CN1110573C - 检测人21号染色体三体的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种唐氏综合症的产前诊断方法，其中包括PCR扩增21号染色体上至少三个位点并观察这些位点的多态性。还公开了用于上述方法的试剂盒，其中包括用于PCR扩增的特异性引物。
Description
技术领域
本发明涉及一种产前诊断唐氏综合症的方法，特别是一种利用聚合酶链式反应(PCR)的唐氏综合症产前诊断方法，还涉及一种用于本发明诊断方法的试剂盒。
背景技术
唐氏综合症(Down’s syndrome)，又称先天愚型，或21三体，是最常见的染色体病之一。也是造成先天智力低下的主要原因。其临床特征为：严重智力低下，独特的面部和身体畸形(如宽眼距，低鼻梁，肌无力，肢体短小，及贯通手等)，先天性心脏病，消化道畸形等，白血病的发病率比一般人要高得多。
该病的发病机制是生殖细胞减数分裂时不分离。而绝大多数病例是由卵细胞第一次(75％)或第二次(15％)减数分裂不分离所致；发生于精子细胞的只占少数(10％)。所以该病的发病率与母亲年龄有关，母龄越大，发病率也越高。例如，母龄为25岁者，发病率为1/1200；35岁者，发病率为1/300，而45岁者发病率可高达1/50。群体中的平均发病率为1/700～1/800。与一般的基因病(如常染色体显/隐性遗传，或性常染色体显/隐性遗传)不同，唐氏综合症这类染色体病是偶发的，每个孕妇都有一定的危险性，而且一般没有种族或家族积聚的现象。
常规细胞遗传学方法诊断通常需要取胎儿组织(羊水或绒毛)，经过长达两周的细胞培养，再经过繁复的染色体制片，显带，拍照，剪排核型等工续才能等到细胞遗传学结果。常规细胞遗传学方法不仅周期长、操作繁杂，而且效率不高。
曾报道过用PCR(多聚酶链式反应)来查染色体异常的方法。例如，von Eggeling F等，(Human Genetics.91(6)：567-70，1993 Jul.)；Celi FS.等，(Genomics.21(2)：304-10，1994 May 15.)；Lee HH.等，(HumanGenetics.99(3)：364-7，1997 Mar.)分别报道了利用天然(基因组中现有的DNA)或人工(利用生物技术加工出的)扩增对照物的手段定量推测染色体数目的试验方法。Adinolfi M.等(Bioassays.17(7)：661-4，1995 Jul.)，也对用PCR扩增多态重复序列的方法诊断唐氏综合症进行了报道。但受限于下述因素上述有关技术没能转化为成型产品：用对照或内部参考的定量PCR方法要靠PCR产物的大小来区分PCR扩增出的野生型与对照物。因为PCR产物大小不同，即便使用同样引物，扩增出的产物量也会差别很大，因此可能导致定量误差而误诊染色体三体综合症。另外，多数报道所使用的仪器设备都较昂贵(如用毛细管电泳仪，或全自动DNA测序仪等价值十几万美元的设备)，或应用了放射同位素等有害试剂。
发明内容
如上所述，现有的分子遗传学方法由于PCR杂交等操作中存在许多影响扩增产物量的因素以及需要昂贵的仪器而不令人满意。本发明的目的是提供一种操作简便、设备简单而又结果准确的唐氏综合症产前诊断方法。
本发明的另一目的是提供用于唐氏综合症产前诊断的试剂盒。
概括地讲，本发明涉及一种唐氏综合症的产前诊断方法，包括(a)从含有胎细胞的取自孕妇的样品中分离胎细胞；(b)从所述胎细胞提取DNA；(c)用三对或三对以上PCR引物从上述DNA同时扩增21号染色体上三个或三个以上的多态位点；(d)电泳分离PCR产物并显色，观察至少一个多态位点扩增产物三带型的存在与否。
上述方法的(a)步中所述样品选自：血液、尿液、组织样品和羊水，优选为羊水。
上述方法的(c)步中，每个多态位点的杂合率大于70％，优选大于80％，例如大于83％。
本发明还涉及用于上述诊断方法的试剂盒，其中包括用于扩增21号染色体上三个或三个以上多态位点的三对或更多引物和用于进行PCR扩增的试剂。
本发明采用分子遗传学的方法诊断唐氏综合症，其诊断手段是用PCR方法扩增位于21号染色体上的多态性位点。所谓多态性是指群体中这个位点上有许多等位基因。正常人的21号染色体只有父源和母源两条，因此每个位点上只应有两个等位基因。患唐氏综合症时，多出的一条21号染色体使患者在每个位点上有三个等位基因，也就有三个分子量不同的PCR产物。我们用来诊断的DNA标记是分布在21号染色体上不同区域的三个或更多多态位点，综合分析这些位点的PCR产物可以定性地为97％的病人作出诊断，甚至达到99.5％以上。
在本发明的一个优选实施方案中，利用三对引物扩增21号染色体上三个多态位点，每个位点的杂合率大于83％。
在本发明的一个优选实施方案中，每个多态位点中等位基因表现为四聚核苷酸重复序列重复次数不同的DNA片段，它们之间分子量大小的差别足以用凝胶电泳法加以区分。
在本发明的一个优选实施方案中，选择三个多态位点的扩增产物大小，使得可以扩增出三组在凝胶电泳上可区分的PCR产物。即每组中的多态性扩增产物在电泳胶上的迁移位置互邻，中间没有被别组的扩增产物带所分隔。优选组间扩增产物大小相差至少20个核苷酸，更优选至少40个核苷酸。
在本发明的一个优选实施方案中，三对PCR产物为1号和2号序列；3号和4号序列；以及5号和6号序列。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的诊断方法中还包括一个对照位点的PCR扩增。优选该位点为纯合位点。在一具体实施方案中，该对照位点为用序列号7和8引物对所扩增的10号染色体上的位点。该对照用作扩增反应的对照(AC)。
在本发明的另一实施方案中，本发明的诊断方法中还包括一个检测对照，例如由9，10号引物对扩增出的X染色体基因组DNA片段，用作电泳及染色反应的对照。
在本发明的一实施方案中，所用引物对是被标记的，例如用荧光团标记或用生物素标记等。
唐氏综合症的发病机制是生殖细胞减数分裂时染色体不分离。有85％以上的病例为第一次减数分裂时同源染色体不分离，其余15％的病例为第二次减数分裂时姐妹染色单体不分离所致。
第一次减数分裂不分离造成同源的两条21号染色体停留在同一个生殖细胞内，经正常的第二次减数分裂以后，每个生殖细胞内有两条21号姐妹单体。这种不正常的卵细胞受精后，加上一条父源的21号染色体，就变成21三体。因为同源的两条21号染色体(其中一条来自她的父亲，另一条来自她的母亲)及来自精子的一条染色体遗传来源不同，虽然在细胞水平上三者很难区分，在分子水平上完全可以靠多态DNA标记加以鉴别。所谓多态性是指群体中每个基因位点上都有多个等位基因，如A位点上可以有A1，A2，A3，……等多个等位基因。而就群体中某个正常个体而言，因为他(她)只有两条同源染色体，所以在某一位点上只可能有两个等位基因。这两个等位基因的遗传物质完全相同时为纯合体(Homozygous)，不同时为杂合体(Heterozygous)。本发明依赖检测高度多态(高杂合率)的四聚核苷酸重复序列的方法区别唐氏综合症时的三条21号染色体。具体方法是通过PCR扩增多态位点。一对PCR引物扩增一个位点，该位点上的数个等位基因则表现为四聚核苷酸重复序列重复次数不同的DNA片段，因为分子量大小的不同可以用凝胶电泳法加以区分。我们所选的21号染色体上的位点杂合率都在83％以上，纯合率为17％。所以，就任何一个位点而言，有83％的正常人因为是杂合体而经PCR电泳后可见到两条带纹。唐氏综合症时则有三种等位基因组合的可能：(1)三条21号染色体上的等位基因都不相同，为纯杂合体。一对针对特定位点的PCR引物可以扩增出三个不同分子量的产物，电泳显示三条带。(2)三个等位基因中有两个相同，一个不同，为半杂合。一对PCR引物可以扩增出两个不同分子量的产物，电泳显示两条带。(3)三个等位基因完全相同，为纯合体。一对PCR引物只能扩增出一种产物，电泳显示一条带。就一个位点而言，出现三条带的几率是68％(83％×83％)，这种情况下唐氏综合症可以得到定性诊断；唐氏病人出现两条带的几率是28％(83％×17％×2)，因为两种PCR产物的量有明显不同(为2∶1，正常人的两个等位基因PCR产物量相同，为1∶1)可以用定量的方法协助诊断；病人只出现一条带的几率是3％(17％×17％)，不能诊断。
本发明的一个特点就是用增加检测位点数目的方法提高定性诊断能力。如果综合分析三个位点PCR结果的话，则有97％的病例因为至少有一个位点为纯杂合体(电泳三条带)而得到定性诊断。
第二次减数分裂不分离也能引起唐氏综合症。因为不分离的是姐妹染色单体，所以如果在减数分裂以前没有发生同源染色体互换的话，就不可能有杂合体存在，也就无法做定性诊断了。本发明例举了三个位点：1号位点GATA49E01；2号位点GATA8G04；3号位点GATA70B08。三个位点分别位于21号染色体距着丝点45，55，80毫摩(CM)的地方。也就是说三个位点分别有45％、55％，80％的重组率，加上唐氏综合症时染色体重组率提高至少30％，所以三位点呈纯杂合体的可能性分别是：40.3％，49.3％，及71.65％。综合分析三个位点PCR结果，则有91.4％的病例因为至少有一个位点为纯杂合体(电泳三条带)而得到定性诊断。
附图说明
图1：表示本发明一具体实例中PCR反应后电泳分离扩增产物并显色后的结果照片。
1号和2号序列是一对PCR引物，用来扩增位于21号染色体上基因组DNA的一个多态重复序列。扩增产物大小在124-152个碱基对之间。
3号和4号序列是一对PCR引物，用来扩增位于21号染色体上基因组DNA的一个多态重复序列。扩增产物大小在162-186个碱基对之间。
5号和6号序列是一对PCR引物，用来扩增位于21号染色体上基因组DNA的一个多态重复序列。扩增产物大小在209-227个碱基对之间。
7号和8号序列是一对PCR引物，用来扩增位于10号染色体上基因组DNA的一段保守序列。扩增产物大小为158个碱基对。
9号和10号序列是一对PCR引物，用来扩增位于X号染色体上基因组DNA的一段保守序列。扩增产物大小为236个碱基对。
下述具体实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。
具体实施方式
本实例中使用了下列试剂：
1.DNA提取液(为美国Gull Laboratory公司产品)，DNA溶解液(1.5ml蒸馏水)。
2.PCR试剂：引物(由美国Research Genetics公司合成)：含有四对引物可以扩增21号染色体上的1，2，3号位点及10号染色体上的一个对照位点(序列见序列表)，dNTPs(从Boringer Manham公司购买)，Taq耐热DNA多聚酶(Perkin Elmer)，10x PCR缓冲液(Genaco)，矿物油(Sigma)。
3.电泳试剂：TBE(Tris-硼酸-EDTA)缓冲液，40％聚丙烯酰胺(Fisher)，尿素(Fisher)，TEMED(Sigma)，过硫酸铵(Sigma)，点样缓冲液。
4.显色试剂：链亲和素AP偶联物(Schleicher & Schuell)，封闭缓冲液(Schleicher & Schuell)，清洗液(1.5M NaCl)，20％SDS，显色底物药片(Schleicher & Schuell)。
I.提取胎儿DNA
(1).加30ml双蒸水将DNA提取液稀释成1倍制剂备用。用常规腹壁穿刺的方法取羊水5-10毫升。通过肉眼观察的方法以粗略估计羊水中细胞的密度，并分成四级：+，细胞极少，羊水几乎透明；++，细胞量中等，羊水稍有混浊；+++，细胞多，羊水混浊；++++，细胞极多，羊水很混浊。给羊水细胞含量分级的目的是为了使以后PCR用的DNA模板量规范化，病人与病人之间的差异尽可能减小(参见以下有关准备PCR反应一节)。
(2).取2ml羊水放入容量为2毫升的微离心管内，离心(10,000到14,000转/分钟)20秒钟。倒掉上清液，加入0.7ml DNA提取液，盖紧试管，用振荡器悬浮沉淀的细胞颗粒。将余下的羊水放置4℃冰箱保存以防万一需要重复检测。
(3).将试管放入微波炉的中央，微波(775瓦)加热10秒钟。每次加热不超过8管。加热后DNA提取液会由清澈透明变成雾样混浊，试管也会非常热。
(4).轻轻晃动试管以混匀内容物，但不要将液体摇晃到试管盖子里面去。如果盖子里面有液体，请略加离心。
(5).再将试管放入微波炉中加热3秒钟(2325瓦-秒)。DNA提取液又会变混浊。注意：如果提取液不变混浊，离心管的管壁也不热的话，说明加热不够，很可能导致DNA提取失败并造成假阴性。
(6).将加热过的离心管放置室温冷却3分钟(或放置冰上1分钟)。冷却有助于分离不必要的蛋白质。
(7).离心1分钟，以将变性的蛋白质沉淀。
(8).移取500μl上清液放入一个新的1.5ml微离心管内，尽量不去扰动蛋白质沉淀颗粒。移液时一定注意每个病人标本更换一次枪头。如果蛋白质沉淀颗粒被搅动，重新离心1分钟。
(9).在放有上清液的微离心管内加入分子生物学纯度的异丙醇500微升。将微离心管颠倒十数次以混合内含物。
(10).将微离心管放入离心机内，离心1分钟。如果微离心管的管颈都是统一朝上的话，沉淀颗粒将会在试管的同一方向。离心以后有可能观察到一个很小的DNA沉淀颗粒。
(11).小心倒掉上清液，加入1ml 70％的酒精并用振荡器清洗沉淀颗粒。
(12).再次将样品离心1分钟。在不扰动沉淀颗粒的前提下吸去上清液(或将上清液倒掉)。将微离心管倒置凉干约5分钟。
(13).根据第一步时为羊水细胞密度进行的估计，每个病人加不同量的DNA溶解液：+者加10微升；++加20微升；+++，30微升；++++，加40微升。
(14).如标本不马上使用的话，放置-20冰箱内保存。
II.建立PCR反应
PCR试剂1中含有4对PCR引物，其中三对可以扩增21号染色体上的三个多态位点，分别为序列1∶2；序列3∶4及序列5∶6；另一对则扩增10号染色体上的一个非多态性位点(用来做PCR正对照)，即序列7∶8。
(1).首先在PCR用的小离心管上标记好病人编号。每个病人要准备一个小离心管。按照编号在每个病人的两管中分别加入2μl从羊水中提取出的DNA。注意每添加一个病人的标本要更换一次移液枪头。
(2).根据病人数量按比例制成PCR反应混合液。例如，一次试验要给八个病人做检测则按如下配方：
引物混合液(每个引物含25ng) 130μl
dNTPs 32μl
Taq酶 2μl
10倍缓冲液 20μl
总计 184μl
反应混合液配制好以后在每个已经加好DNA模板的小离心管内加入23μl反应混合液，PCR反应的最终体积为25μl。
(3).每管加入一滴矿物油。离心一分钟。按如下条件编排PCR扩增程序：先做95℃，3分钟一个周期；然后，94℃，1分钟；61℃，2分钟；72℃，3分钟。扩增6个周期以后换条件为：94℃，45秒钟；61℃，45秒钟；72℃，45秒钟。在这个新条件下扩增24个周期后，再加一个72℃ 7分钟的周期。反应停止后标本放室温保存。
III.电泳分离PCR产物
(1).配制10倍的TBE缓冲液。
(2).配制6％聚丙烯酰胺变性胶液。
(3).按照厂家说明安装玻璃板，制备凝胶。
(4)配制0.6倍TBE电泳缓冲液。将胶预跑一小时使玻璃板的温度达到大约50-55℃。电压强度大约在500伏左右，不同品牌的电泳仪条件可能不同。
(5).在每份25℃的PCR产物中加入17μl的点样缓冲液(点样缓冲液中含有用第9，10号引物扩增出的一个大小为236个碱基对的PCR产物。放在点样缓冲液中的目的是做电泳及下一步显色反应的正对照)。振荡混均后加热94-100℃五分钟(可以在PCR仪中进行加热变性)。
(6).用注射器彻底清洗点样井孔底部尿素，将加热变性将后的标本点在每个井孔中，在500伏下电泳大约35分左右，等到大分子量的染料(跑得慢的浅绿色带)刚刚跑出胶底后停止电泳。
(7).转膜。将夹着凝胶的玻璃板分开。凝胶通常与其中一块玻璃板结合在一起(为了让胶每次都跟着特定的一块玻璃走，应该在另一块玻璃上涂一层silicon)。将尼龙膜用去离子水浸5分钟，把潮湿的尼龙膜齐胶底放在凝胶上(因为所有相关产物都已跑到胶的下半部，只有一半需要转膜，上半部用保鲜膜搭胶边盖住，以保证转膜成功)。在尼龙膜上放两张转膜滤纸，放回拆开来的那层玻璃，颠倒两块玻璃使凝胶内的DNA能借重力及虹吸效应转移到尼龙膜上。加一重物在玻璃板上以加快转膜过程。转膜过程需要至少4小时。
IV.显色反应
(1).取4.5μl的链霉亲和素-AP偶联物稀释到7.5ml 1倍的封闭缓冲液中。
(2).将带有DNA的尼龙膜放入一个塑料口袋中，加入上述7.5ml显色试剂混合液。将塑料袋加热封闭。室温下摇动反应一小时。
(3).配制清洗液，把尼龙膜放入50ml含1％ SDS的清洗液中摇动清洗5分钟。重复清洗一次。
(4).用50ml不含SDS的清洗液清洗5分钟。
(5).将底物药片溶解在30ml蒸馏水中。再将洗干净的尼龙膜放入一个塑料口袋中，加入15ml底物(另外15m放存到下次用)，加热封口。天蓝色的带纹在20分钟到2小时内开始显示。
V.结果分析
图1为分子生物学诊断结果。DC：由第9，10号引物扩增出的PCR产物用来做电泳及显色反应对照；1号位点显带区：2号位点显带区；AC：扩增反应对照；3号位点显带区。如图所示，分析时应首先观察DC，AC两个对照位点。每个标本都应在DC位点看到产物，说明电泳，转膜，显色等程序没有问题。每个标本也都应该在AC位点看到一条大小衡定的产物，说明DNA提取，PCR扩增反应试剂等都没有问题。然后依次观察三个多态位点。正常人杂合体时每个位点有两个等位基因，表现为强度相等的两条带纹。也有17％纯合的可能性，电泳显示一条带。唐氏综合症病人如果在某位点(如图中的2号位点)为纯杂合体，就有三个不相同的等位基因，则电泳后可见到强度相等的三条带纹。如位点为半杂合体，则三个等位基因有两个相同，电泳后可见强度为2∶1的两条带纹(如图中的1，3号位点)。如前所述，根据发病机制的不同，综合观察三个位点的PCR结果，可以分别为97％(第一次减数分裂不分离)或91.4％(第二次减数分裂不分离)做定性诊断。实际上，如果加上半杂合时的定量诊断(靠2∶1的带纹强度)，则在两种机制下诊断率都可达到99％以上。
序列表(1)一般信息(i)申请人：韩健(ii)发明题目：唐氏综合症产前诊断方法和试剂盒(iii)序列数目：8(iv)联系人地址：(A)联系人：王冰女士(B)街号：海淀区正福寺四号(C)城市：北京市(D)国家：中华人民共和国(E)邮编：100081(v)电脑可读文件：(A)储存媒介：3.5英寸磁盘(B)电脑：IBM兼容机(C)操作系统：Microsoft Windows(D)应用软件：Microsoft Word 6.0(2)有关1号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：27个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：非(iiv)特殊加工：生物素5′端标记(xi)序列描述：1号序列CATTCCCCTC TCAATTGTTT GTCTACC(2)有关2号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：26个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：有(iiv)特殊加工：无(xi)序列描述：2号序列CGTATATTAT TGAGTCCTGT GAAATG(2)有关3号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：27个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：非(iiv)特殊加工：生物素5′端标记(xi)序列描述：3号序列TTCAGGGCTA CATAGAGAAA CAGAACC(2)有关4号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：20个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：有(iiv)特殊加工：无(xi)序列描述：4号序列ACACACACAC ACACACATGG(2)有关5号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：26个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：非(iiv)特殊加工：生物素5′端标记(xi)序列描述：5号序列TATGTACGAT ACGTAATACT TGACAA(2)有关6号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：23个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：有(iiv)特殊加工：无(xi)序列描述：6号序列AATATGTCCC AAAGGACCTG CTC(2)有关7号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：22个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：非(iiv)特殊加工：生物素5′端标记(xi)序列描述：7号序列GAGTTTATTG GTACAGGTGC AG(2)有关8号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：21个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：有(iiv)特殊加工：无(xi)序列描述：8号序列ATGGACAGTA GCCTATATGC C(2)有关9号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：20个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：非(iiv)特殊加工：生物素5′端标记(xi)序列描述：9号序列TGTATGCCTT GGCAATTTAA(2)有关10号序列的信息：(i)序列特征(A)长度：20个核苷酸(B)种类：脱氧核糖核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线状(ii)分子种类：DNA(iii)假设性：非(iv)反义链：有(iiv)特殊加工：无(xi)序列描述：10号序列CATGTTTCAC AGGAAAGTTC
Claims (20)
1.一种检测人21号染色体三体的方法，包括(a)从含有胎细胞的样品中分离胎细胞；(b)从所述胎细胞提取DNA；(c)用三对或三对以上PCR引物从上述DNA同时扩增21号染色体上三个或三个以上的多态位点；(d)电泳分离PCR产物并显色，观察至少一个多态位点扩增产物三带型的存在与否。
2.根据权利要求1的方法，其中所述样品选自血液、尿液、组织样品和羊水。
3.根据权利要求2的方法，其中所述样品为羊水。
4.根据权利要求1的方法，其中每个多态位点的杂合率大于70％。
5.根据权利要求4的方法，其中每个多态位点的杂合率大于80％。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中使用三对PCR引物扩增三个多态位点。
7.根据权利要求6的方法，其中三对引物如下：
CATTCCCCTC TCAATTGTTT GTCTACC
CGTATATTAT TGAGTCCTGT GAAATG；
TTCAGGGCTA CATAGAGAAA CAGAACC
ACACACACAC ACACACATGC；和
TATGTACGAT ACGTAATACT TGACAA
AATATGTCCC AAAGGACCTG CTC。
8.根据权利要求1-5之一的方法，其中在(c)步还包括PCR扩增一个纯合的扩增对照位点。
9.根据权利要求8的方法，其中用于扩增对照位点的PCR引物对为GAGTTTATTG GTACAGGTGC AG
ATGGACAGTA GCCTATATGC C。
10.根据权利要求1-5之一的方法，其中在(c)步还包括PCR扩增一个检测对照位点。
11.根据权利要求10的方法，其中用于检测对照位点的PCR引物对为
TGTATGCCTT GGCAATTTAA
CATGTTTCAC AGGAAAGTTC。
12.一种用于唐氏综合症产前诊断的试剂盒，其中包括用于扩增21号染色体上至少三个多态位点的至少三对引物和用于进行PCR扩增的试剂。
13.根据权利要求12的试剂盒，其中每个多态位点的杂合率大于70％。
14.根据权利要求13的试剂盒，其中每个多态位点的杂合率大于80％。
15.根据权利要求12-14任一项的试剂盒，其中使用三对PCR引物扩增三个多态位点。
16.根据权利要求15的试剂盒，其中：对引物如下：
CATTCCCCTC TCAATTGTTT GTCTACC
CGTATATTAT TGAGTCCTGT GAAATG；
TTCAGGGCTA CATAGAGAAA CAGAACC
ACACACACAC ACACACATGC；和
TATGTACGAT ACGTAATACT TGACAA
AATATGTCCC AAAGGACCTG CTC。
17.根据权利要求12-14之一的试剂盒，其中还包括用于PCR扩增一个纯合的扩增对照位点的引物对。
18.根据权利要求17的试剂盒，其中用于扩增对照位点的PCR引物对为GAGTTTATTG GTACAGGTGC AG
ATGGACAGTA GCCTATATGC C。
19.根据权利要求12-14之一的试剂盒，其中还包括PCR扩增一个检测对照位点的引物。
20.根据权利要求19的试剂盒，其中用于检测对照位点的PCR引物对为
TGTATGCCTT GGCAATTTAA
CATGTTTCAC AGGAAAGTTC。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101323877B (zh) * | 2007-06-15 | 2011-05-11 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测21号染色体和性染色体数目异常的试剂盒 |
| CN101560565B (zh) * | 2009-05-12 | 2011-08-24 | 北京大学第三医院 | 一种21-三体综合征产前筛查试剂盒 |
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| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHENZHEN JIENA BIOTECHNOLOGY CO., LTD.,202,2-204A Free format text: FORMER OWNER: HAN JIAN Effective date: 20060811 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20060811 Address after: 518057. A biological incubator building, 1-201, 202, 2-204A and B, Nanshan District hi tech, Guangdong, Shenzhen Patentee after: Shenzhen Jiena Biological Technology Co. Ltd. Address before: 100081 No. four Fu Fu Temple, Beijing, Haidian District Patentee before: Han Jian |
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| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20030604 Termination date: 20101012 |