JP2003500067A

JP2003500067A - 少なくとも１つの疾患に対する患者の遺伝的疾病素質の分析法およびその方法に適応する増幅

Info

Publication number: JP2003500067A
Application number: JP2000620127A
Authority: JP
Inventors: ブリュノ・モーギン; ジャン−マリー・ティルシー
Original assignee: ベーイーオー・メリュー
Priority date: 1999-05-20
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2003-01-07
Also published as: DE60014887T2; AU4766000A; ATE279535T1; CN1351672A; CA2374440A1; AU772175B2; EP1179091A1; WO2000071750A1; ES2230109T3; BR0010739A; US7060438B1; DE60014887D1; EP1179091B2; ES2230109T5; EP1179091B1; DE60014887T3; FR2793809A1; FR2793809B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、少なくとも１の疾患についての患者の遺伝的体質を分析する方法に関する。本発明はこの方法に適合された増幅方法に関する。この方法は、探索する疾患の興味ある少なくとも１の多形領域の増幅に由来する少なくとも１のタイプのアンプリコンを含む液体試料を、特定のプローブの存在下に置くことからなる。その特定のプローブとしては、疾患に特異的な低分解能タイピングプローブ、及びそのタイピングプローブに特異的な高分解能サブタイピングプローブがある。これらのプローブがハイブリダイズするか否かで、疾患に対する感受性又は抵抗性があるかを区別できる。本発明は特に診断分野において利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、慢性関節リウマチ（リューマチ性関節炎）または強直性脊椎炎など
の少なくとも１つの疾患に対する患者の遺伝子的疾病素質（遺伝的体質）の分析
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

各個体は、個体の先祖から受け継いだ遺伝的遺産を有する。この特定の遺伝的
状況は、しばしば以下の一定の病態（病原体（例えば、（AIDSウイルス））の感
染、自己免疫疾患（例えば、リウマチ性疾患））の出現および/または発症に積
極的に関与し得る。主要組織適合複合体（MHC）の遺伝子、特にHLA抗原（ヒト白
血球抗原）をコードする遺伝子は、慢性関節リウマチ（Lawrence, 1970、Stastn
y, 1978、Khan, 1979、Stastny, 1983、Gregersen, 1986、Gregersen, 1987、St
astny, 1988、Todd, 1988、Wordsworth, 1989、Nepom, 1989、Hiraiwa, 1990、N
epom, 1991）または強直性脊椎炎（Brewerton, 1973、Schlosstein, 1973、Benj
amin, 1990）などの関節自己免疫疾患の発症の主要な原因である。

【０００３】慢性関節リウマチ抵抗性遺伝的要素の大部分を免疫応答の制御機構の中枢機能
であるTリンパ球に対するペプチド提示に関与するHLA-DR分子のβ鎖をコードす
るHLA-DRB遺伝子に関連付けることが可能である。より正確には、慢性関節リウ
マチに関与すると報告された種々の対立遺伝子においては、HLA-DRβ1分子の第
３の超可変部の第70位-第74位に対応する５つのアミノ酸の特定の配列が存在す
ることが示されている。配列QKRAA、QRRAA、またはRRRAA（一文字表記のアミノ
酸コード）に対応するこの「共有エピトープ」が関与することが、現在十分に報
告されている。遺伝子型が抵抗性対立遺伝子を含まないかその１つまたは２つを
含む場合、この分子的説明はまた、疾患の重症度が進行するという所見（一般に
、線量-効果と呼ばれる）と首尾一貫する。

【０００４】強直性脊椎炎はHLA-B27抗原に非常に強く関連する（相対危険度：69.1）こと
が認められた別の炎症性疾患である（Baarsma, 1992）。1977年には、Schlosste
inがHLA-B27と種々の脊椎関節炎との強い関連を公開している（Schlosstein, 19
77）。HLA-B27分子のこの関連を説明するために、特異的ペプチドを提示する機
能が関与する、種々の仮説が提唱されている。

【０００５】 HLA-B27と急性前部ブドウ膜炎との間の正の関連性（相対危険度8.2）も公表さ
れている。

【０００６】リウマチ学的コンサルティングで一般に行われている分析であるという事実に
よって証明されているように、HLA-B27抗原の検出は明らかな臨床液価値を有す
る。

【０００７】目的の（興味ある）特異的領域を増幅および分析する分子生物学的技術を使用
して、1つまたは複数のHLA-B^*27対立遺伝子の検出も可能である。

【０００８】 1985年には、WeissがHLA-B27遺伝子の構成、配列、および発現を発表している
。1991年には、HillがPCRによりHLA-B遺伝子の多形領域の増幅法および特異的プ
ローブを用いたハイブリダーゼーションによるHLA-B^*2703の検出法を発表してい
る（Hill, 1991）。Dominquezは、1992年、HLA-B遺伝子の多形領域をPCRで増幅
した後に、B27遺伝子型を分類する最初の方法の説明を発表している。

【０００９】現在、慢性関節リウマチに関しては、１つまたは複数の抵抗性対立遺伝子を同
定することが通常行われており、これによって特に、低分解能又は一般的なHLA-
DRタイピングの間に１つ又は複数のＨＬＡ-ＤＲ4抗原または１つまたは複数のHL
A-DRB1^*gr04対立遺伝子の検出が可能となっている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】

これらの試験は、輸血センターや一定の専門病院等の、HLA遺伝子研究の専門
センターで行われる。したがって、この同定は、サンプルの発送および非常に骨
の折れる技術の使用を必要とする。したがって、 -サンプルを紛失する危険性があること、 -同定に膨大な時間がかかること、 -同定に比較的高いコストがかかること、および -このサービスの提供者について、当該サービスを要求する者を調整すること
ができないなどの負の結果が存在する。

【００１１】分子生物学的技術を使用、HLA-DRと慢性関節リウマチとの関連についての最新
技術は非常に限られている。

【００１２】強直性脊椎炎では、最新技術は、本質的に免疫学的技術からなる。これは、B2
7抗原の同定を可能にする特許出願WO-A-95/30152の場合である。したがって、強
直性脊椎炎に関しては、血清学的技術（特異的抗B27抗体を使用したフローサイ
トメトリーまたは細胞傷害性による）を使用したHLA-B27抗原の単純な探索が慣
習的に行われている。

【００１３】これらの技術は迅速であるが、自己抗原またはペプチドによる、B27抗原のマ
スキングによる偽負性の反応がしばしば認められる（Neumuller, 1993、Kirvesk
ari, 1997）。さらに、リンパ球表面に発現する抗原を分析する何れの技術と同
様に、細胞を良好に保持する注意が必要であり、しばしばこれに拘束される。

【００１４】この分野でも、最新技術は分子生物学技術からなる。したがって、米国特許第
4,971,902号は、慢性関節リウマチについての患者の疾病素質（体質）の診断用
プローブに関する。これらのプローブは、DRB1^*gr04群の対立遺伝子の認識に基
づく。

【００１５】しかし、このDRB1^*gr04群対立遺伝子が慢性関節リウマチと有効に関連する場
合、現在公知の全ての対立遺伝子（DRB1^*gr0401-DRB1^*gr0427）がこの疾患に関
連する必要は無い。この結果は、分類がDRB1^*gr04対立遺伝子に限られる場合、
存在する対立遺伝子に依存して、医師および患者に警告する必要の無い偽陽性が
、真の陽性または真の陰性とは別に得られるかもしれない。

【００１６】血清学的技術（既知の特異性の一連の血清を使用したDR抗原の分析：結果は命
名法DR1-DR10により記する）または分子生物学的技術（DRB1対立遺伝子分析：結
果は命名法DRB1^*01-DRB1^*10によって記する）のどちらかを使用するかにより、
本質的に医師は、「線量-効果」情報を有する可能性のある１つまたは複数のDR4
抗原または１つまたは複数のDRB1^*gr04対立遺伝子の存在に注目する。

【００１７】疾病素質を示唆する結果が得られた場合、一般に、DRB1^*gr04対立遺伝子（199
8年の公式名によるとDRB1^*gr0401-gr0427）を特定するために、「DR4サブタイピ
ング」、「高分解能」分子生物学的技術を使用して、第２の試験を行うが、疾患
に関連すると報告されているのは、DRB1^*gr0401、gr0404、gr0405、およびgr040
8対立遺伝子のみである。

【００１８】これらの試験は信頼できるが、長期（数日）且つ高価である。

【００１９】

【課題を解決するための手段】

特許請求の範囲に記載の分析法は、より迅速で（アンプリコンの調製から2時
間未満）、比較的安価であるという実用的始点から簡略化された分析を可能にす
る。

【００２０】

【発明の実施の形態】

したがって本発明は、次のものに関する：少なくとも１の疾患に対しての、患者の遺伝的体質を分析する方法であって、探
索している疾患に関しての少なくとも１の興味ある多形領域の増幅に由来した少
なくとも１のタイプのアンプリコンを含む液体試料を、以下より選択されるプロ
ーブの存在下に置く工程を含む方法： -少なくとも１の特定の「低分解能」タイピングプローブであって、当該アンプ
リコンが保持し、且つ当該疾患に関連する遺伝子についての一群の対立遺伝子、
又は少なくとも１の遺伝子、についての興味ある当該多形領域にハイブリダイズ
することができるプローブ、及び -少なくとも１の特定の「高分解能」サブタイピングプローブであって、当該「
低分解能」タイピングプローブに対して特異的な、一群の対立遺伝子、又は対立
遺伝子、の興味ある当該多形領域にハイブリダイズできるプローブ、ここで、当該高分解能プローブは、当該疾患に対しての抵抗性に関連した対立遺
伝子、及び／又は当該疾患に対しての抵抗性に関連した対立遺伝子を、ハイブリ
ダイズするか否かで区別することを可能にする。

【００２１】別の対立遺伝子の存在を検出するため、遺伝子の１つの対立遺伝子またはこの
遺伝子の対立遺伝子群が、対立遺伝子の他の群に対応する少なくとも１つの特異
的低分解能分類プローブを使用して検出された場合には、この方法は、低分解能
プローブによって検出された前記遺伝子の多形またはこの遺伝子の対立遺伝子群
に対応する少なくとも１つの他の対立遺伝子に特異的な少なくとも１つのプロー
ブの存在下にアンプリコンを配置する工程を包含する。

【００２２】探索している、疾患に特異的な低分解能または高分解能プローブのそれぞれは
、探索している疾患に特徴的な少なくとも１つのモチーフを含む。

【００２３】慢性関節リウマチおよび他の関連疾患に対する遺伝的抵抗性についてのHLA-DR
対立遺伝子を検出したい場合、以下を使用することができる： - DRB1^*gr04対立遺伝子にハイブリダーゼーションすることができる少なくと
も１つの低分解能プローブ、 -以下の対立遺伝子：DRB1^*0101、DRB1^*gr0401、DRB1^*gr0404、DRB1^*gr0405、D
RB1^*gr0408、およびDRB1^*gr1402とハイブリダーゼーションすることができる、
慢性関節リウマチに対する遺伝的感受性に関連する少なくとも１つの高分解能プ
ローブ、 -以下の対立遺伝子：DRB1^*0402、DRB1^*gr0403、DRB1^*gr0406、およびDRB1^*gr0
407とハイブリダーゼーションすることができる、慢性関節リウマチに対する遺
伝的抵抗性（耐性）に関連する少なくとも１つの高分解能プローブ。

【００２４】さらに、DRB1^*01群対立遺伝子およびDRB1^*10対立遺伝子にハイブリダーゼーシ
ョンすることができる少なくとも１つの低分解能プローブを使用する。

【００２５】別の対立遺伝子の存在を検出したい場合に、DRB1^*gr04群対立遺伝子の単一の
対立遺伝子が検出されているときは、以下の対立遺伝子：DRB1^*02、DRB1^*03、DR
B1^*07、DRB1^*08、DRB1^*09、DRB1^*11、DRB1^*12、DRB1^*13、およびDRB1^*14にハイ
ブリダーゼーションすることができる少なくとも１つのプローブを使用する。

【００２６】これらの対立遺伝子に関するプローブに関して、以下を使用する： -DRB1^*gr04タイピング用の配列番号3のプローブ、 -慢性関節リウマチに対する遺伝的抵抗性に関連する２つの高分解能プローブ
、 -DRB1^*gr0401用の配列番号4、 -DRB1^*0101、DRB1^*gr0404、DRB1^*gr0405、DRB1^*gr0408、およびDRB1^*1402用の
配列番号7、 -慢性関節リウマチに対する遺伝的耐性に関連する高分解能プローブ、 -DRB1^*gr0402用の配列番号５、 -DRB1^*gr0403、DRB1^*gr0406、およびDRB1^*gr0407用の配列番号6。

【００２７】より詳細には、DRB1^*gr0405に特異的で慢性関節リウマチに対する遺伝的抵抗
性と関連した高分解能プローブ（配列番号8）もまた使用する。

【００２８】さらに、タイピングに以下の２つのプローブを使用する： - DRB1^*01群対立遺伝子用の配列番号11、 -DRB1^*10対立遺伝子用の配列番号15。

【００２９】別の対立遺伝子の存在を検出したい場合に、DRB1^*gr04群対立遺伝子の単一の
対立遺伝子が検出されている時は、以下の４つのタイピングプローブを使用する
： -DRB1^*02用の配列番号13、 -DRB1^*07およびDRB1^*09用の配列番号14、 -DRB1^*08およびDRB1^*12用の配列番頭16、 -DRB1^*03、DRB1^*11、DRB1^*13、およびDRB1^*14用の配列番号12。

【００３０】何れの場合にも、慢性関節リウマチおよび他の関連疾患についての遺伝的抵抗
性に関しての対立遺伝子に特異的な低分解能または高分解能プローブのそれぞれ
は、以下の特徴的モチーフの１つを含む：QKRAA、QRRAA、またはRRRAA。

【００３１】 DRB1遺伝子群とハイブリダーゼーションすることができる少なくとも１つの対
照プローブを使用して、全てのDRB1遺伝子を検出可能である（配列番号１：TTC
GAC AGC GAC GTG GGGなど）。

【００３２】強直性脊椎炎および他の関連疾患に対する遺伝的抵抗性について対立遺伝子の
検出も意図する場合、HLA-B遺伝子にハイブリダーゼーションすることができ且
つ対立遺伝子のHLA-B27群に特異的な配列番号10などの少なくとも１つの低分解
能プローブを使用する。

【００３３】播種状紅斑性狼瘡、膠原病、シェーグレン症候群、および他の関連疾患に関連
する遺伝的抵抗性の検出も意図する場合、HLA-DR遺伝子にハイブリダーゼーショ
ンすることができ且つHLA-DRB1^*03群対立遺伝子に特異的な配列番号19などの少
なくとも１つの低分解能プローブを使用する。

【００３４】どのような検出の場合であっても、同一の低分解能または高分解能プローブの
最大38.89％の塩基がイノシンなどの少なくとも1つの類似の塩基で置換される。

【００３５】本方法の1つの変形形態では、特異的低分解能または高分解能プローブのそれ
ぞれを他のプローブとは独立に、マイクロタイタープレートのウェルに入れる。

【００３６】本方法の別の変形形態では、全ての反応を同時に行う。

【００３７】上記の方法を行う前に、少なくとも1つの目的の多形領域の増幅を行う。

【００３８】 HLA-DRに関連する目的の多形領域の増幅およびHLA-Bに関連する目的の多形領
域の増幅を同時に行う。

【００３９】１つの変形形態では、多形領域について既に行われたものよりも高度に標的化
された、少なくとも１つの領域の第2の増幅を行うが、この高度に標的化された
領域は、探索している疾患についての目的の領域であり、得られたアンプリコン
を、先に定義したプローブの存在下に置く。

【００４０】この変形形態では、より高度に標的化した増幅である第二の増幅と同時にまた
はそれに先立って第１の増幅を行う。

【００４１】本発明はまた、配列番号21のプライマーと組み合わせて配列番号20のプライマ
ーを使用する工程を包含する、慢性関節リウマチについての患者の遺伝的疾病素
質の分析法を使用する目的で、DRB1^*gr04群対立遺伝子に対応する配列を増幅す
ることに関する。

【００４２】本発明はまた、配列番号24および/または配列番号26のプライマーと組み合わ
せて配列番号22、配列番号23、および/または配列番号25のプライマーを使用す
る工程を包含する、強直性脊椎炎について患者の遺伝的疾病素質の分析法を使用
する目的で、B27対立遺伝子に対応する配列を増幅することに関する。

【００４３】さらに本発明は、慢性関節リウマチおよび/または強直性脊椎炎についての患
者の遺伝的疾病素質の分析法を使用する目的で、上記の２つのパラグラフに記載
される２つの増幅の組み合わせることができる。

【００４４】このような場合、増幅は、DBR1^*gr04群対立遺伝子に対応する配列の増幅用プ
ライマーの最終濃度がB27対立遺伝子に対応する配列の増幅用プライマーの最終
濃度より高いものとなる。

【００４５】１つの実行変形形態においては、上記の増幅は、配列番号27のプライマーと組
み合わせて配列番号21のプライマーを使用することを包含する、DRB1^*gr04対立
遺伝子中に含まれる、より高度に標的化された領域に対応する配列の増幅と組み
合わせる。

【００４６】例示として添付の実施例を示すが、これは性質上決して限定を意味するもので
はない。これらの実施例により、本発明をより明確に理解することができる。

【００４７】本発明は、迅速且つ安価な遺伝病の検出法を提供する。この新規の技術を、全
ての遺伝病、特に、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、および他の自己免疫疾患
（膠原病（狼瘡、強皮症など）など）、およびリウマチ療法指導中に遭遇する疾
患にも使用することができる。

【００４８】これは、複数の遺伝子の同時分析が可能な分子生物学的技術を使用した一定の
疾患に対する個体の遺伝的疾病素質の分析法である。この方法を、１つまたは複
数の遺伝子に関連する１の疾患または一連の関連疾患についての個体の遺伝的疾
病素質の分析に有利に適用することができる。この方法を、一定の炎症性自己免
疫疾患（慢性関節リウマチおよび強直性脊椎炎など）についての個体の遺伝的疾
病素質の分析に適用することができる。

【００４９】この方法の利点は、一工程（多要素であるが１回の試験）で目的（診断目的、
予防目的、および治療方針）の完全な一連の関連臨床情報の獲得である。この方
法を以下のようにいくつかの工程に分割することができる：１）個体由来の生体サンプルからの核酸を抽出する、２）病態についての遺伝的疾病素質に関連する多形が記載されている、目的の領
域を増幅する、３）一定の、対立遺伝子又は一連の対立遺伝子についての正確な分析を許容する
一連の分子プローブを利用した（implementing）、一連のハイブリダイゼーショ
ン反応を使用して、アンプリコンを同時に分析する。

【００５０】

【実施例】

Ｉ-慢性関節リウマチおよび強直性脊椎炎についての患者の遺伝的疾病素質の
同時分析の実施例。１）末梢血サンプルからのデオキシリボ核酸（DNA）の抽出。この抽出を完全に従来通りに行う。実際、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）など
の増幅法を使用してその後増幅することができる物質の獲得が可能な任意のDNA
抽出技術を使用可能である。核酸の抽出および精製を含むこれらの細胞溶解技術
は、遺伝子分析で推奨される従来の技術または市販の製品（QIAGEN S.A.のQIAmp
血液キット（商標）など）を使用した迅速な技術である。

【００５１】 2）PCRによる同時増幅。本増幅は、以下の遺伝子座に関する： -HLA-DR遺伝子座：公式の命名法にしたがって、HLA-DRB遺伝子のコドン5-94に
対応するエクソン2領域を含む、 -HLA-DR遺伝子座：公式の命名法にしたがって、HLA-B遺伝子のコドン25-114に
対応するエクソン2領域を含む。

【００５２】以下の表1は、上記の2つの遺伝子座の増幅に使用したプライマーを記載する。
表はまたこの増幅用の一連の物理化学的条件を示す。

【００５３】

【表１】

【００５４】 3）アンプリコンの同時分析：この分析は、特に慢性関節リウマチおよび強直性脊椎炎についての遺伝的疾病
素質の研究に重要なHLA-DRB1およびHLA-B^*27対立遺伝子または対立遺伝子群を正
確に分析することを可能にする一連のオリゴヌクレオチドプローブを利用する一
連のハイブリダーゼーション反応を使用する。

【００５５】表2は、これら2つの疾患の検出に使用する一連のプローブを記載する。示した
表示は、左から右に以下である： -HLA命名法で割り当てたプローブ参照符号、 -この書類で割り当てた配列番号、 -関連するHLA遺伝子、 -このプローブを形成する配列、および -HLA遺伝子上のコドン（3ヌクレオチド）の位置。

【００５６】

【表２】

【００５７】一定のプローブでは、イタリック体の第2の配列（下段）は、天然の配列（す
なわち、4つのヌクレオチドであるアデノシン(A)、チミン(T)、グアニン(G)、お
よびシトシン(C)のみからなる配列）を特定している。他の配列は、いくつかの
ヌクレオチドの異なるヌクレオチドへの置換を除いて同一のヌクレオチドが反復
している。本発明の場合、これはイノシンである。

【００５８】一定の配列（配列番号1、2、3、8、9、11、12、13、15、17、および18の場合
）ではイノシンを全く含まない。他の配列（配列番号19の場合）はイノシンをほ
とんど含まず、これは全部で19個のヌクレオチドのうちの1つがイノシンである
（すなわち、基本配列と比較して6.25％異なる）。その他の配列（配列番号6等
）はさらに多くのイノシンを含み、これは全部で18個のヌクレオチドのうちの7
つがイノシンである（すなわち、基本配列と比較して38.89％異なる）。

【００５９】イノシンの使用により、ハイブリダーゼーションする配列に関するプローブの
特異性をさらに改良可能である。捕獲プローブの特異性を、以下の表3に明確に
特定する。

【００６０】

【表３】

【００６１】表3では、用語「特に」は、一定の対立遺伝子に関連する場合がある。実際に
、他の対立遺伝子が存在すると解釈できる。したがって、配列番号5では、DRB1^* gr0402だけでなくDRB1^*gr0414も検出される。後者は、非常に稀であるので、現
在までのところ慢性関節リウマチでのその存在を関連付ける研究が行われていな
い。しかし、これら2つの対立遺伝子のモチーフは、目的の多形領域において類
似しているので、この疾患に対する抵抗性が同一である可能性が高い。

【００６２】配列番号17および18に対応するプローブD1およびD6は検出プローブである。

【００６３】これらは、同一の遺伝子の全ての対立遺伝子で見られる領域を認識する。した
がって、HLA DR遺伝子の保存領域中で配列番号17のプローブを選択し、HLA B遺
伝子の保存領域中では配列番号18のプローブを選択する。

【００６４】標準化された形式のマイクロタイタープレートまたはマイクロプレート上でこ
のプローブ分析を行うことができる。これらのプレートは、行うべき試験数に依
存して集合させることができる、それぞれ8個のウェルからなるストリップを含
む。利便性および費用の要求により、1試験あたり2つのストリップを使用するこ
とがよい。

【００６５】生産費用ができるだけ低いと同時に非常に高レベルの性能を示さなければなら
ないので、最小数のストリップを用いて結果を得ることを目的としている。この
最小数は、2つのストリップである。

【００６６】したがって、慢性関節リウマチおよび強直性脊椎炎の場合、それぞれR1および
R2と呼ばれる2つのストリップを使用することができる。ストリップR1について1
つの可能性が得られ、R2については2つのシナリオが可能である。

【００６７】

【表４】

【００６８】ストリップR1は、DRB1^*遺伝子の全ての対立遺伝子を検出可能なポジティブコ
ントロール（配列番号1）を含み、表1に記載のプライマーP1とP2との間の目的の
領域が実際に増幅されたことを評価することを可能にする。ネガティブコントロ
ール（配列番号2）は、診断目的ではなく、一定の標準を満たすためのみに存在
する。この配列は、HLAには全く特異的ではなく、HLA遺伝子に見出されないラン
ダム配列に対応する。

【００６９】配列番号3は、DRB1^*gr04群を構成する一連の対立遺伝子をタイピングすること
が可能である。これは、全DRB1^*gr04対立遺伝子の同定を可能にし、これらの対
立遺伝子は、DR4群などの血清学を使用したHLAタイピング技術によって定義され
た群に所属する。これは低分解能プローブであり、即ち多くの対立遺伝子をこの
プローブによって認識することができる。

【００７０】配列番号4-8自体により、特定の配列を共有する対立遺伝子を特製するDRB1^*gr
04群を構成するいくつかの対立遺伝子のサブタイピングすることを可能にする。
これらは高分解能プローブであり、即ちこれらのプローブの１つを用いて少数の
対立遺伝子または1つの対立遺伝子さえも認識することができる。

【００７１】これらの全てのプローブを使用して、慢性関節リウマチについての遺伝的疾病
素質に関連する共有エピトープを含む対立遺伝子を検出する。より詳細には、配
列番号4および7のプローブにより慢性関節リウマチについての抵抗性に関連する
対立遺伝子を検出可能であり、配列番号5および6のプローブにより慢性関節リウ
マチ耐性に関連する対立遺伝子を検出可能である。配列番号8のプローブにより
、DRB1^*gr0405対立遺伝子の存在の確認が可能である。

【００７２】ストリップR2は、HLA-B遺伝子のエクソン2に対応するアンプリコンを検出可能
にするポジティブコントロール（配列番号9）を含み、表1に記載のプライマーP3
とP4との間の目的の領域が実際に増幅されたことを評価可能にする。

【００７３】これは、最初にB^*27群対立遺伝子を検出可能な配列番号10を含み、これを使用
して個体が強直性脊椎炎の発症抵抗性を示すかどうかを同定する。

【００７４】このストリップの残りは低分解能プローブ（すなわち配列番号11-16）からな
り、これはストリップＲ１で実行したときに、慢性関節リウマチに対する抵抗性
または耐性についての対立遺伝子が存在するかどうかが、任意の個体の2つのハ
プロタイプの分析を行うこと、具体的には、一方または両方のハプロタイプに関
連していることを示すことを可能にする（線量-効果）。

【００７５】抵抗性対立遺伝子と、耐性対立遺伝子と、中性対立遺伝子との間の均衡に依存
して、多少の重症慢性関節リウマチの発症危険度が異なり、意図される治療手段
をこの診断に順応されるであろう。

【００７６】ストリップ2aの場合、2つの修飾以外は実質的にストリップR2と同様の構成を
繰り返す。

【００７７】最初に、2つの反応をまとめてグループ化する。したがって、1つのウェル内に
2つの異なるプローブ（すなわち、配列番号14および配列番号16）を含む。

【００７８】したがって、このように開放された（freed）ウェルに、DRB1^*03対立遺伝子（
DR3）の存在に関連する、配列番号19の新規のプローブを添加することを可能に
する。実際、独立した様式でこのDRB1^*03対立遺伝子群を賢明に同定することが
でき、他の疾患（例えば、播種状紅斑性狼瘡、膠原病、シェーグレン症候群、ま
たはインスリン依存性糖尿病）に関連することが見出された。

【００７９】 4）調製したアンプリコンの分析用試薬の調製。使用した逆ハイブリダーゼーションの原理は、本出願人の特許出願WO-A-93/02
213に記載され、、その内容は、本発明者らの特許出願書類に含まれると考えら
れる。簡単に述べれば、特異的捕獲プローブは、5'末端の修飾（-NH₂官能基の存
在）によってマイクロタイタープレートに集合したストリップのウェルのポリス
チレン上に受動的に吸収される。検出プローブは、5'末端の修飾（-NH₂官能基の
存在）によってHRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）酵素に共有結合したオリゴ
ヌクレオチドである。ハイブリダーゼーション緩衝液の組成を、以下のように改
変する： -75mM Na₂HPO₄・2H₂O、 -25mM Na₂HPO₄・H₂O、 -pH 6.8、 -500mM NaCl、 -2％ PEG 4000, -0.65％のTween 20、 -0.1％のゼラチン、 -0.14g/lの超音波処理DNA、 -0.001％の塩酸シプロフロキサシン、および -0.02％のブロモニトロジオキサン。

【００８０】表4に記載のように、多試験は、ストリップR1およびR2またはR2aからなる。

【００８１】 5）手順： 1）アンプリコンの変性：10μlの変性試薬（2N NaOH）を100μlの調製済アンプ
リコン溶液に添加する。18〜25℃で5分間インキュベートする。 2）2mlのハイブリダーゼーション緩衝液および0.2mlの検出プローブを含む溶液
を添加する。 3）多試験に対応する16個の感作ウェルのそれぞれに100μlの割合で混合物を分
注する。自己粘着性シートで覆う。 4）37℃（35〜39℃）のインキュベーター中で６０分間インキュベートする。 5）18〜25℃での洗浄によって、非ハイブリッド物質を取り除く。 6）ウェルあたり100μlの基質溶液（OPD、オルソフェニレンジアミン）の分配に
よって酵素反応を起す。18〜25℃の暗所で20分間インキュベートする。 7）結果の読み取り：直接または光学密度（492nmでの読み取り）の記録。 8）結果の解釈。

【００８２】 II-実施例および結果：公知のHLA分類による種々のサンプルから得られた結果を以下に示す。

【００８３】 1）第1のサンプル：以下の2つの表5および表6は、2つのストリップR1およびR2を用いて得られた結
果を示す。

【００８４】

【表５】

【００８５】

【表６】

【００８６】ストリップR2を使用したので、2つの分析が可能である。

【００８７】最初に、HLA-DR分析により、以下のことが示される： -配列番号1のプローブは正（陽性）のプローブであること：HLA-DR増幅および
ハイブリダーゼーション試験は正常に機能した、 -配列番号3および配列番号4のプローブは正である：DRB1^*gr0401対立遺伝子が
存在すること、および -配列番号13のプローブは正であること：DRB1^*02対立遺伝子が存在する。

【００８８】結論として、慢性関節リウマチに抵抗性について単一の対立遺伝子（DRB1^*gr0
401）が存在し、第2の対立遺伝子は、慢性関節リウマチに関して中立であるDRB1 ^* 02である。

【００８９】第2に、HLA-B分析により、以下のことが示される： -配列番号9のプローブは正であること：HLA-B増幅およびハイブリダーゼーシ
ョン試験は正確に機能した、 -配列番号10のプローブは負（陰性）であること：B^*27対立遺伝子は存在しな
い。

【００９０】サンプルを試験した患者は、強直性脊椎炎抵抗性ではない。この最初のサンプルのHLA分類は、以下であった： - HLA-DRB1^*gr0401/1602および -HLA-B^*5701。

【００９１】 2）第2のサンプル：以下の2つの表7および表8は、2つのストリップR1およびR2を用いて得られた結
果を示す。

【００９２】

【表７】

【００９３】

【表８】

【００９４】以下の4つの正のプローブが存在する -配列番号1のプローブ：HLA-DR増幅およびハイブリダーゼーション試験は正確
に機能した -配列番号3のプローブ：少なくとも1つのDRB1^*gr04対立遺伝子が存在する、 -配列番号5のプローブ：少なくとも1つのDRB1^*gr0402対立遺伝子が存在する、 -配列番号9のプローブ：少なくとも1つのB^*対立遺伝子が存在するが、配列番
号10が負なのでB^*27は存在しない。

【００９５】したがって、DR4対立遺伝子は存在するが、この対立遺伝子はRAに対する遺伝
的抵抗性に関連しないサブタイプである（DRB1^*gr0402）。第2の対立遺伝子の同
定により、それがDRB1^*02であることを証明可能である。

【００９６】第3のサンプルのHLAタイピングは以下であった： -HLA- DRB1^*gr0402/02および -B^*27以外のHLA-B。

【００９７】 3）第3のサンプル：以下の2つの表9および表10は、2つのストリップR1およびR2を用いて得られた
結果を示す。

【００９８】

【表９】

【００９９】

【表１０】

【０１００】前記の2つの実施例と同様に、2つの分析が可能である。

【０１０１】最初に、HLA-DR分析により、以下のことが示される： -配列番号1のプローブは正であること：HLA-DR増幅およびハイブリダーゼーシ
ョン試験は正確に機能した、 -配列番号3のプローブは負であること：DRB1^*gr04対立遺伝子が存在する、 -配列番号5および配列番号12のプローブは正である：DRB1^*11または13の対立
遺伝子が存在すること、および -配列番号13のプローブは正であること：DRB1^*02対立遺伝子が存在する。

【０１０２】結論として、慢性関節リウマチ抵抗性についての対立遺伝子は存在しないが、
2つのDR対立遺伝子が属（generic）レベルで同定された。

【０１０３】第2に、HLA-B分析により、以下のことが示される： -配列番号9のプローブは正であること：HLA-B増幅およびハイブリダーゼーシ
ョン試験は正確に機能した、 -配列番号10のプローブは正であること：少なくとも1つのB^*27対立遺伝子が存
在する。

【０１０４】第3のサンプルのHLA分類は以下であった： -HLA-DRB1^*02/1301および -HLA-B^*27。

【０１０５】 4）第4のサンプル：以下の2つの表11および表12は、2つのストリップR1およびR2aを用いて得られ
た結果を示す。

【０１０６】 2つのストリップR1および特にR2aを含む構成により（表4を参照のこと）、慢
性関節リウマチおよび強直性脊椎炎に対する遺伝的抵抗性分析に加えて、播種状
紅斑性狼瘡、膠原病、シェーグレン症候群、およびリウマチ療法指導中に遭遇す
る他の関連疾患に対する遺伝的抵抗性を明確に分析可能である。これを、1つの
ウェル中でプローブ7、8、9、および12を含む配列番号14と16との組み合わせに
よって行うが、その特異性を表3に記載する。

【０１０７】

【表１１】

【０１０８】

【表１２】

【０１０９】以下の6つの正のプローブが存在する -配列番号1のプローブ：HLA-DR増幅およびハイブリダーゼーション試験は正確
に機能した -配列番号3のプローブ：少なくとも1つのDRB1^*gr04対立遺伝子が存在する、 -配列番号4のプローブ：少なくとも1つのDRB1^*gr0401対立遺伝子が存在る、 -配列番号9のプローブ：少なくとも1つのB^*対立遺伝子が存在するが、配列番
号10が負なのでB^*27は存在しない、 -配列番号12のプローブ：少なくとも1つのDRB1^*03、11、13、または14対立遺
伝子が存在する、 -配列番号19のプローブ：少なくとも1つのDRB1^*03対立遺伝子が存在する。

【０１１０】この患者においては、DRB^*103対立遺伝子が存在するために播種状紅斑性狼瘡
に対する遺伝的抵抗性についての対立遺伝子が存在するように、DRB1^*gr0401対
立遺伝子が存在するために、慢性関節リウマチに対する遺伝的抵抗性についての
対立遺伝子が存在する。B^*27に関する対立遺伝子は存在しない。

【０１１１】第4のサンプルのHLAタイピングは以下であった： -HLA-DRB1^*gr0401/0301および -B^*27以外のHLA-B。

【０１１２】 III-結果の至適化：本発明の目的は、増幅を行うべき条件を改良することであった。至適条件を以
下の表13に示す。

【０１１３】

【表１３】

【０１１４】したがって、表1と表9の増幅条件の間の相違は、わずかに改変したP3およびP4
、プライマーP1、P2、P3、およびP4の新規の濃度、および増幅プログラムの温度
の変形形態の選択にある。これらの改変の結果への導入を、異なる患者サンプル
に対応する表14、表15、および表16に特定する。

【０１１５】

【表１４】

【０１１６】この第1のサンプルのタイピングは、DRB1^*gr0404/52である。

【０１１７】

【表１５】

【０１１８】この第2のサンプルのタイピングは、DRB1^*gr0401/gr0402である。

【０１１９】

【表１６】

【０１２０】この第3のサンプルのタイピングは、DRB1^*gr0403/gr0405である。

【０１２１】これらの全ての値は1000を掛けたOD値である（OD×1000）。読み取り可能な最
大値が2.5であるので、この値よりも大きな数字の場合、値は、単純に2500より
も大きい（＞2500）ものとして示してある。

【０１２２】全ての顕著な値を太字で強調していることに留意されたい。これは、正のプロ
ーブのみを含む。第1のサンプルでは、7つの顕著な値の全てが初期条件を至適化
した条件に由来する。3つの値はプライマーの至適化に関し、4つはプライマーお
よび増幅の至適化に関する。第2のサンプルでは、5つの顕著な値の全てが初期条
件を至適化した条件由来である。1つの値はプライマーの至適化に関し、4つはプ
ライマーおよび増幅の至適化に関する。第3のサンプルでは、7つの顕著な値の全
てが初期条件を至適化した条件に由来する。2つの値はプライマーの至適化に関
し、5つはプライマーおよび増幅の至適化に関する。

【０１２３】増幅のみの至適化は、プライマーのみまたはプライマーおよび増幅の至適化よ
りも価値が低い。しかし、19個の顕著な値に対応する配列のうち、18個の配列は
増幅初期条件に関しての至適化が有利であることに留意されたい。

【０１２４】表1と表13との増幅技術を比較すると、DRB1^*gr04群対立遺伝子に対応する配列
の増幅用プライマーの最終濃度がB27対立遺伝子に対応する配列の増幅用プライ
マーの最終濃度より高い場合、増幅はより有効であることが認められる。

【０１２５】 IV-改良：一定の場合、あいまい性が出現し得る。したがって、プラマーがDR4に特異的
でない場合、他の対立遺伝子が増幅され、解釈に困難が生じ得る。これは、例え
ば、以下の3つの例の場合である。唯一の解決策は、以下の表17に記載の特定の
プライマーを使用し、DR4に対してより高度に標的化した増幅を行うことである
。

【０１２６】

【表１７】

【０１２７】このようなあいまい性およびその解決を示す例を以下に示す。

【０１２８】１）第1のサンプル

【０１２９】

【表１８】

【０１３０】

【表１９】

【０１３１】この場合、DRB1^*gr04群（配列番号3は正である）内で、DRB1^*gr0401（配列番
号4は正である）とDRB1^*gr0402（配列番号5は正である）との間で区別すること
はリスクなしでは不可能である。他の対立遺伝子は、gr52（配列番号12は正であ
る）である。さらに、配列番号5は1692の正の値を有し、DRB1^*gr0401については
、配列番号4は182のみの正の値を有するので、おおよその数字ではDRB1^*gr0402
を支持する傾向がある。

【０１３２】それにもかかわらず、第2の分析によりこれら2つの対立遺伝子の区別が可能で
ある。これを、表20および表21に明確に示す。

【０１３３】

【表２０】

【０１３４】

【表２１】

【０１３５】したがって、この第2の分析によってDRB1^*gr0401（配列番号4は正である）お
よびDRB1^*gr0402（配列番号5は負（陰性）である）であることが明白に認められ
る（原文）。したがって、これら2つの対立遺伝子は慢性関節リウマチに同一の
影響を与えないので、非常に関連するDRB1^*gr0401とDRB1^*gr0402とを区別可能で
ある。したがって、DRB1^*gr0401は、慢性関節リウマチに対する遺伝的抵抗性に
関連し、DRB1^*gr0402は慢性関節リウマチに対する遺伝的耐性に関連する。

【０１３６】したがって、この第1のサンプルのタイピングはDRB1^*gr0401/gr52である。

【０１３７】 2）第２のサンプル

【０１３８】

【表２２】

【０１３９】

【表２３】

【０１４０】この場合、DRB1^*gr04群（配列番号3は正である）内で、DRB1^*gr0404（配列番
号7は正である）とDRB1^*gr0405（配列番号7および配列番号8は共には正である）
との間の区別はリスクなしでは不可能である。他の対立遺伝子は、gr52（配列番
号12は正である）である。

【０１４１】それにもかかわらず、第2の分析によりこれら2つの対立遺伝子の区別が可能で
ある。これを、表24および表25に明確に示す。

【０１４２】

【表２４】

【０１４３】

【表２５】

【０１４４】したがって、これは、第2の分析によってDRB1^*gr0405（配列番号7および配列
番号8は共には正である）である一方で、DRB1^*gr0404である場合は配列番号8は
負であるはずであることが明白に認められる。したがって、現在の知識によれば
これら2つの対立遺伝子は慢性関節リウマチに同一の影響を与るので、あまり関
連のないDRB1^*gr0404とDRB1^*gr0405とを区別可能である。したがって、DRB1^*gr0
404およびDRB1^*gr0405は共に、慢性関節リウマチに対する遺伝的抵抗性に関連す
る。勿論、これら2つの対立遺伝子の1つが他のものより更に有意に影響を与える
さらなる知識が証明された場合、この第2の分析の重要性は変化し得る。

【０１４５】したがって、この第2のサンプルのタイピングはDRB1^*gr0405/gr52である。

【０１４６】 3）第3のサンプル

【０１４７】

【表２６】

【０１４８】

【表２７】

【０１４９】この場合、DRB1^*gr04群（配列番号3は正である）内で、DRB1^*gr0404（配列番
号7は正である）とDRB1^*gr0405（配列番号7および配列番号8は共には正である）
との間の区別はリスクなしでは不可能である。他の対立遺伝子はgr8+12（配列番
号16は正である）であり、これは現在の知識では慢性関節リウマチまたは強直性
脊椎炎に中立である。前述の2つの例と異なり、B^*27対立遺伝子が存在すること
を留意すべきである。第2の分析はこれら2つの対立遺伝子を再度区別可能である
。これを、表28および表29に明確に示す。

【０１５０】

【表２８】

【０１５１】

【表２９】

【０１５２】したがって、前記実施例に記載のように、この第2の分析によって、配列番号7
は正であり配列番号8は負であるので、これはDRB1^*gr0404である一方で、これが
DRB1^*gr0405である場合は配列番号8は正であるはずであることが明白に認められ
る。したがって、これら2つの対立遺伝子は慢性関節リウマチに同一の影響を与
るので、第1の実施例よりも関連の低いDRB1^*gr0404とDRB1^*gr0405とを区別可能
である。したがって、DRB1^*gr0404およびDRB1^*gr0405は共に、慢性関節リウマチ
に対する遺伝的抵抗性に関連する。しかし、第2のサンプルでのコメントを繰り
返すことができる。

【０１５３】したがって、この第3のサンプルのタイピングはDRB1^*gr0404/gr8+12であり、
少なくとも1つのB^*27対立遺伝子が存在する。

【０１５４】 V-結論：これらの実施例が証明するように、特許請求の範囲に記載の方法により、医師
が必要な情報（DR1、DR4、DR10、DRB1^*gr04のサブタイプ、モチーフQKRAA、QRRA
A、およびRRRAAの存在、線量-効果）にのみ差し向けられた分析に基づいて、慢
性関節リウマチに対する遺伝的抵抗性の調査ならびにHLA-B^*27の調査を、1工程
または2工程で、同時に実行可能であり、これはリウマチ治療指導の参考になる
場合もある。

【０１５５】リウマチ治療指導を行う場合、HLA-DRおよびHLA-B27情報の関連を知る必要が
ある。試験の単純性、可能性、および速度は、結果として有意に経済的影響を与
えるので、本発明の方法の利点である。

【０１５６】

【参考文献】

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年７月２４日（２００１．７．２４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 CA20 HA13 HA14 4B063 QA13 QA17 QA19 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも１の疾患に対しての、患者の遺伝的体質を分析す
る方法であって、探索している疾患に関しての少なくとも１の興味ある多形領域
の増幅に由来した少なくとも１のタイプのアンプリコンを含む液体試料を、以下
より選択されるプローブの存在下に置く工程を含む方法： -少なくとも１の特定の「低分解能」タイピングプローブであって、当該アンプ
リコンが保持し、且つ当該疾患に関連する遺伝子についての一群の対立遺伝子、
又は少なくとも１の遺伝子、についての興味ある当該多形領域にハイブリダイズ
することができるプローブ、及び -少なくとも１の特定の「高分解能」サブタイピングプローブであって、当該「
低分解能」タイピングプローブに対して特異的な、一群の対立遺伝子、又は対立
遺伝子、の興味ある当該多形領域にハイブリダイズできるプローブ、ここで、当該高分解能プローブは、当該疾患に対しての抵抗性に関連した対立遺
伝子、及び／又は当該疾患に対しての抵抗性に関連した対立遺伝子を、ハイブリ
ダイズするか否かで区別することを可能にする。
【請求項２】別の対立遺伝子の存在を検出するための、請求項１に記載の
方法であって、前記遺伝子についての単一の対立遺伝子、又は当該遺伝子につい
ての前記の一群の対立遺伝子が、少なくとも１の特定の低分解能タイピングプロ
ーブであって他の群の対立遺伝子に対応するもので検出された場合に、前記アンプリコンを、少なくとも１の他の対立遺伝子であって、前記の低分解
能プローブにより検出される当該遺伝子についての当該一群の対立遺伝子、又は
前記遺伝子、の多形部分に対応するものに特異的な少なくとも１のプローブの存
在下に置くことを含む方法。
【請求項３】探索している疾患に対して特異的な、低分解能プローブ及び
高分解能プローブのそれぞれが、探索している当該疾患に特異的な少なくとも１
のモチーフを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】リューマチ性関節炎及び他の関連疾患に対する遺伝的抵抗性
についてのＨＬＡ-ＤＲ対立遺伝子を検出するための、請求項１乃至３の何れか
一項に記載の方法であって、以下のものを使用することを特徴とする方法： -少なくとも１の低分解能プローブであって、対立遺伝子のＤＲＢ１^*ｇｒ０４に
ハイブリダイズすることができるプローブ； -少なくとも１の高分解能プローブであって、リューマチ性関節炎に対する遺伝
的抵抗性に関連し、ＤＲＢ１^*０１０１、ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０１、ＤＲＢ１^*ｇ
ｒ０４０４、ＤＲＢ１^*０４０５、ＤＲＢ１^*０４０８、及びＤＲＢ１^*ｇｒ１４
０２の対立遺伝子とハイブリダイズすることができるプローブ； -少なくとも１の高分解能プローブであって、リューマチ性関節炎に対する遺伝
的抵抗性に関連し、ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０２、ＤＲＢ１^*０４０３、ＤＲＢ１^*ｇ
ｒ０４０６、及びＤＲＢ１^*０４０７の対立遺伝子とハイブリダイズすることが
できるプローブ。
【請求項５】少なくとも１の低分解能プローブであって、ＤＲＢ１^*０１
グループの対立遺伝子、及びＤＲＢ１^*１０対立遺伝子にハイブリダイズするこ
とができるプローブを使用することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】ＤＲＢ１^*ｇｒ０４グループの対立遺伝子群のうちの単一の
対立遺伝子が検出された場合に、別の対立遺伝子の存在を検出するための、請求
項４又は５に記載の方法であって、少なくとも１のプローブであって、ＤＲＢ１^*０２、ＤＲＢ１^*０３、ＤＲＢ１ ^* ０７、ＤＲＢ１^*０８、ＤＲＢ１^*０９、ＤＲＢ１^*１１、ＤＲＢ１^*１２、ＤＲ
Ｂ１^*１３、及びＤＲＢ１^*１４の対立遺伝子にハイブリダイズすることが可能な
プローブを使用することを特徴とする方法。
【請求項７】 -ＤＲＢ１^*ｇｒ０４についてのタイピング用の、配列番号３
のプローブ； -リューマチ性関節炎に対する遺伝的抵抗性に関連した２つの高分解のプローブ
：ＤＲＢ１^*０４０１用の、配列番号４のプローブ；ＤＲＢ１^*０１０１、ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０４、ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０５、Ｄ
ＲＢ１^*０４ｇｒ０８、及びＤＲＢ１^*１４０２用の、配列番号７のプローブ； -リューマチ性関節炎に対する遺伝的抵抗性に関連した２つの高分解能プローブ
：ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０２用の、配列番号５のプローブ；ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０３、ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０６、及びＤＲＢ１^*ｇｒ０４
０７用の、配列番号６のプローブを使用することを特徴とする請求項４乃至６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０５に特異的であり、リューマチ性関節
炎に対する遺伝的抵抗性に関連した、配列番号８の高分解能プローブをも使用す
ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】以下の二つのプローブ： -ＤＲＢ１^*０１グループの対立遺伝子用の、配列番号１１のプローブ； -ＤＲＢ１^*１０対立遺伝子用の、配列番号１５のプローブをタイピング用に使用することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】ＤＲＢ１^*ｇｒ０４グループの対立遺伝子のうちの単一の
対立遺伝子が検出された場合に、別の対立遺伝子の存在を検出するための、請求
項６に記載の方法であって、以下の４つのタイピング用プローブ： -ＤＲＢ１^*０２用の、配列番号１３のプローブ； -ＤＲＢ１^*０７及びＤＲＢ１^*０９用の、配列番号１４のプローブ； -ＤＲＢ１^*０８及びＤＲＢ１^*１２用の、配列番号１６のプローブ； -ＤＲＢ１^*０３、ＤＲＢ１^*１１、ＤＲＢ１^*１３、及びＤＲＢ１^*１４用の、配
列番号１２のプローブ；を使用することを特徴とする方法。
【請求項１１】リューマチ性関節炎及び他の関連疾患に対する遺伝的抵抗
性についての対立遺伝子に特異的な、低分解能プローブ及び高分解能プローブの
それぞれが、ＱＫＲＡＡ、ＱＲＲＡＡ、又はＲＲＲＡＡの特徴的モチーフのうち
の一つを含むことを特徴とする請求項４乃至１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】ＤＲＢ１遺伝子群とハイブリダイズすることができる、少
なくとも１の対照プローブを使用して、ＤＲＢ１遺伝子群の全て、例えば配列番
号１：TTC GAC AGC GAC GTG GGGの検出を可能にすることを特徴とする請求項４
乃至１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】強直性脊髄炎及び他の関連疾患に対する遺伝的抵抗性につ
いての対立遺伝子を検出するための、請求項４乃至１２の何れか一項に記載の方
法であって、例えば配列番号１０等の少なくとも１の低分解能プローブであって
、ＨＬＡ-Ｂ遺伝子にハイブリダイズすることができ、且つＨＬＡ-Ｂ２７グルー
プの対立遺伝子に特異的であるものを使用することを特徴とする方法。
【請求項１４】播種状紅斑性狼瘡、膠原病、シェーグレン症候群、及び他
の関連疾患に関連した遺伝的抵抗性を検出するための、請求項４乃至１３の何れ
か一項に記載の方法であって、配列番号１９等の少なくとも１の低分解能プローブであって、ＨＬＡ-ＤＲ遺
伝子にハイブリダイズすることができ、且つＤＲＢ１^*０３グループの対立遺伝
子に特異的なものを使用することを特徴とする方法。
【請求項１５】同じ低分解能プローブ又は高分解能プローブのうちの最大
で３８.９％の塩基が、イノシン等の少なくとも１の類縁体塩基で置換されてい
ることを特徴とする請求項１乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】特異的低分解能プローブ又は高分解能プローブのそれぞれ
を、互いのプローブとは独立して、マイクロタイタープレートのウェルに入れる
ことを特徴とする請求項１乃至１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】全ての反応が、同時に実行されることを特徴とする請求項
１乃至１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】興味ある多形領域についての少なくとも１の増幅を、予め
行っておくことを特徴とする請求項１乃至１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】ＨＬＡ-ＤＲに関連した興味ある多形領域の増幅、及びＨ
ＬＡ-Ｂに関連した興味ある多形領域の増幅を、予め同時に行っておくことを特
徴とする請求項１乃至１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】多形領域について既に行ったものよりも更に高度標的化さ
れたものである、少なくとも１の領域についての第二の増幅を行い、当該高度標
的化された領域が、探索している疾患についての興味ある領域であることを特徴
とし、更に得られたアンプリコンが、上記のプローブの存在するなかに置かれる
ことを特徴とする、請求項１乃至１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】第一の増幅が、第二の、更に高度標的化された増幅と同時
に、又はそれよりも前に実行されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】リューマチ性関節炎に対する患者の遺伝的体質を分析する
方法において使用するための、ＤＲＢ１^*ｇｒ０４グループの対立遺伝子に対応
する配列の増幅であって、配列番号２０のプライマーと、配列番号２１のプライ
マーと組み合わせて使用することを含むもの。
【請求項２３】強直性脊髄炎に対する患者の遺伝的体質を分析する方法に
おいて使用するための、Ｂ２７対立遺伝子に対応する配列の増幅であって、配列
番号２２、配列番号２３、及び／又は配列番号２５のプライマーを、配列番号２
４及び／又は配列番号２６のプライマーと組み合わせて使用することを含むもの
。
【請求項２４】リューマチ性関節炎及び／又は強直性脊髄炎に対する患者
の遺伝的体質を分析する方法において使用するための、請求項２２及び２３にお
ける二つの増幅を組み合わせることを含む増幅。
【請求項２５】ＤＲＢ１^*ｇｒ０４グループの対立遺伝子に対応する配列
を増幅するためのプライマーの最終濃度が、Ｂ２７対立遺伝子に対応する配列を
増幅するためのプライマーの最終的な濃度よりも高いことを特徴とする請求項２
４に記載の増幅。
【請求項２６】ＤＲＢ１^*ｇｒ０４グループ対立遺伝子に含まれている、
更に高度標的化された領域に対応する配列についての、請求項２２乃至２５の何
れか一項に記載の増幅であって、配列番号２１のプライマーを配列番号２７のプ
ライマーと組み合わせて使用することを含むもの。