTCCACTTTTCAGAGT-3’(SEQ ID NO:9)和5’-GCTAAAAACTTGGAATGATATA-3’(SEQ ID NO:10);
针对DXS6809位点的是:5’-GCTTTAGGCTGATGTGAGGA-3’(SEQ ID NO:11)和5’-GGGCATGACTAGATTATGTAG-3’(SEQ ID NO:12);
针对X22位点位点的是:ACATAGTGATTCTGCCAGGA-3’(SEQ ID NO:13)和5’-GGGCTCTTTCAATCTGAACA-3’(SEQ ID NO:14)。
2.根据权利要求1的试剂盒,其特征在于七重复合扩增体系优选了一个AMXY基因片段和六个STR位点,包括D21S11,D21S1435,D21S1411,DXS981,DXS6809,X22,STR位点核心重复序列长度为4-5核苷酸序列片段。
3.根据权利要求1的试剂盒,其特征在于染色体数目异常是指21号染色体三体和性染色体单体或者性染色体多倍体,选用的21号染色体和性染色体上特异性的遗传标记位点是D21S1435位点、D21S11位点、D21S1411位点、AMXY位点、DXS981位点、DXS6809位点和X22位点。
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